CN113980993B - Mal33基因缺失在提高酿酒酵母对木质纤维素水解液抑制物耐受性中的应用 - Google Patents

Mal33基因缺失在提高酿酒酵母对木质纤维素水解液抑制物耐受性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及MAL33基因缺失在提高酿酒酵母对木质纤维素水解液抑制物耐受性中的应用，属于生物工程领域。本发明提供了一株MAL33基因缺失的酿酒酵母菌株，对乙酸耐受性大幅度提高；对木质纤维素水解液中其它典型抑制物和H2O2的耐受性也有提高；在3.5 g/L乙酸的葡萄糖木糖培养基（YPDX）中的延滞期缩短了24 h，葡萄糖和木糖共利用产乙醇的发酵周期缩短了20 h；在含有混合抑制物的葡萄糖木糖培养基（YPDX）中的生长、葡萄糖和木糖共发酵产乙醇情况均优于对照菌株；为提高酿酒酵母对木质纤维素水解液中的抑制物耐受性提供了方法，为克服二代燃料乙醇生产中技术瓶颈提供了理论依据。

Description

MAL33基因缺失在提高酿酒酵母对木质纤维素水解液抑制物 耐受性中的应用
技术领域
本发明涉及MAL33基因缺失在提高酿酒酵母对木质纤维素水解液抑制物耐受性中的应用，属于生物工程领域。
背景技术
近年来，利用丰富、廉价的木质纤维素原料（如农业废弃物、林业废弃物等）生产的二代燃料乙醇有望替代不可再生的化石能源，可以缓解当前世界的能源危机，减少环境污染，受到各国的广泛关注。木质纤维素原料经过预处理、酶解等过程释放可被酿酒酵母等微生物利用的六碳糖和五碳糖等糖分，还产生了各种抑制物，包括弱酸类、呋喃类和酚类化合物。
弱酸类主要包括甲酸、乙酸和乙酰丙酸，乙酸是木质纤维素预处理液中的典型抑制物，乙酸含量最高，预处理手段不同，乙酸浓度也不同，大致浓度范围在1-10 g/L之间，乙酸对细胞产生不利影响：（1）引起DNA损伤，导致DNA和RNA合成速率以及代谢活性降低；（2）为维持正常的生长环境，通过水解ATP获得足够能量驱动质子泵，从而排出胞内大量积累的H+，这个过程会消耗大量ATP，用于细胞代谢的ATP就会供应不足，从而导致细胞活性降低，并最终影响微生物的发酵过程；（3）容易引起ROS积累，导致细胞程序性死亡；（4）还会影响膜结构，抑制胞内翻译。
呋喃类抑制物主要是糠醛和HMF，浓度一般在0-5 g/L之间。HMF对参与糖酵解和三羧酸循环等其他代谢过程中的酶（如乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶和丙酮酸脱氢酶等）产生抑制，降低发酵过程中葡萄糖和木糖的转化率；酿酒酵母将呋喃类抑制物转化为相应的醇化合物过程中消耗大量的辅酶，容易造成胞内氧化还原的失衡，导致细胞产生ATP的能力降低；糠醛能够诱导酿酒酵母中活性氧ROS 的积累，引发细胞程序性死亡，降低乙醇得率。
酚类化合物主要由木质素在高温酸解等预处理过程中分解产生，它们通常是含苯环的芳香族化合物。酚类抑制物通过破坏细胞膜的完整性和线粒体膜的电化学梯度，进而影响细胞膜的选择性和通透性。因此，提高酿酒酵母对木质纤维素水解液中的抑制物耐受性对于二代燃料乙醇的发展和应用至关重要。
MAL33基因参与麦芽糖代谢，是调节麦芽糖通透酶基因MAL31和麦芽糖酶基因MAL32表达的转录因子，在提高酿酒酵母对乙酸和H2O2耐受性方面的尚无报道，也没有关于该基因提高酿酒酵母对木质纤维素水解液抑制物耐受性的相关报道。
发明内容
利用木质纤维素原料生产二代燃料乙醇过程中，存在酿酒酵母对木质纤维素水解液中的抑制物耐受性较低的问题，本发明提供了MAL33基因缺失在提高酿酒酵母对木质纤维素水解液抑制物的耐受性中的应用。
本发明的技术方案如下：
MAL33基因缺失对木质纤维素水解液抑制物的耐受性中的应用，所述的MAL33基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
酿酒酵母的MAL33基因缺失方法包括MAL33基因敲除片段的扩增，MAL33基因敲除片段转化酿酒酵母和转化子的验证等步骤。
