CN101113474B - Bpde致癌相关基因的全基因组筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，包括如下步骤：(1)从正常肺组织中提取基因组DNA；(2)AFLP DNA片段的制备；(3)与BPDE相互作用的AFLP DNA片段的免疫磁性富集、分离；(4)AFLP PCR扩增；(5)AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色；(6)差异片段的回收、扩增、克隆、测序及同源相似性检索分析，本发明的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，为一高效、特异的方法，在全基因组水平筛选出更多的BPDE致癌易感基因，为阐明BPDE的致癌分子机制打下基础。

Description

BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体的说涉及一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法。

背景技术

随着社会经济的飞速发展，环境污染已成为人们所面临的一个严峻问题，生活在工业国家或地区的人们普遍面临着由化学物质引起诱变、致癌或致畸的危险。肿瘤，尤其是恶性肿瘤，严重危害着人类的健康及生命，很多国家为此投入了巨大的人力和物力，但迄今肿瘤的危害仍未能被遏制。近几年来，很多国家恶性肿瘤发病率节节攀升。在我国，恶性肿瘤死亡率已高居死因第一位。肺癌是呼吸系统最常见的恶性肿瘤，我国肺癌的发病率和死亡率一直呈明显上升趋势，有报告预计，到2025年，我国每年仅死于肺癌的人数将接近100万。因此开展恶性肿瘤防治研究对于预防恶性肿瘤的发生，降低发生率，减少死亡率，指导临床和提高肿瘤患者的生存质量等都具有十分重要的现实意义。经过长期的探索和研究，尤其是近20年来癌基因和抑癌基因的发现，使得人们认识到肿瘤其实是一种基因分子疾病。肿瘤的发生是一个多因素作用、多基因参与、经过多个阶段才最终形成的极其复杂的生物学现象。人类肿瘤中，绝大部分是环境致癌因素与机体基因相互作用的结果。化学性和生物性致癌因素是肿瘤病因中的重要环境因素。化学致癌物在酶系统作用后，经代谢活化产生有致癌活性的终致癌物，其亲电子基团能与细胞靶器官——生物大分子如DNA中的亲核基团经共价键结合，形成化学性质稳定的产物即加合物，导致DNA的突变，造成遗传性危害。但目前对环境化学致癌物靶基因作用位点的了解尚不能阐明环境化学致癌物的致癌分子机制。

苯并[α]芘(benzo[α]pyrene，BαP)是一种广泛存在于人们生活环境中的多环芳烃类环境污染物，主要由含碳物质的不完全燃烧产生，存在于煤烟、香烟的烟雾、熏烤食品、汽车排出的废气中，致癌性强，与人类肺癌的发生有关。BαP是间接致癌物，需在体内代谢活化才具有强烈的致癌作用。反式二氢二醇环氧苯并芘[anti-7，8-dihydrodiol-9，10-epoxidebenzo(α)pyrene，BPDE]是BαP的活性代谢终产物之一，致癌活性最强，具有亲电子性，可与DNA的亲核位点共价结合形成BPDE-DNA加合物，引起DNA碱基突变，在化学诱变和肿瘤发生中起关键作用。但其具体致癌机制仍不十分清楚。

文献表明，BPDE可能通过引起p53、k-ras、c-myc、bcl-2等多种基因的突变而引发肿瘤。目前已知的与BPDE相互作用的基因尚不能阐明BPDE的致癌分子机制，寻找出更多的BPDE致癌易感基因是个亟需解决的问题，而如何寻找更多的BPDE靶基因作用位点又成为其中的关键。人类基因组研究发现人类基因数目约为3.4万至3.5万个，如此众多的基因，究竟哪个或哪几个基因是这些致癌物的特异靶作用位点？又如何高通量筛选出致癌物特异的靶基因作用位点？

目前，对各种生命奥秘和疾病相关基因的分离和鉴定已成为功能基因组学的研究热点，已发展多种技术方法寻找差异表达基因，如差异显示PCR(DD-PCR)方法、基因芯片技术、基因表达的系统分析(SAGE)、消减杂交法等，这些方法都能有效分离差异基因，但又存在其自身的缺点和局限性。如DD-PCR的假阳性率高，获得的片段较短，提供的基因信息比较有限，同位素有污染和伤害问题；基因芯片技术的杂交和洗涤条件较难把握，会导致一定的假阳性或假阴性率，分析图像和数据较耗时；SAGE则克隆过程比较繁琐；消减杂交法虽可获得低丰度的差异基因，但不能同时展示所有的基因及差异基因。

扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)是新近发展起来的一项DNA指纹技术，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生DNA限制性片段，用双链人工接头连接到限制性片段的两端形成的特异性片段作为模板，在接头序列和内切酶识别位点的基础上加上一定数目(1～3个)的选择性碱基设计引物，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增，可以在不需要知道DNA序列信息的前提下，对酶切片段进行传统的PCR扩增，将酶切限制性片段的可靠性和PCR技术的快捷方便结合在一起，克服了RFLP和RAPD技术中的一些不足而兼具两者的优点。由于AFLP可用多种不同类型的限制性内切酶及不同数目的选择性碱基，因此，理论上AFLP可以产生无限多的标记数并可覆盖整个基因组，是指纹图谱中多态性最丰富的一项技术，且具有准确性高，重复性好，结果可靠等特点，是检测基因组变异较为理想的一种方法，已广泛用于遗传图谱构建、遗传多样性研究、基因定位及品质鉴定等方面。Majima等应用AFLP技术成功分离克隆出了一条与大鼠肾癌早期发生有关的候选新基因——Niban基因。也有学者应用AFLP技术检测了小鼠高、低转移性肝癌细胞株基因组的遗传改变，检测到4条差异片段，认为AFLP技术适用于肿瘤易感基因的筛选。AFLP筛选是基因组水平基因分型的一个策略，已广泛应用植物和细菌方面，但应用于人类的报道还很少见。Wong等首次应用毛细管电泳AFLP技术进行人肿瘤的分类和鉴别诊断，成功分类了16个肿瘤样品，而这些样品用比较基因组杂交并没有检测到基因组的变异，表明毛细管电泳AFLP技术是进行肿瘤筛选和诊断的有应用前景的方法。Matsunaga等应用AFLP差异显示技术对肺癌组织和肺癌病人外周血的基因转录产物进行鉴定，发现了4个差异转录产物，并用这4个转录产物和细胞角蛋白19作为新的指标对肺癌病人分期进行评价，有助于肺癌病人的早期诊断、分期和随访，改善肺癌病人的预后和提高生存率。因此，AFLP结合其他分子生物学技术可以用于肿瘤易感基因的筛选和鉴定。AFLP采用特定引物扩增，退火温度高，使假阳性率降低，特异性和可靠性增高，因而具有准确性高，重复性好，结果可靠等特点，而且可以在不知道基因组序列特点的情况下对其进行扩增，利用少量的内切酶组合建立一系列AFLP DNA，可以涵盖所有的基因组序列，用不同的引物组合来筛选这些AFLP片段中的感兴趣的序列，理论上可以将基因组中的这些感兴趣的序列全部富集筛选出来，被认为是一种十分理想的、有效的、先进的分子标记。

研究表明，BPDE与DNA相互作用形成BPDE-DNA加合物进而引起DNA碱基的突变，可能与DNA特定的位点有关或者是具有明显的DNA碱基序列或构象的特异性。利用这个特点，我们设计了在体外使BPDE抗原与DNA双酶切片段相互作用，BPDE抗原与DNA的特异作用序列结合制备形成BPDE抗原-DNA特异作用序列加合物。然后用针对BPDE抗原的特异性单克隆抗体与纳米磁颗粒耦联成免疫纳米磁颗粒，把与BPDE相互作用并结合的特异DNA片段从未结合的DNA片段中分离出来，找出可能致癌的与BPDE作用的特异DNA片段。此过程中，关键的问题是如何把特异的DNA片段进行初步富集并分离出来。

以纳米磁颗粒和抗原抗体反应为基础的免疫磁性分离(immunomagnetic separation，IMS)技术，由于具有巨大的比表面积、高吸附特性，及灵敏度高、特异性强、重复性好、分离效果好、简便快速等优点，已用于微生物、细胞以及其他目的物质的富集和分离，已成为一种有效的富集、分离和纯化工具。但免疫磁性分离技术应用于核酸片段的分离和富集尚未见报道。把AFLP技术和IMS技术相结合应用于肿瘤易感基因的筛选亦尚未见报道。我们利用抗原抗体反应的高特异性和纳米磁颗粒的巨大比表面积、高吸附特性、高灵敏性、重复性好、分离效果好、简便快速等优点，对特异的DNA片段成功进行了初步富集和分离，解决了实验中的一个关键问题，并为后续的AFLP-PCR进一步的扩增富集提供了物质基础。

由于能与BPDE相互作用的特异DNA片段可能很少，且我们并不能事先知道与BPDE相互作用的特异DNA片段的序列特点和碱基组成，如何使这些片段进一步扩增和富集成为实验中的另一个关键问题。应用AFLP技术正好可以解决这一问题，从而对初步富集分离的与BPDE相互作用的特异DNA片段进行大量特异性扩增，为后续实验提供条件。进而通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从而富集、分离、扩增、回收、克隆测序BPDE作用位点的特异DNA片段的核苷酸序列，经同源相似性分析获得与其同源的已知基因或未知核苷酸序列。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法。

本发明的技术方案概述如下：

BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，包括如下步骤：

(1)从正常肺组织中提取基因组DNA；

(2)AFLP DNA片段的制备：基因组DNA经双酶切获得AFLP DNA片段；

(3)与BPDE相互作用的AFLP DNA片段的免疫磁性富集、分离：AFLP DNA片段与BPDE孵育形成AFLP DNA-BPDE加合物，加入针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒，在磁场作用下，使与BPDE相互作用的AFLP DNA片段的富集并分离出来；

(4)AFLP PCR扩增：AFLP DNA片段与接头的连接，预扩增和选择性扩增；

(5)AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色；

(6)差异片段的回收、扩增、克隆、测序及同源相似性检索分析。

优选的是：所述AFLP DNA片段的制备为：

(1)用Taq I消化：准备4-6个反应体系，每个反应体系总体积为20μl，其中包括：DNA 300ng，Taq I 10u，1×buffer，其中1×buffer的成分终浓度为：50mM Tris-HCl pH 8.0，10mMMgCl₂，50mM NaCl，混匀后，65℃恒温水浴消化1～3h；

(2)向每一反应体系中补加Pst I 10u，37℃恒温水浴消化1～3h后，70～75℃水浴10～20min灭活酶的活性，4～8℃保存备用；

(3)1.5％琼脂糖凝胶电泳观察基因组DNA的酶切情况。

优选的是：所述与BPDE相互作用的AFLPDNA片段的免疫磁性富集、分离的步骤为：

(1)纳米磁颗粒免疫分离BPDE-DNA片断：

1)取所述AFLP DNA片段20μl，分成4组放入试管中：免疫磁性特异分离组、免疫磁性非特异吸附组、裸磁颗粒非特异吸附组、正常对照组；

2)向所述免疫磁性特异分离组的试管中加入2mmol/L的BPDE 0.5～2μl，其余各组分别加入0.5～2μl灭菌超纯水，37℃避光孵育3～7d；

3)向所述免疫磁性特异分离组的试管中加入体积比为10∶4的乙酸乙酯和乙醚20～22μl，轻摇混匀，静置1～4min，除去含有未结合BPDE的上层液相，重复2-4次，纯化、沉淀DNA-BPDE加合物，加20μl水重悬DNA-BPDE加合物；

