KR20200094227A - 미생물 기반 산물을 생산하기 위한 반응기 및 심부 발효법 - Google Patents

미생물 기반 산물을 생산하기 위한 반응기 및 심부 발효법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 구현예는 신규하고 저렴한 발효 시스템 및 그 사용 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 매우 높은 세포 밀도를 갖는 다양한, 예컨대 바이오 수준 1 미생물을 발효시키기 위한 생물학적 반응기 시스템을 제공한다. 이 반응기 시스템은 효모, 진균 및 박테리아뿐만 아니라 이들의 성장 부산물을 성장시키는 데 사용될 수 있다. 구체적 구현예에서, 이 반응기 시스템은 효모 기반 조성물의 생산에 사용된다. 특정 구체적 구현예에서, 이 반응기 시스템은 스타르메렐라 봄비콜라 효모 조성물의 생산에 사용된다.

Description

미생물 기반 산물을 생산하기 위한 반응기 및 심부 발효법
본 출원은 2017년 12월 28일에 출원된 미국 가출원 제62/611,300호로부터 우선권을 주장하며, 해당 출원 전체가 참조로서 여기에 포함된다.
본 발명의 구현예는 신규하고 저렴한 발효 시스템 및 그 사용 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 매우 높은 세포 밀도를 갖는 다양한, 예컨대 바이오 수준 1 미생물을 발효시키기 위한 생물학적 반응기 시스템을 제공한다.
박테리아, 효모 및 진균과 같은 미생물의 배양은 광범위한 유용한 바이오 제형(bio-preparations)의 생산을 위해 중요하다. 미생물은 예컨대 석유 및 가스 회수, 식품 산업, 제약, 농업, 광업, 환경 개선 및 폐기물 관리에 있어서 중요한 역할을 한다.
광범위한 산업에서 미생물을 사용할 수 있는 엄청난 잠재력이 존재한다. 그러나, 미생물 기반 산물(microbe-based products)의 상용화에 있어서 중요한 제한 요소는 번식체(propagule) 밀도 당 비용이었는데, 이때 이익을 내기에 충분한 접종원(inoculum)으로 대규모 운전에 미생물 산물을 적용하는 것은 특히 비용이 많이 들고 실현 가능하지 않다.
미생물 배양의 두 가지 주요 형태는 심부 배양(submerged cultivation)과 표면 배양(surface cultivation)이다. 박테리아, 효모 및 진균은 모두 표면 또는 심부 배양법을 사용하여 배양할 수 있다. 이 배양법 모두 미생물의 성장을 위한 영양 배지(nutrient medium)를 필요로 한다. 영양 배지는 액체 또는 고체 형태일 수 있는데, 전형적으로 탄소원, 질소원, 염과 적절한 부가 영양소 및 미량 원소를 포함한다. pH와 산소 수준은 주어진 미생물에 적절한 값들로 유지된다.
미생물과 그 성장 부산물은, 더 쉽게 이용 가능하고, 살아 있는 미생물의 경우 더 활성적이거나 생존 가능한 형태로 이용 가능하다면, 예컨대 석유와 농업 분야에서 매우 유익한 역할을 할 수 있는 잠재력을 가지고 있다.
석유는 지구 표면 아래의 저류층 암석 안에 있는 작은 기공과 좁은 균열 내에 존재한다. 석유와 천연 가스는 보통 굴착기(drilling rig)라고 불리는 장비를 이용하여 지구 표면을 통해 굴착하여 얻어진다. 유정이 굴착된 후, 일반적으로 생산 라이너(또는 케이싱)가 배치되고, 그 후 유정이 천공된다(예컨대, 석유 함유 층 내의 특정 지점에서 생산 라이너에 구멍을 내는 데 폭발물이 사용된다). 저류층의 자연 압력에 의해 석유가 지표면까지 흘러서 1차 생산을 제공한다. 그러나, 석유의 생산이 진행됨에 따라, 경제적인 석유 생산율을 유지하기 위해 인위적인 수송이나 펌핑이 필요한 시점까지 저류층 압력이 고갈된다.
다양한 화학 물질과 장비가 이 문제를 방지하고 해결하기 위해 이용되지만, 이들은 유해하거나 오염물일 수 있다. 따라서, 더 친환경적이고 덜 유해하며 향상된 효율을 갖는 개선된 제품과 방법이 요구되고 있다.
이러한 메커니즘 중 하나는 미생물과 그 부산물을 사용하여 석유 회수를 증진시킨다(또는 미생물 석유 회수 증진(microbial enhanced oil recovery; MEOR)). 미생물 부산물은 바이오 계면활성제, 바이오 폴리머, 산, 용매, 기체 및 효소를 포함할 수 있는데, 예컨대 석유의 물성 및 석유, 물과 다공성 매질 사이의 상호작용을 변경하고, 지하층의 투과성을 바꾸고, 궁극적으로 석유의 이동성과 회수를 증가시킬 수 있다.
다양성, 친환경 특성, 대량 생산 가능성, 선택성, 극한 조건에서의 성능 및 환경 보호의 잠재적 응용성으로 인해, 미생물 계면활성제에 대한 관심이 최근 꾸준히 증가하고 있다. 미생물에 의해 생산된 계면활성제, 즉 바이오 계면활성제(biosurfactants)는 물과 석유 사이의 계면 장력을 줄이며, 따라서 모세관 효과를 극복하기 위해 공극에 포획된 액체를 이동시키는 데 더 낮은 정수압이 요구된다. 둘째, 바이오 계면활성제는 이동하는 수성상에서 오일을 동원하기 위한 물리적 메커니즘을 제공하는 미셀(micelles)의 형성에 기여한다. 나아가, 바이오 계면활성제는 탄화수소의 유화를 향상시키고, 탄화수소 오염 물질을 가용화시키며 이를 미생물 분해에 이용할 가능성을 증가시키는 잠재력이 있다. 이 화합물은 또한 석유 회수 증진에 사용될 수 있다.
석유와 가스 산업에서의 유용성 외에도, 미생물과 그 대사 산물(metabolites)은 또한 농산물 생산의 일반적인 장애에 대한 안전하고 효과적이며 친환경적인 방안의 요구에 대한 유망한 해결책이다. 농민들은 병원균, 해충과 질병으로부터 작물을 보호하고 수확량을 높이기 위해 합성 화학 물질과 화학 비료의 사용에 크게 의존해 왔다. 그러나, 이들을 과용하거나 부적절하게 사용하면, 이들은 유출, 침출과 증발을 통해 대기와 수질의 오염원이 될 수 있다. 적절하게 사용된 때조차도, 특정한 화학 비료와 농약들에 대한 과의존과 장기적 사용은 토양 생태계를 유해하게 변경하고, 스트레스 내성을 감소시키고, 해충의 내성을 증가시키며, 식물과 동물의 성장과 활력을 저해한다.
증가하고 있는 규제는 화학 물질의 이용 가능성과 용도를 통제할 것을 요구하고 있고, 환경에 대한 피해를 최소화하면서 생산되며 잔여물이 없고 지속 가능하게 재배되는 식품에 대한 소비자들의 요구는 산업에 영향을 미치고 있고, 무수한 과제들을 어떻게 해결할지에 대한 사고의 발전을 야기하고 있다. 더 안전한 농약과 대체 해충 방제 전략에 대한 요구가 증가하고 있다. 화학 물질의 무차별적 배제는 현재 타당하지 않지만, 농부들은 통합 영양 관리 및 통합 해충 관리 프로그램(Integrated Nutrient Management and Integrated Pest Management programs)의 실행 가능한 요소들로서 생물학적 수단의 이용을 점점 더 수용하고 있다.
예를 들어, 최근 선충류(nematodes)의 생물학적 방제가 큰 관심을 끌고 있다. 이 방법은 살아 있는 미생물, 이 미생물로부터 유도되는 바이오 산물 및 이들의 조합과 같은 생물학적 제제(biological agents)를 농약으로서 이용한다. 이 생물학적 농약은 다른 종래의 농약에 비해 중요한 장점을 가진다. 예를 들어, 이들은 종래의 화학적 농약에 비하여 덜 해롭고, 더 효과적이고 더 특정적이며, 종종 빠르게 생분해되어서 환경 오염이 덜하다.
미생물과 같은 생물학적 제제, 예컨대 바이오 계면활성제는 다양한 산업 조업에 긍정적인 영향을 미칠 잠재력이 있지만, 그 사용은 생산, 이송, 관리, 가격 책정 및 효능에 있어서의 어려움 때문에 크게 제한되어 왔다. 예를 들어, 많은 미생물들은 성장시키고 이어서 유용할 만큼의 충분한 양으로 예컨대 유정이나 농업 작물에 적용하기 어렵다. 이 문제는 유통 전의 가공, 조제, 저장 및 안정화로 인한 생존성(viability) 및/또는 활성(activity)에 있어서의 손실에 의해 악화된다. 나아가, 일단 적용되면, 생물학적 제품은 예컨대 불충분한 초기 세포 밀도, 특정 지점에 존재하는 미소 식물(microflora)과 효과적으로 경쟁할 수 없는 무능 및 미생물이 번성하거나 또는 생존할 수 없는 지층, 토양 및/또는 다른 환경적 조건에 도입되는 등의 여러 이유들로 인해 번성하지 못할 수 있다.
미생물 기반 조성물(microbe-based compositions)은 석유 및 가스 산업, 농업 분야를 비롯한 다른 여러 분야에서 직면하고 있는 위에서 언급된 문제들의 일부를 해결하는 데 도움을 줄 수 있다. 따라서, 미생물과 미생물 대사 산물의 대량 생산을 위한 더 효과적인 배양법이 요구되고 있다.
본 발명은 석유 및 가스 산업, 농업, 보건 의료 및 환경 정화뿐만 아니라 다양한 다른 응용 분야에 사용될 수 있는 미생물 기반 조성물을 생산하기 위한 재료, 방법 및 시스템을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 미생물의 효율적인 배양 및 미생물 성장 부산물의 생산을 위한 물질, 방법 및 시스템을 제공한다.
본 발명의 구현예는 단순하고 저 비용의 발효 시스템 및 그 사용 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 매우 높은 세포 밀도를 갖는 다양한, 예컨대 바이오 수준 1 미생물을 발효시키기 위한 생물학적 반응기 시스템을 제공한다. 이 반응기 시스템은 효모, 진균 및 박테리아뿐만 아니라 이들의 성장 부산물을 성장시키는 데 사용될 수 있다. 구체적 구현예에서, 이 반응기 시스템은, 예컨대 스타르메렐라 봄비콜라(Stamerella bombicola), 위커하모마이세스 아노말루스(Wickerhamomyces anomalus) 및/또는 슈도지마 애피디스(Pseudozyma aphidis) 효모를 포함하는 조성물을 포함하는, 효모 기반 조성물을 생산하는 데 사용된다.
특정 구현예에서, 이 반응기 시스템은 스타르메렐라 봄비콜라 효모 기반 조성물의 생산에 사용된다.