上述MAL33基因的缺失可以提高酿酒酵母对乙酸的耐受性。
上述MAL33基因的缺失可以提高酿酒酵母对木质纤维素水解液中其它典型抑制物和H2O2的耐受性。
上述MAL33基因缺失的酿酒酵母可以提高对木质纤维素水解液中混合抑制物的耐受性。
所述的其他典型抑制物为香草醛、甲酸、HMF或乙酰丙酸。
本发明提供了一株酿酒酵母MAL33基因缺失菌株，实验证实该缺失菌株对乙酸耐受性大幅度提高；敲除MAL33基因也能提高酵母对其它抑制物的耐受性，同时还能提高对H2O2的耐受性；MAL33基因缺失菌株在3.5 g/L乙酸的葡萄糖木糖培养基（YPDX）中的延滞期缩短了24 h，葡萄糖和木糖共利用产乙醇的发酵周期缩短了20 h，为构建高乙酸抗性的酿酒酵母细胞提供了基础；在含有混合抑制物的葡萄糖木糖培养基（YPDX）中的生长、葡萄糖和木糖共发酵产乙醇情况均优于对照菌株，本发明为提高酿酒酵母对木质纤维素水解液中的抑制物耐受性提供了重要方法，为克服二代燃料乙醇生产中技术瓶颈提供了理论依据。
本发明具有如下技术效果：
（1）能提高酵母对乙酸的耐受性。
（2）能提高酿酒酵母对木质纤维素水解液中其它典型抑制物和H2O2的耐受性。
（3）能提高酿酒酵母在含有3.5 g/L乙酸的混糖培养基YPDX中的生长，延滞期缩短了24 h，葡萄糖和木糖共发酵产乙醇的周期缩短20 h。
（4）能提高酿酒酵母在含有木质纤维素水解液中混合抑制物（含有0.68 g/L乙酸、0.23 g/L甲酸、0.58 g/L乙酰丙酸、0.48 g/L糠醛、0.63 g/L HMF和0.76 g/L香草醛）的混糖培养基YPDX中的生长及葡萄糖和木糖共发酵产乙醇。
附图说明
图 1 为实施例1中MAL33基因上游同源臂和下游同源臂的PCR扩增结果图。M：DL5000 DNA marker；1：利用引物UPS-MAL33-F和UPS-MAL33-R进行PCR扩增获得的MAL33基因上游同源臂；2：利用引物DOS-MAL33-F和DOS-MAL33-R进行PCR扩增获得的MAL33基因下游同源臂。
图2为实施例1中loxP-KanMX4-loxP基因片段的PCR扩增结果图。M：DL5000 DNAmarker；1：利用引物KanMX4-F和KanMX4-R进行PCR扩增获得的G418抗性基因loxP-KanMX4- loxP的基因片段。
图3为实施例1中MAL33基因敲除片段。M：DL5000 DNA marker；1：利用引物UPS-MAL33-F和DOS-MAL33-R，进行融合PCR获得MAL33基因敲除片段。
图4为实施例1中转化子的PCR验证图。M：DL5000 DNA marker；1：以转化子基因组DNA为模板，利用引物UPS-MAL33-F和DOS-MAL33-R，进行PCR验证。
图5为实施例2中MAL33基因缺失菌株BSPX051-3XI-mal33△和对照菌株BSPX051-3XI在含有3 g/L乙酸的YPD培养基中的生长曲线测定。
图6为实施例2中MAL33基因缺失菌株BSPX051-3XI-mal33△和对照菌株BSPX051-3XI在含有其它抑制物和H2O2的YPD平板上的梯度生长测试。
图7为实施例2中MAL33基因缺失菌株BSPX051-3XI-mal33△和对照菌株BSPX051-3XI在含有3.5 g/L乙酸的YPDX培养基中进行限氧摇瓶发酵的生长曲线测定。
图8为实施例2中MAL33基因缺失菌株BSPX051-3XI-mal33△和对照菌株BSPX051-3XI在含有3.5 g/L乙酸的YPDX培养基中进行限氧摇瓶发酵，对葡萄糖、木糖的消耗和乙醇产生情况分析。
图9为实施例2中MAL33基因缺失菌株BSPX051-3XI-mal33△和对照菌株BSPX051-3XI在含有混合抑制物的YPDX培养基中进行限氧摇瓶发酵的生长曲线测定。
图10为实施例2中MAL33基因缺失菌株BSPX051-3XI-mal33△和对照菌株BSPX051-3XI在含有混合抑制物的YPDX培养基中进行限氧摇瓶发酵，对葡萄糖、木糖的消耗和乙醇产生情况分析。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，是本发明的较佳实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中涉及的培养基和实验材料概述：