4)向所述免疫磁性特异分离组和免疫磁性非特异吸附组中加入针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒0.5～2μl，向所述裸磁颗粒非特异吸附组中加入裸磁颗粒0.5～2μl，向所述正常对照组中加入灭菌超纯水0.5～2μl，室温、避光、轻摇10～30min；

5)把各试管放入磁分离架上，在磁场作用2～5min，磁颗粒贴附在管壁一侧，小心吸弃上清液，用灭菌超纯水30～40μl洗2～4次，每次2～5min；

6)加5μl灭菌超纯水溶解，即得到与BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫纳米磁颗粒复合物溶液；

(2)AFLP-DNA片段与磁颗粒的解离

把步骤(1)中得到的放置有与BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫纳米磁颗粒复合物溶液的试管放入沸水浴中10～15min，然后8000～11000r/min离心5～10min，收集上清液，使AFLP-DNA片段与抗原抗体磁颗粒复合物解离，即获得含有与BPDE相互作用的AFLP DNA片段，-20℃冻存备用。

所述针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒的制备步骤为：

(1)取裸纳米磁颗粒330μl，加入一干净灭菌的1.5ml离心管中；

(2)在磁场作用2～5min，吸弃上清；

(3)取0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液330μl重悬裸纳米磁颗粒，再加入BPDE单克隆抗体500μl；

(4)20～25℃孵育10～20min，然后加入牛血清白蛋白至终浓度为1mg/ml；

(5)在避光条件下，4～8℃孵育10～16h，不时轻轻颠倒；

(6)把离心管放入磁分离架作用2～5min，吸弃上清；

(7)向管中加330μl pH7.4磷酸盐缓冲液，用移液器枪头轻轻吹打混匀，20～25℃孵育5～10min，轻轻颠倒；

(8)重复步骤(6)、(7)各2次；

(9)把离心管放入磁分离架作用2～5min，吸弃上清；

(10)从分离架上取出离心管，加入330μl pH 7.4磷酸盐缓冲液重悬纳米磁颗粒-抗体耦合物，即成针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒；

所述AFLP PCR扩增的步骤为：

(1)AFLP-DNA片段与接头的连接：

连接反应体系总体积为20μl，其中包括：AFLP-DNA片段5μl，Taq I接头5pmol，Pst I接头2pmol，T₄DNA ligase 400u，1×buffer，其中1×buffer的成分终浓度为：50mMTris-HCl，10mM MgCl₂，10mM DTT，1mM ATP，25μg/ml BSA，pH 7.5；连接反应条件为：16～25℃ 1～4h，70℃ 5～15min，4～8℃保存；所述

Taq I接头为5′-GACGATGAGTCCTGA G-3′

3′-TACTCAGGACT CGC-5′

Pst I接头为5′-GACGTGACGGCCGTC ATGCA-3′

3′-GCACTGCCGGCAG T-5′

(2)AFLP预扩增PCR：

AFLP预扩增PCR反应体系总体积为20μl，其中包括：从所述步骤(1)获得的连接产物1μl，Taq I预扩增引物5pmol，Pst I预扩增引物5pmol，1×Taq PCR MasterMix，其中1×Taq PCR MasterMix的成分终浓度为：10mmol/L Tris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，250μmol/L dNTP each，2u Taq polymerase，混匀后，按下述条件进行PCR扩增反应：94℃0.5～1min，56℃0.5～2min，72℃0.5～2min，20～40个循环后，72℃5～15min，AFLP预扩增PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳证实有弥散条带出现后，稀释20～50倍，4～8℃保存备用；所述

Taq I预扩增引物为：5′-GATGAGTCCTGAGCGAA-3′

Pst I预扩增引物为：5′-GACGGCCGTCATGCAGA-3′

(3)AFLP选择性扩增PCR

AFLP选择性扩增PCR反应体系总体积为20μl，其中包括：AFLP预扩增PCR产物稀释液1μl，Taq I选择性扩增引物5pmol，Pst I选择性扩增引物5pmol，1×Taq PCRMasterMix，其中1×Taq PCR MasterMix的成分终浓度为：10mmol/L Tris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，250μmol/L dNTP each，2u Taq polymerase，混匀后，按下述条件进行PCR扩增反应：94℃0.5～1min，65℃0.5～1min，72℃0.5～2min，其中退火温度从65℃开始每循环降低0.7℃，共12个循环，12个循环后反应条件变为：94℃0.5～1min，56℃0.5～1min，72℃0.5～2min，20～30个循环后，72℃5～15min，AFLP选择性扩增PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳证实有条带后，4～8℃保存，然后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；所述AFLP选择性扩增PCR所用Taq I选择性扩增引物为4条，PstI选择性扩增引物为4-5条，组合成4-20对引物组合。

所述4条Taq I选择性扩增引物分别为：

Taq I选择性扩增引物15′-GATGAGTCCTGAGCGAACG-3′

Taq I选择性扩增引物25′-GATGAGTCCTGAGCGAATG-3′

Taq I选择性扩增引物35′-GATGAGTCCTGAGCGAAGA-3′

Taq I选择性扩增引物45′-GATGAGTCCTGAGCGAAGC-3′

所述4-5条Pst I选择性扩增引物分别为：

Pst I选择性扩增引物15′-GACGGCCGTCATGCAGAGC-3′

Pst I选择性扩增引物25′-GACGGCCGTCATGCAGATG-3′

Pst I选择性扩增引物35′-GACGGCCGTCATGCAGACT-3′

Pst I选择性扩增引物45′-GACGGCCGTCATGCAGAAC-3′

Pst I选择性扩增引物55′-GACGGCCGTCATGCAGATT-3′

所述20对引物组合分为：

1       2       3       4       5       6       7       8       9       10

P1T1    P1T2    P1T3    P1T4    P2T1    P2T2    P2T3    P2T4    P3T1    P3T2

11      12      13      14      15      16      17      18      19      20

P3T3    P3T4    P4T1    P4T2    P4T3    P4T4    P5T1    P5T2    P5T3    P5T4

所述AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色的步骤为：

(1)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

向AFLP选择性扩增PCR产物中加入上样缓冲溶液，所述AFLP选择性扩增PCR产物与上样缓冲溶液的体积比为8∶3制成上样混合物；经60W恒功率预电泳20～50min后，取3～6μl上样混合物加样到6％变性聚丙烯酰胺凝胶上以60W恒功率电泳120～150min，亦即至二甲苯青FF指示带距凝胶底部2～5cm时终止电泳；

(2)变性聚丙烯酰胺凝胶的银染色

1)电泳结束后，取下胶板，放入2L体积百分浓度为10％的冰乙酸水溶液即固定液中固定，充分振荡10～30min或至指示剂完全消失；

2)用超纯水振荡洗胶2～4次，每次2～5min；

3)把凝胶移至2L染色溶液中，染色溶液的成分为含有1g/L硝酸银、1.5ml/L 37％甲醛的水溶液，充分振荡20～40min；

4)从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5～10s，立刻将凝胶转移至1L预冷的显色液中，显色液的成分为含有30g/L碳酸钠、2mg/L硫代硫酸钠、1.5ml/L 37％甲醛的水溶液，充分振荡，直至模板条带开始显现或开始出现第一批条带，倒掉显色液，把新鲜的1L预冷的显色液倒入盘中，使凝胶继续显色2～3min，或直至所有条带出现；

5)待凝胶完全显色后，加入1L固定溶液，振荡2～3min，终止显色反应，固定凝胶；

6)在超纯水中浸洗凝胶2次，每次2～5min；

7)将凝胶置于室温自然干燥，观察并拍片、保存实验结果；

所述差异片段的回收、扩增、克隆、测序及同源相似性检索分析步骤为：

(1)差异片段DNA的回收

用刀片从聚丙烯酰胺凝胶上切下差异条带，放入一干净无菌的离心管中，加入超纯水30～40μl，置沸水浴中10～20min，然后3000～8000r/min离心5～10min，收集上清液备用；

(2)回收差异片段DNA的PCR再扩增

PCR再扩增的反应体系总体积为50μl，其中包括：差异片段DNA的回收上清液7μl，Taq I选择性扩增引物10pmol，Pst I选择性扩增引物10pmol，1×Taq PCR MasterMix，其中1×Taq PCR MasterMix的成分终浓度为：10mmol/L Tris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，250μmol/L dNTP each，2u Taq polymerase，混匀后，按下述条件进行PCR扩增反应：94℃0.5～2min，56～65℃0.5～1min，72℃0.5～2min，25～40个循环后，72℃5～15min，经1.5％琼脂糖凝胶电泳证实有PCR产物，4～8℃保存；

(3)克隆

回收差异片段DNA PCR再扩增产物经纯化后，与pMD18-T载体质粒进行连接，将连接有回收差异片段DNA PCR再扩增产物的T载体质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，使T载体质粒重组子扩增、提取、酶切鉴定，T载体质粒重组子的酶切鉴定反应体系总体积为20μl，其中包括：T载体质粒重组子6μl，Sal I 10u，Xba I 10u，1×buffer，混匀后，37℃1～3h，70℃5～15min；

T载体质粒重组子用Xba I和Sal I内切酶进行酶切，经1.5％的琼脂糖凝胶电泳，可见2681bp和11+差异片段长度bp的两个片段时为阳性质粒重组子，将获得的差异片段DNA-T载体质粒阳性重组子进行测序分析差异片段DNA的核苷酸序列；

(4)同源相似性检索分析

将测序分析得到的DNA核苷酸序列在美国国家生物技术信息中心基因组核酸数据库中进行同源相似性检索分析。

本发明的优点：

本发明的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，为一高效、特异的方法，在全基因组水平筛选出更多的BPDE致癌易感基因，为阐明BPDE的致癌分子机制打下基础。

附图说明

图1为本发明一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法的流程图。

图2为免疫磁性分离程序。

图3为小鼠肺组织基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图。

图4为小鼠肺组织基因组DNA双酶切后琼脂糖凝胶电泳图。

图5为AFLP预扩增PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。

图6为AFLP选择性扩增PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。

图7为不同引物组合选择性扩增PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳条带图谱。

图8为免疫磁性分离AFLP选择性扩增产物(P3T3)PAGE条带图谱。

图9为免疫磁性分离AFLP选择性扩增产物(P5T3、P4T3)PAGE条带图谱。

图10为回收差异条带PCR再扩增产物琼脂糖电泳。

图11为回收差异条带PCR再扩增产物琼脂糖电泳。

图12为T-A克隆的Xba I和Sal I双酶切鉴定。

具体实施方式

研究方法：本研究首次应用扩增片段长度多态性(amplified fragment lengthpolymorphism，AFLP)与免疫纳米磁性分离(immunomagnetic separation，IMS)技术相结合的方法，以小鼠为例，对小鼠全基因组DNA与BPDE相互作用的基因位点进行筛选，对差异片段进行了回收、再扩增、克隆测序及BLAST同源相似性检索分析，获得与差异片段核苷酸序列同源的已知基因或未知核苷酸序列。

本发明的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法的流程见图1。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，包括如下步骤：

(1)从正常肺组织中提取基因组DNA；

(2)AFLP DNA片段的制备：基因组DNA经双酶切获得AFLP DNA片段；

(3)与BPDE相互作用的AFLP DNA片段的免疫磁性富集、分离：AFLP DNA片段与BPDE孵育形成AFLP DNA-BPDE加合物，加入针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒，在磁场作用下，使与BPDE相互作用的AFLP DNA片段的富集并分离出来；