일부 구현예에서, 이 효모 기반 조성물은, 예컨대 효모 세포의 유리한 특성으로 인해, 예컨대 단독의 정제된 미생물 대사 산물보다 우수할 수 있다. 이러한 특성에는 효모 세포벽 외부 표면의 일부로서 만노단백질(mannoprotein)(만노단백질은 매우 효과적인 바이오 유화제이다)의 고농도 및 효모 세포벽에 바이오 폴리머 베타-글루칸(또한 효과적인 유화제)의 존재가 포함된다. 또한, 효모 발효 산물은 배양물에서 표면 및 계면 장력을 감소시킬 수 있는 바이오 계면활성제, 효소 및 다른 대사 산물(예를 들어, 락트산, 에틸 아세테이트, 에탄올 등)을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 이 반응기 시스템은, 예컨대 바실러스 종(Bacillus spp.)(예를 들어, B. 서브틸리스(B. subtilis), B. 아밀로리퀴페시언스(B. amyloliquefaciens), B. 리체니포미스(B. licheniformis)) 및/또는 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.)(예를 들어, P.　클로로라피스(P. chlororaphis))를 포함하는 조성물을 포함하는, 박테리아 기반 조성물을 생산하는 데 사용된다.
특정 구현예에서, 이 반응기 시스템은, 예컨대 효소, 산, 용매, 알코올, 단백질, 탄수화물, 비타민, 미네랄, 미량 원소, 아미노산, 바이오 유화제, 바이오 폴리머 및 바이오 계면활성제를 포함하는, 미생물 대사 산물의 생산에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 이 대사 산물은 발효 브로스(fermentation broth)로부터 추출될 수 있고, 선택적으로 정제될 수 있다. 구체적 구현예에서, 이 시스템은 당지질(예를 들어, 소포로리피드(sophorolipid), 람노리피드(rhamnolipid), 만노실에리트리톨 리피드(mannosylerythritol lipid) 또는 트레할로스 리피드(trehalose lipid)) 또는 리포펩티드(예를 들어, 서팩틴, 이투린, 펜기신 또는 리케니신)와 같은 바이오 계면활성제를 생산하는 데 사용된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 반응기 시스템은 하나의 대용량 수직 평행 육면체 탱크를 포함한다. 바람직하게는, 이 탱크는 금속 또는 금속 합금, 예컨대 스테인레스 스틸로 만들어진다. 이 탱크는 그 상단에 작동 및/또는 청소 동안 밀봉될 수 있는 개구부를 가질 수 있다.
발효 배양물의 포화 산소 요건에 따라, 이 탱크는 교반식 탱크 반응기 및/또는 비교반식 탱크 반응기로 구성될 수 있다. 일 구현예에서, 이 탱크는 변형된 스테인레스 스틸 중형 벌크 컨테이너(intermediate bulk container; IBC)이다.
유리하게는, 본 반응기 시스템은 의도된 용도에 따라 스케일링 될 수 있다. 예를 들어, 이 탱크의 부피는 수 갤런부터 수천 갤런까지의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 이 탱크는 약 1 내지 약 1,500 갤런을 보유할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 반응기 시스템이 인클로저(enclosure) 또는 하우징 설비 내에 설치되어 훨씬 더 많은 총 부피의 발효 산물을 생산할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 이 반응기 시스템은 카오스 혼합 구조(chaotic mixing scheme)를 이용하여 배양물을 순환시키고 매우 효율적인 물질 교환을 보장한다. 이 카오스 혼합 구조는 내부 혼합 장치뿐만 아니라 외부 순환 시스템을 사용한다.
일 구현예에서, 이 내부 혼합 장치는 탱크의 상단에 위치한 혼합 모터를 포함한다. 이 모터는 탱크 내로 연장되며 탱크 상단으로부터 탱크 하단으로 탱크 액체를 밀어 보내고 배양물 전체에 걸쳐 효율적인 혼합 및 가스 분산을 보장하기 위해 임펠러가 고정되어 있는 금속 샤프트에 회전 가능하게 부착된다. 일 구현예에서, 임펠러를 구비한 금속 샤프트는 대각선 축(예를 들어, 수직으로부터 15 내지 60°의 축)상에서 회전한다.
일 구현예에서, 이 임펠러는 표준 4날 러쉬톤(Rushton) 임펠러이다. 일 구현예에서, 이 임펠러는 축류 폭기 터빈(axial flow aeration turbine) 및/또는 소형 선박 프로펠러를 포함한다. 일 구현예에서, 이 임펠러 설계는 난류를 증가시키기 위해 맞춤형 블레이드 형태를 포함한다.
일 구현예에서, 카오스 혼합 구조는 외부 순환 시스템을 추가로 이용한다. 바람직한 구현예에서, 외부 순환 시스템은 이중의 온도 제어 시스템이다. 유리하게는, 특정 구현예에서, 이 외부 순환 시스템은 이중-벽 탱크나 외부 온도 제어 재킷에 대한 필요성을 제거한다.
일 구현예에서, 이 외부 순환 시스템은 인라인 열교환기를 포함하는 2개의 매우 효율적인 외부 루프들을 포함한다. 일 구현예에서, 이 열교환기는 쉘-튜브 열교환기이다. 각각의 루프에는 각각의 순환 펌프가 장착되어 있다.
이 2개의 펌프는 예컨대 분당 250 내지 400 갤런의 액체를 탱크 하단으로부터 열교환기를 통해 탱크 상단으로 다시 이송한다. 유리하게는, 배양물이 루프들을 통해 펌핑되는 고속에 의해 세포가 루프의 내부 표면에 응착(caking)되는 것을 방지하는 것을 돕는다.
이 루프는 수원 및 선택적으로 냉각기에 부착될 수 있으며, 이로써 물이 열교환기 내부를 통과하는 배양물 주위에서 분당 약 10 내지 15 갤런의 유량으로 펌핑되어, 원하는 대로 온도를 올리거나 내린다. 일 구현예에서, 이 물은 배양물과 전혀 접촉하지 않으면서 배양물의 온도를 제어한다.
이 반응기 시스템은 배양물에 여과된 공기를 제공할 수 있는 폭기 시스템(aeration system)을 추가로 포함할 수 있다. 이 폭기 시스템은 선택적으로 배양물의 오염을 방지하기 위한 에어 필터를 가질 수 있다. 이 폭기 시스템은 배양물에 대한 공기 수준, 용존 산소(dissolved oxygen; DO) 및 탱크 내부 압력을 원하는 수준으로(예를 들어, 일정하게) 유지하는 기능을 할 수 있다.
특정 구현예에서, 이 유닛에는 폭기 시스템이 이를 통해 공기를 공급하는 고유한 살포 시스템(sparging system)이 장착될 수 있다. 바람직하게는, 이 살포 시스템은 미세 기포를 생성하는 스테인레스 스틸 인젝터를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 이 살포기는 공기 공급원에 연결된 4 내지 10개의 폭기 장치를 포함할 수 있으며, 후자는 스테인레스 스틸 미세 다공성 파이프(예를 들어, 1 마이크론 이하 크기의 수십 또는 수백 개의 구멍을 갖는다)를 포함한다. 이 고유한 미세 다공성 디자인으로 인해 산소가 배양물 전체에 적절히 분산될 수 있고, 오염 미생물이 공기 공급원을 통해 배양물에 유입되는 것을 방지할 수 있다.
일부 구현예에서, 이 반응기 시스템은 프로그램 가능형 논리 제어기 (programmable logic controller; PLC)에 의해 제어된다. 특정 구현예에서, 이 PLC는 터치 스크린 및/또는 자동화된 인터페이스를 갖는다. 이 PLC는 반응기 시스템을 시작 및 중지하고, 발효 전반에 걸쳐 예컨대 온도, DO 및 pH를 모니터링하고 조절하는 데에 사용될 수 있다.
이 반응기 시스템에는 예컨대 pH, 온도 및 DO 수준과 같은 발효 파라미터를 모니터링하기 위한 프로브(probes)가 장착될 수 있다. 이 프로브는 컴퓨터 시스템 예컨대 PLC에 연결되고, 이를 통해 프로브의 판독 값을 기반으로 발효 파라미터를 자동으로 조정할 수 있다.
특정 구현예에서, 배양물의 미생물이 산소를 소비하고 복제함에 따라서 DO는 연속적으로 조정된다. 예를 들어, DO를 (포화의) 약 30%로 일정하게 유지하기 위해, 미생물이 성장함에 따라 산소 투입량을 꾸준히 증가시킬 수 있다.
이 반응기 시스템에는 또한 반응기 시스템을 가동하기 전 및/또는 후에 증기 멸균 주기를 가동하기 위한 시스템이 장착될 수 있다. 특정 구현예에서, 이 증기 멸균 시스템은 자동화된다.
이 반응기 시스템은 공기를 방출하기 위한 오프 가스 시스템(off-gas system)을 포함할 수 있다. 기포의 발생을 억제하기 위하여, 기계적 소포 장치나 화학 또는 생화학 첨가제와 같은 소포 수단을 사용할 수도 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 반응기 시스템을 사용하여 오염 없이 미생물을 배양하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 이 배양법은 예컨대 연동 펌프(peristaltic pump)를 사용하여 물과 영양 성분을 포함하는 배양 배지를 탱크에 첨가하는 단계; 반응기 시스템에 생균을 접종하는 단계; 및 선택적으로, 살균제를 배양 배지에 첨가하는 단계를 포함한다. 이 살균제는 예컨대 항생제(예를 들어, 사용 위치 또는 생산되는 산물에 기초하여 허용되는 경우) 또는 당지질(예를 들어, 소포로리피드, 람노리피드)일 수 있다.
이 방법은 배양물 내에서 원하는 세포 농도 및/또는 원하는 대사 산물 농도를 달성하기 위해 일정 시간 동안 시스템을 작동하는 단계를 추가로 포함한다. 미생물 및/또는 대사 산물은 직접 사용, 저장 및/또는 가공을 위해 수확될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 반응기 시스템을 사용하여 성장한 적어도 하나의 미생물 및/또는 이 미생물에 의해 생산된 적어도 하나의 미생물 대사 산물을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 이 조성물 중의 미생물은 활성 또는 비활성 형태로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 발효의 결과로 인한 상청액(supernatant) 및 성장 부산물은 미생물로부터 분리된다.
유리하게는, 본 발명의 방법 및 장비는 미생물 및 이의 대사 산물을 대규모로 생산하기 위한 자본 및 노동 비용을 감소시킨다. 나아가, 본 발명의 배양 공정은 배양이 완료된 후 유기체를 농축시킬 필요성을 줄이거나 제거한다. 본 발명은 영양 배지 단위 당 미생물 산물의 수율을 실질적으로 증가시킬 뿐만 아니라 생산을 단순화하고 운반 가능성을 향상시키는 배양법을 제공한다.
미생물 기반 조성물이 사용이 의도된 장소 또는 그 근처에서 생산될 수 있기 때문에, 이러한 운반 가능성에 의해 상당한 비용을 절감할 수 있다. 원하는 경우 현지의 재료를 사용하여 현장에서 최종 조성물을 제조할 수 있으며, 따라서 운송 비용이 절감됨을 의미한다. 따라서, 이 조성물은 적용 시 생균을 포함할 수 있고, 이는 제품의 효능을 증가시킬 수 있다. 또한, 이 조성물은 특정 위치에서의 조건에 이상적인 실시간으로 맞춤화될 수 있다.