1.培养基
YPD培养基：20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母粉，20 g/L葡萄糖；固体培养基加20 g/L琼脂粉，115°C灭菌30 min。用作筛选培养基时，可以加入终浓度为200 ug/mL的G418。用作发酵培养基时，加入终浓度为3 g/L的乙酸。
YPDX培养基：20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母粉，20 g/L葡萄糖，20 g/L木糖； 115°C灭菌30 min。用作发酵培养基时，加入终浓度为3.5 g/L的乙酸。
2. 酶与试剂
PCR扩增所用DNA聚合酶为Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase（P502-d1）和DL5000 DNA marker，购自于南京诺唯赞生物科技有限公司（Vazyme），其它所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径获得。
实施例1：MAL33基因缺失酵母菌株的构建
1.酿酒酵母基因组的提取
将酿酒酵母BY4741菌株过夜培养于5mL YPD培养基中，收集菌体，提取BY4741基因组DNA。
2. 基因敲除片段的扩增
（1）MAL33上游同源臂和下游同源臂的扩增：以酿酒酵母BY4741的基因组DNA为模板，利用引物UPS-MAL33-F（5’-AATGGTCACTCCAAGTAACGGTATTGTGATTTCAACAGAA-3’）和UPS-MAL33-R（5’-TATTAAGGGTTGTCGACCTGATCTTGACAACTGAGCTCTTTCACAC-3’）（下划线为与loxP- KanMX4-loxP片段上游同源的序列，用于与loxP-KanMX4-loxP进行融合PCR），以及DOS-MAL33-F（5’- TGATATCAGATCCACTAGTGTAGGACCCTCATCACAATGATT -3’）（下划线部分为与loxP-KanMX4-loxP下游同源序列，用于与loxP-KanMX4-loxP融合PCR）和DOS-MAL33-R（5’-TGAACTCAGAGAAATGGAATTGGGGTGCTA-3’）分别进行PCR扩增获得500 bp左右的带有G418抗性基因loxP-KanMX4-loxP部分序列的MAL33基因上游同源臂和MAL33基因下游同源臂，PCR扩增条件为95℃预变性 10 min，95℃变性15 s，52℃退火15 s，72℃延伸 30 s，30个循环，72℃终延伸5 min。
（2）G418抗性基因loxP-KanMX4-loxP的扩增：以pUG6质粒为模板，以KanMX4-F（5’-AGCTGAAGCTTCGTACGCTG -3’）和KanMX4-R（5’- GCATAGGCCACTAGTGGATCTG-3’）为引物进行PCR扩增，获得1500 bp左右的带有loxP位点的基因片段loxP-KanMX4-loxP。
（3）MAL33上下游同源臂与loxP-KanMX4-loxP融合PCR扩增：分别以带有MAL33基因的上下游同源臂和loxP-KanMX4-loxP为模板，利用引物UPS-MAL33-F和DOS-MAL33-R，进行融合PCR，扩增获得2600 bp左右的MAL33基因敲除片段，PCR扩增条件为95℃预变性10 min，95℃变性15 s，52℃退火15 s，72℃延伸3 min 50 s，30个循环，72℃终延伸5 min。
3. MAL33基因敲除片段转化酿酒酵母：
利用醋酸锂转化法将融合PCR扩增得到的MAL33基因敲除片段转入酿酒酵母BSPX051-3XI中，在含有200 μg/mLG418的YPD平板上进行筛选，初步获得MAL33基因缺失的转化子。