(4)AFLP PCR扩增：AFLP DNA片段与接头的连接，预扩增和选择性扩增；

(5)AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色；

(6)差异片段的回收、扩增、克隆、测序及同源相似性检索分析。

实施例2

小鼠肺组织基因组DNA的提取

1、主要仪器

台式高速冷冻离心机(UNIVERSAL 32R，德国Hettich公司)、Beckman Du530分光光度计(德国Beckman公司)、紫外分析仪(上海康华仪器制造厂)、高纯水装置SCD-II(军事医学科学院卫生装备研究所)

2、主要材料和试剂

BALB/c小鼠(军事医学科学院实验动物中心)、DNA提取试剂盒(北京天为时代)、蛋白酶K(大连宝生物工程有限公司)、无水乙醇(AR，天津市申泰化学试剂有限公司)、琼脂糖(大连宝生物工程有限公司)、DNA Marker(大连宝生物工程有限公司)

3、主要试剂的配制

(1)PBS pH7.4的配制：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，超纯水900ml，调pH值为7.4，加水至1000ml，高压后备用。

(2)10mol/L NaOH的配制：400g NaOH溶于450ml H₂O中，补H₂O至1L。

(3)0.5mol/L EDTA的配制：186.1g Na₂EDTA·2H₂O溶于700ml H₂O中，加热、磁力搅拌使溶解加快，用10mol/LNaOH调至pH8.0(约40ml)，补加H₂O至1L。

(4)5×TBE的配制：54g Tris，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，加水至1L。

4、方法步骤

按DNA提取试剂盒说明书进行以下步骤：

(1)取小鼠肺组织少许，PBS冲洗血液，放入匀浆器后加少许PBS制成细胞悬液，10000r/min离心1min，弃上清。加200μl缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。加入200μl蛋白酶K(20mg/ml)，混匀，置55℃水浴中至组织溶解，约需3h。

(2)加220μl缓冲液GB，混匀，70℃水浴10min，溶液变清亮。

(3)加220μl无水乙醇，混匀，有絮状沉淀出现。

(4)将溶液及沉淀转移至一个吸附柱CB中，将吸附柱CB放入废液收集管，12000r/min 30s，弃滤液。

(5)加入500μl去蛋白液GD，12000r/min离心30s，弃滤液。

(6)加700μl漂洗液GW，12000r/min离心30s，弃滤液。

(7)加500μl漂洗液GW，12000r/min离心30s，弃滤液。

(8)再离心，12000r/min 2min，尽量除去漂洗液。

(9)将CB转入一个干净的离心管中，向CB中加入100μl洗脱缓冲液TE(70℃水浴预热)，混匀，室温放置2～5min，12000r/min 30s。

(10)离心得到的溶液再次加入吸附柱CB中，室温放置2min，12000r/min 2min，得到DNA溶液。

(11)1.5％琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、完整性及产量。

(12)Beckman分光光度计检测DNA纯度及含量，分装成小份，-20℃保存备用。见图3。图中，M：DNA Marker DL2000；1～3：小鼠肺组织基因组DNA

实施例3

双酶切制备AFLP DNA片段

1、主要仪器

电热恒温水浴箱(天津市华北实验仪器厂)

2、主要试剂

小鼠肺组织DNA、Taq I核酸内切酶(美国Invitrogen公司)、Pst I核酸内切酶(美国Invitrogen公司)

3、方法步骤

(1)首先用Taq I内切酶消化。其中设不加核酸内切酶的管作为对照。

反应体系如下：

Taq I          1μl

10×buffer     2μl

0.1％BSA       2μl

DNA       1μl

ddH₂O     14μl

Total     20μl

反应条件：放入恒温水浴箱，65℃恒温水浴消化2h；

(2)然后进行下述操作，向每一反应体系中补加5μl含Pst I的反应液：

Pst I         1μl

10×buffer    2μl

ddH₂O         2μl

Total         5μl

反应体系总体积为25μl；

反应条件：放入恒温水浴箱，于37℃水浴消化2h后，70℃水浴10min灭活核酸内切酶的活性，4℃保存备用。见图4，图中M：DNA Marker DL2000；1～2：DNA对照；3～4：DNA双酶切后。

实施例4

AFLP DNA片段的制备为：

(1)用Taq I消化：准备4个反应体系，每个反应体系总体积为20μl，其中包括：DNA 300ng，Taq I 10u，1×buffer，其中1×buffer的成分终浓度为：50mM Tris-HCl pH 8.0，10mMMgCl₂，50mM NaCl，混匀后，65℃恒温水浴消化1h；

(2)向每一反应体系中补加Pst I 10u，37℃恒温水浴消化1h后，72℃水浴20min灭活酶的活性，6℃保存备用；

(3)1.5％琼脂糖凝胶电泳观察基因组DNA的酶切情况。

实施例5

AFLP DNA片段的制备为：

(1)用Taq I消化：准备6个反应体系，每个反应体系总体积为20μl，其中包括：DNA 300ng，Taq I 10u，1×buffer，其中1×buffer的成分终浓度为：50mM Tris-HCl pH 8.0，10mMMgCl₂，50mM NaCl，混匀后，65℃恒温水浴消化3h；

(2)向每一反应体系中补加Pst I 10u，37℃恒温水浴消化3h后，75℃水浴10min灭活酶的活性，8℃保存备用；

(3)1.5％琼脂糖凝胶电泳观察基因组DNA的酶切情况。

实施例6

与BPDE相互作用的AFLP DNA片段的免疫磁性富集、分离的步骤为：

(一)、免疫纳米磁性颗粒的制备

1、主要材料和试剂

纳米磁颗粒(本实验室自制)、磁分离架(本实验室研制)、BPDE单克隆抗体(monoclonalantibody to benzo(α)pyrene diol epoxide，clone 8E11)(荷兰Hycult公司)、BSA(美国Sigma公司)

2、主要试剂的配制

(1)0.1mol/LpH7.8磷酸缓冲液(PB)的配制：A液(0.2mol/LNa₂HPO₄)：Na₂HPO₄·12H₂O7.164g加水溶解后定容至100ml；B液(0.2mol/LNaH₂PO₄)：NaH₂PO₄·2H₂O 3.121g加水溶解后定容至100ml；A液91.5ml和B液8.5ml混合，调pH值为7.8，即成0.2mol/L PB，稀释一倍，得到0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液(PB)。

(2)PBS pH7.4的配制：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，超纯水900ml，调pH值为7.4，加水定容至1000ml，高压后备用。

3、方法

(1)取裸磁颗粒330μl加入一干净灭菌的1.5ml离心管中。

(2)放入磁分离架中在磁场作用1min，吸弃上清，把离心管移出磁分离架。

(3)重悬裸磁颗粒：取0.1mol/LpH7.8磷酸缓冲液(PB)330μl重悬裸磁颗粒，再加入BPDE单克隆抗体500μl。

(4)室温孵育15min，然后加入BSA至终浓度为0.1％(W/V)。

(5)在避光条件下，4℃孵育过夜，不时轻轻颠倒。

(6)把离心管放入磁分离架作用1min，吸弃上清。

(7)向管中加330μl pH7.4PBS，用移液器枪头轻轻吹打混匀，室温孵育5min，轻轻颠倒。

(8)重复步骤(6)、(7)各2次。

(9)把离心管放入磁分离架作用1min，吸弃上清。

(10)从分离架上取出离心管，加入330μl pH 7.4PBS，重悬磁颗粒-抗体耦合物，即成针对BPDE的免疫纳米磁性颗粒。

(二)、AFLP DNA片段的免疫纳米磁性富集、分离

1、主要试剂

BPDE[Benzo(α)pyrene-r-7，t-8-dihydrodiol-t-9，10-epoxide(±)(anti)](美国国家癌症研究所化学致癌物标准品贮藏室)、四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)(美国Sigma公司)、AFLP DNA片段、针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒

2、主要试剂的配制

BPDE溶液的配制：称BPDE 5.2mg，加入8.6ml THF溶解，即可配制成2mmol/L的BPDE四氢呋喃溶液，-20℃保存备用。

3、方法

(1)纳米磁颗粒免疫分离BPDE-DNA片断：

1)取AFLP DNA片段20μl，共4管，分成4组：免疫磁性特异分离组、免疫磁性非特异吸附组、裸磁颗粒非特异吸附组、正常对照组。

2)为了获得BPDE-DNA片段，参照文献并略做改动，向免疫磁性特异分离组的试管中加入2mmol/L的BPDE 0.5μl，其余各组分别加入0.5μl灭菌超纯水，37℃避光孵育1周。

3)参照文献并略做改动萃取免疫磁性特异分离组中未结合的BPDE，即向免疫磁性特异分离组的管中加入乙酸乙酯和乙醚(10∶4，V∶V)20μl，轻摇混匀，静置3min，除去上层液相，重复2次，然后根据《分子克隆实验指南》中的方法，纯化、沉淀DNA-BPDE，最后加20μl水重悬DNA-BPDE。

4)向免疫磁性特异分离组和免疫磁性非特异吸附组中加入针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒1μl，向裸磁颗粒非特异吸附组中加入裸磁颗粒1μl，向正常对照组中加入灭菌超纯水1μl，室温、避光、轻摇20min。

5)把各试管放入磁分离架上，在磁场作用5min，磁颗粒贴附在管壁一侧，小心吸弃上清液，用灭菌超纯水30μl洗2次，每次3min。

6)加5μl灭菌超纯水溶解，即得到与BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫纳米磁颗粒复合物溶液。

(2)AFLP-DNA片段与磁颗粒的解离

把步骤(1)中得到的盛有与BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫纳米磁颗粒复合物溶液的试管放入沸水浴中10min，然后11000r/min离心10min，收集上清液，即含有与BPDE相互作用的AFLP DNA片段，-20℃冻存备用。步骤见图2。

实施例7

针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒的制备步骤为：

(1)取裸纳米磁颗粒330μl，加入一干净灭菌的1.5ml离心管中；

(2)在磁场作用2min，吸弃上清；

(3)取0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液330μl重悬裸纳米磁颗粒，再加入BPDE单克隆抗体500μl；

(4)20℃孵育20min，然后加入牛血清白蛋白至终浓度为1mg/ml；

(5)在避光条件下，8℃孵育10h，不时轻轻颠倒；

(6)把离心管放入磁分离架作用2min，吸弃上清；

(7)向管中加330μl pH7.4磷酸盐缓冲液，用移液器枪头轻轻吹打混匀，25℃孵育10min，轻轻颠倒；

(8)重复步骤(6)、(7)各2次；

(9)把离心管放入磁分离架作用2min，吸弃上清；

(10)从分离架上取出离心管，加入330μl pH 7.4磷酸盐缓冲液重悬纳米磁颗粒-抗体耦合物，即成针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒；

实施例8

针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒的制备步骤为：

(1)取裸纳米磁颗粒330μl，加入一干净灭菌的1.5ml离心管中；

(2)在磁场作用5min，吸弃上清；

(3)取0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液330μl重悬裸纳米磁颗粒，再加入BPDE单克隆抗体500μl；