나아가, 특정 구현예에서, 본 발명의 시스템은 자연 발생의 지역 미생물 및 그의 대사 부산물의 능력을 활용한다. 지역 미생물 군집의 사용은, 원격의 경우를 포함하여, 이것으로 제한되지는 않지만, 농업, 환경 개선(예컨대, 기름 유출의 경우), 축산, 양식, 임업, 목초지 관리, 잔디 관리, 원예용 장식 생산, 폐기물 폐기와 처리, 폐수 처리, 식량 생산 및 가공, 채광, 석유 회수 및 인간 건강 등을 포함하는 경우에 유리할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 반응기 시스템의 정면도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 반응기 시스템의 등각도를 나타낸다. 시스템의 전면, 우측면 및 상면이 도시된다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따라서 상단에 있는 개구부가 밀봉되지 않은 상태의 반응기 시스템의 평면도를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 반응기 시스템의 내부의 평면도를 나타낸다.
본 발명은 석유 및 가스 산업, 농업, 보건 의료 및 환경 정화뿐만 아니라 다양한 다른 응용 분야에 사용될 수 있는 미생물 기반 조성물을 생산하기 위한 재료, 방법 및 시스템을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 미생물의 효율적인 배양 및 미생물 성장 부산물의 생산을 위한 물질, 방법 및 시스템을 제공한다.
본 발명의 구현예는 단순하고 저 비용의 발효 시스템 및 그 사용 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 매우 높은 세포 밀도를 갖는 다양한, 예컨대 바이오 수준 1 미생물을 발효시키기 위한 생물학적 반응기 시스템을 제공한다. 이 반응기 시스템은 효모, 진균 및 박테리아뿐만 아니라 이들의 성장 부산물을 성장시키는 데 사용될 수 있다. 구체적 구현예에서, 이 반응기 시스템은, 예컨대 스타르메렐라 봄비콜라(Stamerella bombicola), 위커하모마이세스 아노말루스(Wickerhamomyces anomalus) 및/또는 슈도지마 애피디스(Pseudozyma aphidis) 효모를 포함하는 조성물을 포함하는, 효모 기반 조성물을 생산하는 데 사용된다.
특정 구현예에서, 이 반응기 시스템은 스타르메렐라 봄비콜라 효모 기반 조성물의 생산에 사용된다.
일부 구현예에서, 이 효모 기반 조성물은, 예컨대 효모 세포의 유리한 특성으로 인해, 예컨대 단독의 정제된 미생물 대사 산물보다 우수할 수 있다. 이러한 특성에는 효모 세포벽 외부 표면의 일부로서 만노단백질(mannoprotein)(만노단백질은 매우 효과적인 바이오 유화제이다)의 고농도 및 효모 세포벽에 바이오 폴리머 베타-글루칸(또한 효과적인 유화제)의 존재가 포함된다. 또한, 효모 발효 산물은 배양물에서 표면 및 계면 장력을 감소시킬 수 있는 바이오 계면활성제, 효소 및 다른 대사 산물(예를 들어, 락트산, 에틸 아세테이트, 에탄올 등)을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 이 반응기 시스템은, 예컨대 바실러스 종(Bacillus spp.)(예를 들어, B. 서브틸리스(B. subtilis), B. 아밀로리퀴페시언스(B. amyloliquefaciens), B. 리체니포미스(B. licheniformis)) 및/또는 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.)(예를 들어, P.　클로로라피스(P. chlororaphis))를 포함하는 조성물을 포함하는, 박테리아 기반 조성물을 생산하는 데 사용된다.
특정 구현예에서, 이 반응기 시스템은, 예컨대 효소, 산, 용매, 알코올, 단백질, 탄수화물, 비타민, 미네랄, 미량 원소, 아미노산, 바이오 유화제, 바이오 폴리머 및 바이오 계면활성제를 포함하는, 미생물 대사 산물의 생산에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 이 대사 산물은 발효 브로스(fermentation broth)로부터 추출될 수 있고, 선택적으로 정제될 수 있다. 구체적 구현예에서, 이 시스템은 당지질(예를 들어, 소포로리피드(sophorolipid), 람노리피드(rhamnolipid), 만노실에리트리톨 리피드(mannosylerythritol lipid) 또는 트레할로스 리피드(trehalose lipid)) 또는 리포펩티드(예를 들어, 서팩틴, 이투린, 펜기신 또는 리케니신)와 같은 바이오 계면활성제를 생산하는 데 사용된다.
선택적인 정의
본 명세서에서, "미생물 기반 조성물(microbe-based composition)"은 미생물 또는 다른 세포 배양물의 성장의 결과로서 생산된 성분을 포함하는 조성물을 의미한다. 따라서, 미생물 기반 조성물은 미생물 그 자체 및/또는 미생물 성장의 부산물을 포함할 수 있다. 미생물은 생장 상태(vegetative state), 포자 형태, 균사 형태, 다른 번식체 형태, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 미생물은 플랑크톤 또는 생물막 형태, 또는 이 둘의 혼합물일 수 있다. 성장의 부산물은 예컨대 대사 산물, 세포막 성분, 발현된 단백질, 및/또는 다른 세포 성분일 수 있다. 미생물은 손상되지 않았거나 용해되었을 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 미생물은 이들이 성장했던 브로스(broth)와 함께 미생물 기반 조성물 내에 존재한다. 세포는 예컨대 조성물의 밀리리터 당 1 × 104, 1 × 105, 1 × 106, 1 × 107, 1 × 108, 1 × 109, 1 × 1010, 1 × 1011, 1 × 1012 또는 1 × 1013 세포 이상의 농도로 존재할 수 있다. 일부 구현예에 있어서, 미생물 기반 조성물은 발효 브로스 및/또는 미생물로부터 추출 및/또는 분리된 미생물 대사 산물을 포함한다.
본 발명은 "미생물 기반 산물"을 추가로 제공하는데, 이는 원하는 결과를 얻기 위해 실제로 적용되어야 하는 산물이다. 미생물 기반 산물은 단순히 미생물 배양 공정으로부터 수확된 미생물 기반 조성물일 수 있다. 또는, 미생물 기반 산물은 첨가된 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 이 추가적인 성분은 예컨대 안정화제, 완충제, 물, 염 용액, 또는 다른 적절한 담체(carrier)와 같은 적절한 담체, 추가의 미생물 성장을 지원하기 위해 첨가된 영양분, 식물 호르몬과 같은 비-영양적인 성장 증진제 및/또는 적용되는 환경에서 미생물 및/또는 조성물의 추적을 용이하게 해주는 제제를 포함할 수 있다. 미생물 기반 산물은 또한 미생물 기반 조성물들의 혼합물을 포함할 수 있다. 미생물 기반 산물은 또한, 이것으로 제한되지는 않지만, 여과, 원심분리, 용해, 건조, 정제 등과 같은 방식으로 처리된 미생물 기반 조성물의 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, "수확된(harvested)"은 성장 용기로부터 미생물 기반 조성물의 일부 또는 전부를 제거하는 것을 말한다.
본 명세서에서, "생물막(biofilm)"은 박테리아와 같은 미생물의 복합적인 집합체인데, 여기서 세포들은 서로 붙어 있다. 생물막 내의 세포들은 동일한 유기체인 플랑크톤 세포들과 생리학적으로 구별되는데, 후자는 액체 매질에서 부유하거나 또는 헤엄칠 수 있는 단세포들이다.
본 명세서에서, 미생물의 "방제"는 미생물의 사멸, 불능화, 제거, 고정화 또는 개체수를 감소시키는 행위 또는 미생물이 실질적으로 해를 끼칠 수 없게 하는 여타 행위를 말한다.
본 명세서에서, "단리된" 또는 "정제된" 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드(polynucleotide), 폴리펩티드(polypeptide), 단백질, 소분자와 같은 유기 화합물(예를 들어, 이하에서 설명되는 것들) 또는 기타 화합물에는 본래 연관되어 있는 세포질 물질과 같은 다른 화합물이 실질적으로 없다. 예를 들어, 정제되거나 단리된 폴리뉴클레오티드(리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA))에는 자연 발생 상태에서 그 옆에 존재하는 유전자 또는 서열이 없다. 예를 들어, 정제되거나 단리된 폴리뉴클레오티드(리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA))에는 자연 발생 상태에서 그 옆에 존재하는 아미노산 또는 서열이 없다. 정제되거나 단리된 미생물 균주는 본래 존재하는 환경으로부터 제거된다. 따라서, 단리된 균주는 예컨대 생물학적으로 순수한 배양물 또는 담체와 연관된 포자(또는 균주의 다른 형태)로서 존재할 수 있다.
특정 구현예에서, 정제된 화합물은 관심 화합물의 적어도 60 중량%(건조 중량)이다. 바람직하게, 제형(preparation)은 중량 기준으로 관심 화합물의 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 90%이고, 가장 바람직하게는 적어도 99%이다. 예를 들어, 정제된 화합물은 중량 기준으로 원하는 화합물의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99% 또는 100%(w/w)인 것이다. 순도는 적절한 표준 방법에 의해, 예컨대 칼럼 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석에 의해 측정된다.
"대사 산물"은 신진대사에 의해 생산되는 물질(예컨대, 성장 부산물) 또는 특정 신진대사 과정에 참여하는 데 필요한 물질을 말한다. 대사 산물은 신진대사의 출발 물질(예컨대, 글루코스), 중간 물질(예컨대, 아세틸-CoA), 또는 최종 산물(예컨대, n-부탄올)인 유기 화합물일 수 있다. 대사 산물들의 예는 효소, 독소, 산, 용매, 알코올, 단백질, 탄수화물, 비타민, 미네랄, 미량 원소, 아미노산, 고분자 및 바이오 계면활성제를 들 수 있으나, 이것으로 제한되지 않는다.
본 명세서에서, "계면활성제"는 두 액체들 사이 또는 액체와 고체 사이의 표면 장력(또는 계면 장력)을 낮추는 표면 활성 화합물을 말한다. 계면활성제는 예컨대 세제, 습윤제, 유화제, 발포제 및 분산제로서 작용한다. "바이오 계면활성제"는 살아 있는 유기체에 의해 생산되는 계면활성제이다.
본 명세서에서, "중형 벌크 컨테이너", "IBC" 또는 "팔레트 탱크"는, 예컨대 화학 물질(유해 물질 포함), 식재료(예컨대, 시럽, 액체, 과립 및 분말 재료), 용매, 세제, 접착제, 물 및 의약품을 포함하는, 벌크 물질의 운송 및 보관을 위해 설계된 재사용 가능한 산업용 컨테이너를 말한다. 전형적으로, IBC는 적재 가능하고, 팔레트에 올려지며, 또는 지게차 또는 팔레트 잭을 사용하여 이동되도록 설계된다. 따라서, IBC는 운반 가능하도록 설계된다.
전이어(transitional term) "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)" 또는 "함유하는(containing)"과 동의어로서, 포괄적이거나 개방형이며 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 대조적으로, 전이어 "구성되는(consisting of)"은 청구범위에 명시되지 않은 다른 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 전이구 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"은 청구범위를 특정 재료 또는 단계 및 청구된 발명의 "기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것"으로 제한한다.