4. 转化子的PCR验证：从筛选平板上挑取单菌落，在含有200 μg/mL G418的YPD液体培养基中于30°C，200 rpm培养12~24 h，提取转化子基因组DNA，以基因组DNA为模板，以UPS-MAL33-F和DOS-MAL33-R为引物进行PCR验证。PCR扩增条件为95℃预变性10 min，95℃变性15 s，52℃退火15 s，72℃延伸3 min 50 s，30个循环，72℃终延伸5 min。PCR扩增出大约2600 bp左右的条带，说明MAL33基因被成功敲除，得到MAL33基因缺失菌株BSPX051-3XI-mal33△。
实施例2：MAL33基因缺失菌株对乙酸、其他典型抑制物和H2O2的耐受性测试
1. MAL33基因缺失菌株在含有3 g/L乙酸的YPD培养基中的限氧摇瓶发酵情况评估
挑取MAL33基因缺失菌株BSPX051-3XI-mal33△和对照菌株BSPX051-3XI的单菌落，接种到5 mL YPD液体培养基，于30℃摇床中200 rpm活化培养12 h~24 h，待菌液浑浊后再转接至5 mL新鲜培养基中进行第二次活化，活化时间为12 h~24 h。将活化的种子液接种至装有30 mL YPD +3 g/L乙酸培养基的限氧瓶中，调整起始OD600为0.2，在30 ℃，200 rpm的摇床中进行限氧摇瓶发酵，每隔几小时取样，利用紫外可见分光光度计发酵液的OD600，图5结果显示，BSPX051-3XI-mal33Δ的生长明显好于BSPX051-3XI，说明敲除MAL33基因能提高酿酒酵母乙酸耐受性。
2.MAL33基因缺失菌株在含有木质纤维素水解液其它抑制物和H2O2的YPD
平板上的生长情况评估
挑取MAL33基因缺失菌株BSPX051-3XI-mal33△和对照菌株BSPX051-3XI的单菌落接种到YPD中，30℃中振荡活化培养两次，过夜培养，取对数生长期后期的菌体，离心收集并用无菌水清洗菌体3次后悬浮于1 mL无菌水中，置于30℃培养箱中温育9 h消耗内源性营养物质以便制备休止细胞。调节菌体休止细胞浓度使其悬液OD600为1左右，10倍梯度稀释三个梯度（100，10-1，10-2，10-3），取4 μL点滴于含有3 g/L乙酸的YPD平板，于30℃中培养2~3天观察菌落生长情况，拍照保存结果，图6结果所示，BSPX051-3XI-mal33△在含有木质纤维素水解液其它典型抑制物（如香草醛、甲酸、HMF和乙酰丙酸）的YPD平板上生长略好于对照菌株BSPX051-3XI，说明敲除MAL33基因也能提高酵母对木质纤维素水解液其它典型抑制物的耐受性。同时BSPX051-3XI-mal33△在含有H2O2的平板上生长优于对照菌株，说明敲除MAL33基因也能提高酵母对H2O2的耐受性。
实施例3：MAL33基因缺失菌株在含有3.5 g/L乙酸的混糖培养基和含有混合抑制物的混糖培养基中的限氧摇瓶情况评估
1. MAL33基因缺失菌株在含有3.5 g/L乙酸的YPDX培养基中的限氧摇瓶发酵情况评估
挑取MAL33基因缺失菌株BSPX051-3XI-mal33△和对照菌株BSPX051-3XI的单菌落，接种到5 mL YPD液体培养基，于30 ℃摇床中200 rpm活化培养12 h~24 h，待菌液浑浊后再转接至5 mL新鲜培养基中进行第二次活化，活化时间为12h~24 h。将活化的种子液接种至装有30 mL含有3.5 g/L乙酸的YPDX培养基中，调整起始OD600为0.2，在30 ℃，200 rpm的摇床中进行限氧摇瓶发酵，每隔几小时取样，利用紫外可见分光光度计发酵液的OD600，利用高效液相色谱（HPLC）分析发酵产物中的葡萄糖、木糖消耗情况和乙醇产生情况。图7结果显示，BSPX051-3XI-mal33△在含有3.5 g/L乙酸的YPDX培养基中发酵延滞期明显缩短，生长明显好于对照菌株BSPX051-3XI；HPLC分析结果（图8）表明，BSPX051-3XI-mal33△在28 h内利用完葡萄糖，而BSPX051-3XI在48 h才消耗完；BSPX051-3XI-mal33△的木糖消耗和产乙醇能力也明显高于对照菌株，说明敲除MAL33基因可以提高酿酒酵母在含有乙酸的葡萄糖和木糖中的生长，同时能加快酿酒酵母利用葡萄糖和木糖产乙醇。