(4)25℃孵育10min，然后加入牛血清白蛋白至终浓度为1mg/ml；

(5)在避光条件下，4℃孵育16h，不时轻轻颠倒；

(6)把离心管放入磁分离架作用5min，吸弃上清；

(7)向管中加330μl pH7.4磷酸盐缓冲液，用移液器枪头轻轻吹打混匀，20℃孵育5min，轻轻颠倒；

(8)重复步骤(6)、(7)各2次；

(9)把离心管放入磁分离架作用5min，吸弃上清；

(10)从分离架上取出离心管，加入330μl pH 7.4磷酸盐缓冲液重悬纳米磁颗粒-抗体耦合物，即成针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒；

实施例9

与BPDE相互作用的AFLP DNA片段的免疫磁性富集、分离的步骤为：

(1)纳米磁颗粒免疫分离BPDE-DNA片断：

1)取所述AFLP DNA片段20μl，分成4组放入试管中：免疫磁性特异分离组、免疫磁性非特异吸附组、裸磁颗粒非特异吸附组、正常对照组；

2)向所述免疫磁性特异分离组的试管中加入2mmol/L的BPDE 1μl，其余各组分别加入1μl灭菌超纯水，37℃避光孵育5d；

3)向所述免疫磁性特异分离组的试管中加入体积比为10∶4的乙酸乙酯和乙醚21μl，轻摇混匀，静置1min，除去含有未结合BPDE的上层液相，重复3次，纯化、沉淀DNA-BPDE加合物，加20μl水重悬DNA-BPDE加合物；

4)向所述免疫磁性特异分离组和免疫磁性非特异吸附组中加入针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒1μl，向所述裸磁颗粒非特异吸附组中加入裸磁颗粒1μl，向所述正常对照组中加入灭菌超纯水1μl，室温、避光、轻摇10min；

5)把各试管放入磁分离架上，在磁场作用3min，磁颗粒贴附在管壁一侧，小心吸弃上清液，用灭菌超纯水35μl洗3次，每次2min；

6)加5μl灭菌超纯水溶解，即得到与BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫纳米磁颗粒复合物溶液；

(2)AFLP-DNA片段与磁颗粒的解离

把步骤(1)中得到的放置有与BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫纳米磁颗粒复合物溶液的试管放入沸水浴中13min，然后8000r/min离心5min，收集上清液，使AFLP-DNA片段与抗原抗体磁颗粒复合物解离，即获得含有与BPDE相互作用的AFLPDNA片段，-20℃冻存备用。

实施例10

与BPDE相互作用的AFLP DNA片段的免疫磁性富集、分离的步骤为：

(1)纳米磁颗粒免疫分离BPDE-DNA片断：

1)取所述AFLP DNA片段20μl，分成4组放入试管中：免疫磁性特异分离组、免疫磁性非特异吸附组、裸磁颗粒非特异吸附组、正常对照组；

2)向所述免疫磁性特异分离组的试管中加入2mmol/L的BPDE2μl，其余各组分别加入2μl灭菌超纯水，37℃避光孵育3d；

3)向所述免疫磁性特异分离组的试管中加入体积比为10∶4的乙酸乙酯和乙醚22μl，轻摇混匀，静置4min，除去含有未结合BPDE的上层液相，重复4次，纯化、沉淀DNA-BPDE加合物，加20μl水重悬DNA-BPDE加合物；

4)向所述免疫磁性特异分离组和免疫磁性非特异吸附组中加入针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒2μl，向所述裸磁颗粒非特异吸附组中加入裸磁颗粒2μl，向所述正常对照组中加入灭菌超纯水2μl，室温、避光、轻摇30min；

5)把各试管放入磁分离架上，在磁场作用2min，磁颗粒贴附在管壁一侧，小心吸弃上清液，用灭菌超纯水40μl洗4次，每次5min；

6)加5μl灭菌超纯水溶解，即得到与BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫纳米磁颗粒复合物溶液；

(2)AFLP-DNA片段与磁颗粒的解离

把步骤(1)中得到的放置有与BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫纳米磁颗粒复合物溶液的试管放入沸水浴中15min，然后10000r/min离心8min，收集上清液，使AFLP-DNA片段与抗原抗体磁颗粒复合物解离，即获得含有与BPDE相互作用的AFLPDNA片段，-20℃冻存备用。

实施例11

AFLP PCR扩增

1、主要仪器

PCR仪(Mastercycler personal 5332，德国Eppendorf公司)

2、主要材料和试剂

(1)与BPDE相互作用的AFLP DNA片段〔从步骤(二)获得〕。

(2)人工接头由宝生物工程(大连)有限公司DNA合成中心合成，包括核心序列及限制性内切酶特定序列两部分。

         核心序列               酶特定序列

Taq I接头5′-GACGATGAGTCCTGA    G  -3′

3′-TACTCAGGACT                 CGC-5′

Pst I接头5′-GACGTGACGGCCGTC    ATGCA-3′

3′-GCACTGCCGGCAG               T   -5′

(3)T4DNA连接酶(400u/μl)(NEB，New England BioLabs)

(4)根据接头序列设计AFLP预扩增引物及选择性扩增引物，引物包括三部分，即5′端与人工接头序列互补的核心序列(core sequence，CORE)、限制性内切酶特定序列(enzyme-specificsequence，ENZ)和3′端有选择性碱基的粘性末端(selective extention，EXT)，预扩增引物有一个选择碱基，选择性扩增引物有三个选择碱基。引物由宝生物工程(大连)有限公司DNA合成中心合成。

AFLP预扩增引物：

核心序列      酶特定序列        选择碱基

Taq I预扩增引物5′-GATGAGTCCTGAG    CGA      A-3′

Pst I预扩增引物5′-GACGGCCGTCA      TGCAG    A-3′

选择性扩增引物：

                      核心序列             酶特定序列   选择碱基

Taq I选择性扩增引物1  5′-GATGAGTCCTGAG    CGA          ACG-3′

Taq I选择性扩增引物2  5′-GATGAGTCCTGAG    CGA          ATG-3′

Taq I选择性扩增引物3  5′-GATGAGTCCTGAG    CGA          AGA-3′

Taq I选择性扩增引物4  5′-GATGAGTCCTGAG    CGA          AGC-3′

Pst I选择性扩增引物1  5′-GACGGCCGTCA      TGCAG        AGC-3′

Pst I选择性扩增引物2  5′-GACGGCCGTCA      TGCAG        ATG-3′

Pst I选择性扩增引物3  5′-GACGGCCGTCA      TGCAG        ACT-3′

PstI选择性扩增引物4   5′-GACGGCCGTCA      TGCAG        AAC-3′

PstI选择性扩增引物5   5′-GACGGCCGTCA      TGCAG        ATT-3′

选择性扩增引物两两组合可形成20对引物组合，如下：

1       2       3       4       5       6       7       8       9       10

P1T1    P1T2    P1T3    P1T4    P2T1    P2T2    P2T3    P2T4    P3T1    P3T2

11      12      13      14      15      16      17      18      19      20

P3T3    P3T4    P4T1    P4T2    P4T3    P4T4    P5T1    P5T2    P5T3    P5T4

(5)2×Taq PCR MasterMix(北京天为时代)

3、主要试剂的配制

接头和引物的溶解及稀释：向盛接头或引物的管内加10倍接头或引物nmol数体积的ddH₂O溶解接头或引物，然后取1μl至另管，加19μl ddH₂O，结果，每μl液体中含接头或引物为5pmol，即接头或引物的浓度为5μmol/L。

4、方法

(1)AFLP-DNA片段与接头的连接

连接反应体系：

10×buffer       2μl

AFLP-DNA片段     5μl

T4 DNA ligase    1μl

Taq I接头        1μl

PstI接头         0.4μl

ddH₂O            10.6μl

Total            20μl

连接反应条件：

22℃ 2h，70℃ 10min，4℃保存。

(2)AFLP预扩增PCR

AFLP预扩增PCR反应体系：

Taq I预扩增引物         1μl

Pst I预扩增引物         1μl

连接产物                1μl

2×Taq PCR MasterMix    12.5μl

ddH₂O                   9.5μl

Total                   25μl

AFLP预扩增PCR反应体系终浓度为：

10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)

50mmol/L KCl

1.5mmol/L MgCl₂

250μmol/L dNTP each

1u Taq polymerase/10μl

AFLP预扩增PCR反应条件：

1.94℃ 3min；

2.94℃ 30s，

3.56℃ 60s，

4.72℃ 60s，

5.go to 2，repeat 23 cycles；

6.72℃ 10min.

7.4℃  hold.

AFLP预扩增PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳证实有弥散条带出现后，稀释20倍，4℃保存备用。见图5，图中，M：DNA Marker DL2000；1：正常对照组；2：裸磁颗粒非特异吸附组；3：免疫磁性非特异吸附组；4：免疫磁性特异分离组

(3)AFLP选择性扩增PCR

AFLP选择性扩增PCR反应体系：

预扩增产物稀释液         1μl

Taq I选择性扩增引物      1μl

Pst I选择性扩增引物      1μl

2×Taq PCR MasterMix     12.5μl

ddH₂O                    9.5μl

Total                    25μl

AFLP选择性扩增PCR反应条件：

1.94℃ 3min；

2.94℃ 30s，

3.65℃ 30s(-0.7℃/cycle)，

4.72℃ 60s，

5.go to 2，repeat 12 cycles；

6.94℃ 30s，

7.56℃ 60s，

8.72℃ 60s，

9.go to 6，repeat 22 cycles；

10.72℃ 10min；

11.4℃  Hold.

AFLP选择性扩增PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳证实有条带见图6，然后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。图中，M：DNA Marker DL2000；1：正常对照组；2：裸磁颗粒非特异吸附组；3：免疫磁性非特异吸附组；4：免疫磁性特异分离组

实施例12

AFLP PCR 扩增：

(1)AFLP-DNA片段与接头的连接：

连接反应体系总体积为20μl，其中包括：AFLP-DNA片段5μl，Taq I接头5pmol，Pst I接头2pmol，T₄ DNA ligase 400u，1×buffer，其中1×buffer的成分终浓度为：50mMTris-HCl，10mM MgCl₂，10mM DTT，1mMATP，25μg/ml BSA，pH 7.5；连接反应条件为：16～25℃ 1～4h，70℃ 5～15min，4～8℃保存；所述

Taq I接头为    5′-GACGATGAGTCCTGA G  -3′

               3′-TACTCAGGACT CGC-5′

Pst I接头为    5′-GACGTGACGGCCGTC ATGCA-3′

               3′-GCACTGCCGGCAG T    -5′

(2)AFLP预扩增PCR：

AFLP预扩增PCR反应体系总体积为20μl，其中包括：从所述步骤(1)获得的连接产物1μl，Taq I预扩增引物5pmol，Pst I预扩增引物5pmol，1×TaqPCR MasterMix，其中1×Taq PCR MasterMix的成分终浓度为：10mmol/L Tris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，250μmol/L dNTP each，2u Taq polymerase，混匀后，按下述条件进行PCR扩增反应：94℃ 0.5～1min，56℃ 0.5～2min，72℃ 0.5～2min，20～40个循环后，72℃ 5～15min，AFLP预扩增pCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳证实有弥散条带出现后，稀释20～50倍，4～8℃保存备用；所述