본 명세서에서, 구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않은 한, 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다. 본 명세서에서, 구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않은 한, 용어 "a", "an" 및 "the"는 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.
본 명세서에서, 구체적으로 언급되거나 문맥상 명백하지 않은 한, 용어 "약"은 본 기술 분야의 정규 공차 범위 내, 예컨대 평균의 2 표준 편차 내로 이해된다. 약은 언급된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 이내로 이해될 수 있다.
본 명세서에서, 변수의 임의의 정의에서 화학 기의 목록이 명시되면, 이는 임의의 단일 기 또는 열거된 기의 조합으로 해당 변수를 정의하는 것을 포함한다. 본 명세서에서, 변수 또는 양태에 대한 구현예가 명시되면, 이는 임의의 단일 구현예 또는 임의의 다른 구현예 또는 이의 부분과 조합된 구현예를 포함한다.
본 명세서에 제공된 임의의 조성물 또는 방법은 본 명세서에 제공된 임의의 다른 조성물 및 방법 중 하나 이상과 조합될 수 있다.
반응기 시스템 설계 및 작동
도 1~4를 참조하여, 본 발명의 반응기 시스템의 구현예는 아래 성분을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 반응기 시스템(10)은 하나의 대용량 수직 평행 육면체 탱크(100)를 포함한다. 발효 배양물의 포화 산소 요건에 따라, 이 탱크(100)는 교반식 탱크 반응기 및/또는 비교반식 탱크 반응기로 구성될 수 있다. 일 구현예에서, 반응기 시스템(10)은 (연속 반응기와 반대로) 회분식(batch) 반응기로서 사용된다.
본 발명에 따른 탱크(100)는 임의의 산업용 발효기 또는 배양 반응기일 수 있다. 탱크(100)는 예컨대 유리, 고분자, 금속, 금속 합금 및/또는 이들의 조합으로 제조될 수 있다.
바람직하게는, 탱크(10)는 금속, 예컨대 스테인레스 스틸로 만들어진다. 일 구현예에서, 탱크(100)는 발효 반응기로서 사용하기 위해 변형된 스테인레스 스틸 중형 벌크 컨테이너("IBC")이다. 탱크(100)는 예컨대 상단에 위치한 밀봉 가능한 개구부(101)를 가질 수 있다. 탱크(100)는 또한 탱크(100) 내부의 배양물을 시각적으로 모니터링하기 위한 하나 이상의 사이트 글라스(102)를 가질 수 있다.
유리하게는, 반응기 시스템(10)은 의도된 용도에 따라 스케일링될 수 있다. 예를 들어, 이 탱크(100)의 부피는 수 갤런부터 수천 갤런까지의 범위일 수 있다. 일 구현예에서, 탱크(100)의 폭 대 높이의 비가 1:2 내지 1:5이다.
일부 구현예에서, 탱크(100)는 약 1 내지 약 1,500 갤런을 보유할 수 있다. 일부 구현예에서, 탱크(100)는 약 5 리터 내지 약 5,000 리터 이상을 보유할 수 있다. 전형적으로, 탱크(100)는 10 내지 4,000 리터, 바람직하게는 100 내지 2,500 리터일 것이다.
일 예시적 구현예에서, 탱크(100)는 부피가 550 갤런(약 2,082 리터)이고, 길이와 너비가 5 × 5 피트, 높이가 약 6 피트이다.
일부 구현예에서, 복수의 개별 반응기 시스템(10)이 인클로저 또는 하우징 설비 내에 설치되어 훨씬 더 많은 총 부피의 발효 산물을 생산할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 이 반응기 시스템(10)은 카오스 혼합 구조(110 및 120)를 이용하여 배양물을 순환시킨다. 이 카오스 혼합 구조(110 및 120)는 내부 혼합 장치(110)뿐만 아니라 외부 순환 시스템(120)을 사용한다.
일 구현예에서, 이 내부 혼합 장치(110)는 탱크(100)의 상단에 위치한 혼합 모터(111)를 포함한다. 일 구현예에서, 혼합 모터(111)는 대각선 축(예를 들어, 수직으로부터 15 내지 60°의 축)상에서 회전한다. 이 모터(111)는 탱크(100) 내로 연장되며 탱크 상단으로부터 탱크 하단으로 탱크 액체를 밀어 보내고 배양물 전체에 걸쳐 효율적인 혼합 및 가스 분산뿐만 아니라 효율적인 물질 교환을 보장하기 위해 임펠러(113)가 고정되어 있는 금속 샤프트(112)에 회전 가능하게 부착된다. 일부 구현예에서, 샤프트(112)에는 2개 이상의 임펠러(도시되지 않음)가 고정된다.
일 구현예에서, 임펠러(113)는 표준 4날 러쉬톤(Rushton) 임펠러이다. 일 구현예에서, 이 임펠러(113)는 축류 폭기 터빈(도시되지 않음) 및/또는 소형 선박 프로펠러(도시되지 않음)를 포함한다. 일 구현예에서, 이 임펠러(113) 설계는 난류를 증가시키기 위해 맞춤형 블레이드 형태를 포함한다.
일 구현예에서, 카오스 혼합 구조(110 및 120)는 외부 순환 시스템(120)을 추가로 이용한다. 바람직한 구현예에서, 외부 순환 시스템(120)은 이중의 온도 제어 시스템이다. 유리하게는, 외부 순환 시스템(120)은 이중-벽 탱크(100)나 외부 온도 제어 재킷에 대한 필요성을 제거한다.
일 구현예에서, 외부 순환 시스템(120)은 제1 및 제2 인라인 300K 내지 360K 열교환기(122a, 122b)를 포함하는 제1 및 제2 고효율 외부 루프(121a, 121b)를 포함한다. 루프(121a, 121b) 중 하나 또는 둘 모두는 탱크(100)의 어느 한 측면 및/또는 탱크(100)의 후면에 위치할 수 있다.
일 구현예에서, 이 열교환기(122a, 122b)는 쉘-튜브 열교환기이다. 각각의 루프(121a, 121b)에는 각각의 1~2마력 순환 펌프(123a, 123b)가 장착되어 있다.
2개의 펌프(123a, 123b)는 예컨대 분당 250 내지 400 갤런의 액체를 탱크(100) 하단으로부터 제1 및 제2 열교환기(122a, 122b)를 통해 탱크(100) 상단으로 다시 이송한다. 유리하게는, 배양물이 2개의 루프(121a, 121b)를 통해 펌핑되는 속도에 의해 세포가 루프의 내부 표면에 응착되는 것을 방지하는 것을 돕는다.
제1 및 제2 루프(121a, 121b)는 수원(124) 및 선택적으로 냉각기에 부착될 수 있으며, 이로써 물이 열교환기(122a, 122b) 내부를 통과하는 배양물 주위에서 분당 약 10 내지 15 갤런의 유량으로 펌핑되어, 원하는 대로 온도를 올리거나 내린다. 일부 구현예에서, 물은 워터 필터(125)를 통해 여과된다.
열교환기(122a, 122b)는 전기 히터(도시되지 않음)를 이용할 수 있으나, 열이 필요한 더 큰 응용 분야의 경우 증기 또는 탄화수소 연료를 사용하여 열을 생성할 수 있다. 예를 들어, 증기 주입구 및/또는 증기원(도시되지 않음)이 열교환기(122a, 122b)에 연결될 수 있다.
열교환기(122a, 122b)는 폐쇄 시스템을 제공하는데, 여기서 온도 제어에 사용되는 냉각수 또는 증기가 배양물과 접촉하지 않는다. 유리하게는, 외부 순환 시스템(120)이 사이클 사이에서 반응기 시스템(10)을 세정하는 데 사용될 수 있는데, 여기서 세포 물질과 다른 오염 물질을 제거하기에 충분한 시간 동안 증기 및/또는 온수가 탱크(10) 및 외부 루프(121a, 121b)를 통해 순환된다.
일 구현예에서, 반응기 시스템 (10)은, 특히 반응기 시스템(10)이 실외에서 작동되는 경우, 적절한 발효 온도의 유지를 보장하도록 구성될 수 있다. 그러나, 바람직한 구현예에서, 외부 순환 시스템(120)의 사용으로 인해 그러한 구성이 필요하지 않다. 예를 들어, 실외에서 작동되는 경우 낮 동안 반응기 시스템(10)의 온도 상승을 피하기 위해, 시스템(10)의 외부는 반사적일 수 있다. 저온 환경에서 발효 공정이 적절한 온도로 유지될 수 있도록, 반응기 시스템(10)은 단열될 수도 있다. 유리 섬유, 실리카 에어로겔, 세라믹 섬유 단열재 등을 포함하여 당 업계에 공지된 임의의 단열재가 적용될 수 있다. 단열(도시되지 않음)은 시스템(10)의 구성 요소 중 일부 및/또는 전부를 둘러쌀 수 있다.
반응기 시스템(10)은 폭기 시스템(130)을 추가로 포함할 수 있다. 폭기 시스템(130)은 선택적으로 배양물의 오염을 방지하기 위한 에어 필터(131)를 가질 수 있다. 폭기 시스템(130)은 배양물에 대한 공기 수준, DO 및 탱크(100) 내부 압력을 원하는 수준으로(예를 들어, 일정하게) 유지하는 기능을 할 수 있다.
특정 구현예에서, 반응기 시스템(10)에는 폭기 시스템(130)이 이를 통해 공기를 공급하는 고유한 살포 시스템(140)이 장착될 수 있다. 일부 구현예에서, 살포 시스템(140)은 탱크(100)의 하단에 고정된다.
바람직하게는, 이 살포 시스템(140)은 공기의 미세 기포를 생성하는 복수의 폭기 장치(141)를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 살포 시스템(140)은 중앙 공기 공급 파이프(142)에 수직으로 연결된 스테인리스 스틸 미세 다공성 파이프를 포함하는 4 내지 10개의 폭기 장치(141)를 포함한다. 미세 다공성 파이프는 복수의(예를 들어, 수십 내지 수백) 구멍(도시되지 않음)을 포함하며, 이를 통해 공기가 미세 기포 형태로 배양물 내로 주입된다.
바람직한 구현예에서, 폭기 장치(141)의 미세 다공성 파이프의 구멍은 직경이 1 마이크론 이하, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.5 마이크론, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 0.2 마이크론이다. 고유한 미세 다공성 설계에 의해 배양물 전체에 산소를 분산시킬 수 있다. 나아가, 마이크론 이하 크기의 구멍을 통해 공기를 주입함으로써, 오염 미생물이 폭기 시스템(130) 및 공기 공급부(142)를 통해 배양물로 유입되는 것이 방지된다.
일부 구현예에서, 살포 시스템(140)은 하나 이상의 추가 폭기 장치(143)를 포함한다. 추가 폭기 장치(143)는 탱크(100) 하단에 고정될 수 있거나 탱크 (100)의 하단과 상단 사이의 지점, 예컨대 탱크(100) 높이의 중간 지점에서 탱크(100) 내로 돌출될 수 있다.
일 구현예에서, 임펠러(113)는 미세 기포가 더 큰 크기의 기포로 합쳐지는 것을 방지한다.