2. MAL33基因缺失菌株在含有木质纤维素水解液混合抑制物的YPDX培养基中的限氧摇瓶发酵情况评估
挑取MAL33基因缺失菌株BSPX051-3XI-mal33△和对照菌株BSPX051-3XI的单菌落，接种到5 mL YPD液体培养基，于30 ℃摇床中200 rpm活化培养12 h~24 h，待菌液浑浊后再转接至5 mL新鲜培养基中进行第二次活化，活化时间为12h~24 h。将活化的种子液接种至装有30 mL含有混合抑制物（含有0.68 g/L乙酸、0.23 g/L甲酸、0.58 g/L乙酰丙酸、0.48 g/L糠醛、0.63 g/L HMF和0.76 g/L香草醛）的YPDX培养基中，调整起始OD600为0.2，在30 ℃，200 rpm的摇床中进行限氧摇瓶发酵，每隔几小时取样，利用紫外可见分光光度计发酵液的OD600，利用高效液相色谱（HPLC）分析发酵产物中的葡萄糖、木糖消耗情况和乙醇产生情况。图9结果显示，BSPX051-3XI-mal33△在含有混合抑制物的YPDX培养基中生长明显好于对照菌株BSPX051-3XI；HPLC分析结果（图10）表明，BSPX051-3XI-mal33△在葡萄糖和木糖消耗和产乙醇能力也明显高于对照菌株，说明敲除MAL33基因可以提高酿酒酵母在含有木质纤维素水解液混合抑制物中的生长，同时能加快葡萄糖和木糖共发酵产乙醇。
序列表
<110> 齐鲁工业大学
<120> MAL33基因缺失在提高酿酒酵母对木质纤维素水解液抑制物耐受性中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
atgactttag tcaagtatgc atgcgactat tgtcgtgtcc gtcgagtaaa gtgtgatggt 60
aaaaaaccat gtagtcgctg tattgagcac aatttcgatt gcacatatca gcaaccatta 120
aaaaaaagag gctcaaagcc tattggaact agaagcttaa agtatatacc aaaggccaaa 180
atgtttatag ataataaaag ttgtacggca gcggcagaaa tattaatgaa ggttcctaaa 240
aaggtgattg atcagtgttt gaggctttat cacgacaatc tatatgttat ctggccttta 300
ctctcttatg atgaccttca caagcttttg gacgaagaat acaatgacca ttacgtttat 360
tggtttctcg tagctctttc agcagccaat cttagcgatc tacaaagcga attagaatct 420
gaggggggat tttcgtttac tggaaaacaa ttagccgttc tctgtatgtc ctcacgccaa 480
caatttgatg accttagcgg cagagacatt ttccgaatta tgacatatta ttgcttgcta 540
cgttgttttt cacagtcttc tgatgtaaga aattcataca gactttgtcg tgaagctatt 600
ggccttgtta ttgtagcagg gttacatcgt gaaaaagcat acgaatcact atcatttcgt 660
gagcaacagc ttttacgcaa ggtgtattat ttgcttctct tgacggaaag atactattcc 720
gtatatgttc attgtgttac aagtttggat accacaatag ctccacctca gccagagttc 780
gtaacggacc ctcgactttc tttggatagc ttttttgaga tgattagagt atttactgta 840