Taq I预扩增引物为：5′-GATGAGTCCTGAG CGAA-3′

Pst I预扩增引物为：5′-GACGGCCGTCA TGCAG A-3′

(3)AFLP选择性扩增PCR

AFLP选择性扩增PCR反应体系总体积为20μl，其中包括：AFLP预扩增PCR产物稀释液1μl，Taq I选择性扩增引物5pmol，PstI选择性扩增引物5pmol，1×Taq PCRMasterMix，其中1×Taq PCR MasterMix的成分终浓度为：10mmol/L Tris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，250μmol/L dNTP each，2u Taq polymerase，混匀后，按下述条件进行PCR扩增反应：94℃ 0.5～1min，65℃ 0.5～1min，72℃ 0.5～2min，其中退火温度从65℃开始每循环降低0.7℃，共12个循环，12个循环后反应条件变为：94℃0.5～1min，56℃ 0.5～1min，72℃ 0.5～2min，20～30个循环后，72℃ 5～15min，AFLP选择性扩增PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳证实有条带后，4～8℃保存，然后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；所述AFLP选择性扩增PCR所用Taq I选择性扩增引物为4条，Pst I选择性扩增引物为4-5条，组合成4-20对引物组合，(可以选下面的4-20中的任何对的引物组合完成本发明成为新的实施例)

所述4条Taq I选择性扩增引物分别为：

Taq I选择性扩增引物1  5′-GATGAGTCCTGAGCGAACG-3′

Taq I选择性扩增引物2  5′-GATGAGTCCTGAGCGAATG-3′

Taq I选择性扩增引物3  5′-GATGAGTCCTGAGCGAAGA-3′

Taq I选择性扩增引物4  5′-GATGAGTCCTGAGCGAAGC-3′

所述4-5条Pst I选择性扩增引物分别为：

Pst I选择性扩增引物1  5′-GACGGCCGTCATGCAGAGC-3′

Pst I选择性扩增引物2  5′-GACGGCCGTCATGCAGATG-3′

Pst I选择性扩增引物3  5′-GACGGCCGTCATGCAGACT-3′

Pst I选择性扩增引物4  5′-GACGGCCGTCATGCAGAAC-3′

Pst I选择性扩增引物5  5′-GACGGCCGTCATGCAGATT-3′

所述20对引物组合分为：

1       2       3       4       5       6       7       8       9       10

P1T1    P1T2    P1T3    P1T4    P2T1    P2T2    P2T3    P2T4    P3T1    P3T2

11      12      13      14      15      16      17      18      19      20

P3T3    P3T4    P4T1    P4T2    P4T3    P4T4    P5T1    P5T2    P5T3    P5T4

不同引物组合选择性扩增PCR产物聚丙烯酰胺凝胶电泳条带见图7，图中，

1：P1T2；2：P1T1；3：P1T4；4：P1T3；5：P2T1；6：P3T3；7：P2T2；M：pBR322 DNA/MspIMarker；8：P3T4；9：P4T1；10：P2T3；11：P4T2；12：P4T3；13：P2T4；14：P4T4；15：P5T1；16：P5T2；17：P5T3；18：P5T4；19：P3T1；20：P3T2

免疫磁性分离AFLP选择性扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳见图8，图中，M：pBR322DNA/MspI Marker；1：正常对照组；2：裸纳米磁颗粒非特异吸附组；3：免疫纳米磁颗粒非特异吸附组；4～7：免疫纳米磁颗粒特异分离组；注：箭头所示为差异片段条带位置。

免疫磁性分离AFLP选择性扩增产物(P5T3、P4T3)PAGE条带见图9，图中，

M：pBR322 DNA/MspI Marker；84、77：正常对照组；83、76：裸纳米磁颗粒非特异吸附组；82、75：免疫纳米磁颗粒非特异吸附组；71～74、78～81：免疫纳米磁颗粒特异分离组；图中清楚可见有差异片段条带出现。

实施例  13

AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色的步骤为：

(一)、AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(变性PAGE)

1、主要仪器

电脑三恒多用电泳仪DYY-12型(北京六一电泳仪厂)、DNA序列分析电泳槽DXCZ-20B(北京六一电泳仪厂)

2、主要试剂

亲和硅烷(PlusOne Bind-Silane)(Amersham Bioscience，Sweden)、疏水硅烷(PlusOneRepel-Silane ES)(Amersham Bioscience，Sweden)、冰乙酸(glacial acetic acid)(GR，天津市永大化学试剂开发中心)、95％乙醇(AR，天津市申泰化学试剂有限公司)、无水乙醇(AR，天津市申泰化学试剂有限公司)、Tris碱(Tris base)(AR，美国Genview公司，北京鼎国分装)、硼酸(boric acid)(AR，天津市化学试剂六厂)、Na₂EDTA·2H₂O(美国Amresco公司)、丙烯酰胺(acrylamide)(Ultra Pure＞99.9％，BBI原装，Canada)、双丙烯酰胺(bis-acrylamide)(Ultra Pure＞99.0％，BBI原装，Canada)、尿素(urea)(Ultra Pure＞99.5％，美国Amresco公司)、过硫酸铵(ammonium persulfate；APS)(AR，长沙欧麦公司)、TEMED(tetramethylethylenedia mine；四甲基乙二胺)(AR，上海生工)、甲酰胺(formamide)(HPLC级，上海生工)、溴酚蓝(bromophenol blue)(AR，Sanland-chemInternational Inc.)、二甲苯兰FF(AR，xylene cyanol FF，美国Sigma公司)

3、溶液配制     10×TBE：

                Tris 碱                  108g

                硼酸                     55g

                0.5mol/L EDTA(pH8.0)     40ml

                ddH₂O to                 1000ml

30％丙烯酰胺储存液：

               丙烯酰胺                  28.5g

               双丙烯酰胺                1.5g

               ddH₂O to                  100ml

               G3砂芯漏斗过滤，          store at 4℃

6％凝胶储存液：

               Urea                      63g

               10×TBE                   15ml

               30％丙烯酰胺储存液        30ml

               ddH₂O to                  150ml

               store at4℃.

10％过硫酸铵：

               过硫酸铵                  1g

               ddH₂O to                  10ml

                store  at 4℃.

95％乙醇-0.5％冰乙酸：

                95％乙醇        99.5ml

                冰乙酸          0.5ml

甲酰胺上样缓冲液(98％)：

                甲酰胺98ml

                0.5mol/LEDTA    2ml

                溴酚蓝          0.25g

                二甲苯兰FF      0.25g

4、方法步骤

(1)玻璃板准备：

每次铺胶前均需分别严格处理平玻璃板和凹玻璃板，硅化玻璃板操作过程中应戴手套且在通风橱中进行。

1)平玻璃板准备：按下述程序进行：

a.加2μl亲和硅烷到1ml 95％乙醇-0.5％冰乙酸中。

b.把亲和硅烷溶液滴到平玻璃板上，用擦镜纸轻拭擦匀整块平玻璃板面。

c.4～5min后，加2ml 95％乙醇到平玻璃板上，用擦镜纸向一个方向轻轻擦拭，然后，垂直方向略用力擦拭。重复2次，每次均须换用干净的纸，以除去多余的粘合溶液。

2)凹玻璃板准备：

a.一定要更换手套，防止交叉污染亲和硅烷溶液，否则会导致凝胶撕裂。

b.滴加1ml疏水硅烷溶液于凹玻璃板上，擦镜纸轻轻擦匀。

c.5～10min后，加2ml 95％乙醇于玻璃板上，先单方向擦拭玻璃板，然后再按与原来垂直的方向擦拭。重复1次。

(2)凝胶准备：

1)制做胶室：把平玻璃板水平放置，沿其长缘把0.4mm厚压片放好，然后，将凹玻璃板压于其上，用夹子固定于两侧。调整夹子，使鲨鱼齿梳子能方便地插入。水平仪调节水平。

2)制备6％凝胶液：取50ml 6％凝胶储液至干净烧杯中，加热至室温，加入250μl 10％过硫酸铵和25μl TEMED，立即轻轻搅动混匀并避免产生气泡。

3)灌制胶板：立刻用50ml注射器抽取6％凝胶液，使注射器头始终位于液面下，将凝胶沿着压片边缘缓慢地注射到两玻璃板之间的空隙中，溶液靠毛细作用向胶室底端移动，保持溶液流连续，避免形成气泡，一旦形成气泡，用手或注射器柄轻敲玻璃板使气泡移出，否则会影响电泳结果。将剩下的凝胶溶液于4℃保存，减缓聚合速度。

4)制作加样槽：胶室灌满后，立即插入鲨鱼齿梳子的平缘至胶内5mm左右，小心勿使梳子下形成气泡，用2个夹子夹住胶室顶端，使玻璃板与压片和梳子贴紧，以防加样时漏样。插入鲨鱼齿梳子时动作要快，若凝胶开始聚合，则鲨鱼齿梳子将很难插入。检查是否有凝胶泄漏，若需要可用剩下的凝胶溶液将胶室灌满。

5)凝胶聚合：静止放置使凝胶聚合，若凝胶有明显回缩，可再添加些凝胶溶液。使用前，凝胶至少聚合2h，梳子下出现Schlieren线时，标志聚合反应已经完成。若聚合过夜，用浸透1×TBE的滤纸覆盖梳子和玻璃板的底端，以防凝胶变干。

(3)加样及电泳

1)除去固定玻璃板的夹子，清除梳子周围的聚丙烯酰胺凝胶，用ddH₂O冲洗板的顶端，洗净未聚合的丙烯酰胺和滤出的尿素，小心轻轻地取出鲨鱼齿梳子，不要拉扯凝胶顶部，用ddH₂O冲洗加样槽。用水清洗梳子，以供下面使用。

2)将胶板固定在电泳槽中，稀释10×TBE至1×TBE，约1 100ml，加入上下两个电泳槽中，用吸管吸取1×TBE冲洗加样槽，以去除可能存在的未聚合丙烯酰胺，并避免加样槽内形成气泡。

3)预电泳：接上电源，用60W恒功率预电泳30min，预电泳时，在加样槽上方用注射器吸取电泳缓冲液把析出的尿素向两侧吹赶。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度，可防止GC丰富区形成发夹结构。

4)30min后，切断电源。用1×TBE冲洗加样槽，进一步除去尿素。把鲨鱼齿梳子有齿的一头插入加样槽至胶内约1mm，形成加样孔。

5)样品制备：预电泳时，即可进行样品的制备。PCR扩增产物∶甲酰胺上样缓冲液按8∶3(V∶V)混合，95℃变性8min，然后立即置冰浴中冷却。

6)加样：立即用移液枪吸取3～5μl样品，加入样品孔中。加样枪头应在缓冲液槽中冲洗几次后，再吸另一样品。加样时速度要快，但不要产生气泡，以防吹出样品。加样完毕后，立即电泳。

7)电泳：60W恒功率电泳，观察指示剂的迁移情况，以确定电泳时间，约150min。跑胶10min后可移去梳子。

8)电泳结束后，排尽缓冲液，卸下胶板，小心分开两块玻璃板，凝胶应牢固地附着在平玻璃板上，放入银染固定液中固定。

(二)、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的银染：

1、主要仪器和材料

塑料方盘4～6个，约50cm×35cm×8cm大小、脱色摇床(哈尔滨东联电子)

2、主要试剂

冰乙酸(glacial acetic acid)(GR，天津市永大化学试剂开发中心)、硝酸银(silver nitrate)(ACS＞99.0％，BBI原装，Canada)、37％甲醛(formaldehyde)(ACS 36％～38％，BBI原装，Canada)、无水碳酸钠(sodium carbonate，anhydrous)(ACS＞99.5％，美国Amresco公司)、硫代硫酸钠(sodium thiosulfate)(AR，天津市苏庄化学试剂厂)