반응기 시스템(10)에는 반응기 시스템(10)을 가동하기 전 및/또는 후에 증기 멸균 주기를 가동하기 위한 시스템(도시되지 않음)이 장착될 수 있다. 특정 구현예에서, 이 증기 멸균 시스템은 자동화된다.
반응기 시스템(10)은 공기를 방출하기 위한 오프 가스 시스템(도시되지 않음)을 포함할 수 있다. 기포의 발생을 억제하기 위하여, 기계적 소포 장치나 화학 또는 생화학 소포 첨가제의 첨가와 같은 소포 수단을 사용할 수도 있다.
일부 구현예에서, 반응기 시스템(10)은 프로그램 가능형 논리 제어기(PLC; 170)에 의해 제어된다. 특정 구현예에서, 이 PLC(170)는 터치 스크린 및/또는 자동화된 인터페이스를 갖는다. 이 PLC(170)는 반응기 시스템을 시작 및 중지하고, 발효 전반에 걸쳐 예컨대 온도, DO 및 pH를 모니터링하고 조절하는 데에 사용될 수 있다. 원하는 측정은 반응기 시스템(10)이 현장으로 전달되기 전에 또는 작동 전에 현장에서 컴퓨터(170)에 프로그래밍될 수 있다.
일 구현예에서, 반응기 시스템(10)은 기능적 제어/센서/프로브(150)를 갖거나 배양 파라미터를 자동 또는 수동으로 측정하기 위해 기능적 제어/센서/프로브에 연결될 수 있다. 이 파라미터는 예컨대 pH, DO, 압력, 온도, 교반기 샤프트 동력, 습도, 점도, 미생물 밀도 및/또는 대사 산물 농도를 포함할 수 있다.
프로브(150)는 컴퓨터 시스템, 예컨대 PLC(170)에 연결되고, 이는 전자 패널(160)을 사용하여 프로브(150)의 판독 값을 기반으로 발효 파라미터를 조정할 수 있다. 조정은 자동으로 또는 사용자가 수동으로 지시하여 수행될 수 있다.
pH는 사용자에 의해 특정 수치로 설정되거나 발효 공정 전체에 걸쳐 프로브(150) 판독 값에 따라 pH의 변화를 지시하도록 컴퓨터(170)가 미리 프로그램될 수 있다. pH 조정이 수동으로 수행되는 경우, 당 업계에 공지된 pH 측정 도구가 수동 시험 시스템에 포함될 수 있다.
온도는 사용자에 의해 특정 수치로 설정되거나 발효 공정 전체에 걸쳐 프로브(150) 판독 값에 따라 온도의 변화를 지시하도록 컴퓨터(170)가 미리 프로그램될 수 있다. 특정 구현예에서, 온도 프로브(150)는 온도계이다. 온도 측정은 위에서 설명한 온도 제어 시스템을 자동 또는 수동으로 제어하는 데 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 배양물의 미생물이 산소를 소비하고 복제함에 따라서 DO는 연속적으로 모니터링 및 조정된다. 예를 들어, 프로브(150)로부터의 DO 판독 값에 응답하여, 컴퓨터(170)는 폭기 시스템(130)이 DO를 (포화의) 약 30%로 일정하게 유지하도록 지시할 수 있다. 일 구현예에서, 이는 캐스케이드(cascade)에 의해 달성될 수 있는데, 미생물이 성장하고 더 많은 양의 산소를 소비함에 따라 산소 투입량이 꾸준히 증가한다.
온도와 pH를 모니터링 및 제어하는 것 외에도, 각 반응기 시스템(10)은 예컨대 교반, 발포, 미생물 배양물의 순도, 원하는 대사 산물의 생산 등을 모니터링 및 제어하는 능력을 가질 수 있다. 반응기 시스템(10)은 예컨대 태블릿, 스마트폰, 또는 데이터를 무선으로 송수신할 수 있는 다른 모바일 컴퓨팅 장치를 사용하여 이들 파라미터(도시되지 않음)를 원격 모니터링하도록 추가로 구성될 수 있다.
추가 구현예에서, 탱크(10)는 또한 용기 내부의 미생물의 성장(예를 들어, 세포 수 및 성장 단계의 측정)을 모니터링할 수 있다. 또는, 일일 샘플을 용기로부터 채취하여 희석 평판 배양(dilution plating) 기술과 같이 당 업계에 공지된 기술에 의해 계수할 수 있다. 희석 평판 배양은 샘플의 박테리아 수를 추정하는 데 사용되는 간단한 기술이다. 이 기술은 또한 상이한 환경 또는 처리가 비교될 수 있는 지수를 제공할 수 있다.
일 구현예에서, 반응기 시스템(10)은 적절한 양의 원하는 미생물 균주를 포함하는 미생물 산물의 현장 생산을 위해 제공될 수 있는 이동형 또는 운반형 생물 반응기이다. 기존 생산의 박테리아 안정화, 보존, 저장 및 수송 공정에 의존하지 않으면서 미생물 산물이 적용 현장에서 생산되기 때문에, 훨씬 더 높은 밀도의 살아 있는 미생물이 생성되어, 현장 적용에 사용되기 위해 훨씬 적은 부피의 미생물 조성물이 요구될 수 있다. 이는 스케일 다운된 생물 반응기(예를 들어, 더 작은 발효 탱크, 더 작은 양의 출발 물질, 영양소, pH 조절제 및 소포제 등)를 가능하게 하여 시스템의 이동성 및 운반성을 향상시킨다.
반응기 시스템(10)은 장치(10) 구성 요소를 지지하기 위한 프레임 또는 스탠드(180)를 포함할 수 있다. 시스템(10)은 장치(10)를 이동시키기 위한 바퀴(도시되지 않음)뿐만 아니라 장치(10)를 움직일 때 조종하고, 밀고, 당기기 위한 핸들(도시되지 않음)을 포함할 수 있다. 나아가, 시스템(10)은 지게차를 이용한 효율적인 운반을 위해 지게차 포켓(도시되지 않음)을 포함할 수 있다.
반응기 시스템(10)은 픽업 트럭, 플랫 베드 트레일러 또는 세미 트레일러상에서 운송하기에 적합하거나, 플랫 베드 트럭, 트럭 트레일러 및/또는 세미 트레일러의 후면상에 배치될 수 있다.
미생물
본 발명에 따라 생산된 미생물 및 그 성장 산물은 예컨대 순수한 또는 미정제의 바이오 계면활성제, 에탄올, 바이오 살충제, 영양 화합물, 인슐린과 같은 치료 단백질, 백신으로 유용한 화합물, 효소 및 바이오 폴리머를 포함하는 광범위한 유용한 제품을 생산하는 미생물 공장으로서 작용할 수 있다.
이 미생물은 예컨대 박테리아, 효모 및/또는 진균일 수 있다. 이 미생물은 천연 또는 유전자 변형된 미생물일 수 있다. 예를 들어, 미생물은 특정 유전자로 형질 전환되어 특정 특성을 나타낼 수 있다. 미생물은 또한 원하는 균주의 돌연변이일 수 있다. 본 명세서에서, "돌연변이"는 기준 미생물의 균주, 유전자 변이체 또는 아형을 의미하며, 여기서 돌연변이는 기준 미생물과 비교할 때 하나 이상의 유전자 변이(예를 들어, 점 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 결실, 복제, 프레임 시프트 돌연변이 또는 반복 확장)를 갖는다. 돌연변이를 제조하는 절차는 미생물학 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, UV 돌연변이 유발 및 니트로소구아니딘(nitrosoguanidine)이 이 목적을 위해 광범위하게 사용된다.
일 구현예에서, 미생물은 효모 또는 진균이다. 본 발명에 따른 용도에 적합한 효모 및 진균 종들은 아카우로스포라(Acaulospora), 아스페르길루스(Aspergillus), 아우레오바시디움( Aureobasidium)(예를 들어, A. 풀루란스(A. pullulans)), 블라케스레아(Blakeslea), 칸디다(Candida)(예를 들어, C. 알비칸스(C. albicans), C. 아피콜라(C. apicola), C. 바티스태(C. batistae), C. 봄비콜라(C. bombicola), C. 플로리콜라(C. floricola), C. 쿠오이(C. kuoi), C. 리도센시스(C. riodocensis), C. 스텔레이트(C. stellate)), 데바리오마이세스(Debaryomyces)(예를 들어, D. 한제니(D. hansenii)), 엔토모프토라(Entomophthora), 한세니아스포라(Hanseniaspora)(예를 들어, H. 우바룸(H. uvarum)), 한세눌라(Hansenula), 이사첸키아(Issatchenkia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 모르티에렐라(Mortierella), 무코르( Mucor)(예를 들어, M. 피리포르미스(M. piriformis)), 페니실리움(Penicillium), 피디움(Phythium), 피코마이세스(Phycomyces), 피키아(Pichia)(예를 들어, P. 아노말라(P. anomala), P. 귀엘리에몬디이(P. guielliermondii), P. 옥시덴탈리스(P. occidentalis), P. 쿠드리아브제비이(P. kudriavzevii)), 슈도지마(Pseudozyma)(예를 들어, P. 애피디스(P. aphidis)), 리조푸스(Rhizopus), 로도토룰라(Rhodotorula)(예를 들어, R. 보고리엔시스(R. bogoriensis)), 사카로미세스(Saccharomyces)(예를 들어, S. 세레비시아(S. cerevisiae), S. 불라디이 세퀘라(S. boulardii sequela), S. 토룰라(S. torula)), 스타르메렐라(Starmerella)(예를 들어, S. 봄비콜라(S. bombicola)), 토룰롭시스(Torulopsis), 트라우스토키트리움(Thraustochytrium), 트리코데르마(Trichoderma)(예를 들어, T. 리세이(T. reesei), T. 하르지아눔(T. harzianum ), T. 비렌스(T. virens)), 우스틸라고(Ustilago)(예를 들어, U. 마이디스(U. maydis)), 위케르하미엘라(Wickerhamiella)(예를 들어, W. 도메릭키아(W. domericqiae)), 위케르하모미세스(Wickerhamomyces)(예를 들어, W. 아노말루스(W. anomalus)), 윌리옵시스(Williopsis) 및 자이고사카로미세스(Zygosaccharomyces)를 포함한다.