ccaggtaaat gcttttttga tgctttggct acggagtcta ctagcggttc ttgcactgaa 900
gactcactga aaaaaatatg gaaagagctt cacacagcat cccttgaaat agaaccatgg 960
tcttatggct atgtggacat ttcattttct cgacattgga ttagggcgct ggcttggaag 1020
ctagtgtttc agatgaatgg taccaagttt ttctcaaacg ccaataatgc tcacatattg 1080
gtcgaaattg caaaggatat gctggacgac atattcttaa ctccaaacaa cctgtatgat 1140
gtacatggtc ctggaatacc aatgaaatca ttggaagtag ccaatgcatt ggtagatatc 1200
gtaaataagt atgatcacaa tatgaagttg gaggcttgga atattttgtg cgatgtatcc 1260
aagttcgttt tctccctgaa acattgcaat cataaaatgt ttcaaaggtt ttcaactaaa 1320
tgtcagagtg ctctaatcga tttgcctatc tctagaccac tgcgcctaaa tgatgattcc 1380
aaagatgaag acgacataat tccttaa 1407

Claims (1)

1.MAL33基因缺失在提高酿酒酵母对木质纤维素水解液抑制物耐受性中的应用，其特征在于，所述的MAL33基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；其中所述抑制物为乙酸、H2O2、香草醛、甲酸、5-羟甲基糠醛（HMF）、乙酰丙酸。
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CN116223733B (zh) * 2023-01-04 2023-09-15 齐鲁工业大学(山东省科学院) 一种c5/c6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度的定量表征方法
CN116716321B (zh) * 2023-08-03 2023-12-05 齐鲁工业大学(山东省科学院) Hmx1及其编码基因在提高酿酒酵母木糖发酵性能和乙酸耐受性上的应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Intracellular Maltose Is Sufficient To Induce MAL Gene Expression in Saccharomyces cerevisiae";Xin Wang et al.,;《EUKARYOTIC CELL》;20021031;第696-703页 *
"Molecular Evolution of the Telomere-Associated MAL Loci of Saccharomyces";Maureen J.Charron et al.,;《Genetics》;19890630;第122卷;第307-316页 *
"The regulatable MAL32 promoter in Saccharomyces cerevisiae: characteristics and tools to facilitate its use";Matthias Meurer et al.,;《Yeast》;20161123;第34卷;第39-49页 *
"醸造酵母のMAL遺伝子";小倉健太郎等;《J.Brew.Soc.Japan》;20081231;第103卷(第8期);第629-637页 *

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