3、溶液配制 

银染固定液(10％冰乙酸)：

冰乙酸    200ml

ddH₂O    1800ml

银染染色液(1g/L硝酸银，0.056％甲醛)：

硝酸银        2g

37％甲醛      3ml

ddH₂O to      2L

银染显色液(30g/L碳酸钠，0.056％甲醛，2mg/L硫代硫酸钠)：

无水碳酸钠   60g

ddH₂O to     2L

冷却至4～10℃。在临用前立即向碳酸钠溶液中加入3ml 37％甲醛和400μl 10mg/ml硫代硫酸钠溶液，既成显色液。

4、染色程序

染色过程要求凝胶浸在塑料盘内的溶液中，因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前必须用高质量的水洗涤盘子。

(1)电泳结束后卸下胶板，用手术刀片小心地分开两块玻璃板，去掉压片，凝胶应该牢固地附着在平玻璃板上。

(2)固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定溶液2L浸没，充分振荡20min或至样品中指示剂完全消失。胶亦可在固定溶液中保存过夜(不要振荡)。保留固定溶液，以备用于终止显色反应。

(3)洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次3min。从水中取出，在进行下一步洗涤之前，拿着胶板边缘静止10～20s，使水流尽，再进行下一步操作。

(4)凝胶染色：往染色盘中倒入2L染色液，把凝胶移至染色溶液中，充分振荡40min。

(5)凝胶显色：

1)显色液的配制：在上一步即将结束时，向预冷至4～10℃的碳酸钠溶液中加入37％甲醛3ml和10mg/ml的硫代硫酸钠溶液400μl，既成显色液。往显色盘中倒入预冷的显色液1L，放在一边，其余显色液仍放在冰浴中。把凝胶从染色液中取出，放在一边，染色液回收到烧杯中，盘清洗后加入超纯水。

2)从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5～10s。注意，把凝胶从超纯水中转移到显色溶液中时动作要快，总时间不能长于5～10s。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长，可重复用染色液浸泡染色。

3)立刻将凝胶转移至1L(总量的一半)预冷的显色液中，充分振荡，直至模板条带开始显现或开始出现第一批条带，倒掉显色液，把新鲜的1L显色液倒入盘中，使凝胶继续显色2～3min，或直至所有条带出现。

(6)终止显色反应：弃掉显色液，加入1L固定溶液，置摇床上反应2～3min，终止显色反应，固定凝胶。

(7)洗胶：在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2min。注意：在本操作中应戴手套拿着胶板边缘，避免在胶上印上指纹。

(8)干胶：将凝胶置于室温干燥，观察并照相、扫描保留实验结果。

实施例14

AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色的步骤为：

(1)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

1)向AFLP选择性扩增PCR产物中加入上样缓冲溶液，所述AFLP选择性扩增PCR产物与上样缓冲溶液的体积比为8∶3制成上样混合物；经60W恒功率预电泳20min后，取3μl上样混合物加样到6％变性聚丙烯酰胺凝胶上以60W恒功率电泳150min，亦即至二甲苯青FF指示带距凝胶底部2cm时终止电泳；

(2)变性聚丙烯酰胺凝胶的银染色

1)电泳结束后，取下胶板，放入2L体积百分浓度为10％的冰乙酸水溶液即固定液中固定，充分振荡10min或至指示剂完全消失；

2)用超纯水振荡洗胶4次，每次2min；

3)把凝胶移至2L染色溶液中，染色溶液为含有1g/L硝酸银、1.5ml/L 37％甲醛的水溶液，充分振荡20min；

4)从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5s，立刻将凝胶转移至1L预冷的显色液中，显色液为含有30g/L碳酸钠、2mg/L硫代硫酸钠、1.5ml/L 37％甲醛的水溶液，充分振荡，直至模板条带开始显现或开始出现第一批条带，倒掉显色液，把新鲜的1L预冷的显色液倒入盘中，使凝胶继续显色3min，或直至所有条带出现；

5)待凝胶完全显色后，加入1L固定溶液，振荡3min，终止显色反应，固定凝胶；

6)在超纯水中浸洗凝胶2次，每次5min；

7)将凝胶置于室温自然干燥，观察并拍片、保存实验结果；

实施例15

AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色的步骤为：

(1)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

1)向AFLP选择性扩增PCR产物中加入上样缓冲溶液，所述AFLP选择性扩增PCR产物与上样缓冲溶液的体积比为8∶3制成上样混合物；经60W恒功率预电泳50min后，取6μl上样混合物加样到6％变性聚丙烯酰胺凝胶上以60W恒功率电泳120min，亦即至二甲苯青FF指示带距凝胶底部5cm时终止电泳；

(2)变性聚丙烯酰胺凝胶的银染色

1)电泳结束后，取下胶板，放入2L体积百分浓度为10％的冰乙酸的水溶液为固定液，充分振荡30min或至指示剂完全消失；

2)用超纯水振荡洗胶2次，每次5min；

3)把凝胶移至2L染色溶液中，染色溶液为含有1g/L硝酸银、1.5ml/L 37％甲醛的水溶液，充分振荡40min；

4)从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗10s，立刻将凝胶转移至1L预冷的显色液中，显色液为含有30g/L碳酸钠、2mg/L硫代硫酸钠、1.5ml/L 37％甲醛的水溶液，充分振荡，直至模板条带开始显现或开始出现第一批条带，倒掉显色液，把新鲜的1L预冷的显色液倒入盘中，使凝胶继续显色2min，或直至所有条带出现；

5)待凝胶完全显色后，加入1L固定溶液，振荡2min，终止显色反应，固定凝胶；

6)在超纯水中浸洗凝胶2次，每次2min；

7)将凝胶置于室温自然干燥，观察并拍片、保存实验结果；

实施例16

差异片段的回收、扩增、克隆、测序及同源相似性检索分析步骤为：

(1)差异片段DNA的回收

用刀片从聚丙烯酰胺凝胶上切下差异条带，放入一干净无菌的离心管中，加入超纯水35μl，置沸水浴中15min，然后5000r/min离心7min，收集上清液备用；

(2)回收差异片段DNA的PCR再扩增

PCR再扩增的反应体系总体积为50μl，其中包括：差异片段DNA的回收上清液7μl，Taq I选择性扩增引物10pmol，Pst I选择性扩增引物10pmol，1×Taq PCR MasterMix，其中1×Taq PCR MasterMix的成分终浓度为：10mmol/L Tris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，250μmol/L dNTP each，2u Taq polymerase，混匀后，按下述条件进行PCR扩增反应：94℃ 0.5min，56℃ 1min，72℃ 0.5min，25个循环后，72℃ 15min，经1.5％琼脂糖凝胶电泳证实有PCR产物，8℃保存；

(3)克隆

回收差异片段DNA PCR再扩增产物经纯化后，与pMD18-T载体质粒进行连接，将连接有回收差异片段DNA PCR再扩增产物的T载体质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，使T载体质粒重组子扩增、提取、酶切鉴定，T载体质粒重组子的酶切鉴定反应体系总体积为20μl，其中包括：T载体质粒重组子6μl，Sal I 10u，Xba I 10u，1×buffer，混匀后，37℃ 3h，70℃ 5min；

T载体质粒重组子用Xba I和Sal I内切酶进行酶切，经1.5％的琼脂糖凝胶电泳，可见2681bp和11+差异片段长度bp的两个片段时为阳性质粒重组子，将获得的差异片段DNA-T载体质粒阳性重组子进行测序分析差异片段DNA的核苷酸序列；

(4)同源相似性检索分析

将测序分析得到的DNA核苷酸序列在美国国家生物技术信息中心基因组核酸数据库中进行同源相似性检索分析。

实施例17

片段的回收、扩增、克隆、测序及同源相似性检索分析步骤为：

(1)差异片段DNA的回收

用刀片从聚丙烯酰胺凝胶上切下差异条带，放入一干净无菌的离心管中，加入超纯水40μl，置沸水浴中20min，然后8000r/min离心10min，收集上清液备用；

(2)回收差异片段DNA的PCR再扩增

PCR再扩增的反应体系总体积为50μl，其中包括：差异片段DNA的回收上清液7μl，Taq I选择性扩增引物10pmol，Pst I选择性扩增引物10pmol，1×Taq PCR MasterMix，其中1×Taq PCR MasterMix的成分终浓度为：10mmol/L Tris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，250μmol/L dNTP each，2u Taq polymerase，混匀后，按下述条件进行PCR扩增反应：94℃ 2min，65℃ 0.5min，72℃ 2min，40个循环后，72℃ 5min，经1.5％琼脂糖凝胶电泳证实有PCR产物，4℃保存；

(3)克隆

回收差异片段DNA PCR再扩增产物经纯化后，与pMD18-T载体质粒进行连接，将连接有回收差异片段DNA PCR再扩增产物的T载体质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，使T载体质粒重组子扩增、提取、酶切鉴定，T载体质粒重组子的酶切鉴定反应体系总体积为20μl，其中包括：T载体质粒重组子6μl，Sal I 10u，Xba I 10u，1×buffer，混匀后，37℃ 1h，70℃ 15min；

T载体质粒重组子用Xba I和Sal I内切酶进行酶切，经1.5％的琼脂糖凝胶电泳，可见2681bp和11+差异片段长度bp的两个片段时为阳性质粒重组子，将获得的差异片段DNA-T载体质粒阳性重组子进行测序分析差异片段DNA的核苷酸序列；

(4)同源相似性检索分析

将测序分析得到的DNA核苷酸序列在美国国家生物技术信息中心基因组核酸数据库中进行同源相似性检索分析。

实施例18

差异片段的回收、扩增、克隆、测序及同源相似性检索分析步骤为：

(一)、差异片段的回收和扩增

1、主要仪器和材料

PCR仪(同前)

电泳仪(同前)

2、主要试剂

Taq PCR MasterMix(同前)

PCR扩增引物(同前)

3、方法

(1)差异片段DNA的回收

1)仔细观察银染后的聚丙烯酰胺凝胶上免疫磁性特异分离组、免疫磁性非特异吸附组、裸磁颗粒非特异吸附组、空白对照组各泳道上的条带分布，找出免疫磁性特异分离组与免疫磁性非特异吸附组和裸磁颗粒非特异吸附组之间的差异条带。

2)用锋利的手术刀片直接从聚丙烯酰胺凝胶上切下差异条带，放入一干净无菌的离心管中。

3)向管中加入超纯水30μl，置沸水浴中10min。

4)3000r/min离心5min，收集上清液备用。

(2)回收差异片段DNA的PCR再扩增

由于PAGE的样品上样量较少，从片段中回收的差异片段DNA的量亦较少，故需对回收产物进行PCR再扩增，所用引物与该产物AFLP-PCR选择性扩增的引物相同。

PCR再扩增的反应体系：

回收产物上清液            7μl

Taq I选择性扩增引物       2μl

Pst I选择性扩增引物       2μl

Taq PCR MasterMix         25μl

H₂O                       14μl

Total                     50μl

PCR再扩增的反应条件：

1)94℃       2min

2)94℃       30s

3)60℃       30s

4)72℃       1min

5)Go to 2)，repeat 39 cycles

6)72℃       10min

7)4℃        hold

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳观察是否有回收产物。见图10和图11，图10中，M：DNA Marker DL2000其余泳道为不同差异条带的回收再扩增产物。

图11中，中间为DNA Marker DL2000；其余泳道为不同差异条带的回收再扩增产物。

(二)、差异片段的克隆和测序

1、主要仪器

紫外分析仪(同前)

电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)

台式高速冷冻离心机(同前)