일 구현예에서, 미생물은 "킬러 효모"로 알려진 효모이다. 본 명세서에서, "킬러 효모"는 독성 단백질 또는 당 단백질의 분비를 특징으로 하는 효모 균주를 의미하는데, 균주 자체는 이들에 대해 면역이 있다. 킬러 효모에 의해 분비된 외독소(exotoxins)는 다른 효모, 진균 또는 박테리아 균주를 죽일 수 있다. 킬러 효모는, 이것으로 제한되지 않으면서, 예컨대 칸디다(Candida)(예를 들어, C. 노다엔시스(C. nodaensis)), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 데바리오미세스(Debaryomyces)(예를 들어, D. 한제니(D. hansenii)), 한세니아스포라(Hanseniaspora)(예를 들어, H. 우바룸(H. uvarum)), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)(예를 들어, K. 파피이(K. phaffii)), 피키아(Pichia)(예를 들어, P. 아노말라(P. anomala), P. 귀엘리에몬디이(P. guielliermondii), P. 옥시덴탈리스(P. occidentalis), P. 쿠드리아브제비이(P. kudriavzevii)), 사카로미세스(Saccharomyces)(예를 들어, S. 세레비시아(S. cerevisiae)), 토룰롭시스(Torulopsis), 우스틸라고(Ustilago)(예를 들어, U. 마이디스(U. maydis)), 위케르하모미세스(Wickerhamomyces)(예를 들어, W. 아노말루스(W. anomalus)), 윌리옵시스(Williopsis)(예를 들어, W. 므라키이(W. mrakii), 자이고사카로미세스(Zygosaccharomyces)(예를 들어, Z. 바일리이(Z. bailii)) 등을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 미생물은 바이오 계면활성제 생산 효모이다. 예를 들어, 스타르메렐라 봄비콜라와 위케르하모미세스 아노말루스는 당지질을 생산할 수 있다. 반면, 슈도지마 애피디스는 만노실에리트리톨 리피드를 생산할 수 있다.
이 시스템은 또한 석유 회수를 향상시키고 파라핀 분해를 수행할 수 있는 하나 이상의 효모 균주, 예컨대 스타르메렐라(칸디다) 봄비콜라, 칸디다 아피콜라, 칸디다 바티스태, 칸디다 플로리콜라, 칸디다 리도센시스, 칸디다 스텔레이트, 칸디다 쿠오이, 칸디다 종 NRRL Y-27208, 로도토룰라 보고리엔시스 종, 위케르하미엘라 도메릭키아뿐만 아니라 스타르메렐라 계통(clade)의 당지질 생산 기타 균주를 생산하는 데 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 미생물은 그람 양성(Gram-positive) 및 그람 음성(Gram-negative) 박테리아를 포함하는 박테리아이다. 박테리아는 예컨대 아그로박테리움(Agrobacterium)(예를 들어, A. 라디오박터(A. radiobacter)), 아스로박터(Arthrobacter)(예를 들어, A. 라디오박터(A. radiobacter)), 아조모나스 종(Azomonas spp.), 아조토박터(Azotobacter)(예를 들어, A. 비넬란디이(A. vinelandii), A. 크로오코큠(A. chroococcum)), 아조스피릴륨(Azospirillum)(예를 들어, A. 브라실리엔시스(A. brasiliensis)), 바실러스(Bacillus)(예를 들어, B. 아밀로리퀴파시엔스(B. amyloliquifaciens), B. 피르무스(B. firmus), B. 라테로스포루스(B. laterosporus), B. 리체니포르미스(B. licheniformis), B. 메가테리움(B. megaterium), B. 무실라지노서스(B. mucilaginosus), B. 서브틸리스(B. subtilis)), 베이어린키아 종(Beijerinckia spp.), 브라디리조븀(Bradyrhizobium)(예를 들어, B. 자파니슘(B. japanicum), B. 파라스포니아(B. parasponia)), 클라비박터(Clavibacter)(예를 들어, C. 자일 아종 자일(C. xyli subsp. xyli), C. 자일 아종 시노돈티스(C. xyli subsp . cynodontis)), 클로스트리디움(Clostridium)(예를 들어, C. 부티리슘(C. butyricum), C. 티로부티리슘(C. tyrobutyricum), C. 아세토부티리슘(C. acetobutyricum), 클로스트리디움 NIPER 7(Clostridium NIPER 7), C. 베이어린키이(C. beijerinckii)), 시아노박테리아 종(Cyanobacteria spp.), 데르시아 종(Derxia spp.), 에르위니아(Erwinia)(예, E. 카로토보라(E. carotovora)), 대장균(Escherichia coli), 프라테우리아(Frateuria)(예를 들어, F. 아우란티아(F. aurantia)), 클렙시엘라 종(Klebsiella spp.), 마이크로박테리움(Microbacterium)(예를 들어, M. 라에바니포만스(M. laevaniformans)), 판토에아(Pantoea)(예를 들어, P. 아글로메란스(P. agglomerans)), 노카르디아 종(Nocardia spp.), 판토에아(Pantoea)(예를 들어, P. 아글로메란스(P. agglomerans)), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들어, P. 아에루지노사(P. aeruginosa), P. 클로로라피스 아종 아우레오파시엔스(P. chlororaphis subsp. aureofaciens)(클루이베르(Kluyver)), P. 푸티다(P. putida)), 랄스로니아(Ralslonia)(예를 들어, R. 에울로파(R. eulropha), 리죠븀(Rhizobium)(예를 들어, R. 자포니슘(R. japonicum), 시노리조븀 메릴로티(Sinorhizobium meliloti), 시노리조븀 프레디이(Sinorhizobium fredii), R. 레구미노사륨 비오바르 트리폴리(R. leguminosarum biovar trifolii), R. 에틸리(R. etli)), 로도스피릴륨(Rhodospirillum)(예를 들어, R. 루브룸(R. rubrum)), 스핀고모나스(Sphingomonas)(예, S. 파우시모빌리스 (S. paucimobilis)), 스트렙토미세스(Streptomyces)(예를 들어, S. 그리세오크로모게네스(S. griseochromogenes), S. 쿠리세우스(S. qriseus), S. 카카오이(S. cacaoi), S. 아우레우스(S. aureus), S. 카수가에니스(S. kasugaenis)), 스트렙토베르티실륨(Streptoverticillium)(예를 들어, S. 리모파시엔스(S. rimofaciens)) 및/또는 산토모나스(Xanthomonas)(예를 들어, X. 캄페스트리스(X. campestris))일 수 있다.
일 구현예에서, 미생물은 예컨대 B. 서브틸리스 변종 로커스(B. subtilis var. locuses) B1 또는 B2와 같은 B. 서브틸리스의 균주이며, 이는 예컨대 서팩틴 및 다른 리포펩티드 바이오 계면활성제의 효과적인 생산자이다. 본 명세서는 본원에 개시된 가르침과 부합하는 범위 내에서 국제출원공개 제WO 2017/044953 A1호를 참조로서 포함한다. 다른 구현예에서, 미생물들은 바실러스 리체니포르미스 균주이며, 이는 레반(levan)과 같은 바이오 폴리머뿐만 아니라, 리케니신과 같은 리포펩티드 바이오 계면활성제의 효과적인 생산자이다.
일 구현예에 있어서, 미생물은 P. 클로로라피스와 같은 슈도모나스의 비병원성 균주이다.
예컨대 상당한 양의 당지질, 리포펩티드, 만노단백질, 베타-글루칸 및 유용한 산업적 특성(예를 들어, 바이오 유화 특성, 표면/계면장력 감소 특성)을 갖는 다른 대사 산물을 축적할 수 있는 균주를 포함하는 다른 미생물 균주가 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 한 종류의 미생물이 하나의 반응기 시스템에서 성장한다. 다른 구현예에서, 성장 또는 최종 생산물에 악영향을 끼치지 않고 함께 성장할 수 있는 복수의 미생물들이 하나의 반응기 시스템에서 성장할 수 있다. 예를 들어, 하나의 반응기 시스템에 동시에 성장하는 2 내지 3 또는 그 이상의 다른 미생물들이 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 미생물이 반응기에서 공생적으로 성장한다.
미생물 성장 부산물
본 발명의 방법과 시스템은 예컨대 바이오 계면활성제, 효소, 산, 바이오 폴리머, 용매 및/또는 다른 미생물 대사 산물과 같은 유용한 미생물 성장 부산물을 생산하는 데 사용될 수 있다. 미생물은 대사 산물의 생산에 유리한 조건하에서 배양되고, 대사 산물은 배양물로부터 추출되며, 선택적으로 정제 및/또는 농축된다.
구체적 구현예에서, 성장 부산물은 바이오 계면활성제이다. 바람직한 구현예에서, 바이오 계면활성제는 당지질 또는 리포펩티드이다.
바이오 계면활성제는 미생물에 의해 생산되는 표면 활성 물질의 구조적으로 다양한 그룹이다. 바이오 계면활성제는 생분해성이며, 선택적인 유기체를 사용하여 재생 가능한 기질상에서 쉽고 저렴하게 생산될 수 있다. 대부분의 바이오 계면활성제 생산 유기체는 성장 배지 내의 탄화수소원(예를 들어, 오일, 설탕, 글리세롤 등)의 존재에 반응하여 바이오 계면활성제를 생산한다. 철의 농도와 같은 다른 배지 성분도 바이오 계면활성제의 생산에 크게 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 슈도모나스 종에 의한 RLP의 생산은 암모늄보다는 질산염이 질소원으로 사용될 때 증가될 수 있다. 또한, 철, 마그네슘, 나트륨 및 칼륨의 농도; 탄소:인의 비율; 및 교반이 람노리피드의 생산에 크게 영향을 미칠 수 있다.
모든 바이오 계면활성제는 양친매성(amphiphiles)이다. 이들은 극성(친수성) 부분과 비극성(소수성) 기의 2개 부분으로 구성된다. 이들의 양친매성 구조로 인해, 바이오 계면활성제는 소수성의 비수용성 물질의 표면적을 증가시키고, 이러한 물질들의 수 생체이용률(water bioavailability)을 증가시키며, 박테리아 세포 표면들의 특성들을 변경시킨다.
바이오 계면활성제는 저 분자량의 당지질(예를 들어, 람노리피드, 소포로리피드, 만노실에리트리톨 리피드), 리포펩티드(예를 들어, 서팩틴), 플라보리피드(flavolipids), 인지질(phospholipids) 및 지질단백질(lipoproteins), 리포다당류-단백질 복합체(lipopolysaccharide-protein complexes) 및 다당류-단백질-지방 산 복합체(polysaccharide-protein-fatty acid complexes)와 같은 고 분자량의 고분자를 포함한다. 바이오 계면활성제 분자의 공통된 친유성 부분은 지방산의 탄화수소 사슬인 한편, 친수성 부분은 중성 지질의 에스테르 또는 알코올 기들에 의해, 지방산 또는 아미노산(또는 펩티드), 플라보리피드의 경우 유기산의 카르복실 기에 의해, 또는 당지질의 경우 탄수화물에 의해 형성된다.
미생물 바이오 계면활성제는 박테리아, 진균 및 효모와 같은 다양한 미생물에 의해 생산된다. 바이오 계면활성제를 생산하는 예시적인 미생물은 스타르메렐라 종(S. 봄비콜라), 슈도모나스 종(P. 아에루지노사, P. 푸티다, P. 플로레센스(P. florescens), P. 프라기(P. fragi), P. 시린가에(P. syringae)); 플라보박테륨 종(Flavobacterium spp.); 바실러스 종(B. 서브틸리스, B. 푸밀루스(B. pumillus), B. 세레우스(B. cereus), B. 리체니포르미스); 위케르하모미세스 종, 칸디다 종(C. 알비칸스, C. 루고사(C. rugosa), C. 트로피칼리스(C. tropicalis), C. 리포리티카(C. lipolytica), C. 토룰롭시스(C. torulopsis)); 로도코쿠스 종(Rhodococcus spp.); 아스로박터 종(Arthrobacter spp.); 캄필로박터 종(Campylobacter spp.); 코르니박테륨 종(Cornybacterium spp.); 피키아 종(Pichia spp.); 스타르메렐라 종(Starmerella spp.) 및 여기에 열거된 다른 것들을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 시스템들에 의해 생산되는 바이오 계면활성제는 서팩틴 및 람노리피드(RLP), 소포로리피드(SLP), 트레할로스 리피드 또는 만노실에리트리톨 리피드(MEL)와 같은 당지질을 포함한다. 구체적 구현예에서, 본 시스템은 SLP 및/또는 MEL을 대규모로 생산하는 데 이용된다.