2、主要试剂

回收DNA片段PCR再扩增产物

TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(大连宝生物公司)

T载体质粒：pMD18-T vector(大连宝生物公司)

X-gal(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside)(大连宝生物公司)

IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)(大连宝生物公司)

E.coli competent cell DH5α(大连宝生物公司)

质粒提取试剂盒(美国Promega公司)

3、主要试剂的配制

(1)LB培养基(pH＝7.2)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加超纯水至1000ml，加碳酸钠调pH至7.2，高压消毒后备用。

(2)5％X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)：溶解25mg的X-gal于1ml的二甲基甲酰胺(DMF)，用铝箔包裹装液管，-20℃冻存备用。

(3)氨苄青霉素(ampicillin)(100mg/ml)：溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装后于-20℃贮存。以25～50μg/ml的终浓度添加于生长培养基。

4、方法

(1)回收DNA片段PCR再扩增产物的回收和纯化

1)用1×TBE缓冲液配制1.5％的琼脂糖凝胶，然后对目的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，约35min。

2)在紫外分析仪中观察凝胶中DNA条带的位置，与预计大小相符时，用锋利刀片切下含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的电泳缓冲液，并尽量切除多余的凝胶，减小凝胶体积，提高DNA的回收率。

3)称量凝胶块的重量，根据1mg＝1μl计算凝胶块的体积。

4)切碎胶块，可缩短回收时间，提高DNA回收率。

5)向胶块中加入胶块溶合融化液DR-I buffer，加入DR-I buffer的量是凝胶块体积的4倍。

6)混合均匀后，置75℃水浴中加热融化胶块，约10min，此间应间断振荡混合，使胶块充分融化。否则，会严重影响DNA的回收率。

7)向上述胶块融化液中加入DR-I buffer 1/2体积量的DR-II buffer，混合均匀。当回收片段小于400bp时，应在此溶液中再加入终浓度为20％的异丙醇。

8)将Spin Column柱装入Collection管中。

9)将步骤7)中的溶液转移到Spin Column柱中，12000r/min离心1min，弃滤液。如将滤液再加入到Spin Column柱中离心一次，可提高DNA的回收率。

10)将500μl的Rinase A加入到Spin Column柱中，12000r/min离心30s，弃滤液。

11)将700μl的Rinase B加入到Spin Column柱中，12000r/min离心30s，弃滤液。

12)重复步骤11)。

13)将Spin Column柱安装到新的1.5ml离心管中，向Spin Column柱膜的中央处滴加预热到60℃的灭菌超纯水25μl，室温静置1min。

14)12000r/min离心1min洗脱DNA，收集洗脱液(含有差异片段DNA)分装冻存备用。

(2)差异片段的克隆和测序

1)T载体简介

pMD18-TVector是一种高效克隆PCR产物(TA cloning)的专用载体，由pUC18载体改建而成，在pUC18、pUC19载体的多克隆位点处导入了EcoRV识别位点，使用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用这种载体可以进行PCR产物的连接和克隆。

2)T-A连接与克隆

①T-A连接

连接反应体系：在冰水浴中向200μl PCR管中加入以下成份并混匀，以H₂O代替纯化的PCR产物进行连接反应为阴性对照。

pMD18-T Vector(50ng/μl)  1μl

差异片段DNA回收洗脱液     1μl

连接液Solution I          5μl

H₂O                       3μl

Total                     10μl

连接反应条件：16℃ 30min，-20℃保存备用。

②用T-A连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌

a.用冷却的无菌吸头取200μl感受态细胞悬液，转移到无菌1.5ml离心管中，再加入T-A连接产物或阴性对照组的连接产物10μl，轻轻旋转混匀，在冰水浴中放置30min。

b.将离心管放到42℃水浴中，热冲击1min，不要摇动离心管。

c.快速将离心管转移到冰水浴中，使细胞冷却2min。

d.每管加800μl LB培养基，37℃轻摇(转速不超过225r/min)1h；以使细胞复苏并增加感受效率。

e.取100μl转化液涂抹含有X-Gal、IPTG和Amp的L-琼脂平板培养基，置于37℃至液体被吸收后倒置平板，于37℃培养，12-16h后可出现菌落。pMD18-T Vector和差异DNA片段结合成阳性重组子，其菌落为白色，pMD18-T Vector自身环化成阴性重组子，其菌落为蓝色。

③T-A克隆的扩增与提取

a.从平板上挑一个白色或蓝色单菌落，加入含Amp的LB培养基中，37℃振摇培养过夜，直至菌液明显混浊。

b.吸取菌液5ml于EP管中，室温，10000×g离心1min。

c.弃上清，将细菌沉淀以250μl Solution I(含RNAase)重悬，吹打并剧烈振荡以混匀细菌。

d.温和加入Solution II 250μl，轻柔颠倒混合数次，室温放置5min，可见菌液完全清亮。

e.温和加入Solution III 350μl，轻柔颠倒混合至见白色絮状沉淀；室温12000×g离心10min。

f.将上清小心转移至吸附柱中(勿吸白色沉淀)，然后将吸附柱置入试剂盒所配的2mlEP管中，室温10000×g离心1min。

g.弃滤液，在吸附柱中加入500μl Buffer HB，室温10000×g离心1min。

h.弃滤液，向吸附柱中加750μl wash buffer，室温10000×g离心1min，使溶液过柱。重复此步骤一次。

i.室温10000×g离心2min，彻底除去wash buffer。

j.把吸附柱放入无菌的1.5ml EP管中，加无菌水30μl于吸附柱中。

k.室温10000×g离心1min，此时滤液中含有T-A连接所形成的质粒。

④T-A克隆的酶切鉴定

pMD18-T Vector的T克隆位点位于Xba I和Sal I两个酶切位点之间，二者之间为11bp，用这两种酶进行双酶切时，产生2681bp和11bp两个片段，在1.5％的琼脂糖凝胶电泳时，由于11bp的片段太小，只能看到2681bp的条带，如将DNA片段成功插入T克隆位点后再进行双酶切，电泳时则可见2681bp和11+差异片段长度bp的两个片段。

见图12，图中M：100bp DNA Ladder Marker；1：阳性重组质粒；2：阴性重组质粒酶切反应体系：

10×buffer    2μl

重组质粒      6μl

Sal I         1μl

Xba I         1μl

ddH₂O         10μl

Total         20μl

酶切反应条件：37℃  2h。

然后经1.5％琼脂糖凝胶电泳观察。将获得的差异片段DNA-T载体阳性重组子送交北京Invitrogen公司进行测序分析差异片段DNA的核苷酸序列。

共获得125条差异片段DNA的核苷酸序列，将测序分析得到的DNA核苷酸序列在美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)中的全基因组核酸数据库中进行BLAST(basic local alignment search tool，基本局部相似性查询工具)相似性检索分析，与数据库中所有已知序列相比，寻找与待查序列有足够相似性的序列，以提供功能相似的估计，或者确定该序列在基因组中是一个新的序列。把新的未知核苷酸序列向GenBank申请提交注册。

现举例说明.

如25-1序列：

tcctatatag ctactgcctg tctctcacct cctcaatgct aatcatgctc aggtcttcca    60

ggccattagt gctgaaatag ggctgccaag ggttaatgag tcctggctcc ctctgttctc    120

atctctttag agggacaagc tggccctagg ctctatctag cctgtgggac aggtaaccaa    180

ggagcacggg tgagagttgc agaacccaag tcaaagacta cagggatggg tcctctcatc    240

tttactcaga gggaacctgt agtatagatg ctgtctgttc aggagcaccg ttcgctcagg    300

actcatca 308

经BLAST相似性检索分析后，其对应的基因是已知基因Ngfb(nerve growth factor，beta[Mus musculus]，GeneID：18049)和Tspan2(tetraspanin 2[Mus musculus]，GeneID：70747)。如25-3序列：

ccagcactgg gtgctctgtg aatacttaaa agattccagc ccgtcttttc ctgcttctct   60

ctgggtgatt cttattttta tctcctccac aacttcctac ttaattttaa ctttccgttc  120

cctcctggct ggtttatatt ccaggaggct ctatgctatt cagttcctta tgactccttc  180

taacagcgtt cgctcaggac tcatca    206

经BLAST相似性检索分析后，其对应的基因是未知功能的已知基因2410003L11Rik RIKENcDNA 2410003L11 gene[Mus musculus]，GeneID：69729。

如38-3序列：

gacggccgtc atgcagactc aatgcaatcc ccattaaaat tccaactcaa ttattcaacg     60

aattagaagg agcaatttgc aaattcatct ggaataacaa aaaaccgagg atagcaaaaa    120

ctcttctcaa gggtaaaaga acctctggtg gaatcaccat gccagaccta aagctttatt    180

acagagcaat tgtgataaaa actgcatggt actggtatag agacagacaa gtggaccaat    240

ggaatagaat tgaagaccca ggaatgaacc cacacaccta tggtcgcttg atcttcgctc    300

aggactcatc  310

经BLAST相似性检索分析后，该序列为与已知基因没有同源相似性的核苷酸序列，已向GenBank提交注册为新序列，该序列在GenBank的基因登录号为EF473141。

实施例19

研究结果：

1、以扩增片段长度多态性(AFLP)和免疫磁性分离(IMS)相结合，成功建立了基于小鼠全基因组的高效、特异筛选BPDE致癌相关基因的方法。

2、成功获得了清晰的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳条带图谱和与BPDE作用的差异DNA片段条带图谱，并成功对差异片段进行了回收、扩增、克隆测序，共获得125条差异片段DNA的核苷酸序列。

3、经BLAST分析发现：有193条已知基因与差异片段核苷酸序列有同源性，主要为信号转导及通路、生长发育、血管生成、免疫及炎性反应、转录调控、细胞分化等方面的基因和一些未知功能的基因。有6条未知核苷酸序列，向GenBank提交注册，已被GenBank接受为新序列并给予相应的基因登录号：分别为EF176681、EF473140、EF473141、EF473142、EF473143、EF473144。这些基因和序列有可能是与BPDE致癌相关的基因序列。

研究结论：

1、扩增片段长度多态性(AFLP)和免疫磁性分离(IMS)技术相结合的方法，适用于在小鼠全基因组筛选BPDE致癌相关基因。

2、AFLP与IMS技术相结合，共获得125条差异片段DNA的核苷酸序列。经BLAST分析发现：有193条已知基因与差异片段核苷酸序列有同源性，有6条未知核苷酸序列，这些基因和序列有可能是与BPDE致癌相关的基因和序列。

Claims (8)

1.BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，包括如下步骤：

(1)从正常肺组织中提取基因组DNA；

(2)AFLP DNA片段的制备：基因组DNA经双酶切获得AFLP DNA片段；

(3)与BPDE相互作用的AFLP DNA片段的免疫磁性富集、分离：AFLP DNA片段与BPDE孵育形成AFLP DNA-BPDE加合物，加入针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒，在磁场作用下，使与BPDE相互作用的AFLP DNA片段富集并分离出来；

(4)AFLP PCR扩增：AFLP DNA片段与接头的连接，预扩增和选择性扩增；

(5)AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色；

(6)差异片段的回收、扩增、克隆、测序及同源相似性检索分析。

2.根据权利要求1所述的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，其特征是所述AFLPDNA片段的制备为：

(1)用Taq I消化：准备4-6个反应体系，每个反应体系总体积为20μl，其中包括：DNA 300ng，Taq I 10u，1×buffer，其中1×buffer的成分终浓度为：50mM Tris-HCl pH 8.0，10mM MgCl₂，50mM NaCl，混匀后，65℃恒温水浴消化1～3h；