소포로리피드는 예컨대 스타르메렐라 계통의 다양한 효모들에 의해 생산되는 당지질 바이오 계면활성제이다. 연구되었던 스타르메렐라 계통의 효모들 중에서, 칸디다 아피콜라와 스타르메렐라 봄비콜라로부터 소포로리피드의 최대 수율이 보고되었다. SLP는 긴 사슬의 하이드록시 지방산에 연결되어 있는 이당류 소포로스(sophorose)로 구성된다. 이 SLP는 17-L-하이드록시옥타데칸(17-L-hydroxyoctadecanoic)이나 17-L-하이드록시-Δ9-옥타데칸(17-L-hydroxy-Δ9-octadecenoic) 산에 β-글리코시드 결합된 부분적으로 아세틸화된 2-O-β-D-글루코피라노실-D-글루코피라노스 유닛(acetylated 2-O-β-D-glucopyranosyl-D-glucopyranose unit)이다. 하이드록시 지방산은 일반적으로 16 또는 18 탄소 원자들이 있고, 하나 또는 그 이상의 불포화 결합들을 포함할 수 있다. 지방산 카르복실기는 자유롭거나(산성 또는 개방형) 4"-위치에서 내부적으로 에스테르화될 수 있다(락톤 형태).
만노실에리트리톨 리피드는 다양한 효모와 진균 균주에 의해 생산되는 바이오 계면활성제의 당지질 류이다. 유효한 MEL 생산은 각각의 종(species)에 의해 생산되는 MEL 구조에서 상당한 가변성을 가지면서, 슈도지마 속(genus)으로 주로 한정된다. MEL은 그들의 당 부분(sugar moiety) 또는 친수성 유닛으로서 4-O-b-D-만노피라노실-에리트리톨(4-O-b-D-mannopyranosyl-erythritol)을 포함한다. 만노피라노실의 C-4'와 C-6' 위치에서 아세틸화의 정도에 따라, MEL은 MEL-A, MEL-B, MEL-C 및 MEL-D로 분류된다. MEL-A는 디아세틸화된 화합물을 나타내는 반면, MEL-B와 MEL-C는 각각 C-6' 및 C-4'에서 모노아세틸화되어 있다. 완전히 탈아세틸화된 구조는 MEL-D에 기인한다. 슈도지마 외에, 최근에 분리된 균주인 우스틸라고 시타미네아(Ustilago scitaminea)는 사탕수수 즙으로부터 풍부한 MEL-B 생산을 보여주었다. MEL은 유효한 국소 습윤제로서 작용하고, 손상된 털을 회복시킬 수 있다. 나아가, 이 화합물들은 보호 및 치유 활성을 보여주고, 섬유아세포(fibroblasts)와 유두 세포(papilla cells)를 활성화시키며, 천연 산화방지제로서 작용한다.
SLP와 MEL의 구조와 조성으로 인해, 이 바이오 계면활성제는 우수한 표면 및 계면장력 감소 특성뿐만 아니라, 다른 유익한 생화학적 특성들을 가지는데, 이는 대규모 산업 및 농업적 용도와 같은 응용에서, 그리고 화장품, 가전제품 및 건강, 의료 및 제약 분야들을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 분야에서 유용할 수 있다.
바이오 계면활성제는 계면에서 축적되고, 이로써 계면장력을 감소시키며 용액에서 응집된 미셀 구조(aggregated micellular structures)의 형성으로 이어진다. 안전하고, 유효한 미생물 바이오 계면활성제는 액체, 고체 및 기체 분자들 사이의 표면 및 계면장력을 감소시킨다. 기공을 형성하고 생화학적 막을 불안정하게 만드는 바이오 계면활성제의 능력에 의해, 항균, 항진균 및 용혈 제제들로서 이용이 가능하다. 낮은 독성 및 생분해성의 특성과 결합되어, 바이오 계면활성제는 미생물 석유 회수 증진과 같이 광범위한 석유 산업 응용을 위해 석유 및 가스 산업에서 사용에 유리하다. 이 응용은, 이에 한정되지 않지만, 석유 함유 층으로부터 원유 회수의 증진; (시추공으로 석유의 흐름을 개선시키기 위해) 석유 및 가스 정(well)의 자극; 로드(rods), 튜빙, 라이너, 탱크 및 펌프와 같은 장비로부터 파라핀, 아스팔텐(asphaltenes) 및 스케일과 같은 오염물 및/또는 장애물의 제거; 석유 및 가스 생산 및 이송 장비의 부식 방지; 원유 및 천연 가스 내의 H2S 농도의 감소; 원유의 점도 감소; 중질 원유 및 아스팔텐을 경질 탄화수소 유분으로 개질; 탱크, 유선(flowlines) 및 수송관(pipelines)의 세정; 선택적 및 비선택적 막힘으로 인한 수공법 시 석유의 이동성 향상; 및 파쇄 유체(fracturing fluids)를 포함한다.
석유 및 가스 응용 분야에 사용될 때, 본 발명의 시스템은 미생물 기반 유전 조성물의 비용을 낮추는 데 이용될 수 있고, 고분자, 용제, 파쇄 모래 및 비즈, 유화제, 계면활성제 및 당 업계에 알려진 다른 물질과 같은 기타 화학적 강화제와 함께 이용될 수 있다.
본 발명에 따라 생산된 바이오 계면활성제는 예컨대 파이프, 반응기 및 다른 기계 또는 표면의 세정뿐만 아니라, 예컨대 식물 및/또는 그의 주변 환경에 적용 시 해충 방제를 포함하는, 석유 회수 외의 다른 목적을 위해 이용될 수 있다. 본 발명에 따라 생산되는 일부 바이오 계면활성제는 해충의 조직을 관통할 수 있고 보조제의 이용 없이 소량으로도 효과적이기 때문에 해충을 방제하는 데 이용될 수 있다. 임계 미셀 농도 이상의 농도에서, 바이오 계면활성제가 처리 대상물을 더 효과적으로 관통할 수 있음이 발견되었다.
생물 방지제로서 바이오 계면활성제를 생산하는 유기체 또는 바이오 계면활성제 자체를 사용하여 해충을 방제할 수 있다. 또한, 해충 방제는 바이오 계면활성제를 생산하는 유기체의 성장을 지지할 뿐만 아니라 바이오 계면활성제 살충제를 생산하기 위한 특정 기질을 사용함으로써 달성할 수 있다. 유리하게는, 천연 바이오 계면활성제는 경쟁하는 유기체의 성장을 방해하고 특정한 바이오 계면활성제를 생산하는 유기체의 성장을 향상시킬 수 있다.
또한, 이러한 바이오 계면활성제는 동물과 인간 질병을 치료하는 데 중요한 역할을 할 수 있다. 동물은 예컨대 미생물 세포 매스가 있거나 없고, 및/또는 구리나 아연과 같은 다른 화합물의 존재하에, 바이오 계면활성제 용액만에 적시거나 담금으로써 치료될 수 있다.
본 발명에 따라 생산되는 조성물은 전체 세포 배양물의 사용으로 인해 바이오 계면활성제만의 사용에 비하여 장점들을 가지는데, 이는 효모 세포벽의 외부 표면의 일부로서 만노단백질의 고 농도(만노단백질은 80% 유화 지수까지 도달할 수 있는 매우 효과적인 바이오 유화제임); 효모 세포벽 내의 바이오 폴리머 베타-글루칸(유화제)의 존재; 및 배양물 내의 바이오 계면활성제와 대사 산물(예를 들어, 젖산, 에탄올 등)의 존재를 포함한다. 이 조성물은, 많은 다른 용도 중에서, 표면/계면장력 감소 특성을 가질 수 있다.
본 반응기 시스템을 이용한 배양법
도 1~4를 참조하여, 일 구현예에서, 본 발명은 본 반응기 시스템(10)을 사용하는 미생물 배양법을 제공한다. 유리하게는, 일 구현예에서, 이 방법은 오염 없이 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 본 반응기 시스템을 사용하여 오염 없이 미생물을 배양하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 이 배양법은 물과 영양 성분을 포함하는 배양 배지를 탱크(100)에 첨가하는 단계; 반응기 시스템(10)에 생균을 접종하는 단계; 및 선택적으로, 살균제를 배양 배지에 첨가하는 단계를 포함한다. 이 살균제는 예컨대 항생제(예를 들어, 사용 위치 또는 생산되는 제품에 기초하여 허용되는 경우) 또는 당지질(예를 들어, 소포로리피드, 람노리피드)일 수 있다.
유리하게는, 본 발명의 방법 및 장비는 미생물 및 이의 대사 산물을 대규모로 생산하기 위한 자본 및 노동 비용을 감소시킨다. 나아가, 본 발명의 배양 공정은 배양이 완료된 후 유기체를 농축시킬 필요성을 줄이거나 제거한다. 본 발명은 영양 배지 단위 당 미생물 산물의 수율을 실질적으로 증가시킬 뿐만 아니라 생산을 단순화하고 운반 가능성을 향상시키는 배양법을 제공한다.
미생물 기반 조성물이 사용이 의도된 장소 또는 그 근처에서 생산될 수 있기 때문에, 이러한 운반 가능성에 의해 상당한 비용을 절감할 수 있다. 원하는 경우 현지의 재료를 사용하여 현장에서 최종 조성물을 제조할 수 있으며, 따라서 운송 비용이 절감됨을 의미한다. 따라서, 이 조성물은 적용 시 생균을 포함할 수 있으며, 이는 제품의 효능을 증가시킬 수 있다. 또한, 이 조성물은 특정 위치에서의 조건에 이상적인 실시간으로 맞춤화될 수 있다.
나아가, 특정 구현예에서, 본 발명의 시스템(10)은 자연 발생의 지역 미생물 및 그의 대사 부산물의 능력을 활용한다. 지역 미생물 군집의 사용은, 원격의 경우를 포함하여, 이것으로 제한되지는 않지만, 농업, 환경 개선(예컨대, 기름 유출의 경우), 축산, 양식, 임업, 목초지 관리, 잔디 관리, 원예용 장식 생산, 폐기물 폐기와 처리, 폐수 처리, 식량 생산 및 가공, 채광, 석유 회수 및 인간 건강 등을 포함하는 경우에 유리할 수 있다.