(2)向每一反应体系中补加Pst I 10u，37℃恒温水浴消化1～3h后，70～75℃水浴10～20min灭活酶的活性，4～8℃保存备用；

(3)1.5％琼脂糖凝胶电泳观察基因组DNA的酶切情况。

3.根据权利要求1所述的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，其特征是所述与BPDE相互作用的AFLP DNA片段的免疫磁性富集、分离的步骤为： 

(1)纳米磁颗粒免疫分离BPDE-DNA片段：

1)取所述AFLP DNA片段20μl，分成4组放入试管中：免疫磁性特异分离组、免疫磁性非特异吸附组、裸磁颗粒非特异吸附组、正常对照组；

2)向所述免疫磁性特异分离组的试管中加入2mmol/L的BPDE 0.5～2μl，其余各组分别加入0.5～2μl灭菌超纯水，37℃避光孵育3～7d；

3)向所述免疫磁性特异分离组的试管中加入体积比为10∶4的乙酸乙酯和乙醚20～22μl，轻摇混匀，静置1～4min，除去含有未结合BPDE的上层液相，重复2～4次，纯化、沉淀DNA-BPDE加合物，加20μl水重悬DNA-BPDE加合物；

4)向所述免疫磁性特异分离组和免疫磁性非特异吸附组中加入针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒0.5～2μl，向所述裸磁颗粒非特异吸附组中加入裸磁颗粒0.5～2μl，向所述正常对照组中加入灭菌超纯水0.5～2μl，室温、避光、轻摇10～30min；

5)把各试管放入磁分离架上，在磁场作用2～5min，磁颗粒贴附在管壁一侧，小心吸弃上清液，用灭菌超纯水30～40μl洗2～4次，每次2～5min；

6)加5μl灭菌超纯水溶解，即得到与BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫纳米磁颗粒复合物溶液； 

(2)AFLP-DNA片段与磁颗粒的解离 

把步骤(1)中得到的放置有与BPDE相互作用的AFLP DNA片段免疫纳米磁颗粒复合物溶液的试管放入沸水浴中10～15min，然后8000～11000r/min离心5～10min，收集上清液，使AFLP-DNA片段与抗原抗体磁颗粒复合物解离，即获得含有与BPDE相互作用的AFLP DNA片段，-20℃冻存备用。 

4.根据权利要求3所述的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，其特征是所述针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒的制备步骤为： 

(1)取裸纳米磁颗粒330μl，加入一干净灭菌的1.5ml离心管中； 

(2)在磁场作用2～5min，吸弃上清； 

(3)取0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液330μl重悬裸纳米磁颗粒，再加入BPDE单克隆抗体500μl； 

(4)20～25℃孵育10～20min，然后加入牛血清白蛋白至终浓度为1mg/ml； 

(5)在避光条件下，4～8℃孵育10～16h，不时轻轻颠倒； 

(6)把离心管放入磁分离架作用2～5min，吸弃上清； 

(7)向管中加330μl pH7.4磷酸盐缓冲液，用移液器枪头轻轻吹打混匀，20～25℃孵育5～10min，轻轻颠倒； 

(8)重复步骤(6)、(7)各2次； 

(9)把离心管放入磁分离架作用2～5min，吸弃上清； 

(10)从分离架上取出离心管，加入330μl pH 7.4磷酸盐缓冲液重悬纳米磁颗粒-抗体耦合物，即成针对BPDE抗原的免疫纳米磁性颗粒。 

5.根据权利要求1所述的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，其特征是所述AFLPPCR扩增的步骤为： 

(1)AFLP-DNA片段与接头的连接： 

连接反应体系总体积为20μl，其中包括：AFLP-DNA片段5μl，Taq I接头5pmol，Pst I接头2pmol，T₄ DNA ligase 400u，1×buffer，其中1×buffer的成分终浓度为：50mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，10mM DTT，1mM ATP，25μg/ml BSA，pH 7.5；连接反应条件为：16～25℃1～4h，70℃5～15min，4～8℃保存；所述 

Taq I接头为  5′-GACGATGAGTCCTGA G  -3′ 

             3′-TACTCAGGACT CGC-5′ 

Pst I接头为  5′-GACGTGACGGCCGTC ATGCA-3′ 

             3′-GCACTGCCGGCAG T    -5′ 

(2)AFLP预扩增PCR： 

AFLP预扩增PCR反应体系总体积为20μl，其中包括：从所述步骤(1)获得的连接产物1μl，Taq I预扩增引物5pmol，Pst I预扩增引物5pmol，1×Taq PCR MasterMix， 其中1×Taq PCR MasterMix的成分终浓度为：10mmol/L Tris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，250μmol/L dNTP each，2u Taq polymerase，混匀后，按下述条件进行PCR扩增反应：94℃ 0.5～1min，56℃ 0.5～2min，72℃ 0.5～2min，20～40个循环后，72℃ 5～15min，AFLP预扩增PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳证实有弥散条带出现后，稀释20～50倍，4～8℃保存备用；所述 

Taq I预扩增引物为：5′-GATGAGTCCTGAG CGA A-3′ 

Pst I预扩增引物为：5′-GACGGCCGTCA TGCAG A-3′ 

(3)AFLP选择性扩增PCR 

AFLP选择性扩增PCR反应体系总体积为20μl，其中包括：AFLP预扩增PCR产物稀释液1μl，Taq I选择性扩增引物5pmol，Pst I选择性扩增引物5pmol，1×Taq PCRMasterMix，其中1×Taq PCR MasterMix的成分终浓度为：10mmol/L Tris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，250μmol/L dNTP each，2u Taq polymerase，混匀后，按下述条件进行PCR扩增反应：94℃ 0.5～1min，65℃ 0.5～1min，72℃ 0.5～2min，其中退火温度从65℃开始每循环降低0.7℃，共12个循环，12个循环后反应条件变为：94℃ 0.5～1min，56℃ 0.5～1min，72℃ 0.5～2min，20～30个循环后，72℃ 5～15min，AFLP选择性扩增PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳证实有条带后，4～8℃保存，然后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；所述AFLP选择性扩增PCR所用Taq I选择性扩增引物为4条，Pst I选择性扩增引物为4-5条，组合成4-20对引物组合。 

6.根据权利要求5所述的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，其特征是所述4条Taq I选择性扩增引物分别为：

Taq I选择性扩增引物1 5′-GATGAGTCCTGAGCGAACG-3′

Taq I选择性扩增引物2 5′-GATGAGTCCTGAGCGAATG-3′

Taq I选择性扩增引物3 5′-GATGAGTCCTGAGCGAAGA-3′

Taq I选择性扩增引物4 5′-GATGAGTCCTGAGCGAAGC-3′

所述4-5条Pst I选择性扩增引物分别为：

Pst I选择性扩增引物1 5′-GACGGCCGTCATGCAGAGC-3′

Pst I选择性扩增引物2 5′-GACGGCCGTCATGCAGATG-3′

Pst I选择性扩增引物3 5′-GACGGCCGTCATGCAGACT-3′

Pst I选择性扩增引物4 5′-GACGGCCGTCATGCAGAAC-3′

Pst I选择性扩增引物5 5′-GACGGCCGTCATGCAGATT-3′

所述20对引物组合分别为：

1       2       3       4       5       6       7       8       9       10

P1T1    P1T2    P1T3    P1T4    P2T1    P2T2    P2T3    P2T4    P3T1    P3T2

11      12      13      14      15      16      17      18      19      20

P3T3    P3T4    P4T1    P4T2    P4T3    P4T4    P5T1    P5T2    P5T3    P5T4。

7.根据权利要求1所述的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，其特征是所述 AFLP选择性扩增PCR产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染色的步骤为： 

(1)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 

向AFLP选择性扩增PCR产物中加入上样缓冲溶液，所述AFLP选择性扩增PCR产物与上样缓冲溶液的体积比为8∶3制成上样混合物；经60W恒功率预电泳20～50min后，取3～6μl上样混合物加样到6％变性聚丙烯酰胺凝胶上以60W恒功率电泳120～150min，亦即至二甲苯青FF指示带距凝胶底部2～5cm时终止电泳； 

(2)变性聚丙烯酰胺凝胶的银染色 

1)电泳结束后，取下胶板，放入2L体积百分浓度为10％的冰乙酸水溶液即固定液中固定，充分振荡10～30min或至指示剂完全消失； 

2)用超纯水振荡洗胶2～4次，每次2～5min； 

3)把凝胶移至2L染色溶液中，染色溶液的成分为含有1g/L硝酸银、1.5ml/L 37％甲醛的水溶液，充分振荡20～40min； 

4)从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5～10s，立刻将凝胶转移至1L预冷的显色液中，显色液的成分为含有30g/L碳酸钠、2mg/L硫代硫酸钠、1.5ml/L 37％甲醛的水溶液，充分振荡，直至模板条带开始显现或开始出现第一批条带，倒掉显色液，把新鲜的1L预冷的显色液倒入盘中，使凝胶继续显色2～3min，或直至所有条带出现； 

5)待凝胶完全显色后，加入1L固定溶液，振荡2～3min，终止显色反应，固定凝胶； 

6)在超纯水中浸洗凝胶2次，每次2～5min； 

7)将凝胶置于室温自然干燥，观察并拍片、保存实验结果。 

8.根据权利要求1所述的一种BPDE致癌相关基因的全基因组筛选方法，其特征是所述差异片段的回收、扩增、克隆、测序及同源相似性检索分析步骤为： 

(1)差异片段DNA的回收 

用刀片从聚丙烯酰胺凝胶上切下差异条带，放入一干净无菌的离心管中，加入超纯水30～40μl，置沸水浴中10～20min，然后3000～8000r/min离心5～10min，收集上清液备用； 

(2)回收差异片段DNA的PCR再扩增 

PCR再扩增的反应体系总体积为50μl，其中包括：差异片段DNA的回收上清液7μl，Taq I选择性扩增引物10pmol，Pst I选择性扩增引物10pmol，1×Taq PCR MasterMix，其中1×Taq PCR MasterMix的成分终浓度为：10mmol/L Tris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，250μmol/L dNTP each，2U Taq polymerase，混匀后，按下述条件进行PCR扩增反应：94℃ 0.5～2min，56～65℃ 0.5～1min，72℃ 0.5～2min，25～40个循环后，72℃ 5～15min，经1.5％琼脂糖凝胶电泳证实有PCR产物，4～8℃保存； 

(3)克隆 

回收差异片段DNA PCR再扩增产物经纯化后，与pMD18-T载体质粒进行连接，将连接有回收差异片段DNA PCR再扩增产物的T载体质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，使T载体质粒重组子扩增、提取、酶切鉴定，T载体质粒重组子的酶切鉴定反应体系总体积为 20μl，其中包括：T载体质粒重组子6μl，Sal I 10u，Xba I 10u，1×buffer，混匀后，37℃ 1～3h，70℃ 5～15min； 

T载体质粒重组子用Xba I和Sal I内切酶进行酶切，经1.5％的琼脂糖凝胶电泳，可见2681bp和11+差异片段长度bp的两个片段时为阳性质粒重组子，将获得的差异片段DNA-T载体质粒阳性重组子进行测序分析差异片段DNA的核苷酸序列； 

(4)同源相似性检索分析 

将测序分析得到的DNA核苷酸序列在美国国家生物技术信息中心基因组核酸数据库中进行同源相似性检索分析。 

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