본 발명은 신규한 생물학적 반응기(10)를 사용하여 미생물을 효율적으로 생산하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 본 방법에 따라서 담수가 현지 공급원으로부터 공급되어 멸균될 수 있을 것으로 기대되지만, 이 시스템은 예컨대 장비, 멸균 공급 및 배양 배지 성분을 포함하여 발효(또는 배양) 공정에 필요한 모든 물질을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 반응기 시스템(10)에는 생균의 접종원이 제공된다. 바람직하게는, 미생물은 생화학적 생산 미생물이며, 예컨대 바이오 계면활성제, 효소, 용매, 바이오 폴리머, 산 및/또는 다른 유용한 대사 산물을 축적할 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 미생물은 생화학적 생산 효모(킬러 효모 포함), 진균 및/또는 박테리아이며, 여기에 열거된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 반응기 시스템(10)에는 배양 배지가 제공된다. 배지는 영양 공급원, 예컨대 탄소원, 지질원, 질소원 및/또는 미량 영양 공급원을 포함할 수 있다. 각각의 탄소원, 지질원, 질소원 및/또는 미량 영양 공급원은 발효 공정 동안 적절한 시점에 반응기에 첨가될 수 있는 개별 패키지로 제공될 수 있다. 각각의 패키지는 발효 공정 동안 특정 지점(예를 들어, 효모, pH 및/또는 영양 수준이 특정 농도 이상 또는 아래로 떨어질 때) 또는 시점(예를 들어, 10시간, 20시간, 30시간, 40시간 후 등)에 첨가될 수 있는 몇몇 서브 패키지를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 배양 공정에서 사용되는 발효 배지, 공기 및 장비는 멸균된다. 탱크(100)와 같은 배양 장비는 멸균 유닛, 예컨대 오토클레이브나 스티머(도시되지 않음)와 연결될 수 있지만 이로부터 분리될 수 있다.
구체적 구현예에서, 배양법은 발효 전에 본 반응기 시스템(10)을 멸균하는 단계를 포함한다. 배양 장비는 접종을 시작하기 전에 예컨대 스티머(도시되지 않음)를 사용하여 그 자리에서(in situ) 멸균하는 멸균 유닛을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 발효 전에, 반응기 시스템(10)은 오염을 방지하기 위해 과산화수소수(예를 들어, 2.0% 내지 4.0% 과산화수소; 이는 예컨대 80~90℃에서 온수 세정 전 또는 후에 수행될 수 있음)로 세척될 수 있다. 또한, 혹은 대안으로서, 탱크(100)는 상업용 소독제, 표백 용액 및/또는 온수나 스팀 린스로 세척될 수 있다.
반응기 시스템(100)은 농축된 형태의 표백제 및 과산화수소가 함께 제공될 수 있는데, 이는 나중에 사용 전에 발효 장소에서 희석될 수 있다. 예를 들어, 과산화수소는 농축된 형태로 제공될 수 있으며, 예비-린스 오염 제거를 위해 2.0% 내지 4.0% 과산화수소(중량 또는 부피)로 조제하기 위해 희석될 수 있다.
반응기(예를 들어, 탱크, 포트, 살포기 및 혼합 시스템 포함)의 내부 표면은 먼저 상업용 소독제로 세척되고; 이어서 2% 내지 4%의 과산화수소, 바람직하게는 3%의 과산화수소로 분무되고(또는 고 분산 스프레이 시스템으로 분무됨); 최종적으로 약 105℃ 내지 약 110℃ 이상의 온도에서 스팀 처리될 수 있다.
공기는 당 업계에 공지된 방법에 의해 멸균될 수 있다. 예를 들어, 공기는 탱크(100) 내로 공급되기 전에 적어도 하나의 필터(131)를 통과할 수 있다.
배양 배지 성분(예를 들어, 탄소원, 물, 지질원, 미량 영양소 등)도 멸균될 수 있다. 이는 온도 오염 제거(예를 들어, 오토클레이빙) 및/또는 과산화수소 오염 제거(잠재적으로 HCl, H2SO4 등과 같은 산을 사용하여 과산화수소를 중화하는 단계가 후속됨)를 사용하여 달성할 수 있다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 반응기 시스템 내부에서 멸균된다. 배지가 탱크(100)에 첨가된 후, 배지를 외부 순환 시스템을 통해 순환시킴으로써 탱크 내부의 온도가 비등점까지 상승된다. 배지는 이어서 바람직하지 않은 오염 유기체를 제어하기 위해 일정 시간 동안 비등되고, 시스템(10)은 시스템(10)에 생균을 접종하기에 적합한 더 낮은 온도로 복귀된다.
다른 구현예에서, 배지는 저온 살균될 수 있거나 또는 선택적으로 첨가된 열이 전혀 없을 수 있으며, 여기서 원치 않는 박테리아 성장을 제어하기 위해 낮은 수분 활성과 낮은 pH가 활용될 수 있다.
구체적 구현예에서, 배양 배지에 사용되는 물은 인라인 자외선(UV) 수 살균기(도시되지 않음)를 사용하여 자외선 살균되고, 예컨대 서브 마이크론 워터 필터 및/또는 탄소 필터(도시되지 않음)를 사용하여 여과된다.
오염을 추가로 방지하기 위해, 시스템의 배양 배지는 배양 공정 전 및/또는 그 동안 첨가되는 추가의 산, 항생제 및/또는 항균제를 포함할 수 있다. 하나 이상의 항균성 물질은 예컨대 스트렙토마이신, 옥시테트라사이클린, 소포로리피드 및 람노리피드를 포함할 수 있다. 항생제의 추가는 현지 규정 및/또는 그 사용을 금지할 수 있는 기타 요인에 따라 달라진다.
접종은 탱크(100)에서 수행될 수 있으며, 이 시점에서 카오스 혼합 구조(110 및 120)를 사용하여 접종원이 혼합된다. 총 발효 시간은 10 내지 200시간, 바람직하게는 20 내지 180시간의 범위일 수 있다.
본 시스템(10) 및 방법에서 이용되는 발효 온도는 예컨대 약 25 내지 40℃일 수 있지만, 공정은 이 범위 밖에서 작동할 수 있다. 일 구현예에서, 미생물 배양법은 약 5 내지 약 100℃, 바람직하게는 15 내지 60℃, 더 바람직하게는 25 내지 50℃에서 수행된다. 추가의 구현예에서, 배양은 일정한 온도에서 연속적으로 수행될 수 있다. 다른 구현예에서, 배양은 그 온도가 변할 수 있다.
배지의 pH는 관심 미생물에 적합해야 한다. 완충 염과 탄산염 및 인산염 같은 pH 조절제가 최적 값 근처에서 pH를 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 금속 이온이 고 농도로 존재하는 경우, 액체 배지에 킬레이트제를 사용하는 것이 필요할 수 있다.
특정 구현예에서, 미생물은 약 2.0 내지 약 10.0의 pH 범위, 더 구체적으로 약 3.0 내지 약 7.0의 pH 범위(예를 들어, HCl, KOH, NaOH, H2SO4 및/또는 H3PO4와 같은 염기, 산 및 완충제를 사용하여 pH를 수동으로 또는 자동으로 조정함)에서 발효될 수 있다. 본 발명은 또한 이 pH 범위 밖에서 실시될 수 있다.
발효는 제1 pH(예를 들어, 4.0 내지 4.5의 pH)에서 시작한 후, 나머지 공정을 위해 제2 pH(예를 들어, 3.2 내지 3.5의 pH)로 변경하여, 오염을 피하고 다른 바람직한 결과를 생성하는 것을 도울 수 있다(제1 pH는 제2 pH보다 높거나 낮을 수 있음).
일 구현예에서, 원하는 바이오매스 축적이 달성된 후, 예컨대 발효 개시 후 0시간 내지 200시간, 더 구체적으로 12시간 내지 120시간 후, 보다 구체적으로 24시간 내지 72시간 후에, pH를 제1 pH로부터 제2 pH로 조정한다.
일 구현예에서, 배양 배지의 수분 수준은 관심 미생물에 적합해야 한다. 추가 구현예에서, 수분 수준은 20% 내지 90%, 바람직하게는 30% 내지 80%, 더 바람직하게는 40% 내지 60%의 범위일 수 있다.
본 발명의 배양 공정은 혐기성, 호기성 또는 이들의 조합일 수 있다. 바람직하게는, 이 공정은 호기성이며, 발효 동안 용존 산소 농도를 포화의 10% 또는 15% 이상으로 유지하지만, 일부 구현예에서는 20% 이내, 일부 구현예에서는 30% 이내로 유지한다.
유리하게는, 시스템(10)은 예컨대 카오스 혼합 구조(110 및 120)와 조합된 살포 시스템(140)을 이용하여 성장 배양물의 산소화를 용이하게 제공한다. 배양물의 일정한 순환과 살포 시스템(140)으로부터 미세 기포의 주입에 의해 산소화된 공기가 시스템(10)으로 도입 및 순환된다. 산소화된 공기는 연속적으로 또는 주기적으로, 예컨대 매일, 보충되는 대기 및/또는 여과된 공기일 수 있다.
일 구현예에서, 본 시스템(10)에 사용되는 배양 배지는 미생물을 위한 보충 영양소를 함유할 수 있다. 전형적으로, 이는 탄소원, 단백질, 지방 또는 지질, 질소원, 미량 원소 및/또는 성장 인자(예를 들어, 비타민, pH 조절제)를 포함한다. 영양소 농도, 수분 함량, pH 등이 특정 미생물의 성장을 최적화하기 위해 조절될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
지질원은, 트리글리세리드를 포함하여, 유리 지방산 또는 그의 염 또는 에스테르를 함유하는 식물 또는 동물 기원의 오일 또는 지방을 포함할 수 있다. 지방산의 예로는, 이것으로 제한되지 않으면서, 16 내지 18개의 탄소 원자를 함유하는 유리 및 에스테르화된 지방산, 소수성 탄소원, 팜유, 동물성 지방, 코코넛유, 올레산, 대두유, 해바라기유, 카놀라유, 스테아르산 및 팔미트산을 포함한다.
본 시스템(10)의 배양 배지는 탄소원을 추가로 포함할 수 있다. 탄소원은 통상적으로 포도당(glucose), 목당(xylose), 자당(sucrose), 젖당(lactose), 과당(fructose), 트레할로스(trehalose), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 만니톨(mannitol), 소르보스(sorbose), 리보스(ribose) 및 맥아당(maltose)과 같은 탄수화물; 아세트산, 푸마르산, 시트르산, 프로피온산, 말산, 말론산 및 피루브산과 같은 유기산; 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 에리트리톨, 이소부탄올, 자일리톨 및 글리세롤과 같은 알코올; 카놀라유, 콩기름, 미강유(rice bran oil), 올리브유, 옥수수유, 참기름 및 아마씨유(linseed oil)와 같은 지방 및 오일 등이다. 다른 탄소원은 아르부틴(arbutin), 라피노스(raffinose), 글루콘산염(gluconate), 시트르산염(citrate), 당밀(molasses), 가수분해된 녹말, 감자 추출물, 콘 시럽 및 가수분해된 셀룰로스 물질을 포함할 수 있다. 위 탄소원은 독립적으로 또는 2개 이상의 조합으로 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 미생물을 위한 성장 인자와 미량 영양소가 시스템(10)의 배지에 포함된다. 이것은 성장하는 미생물이 필요한 모든 비타민을 생산할 수 없는 것일 경우에 특히 바람직하다. 철, 아연, 칼륨, 칼슘, 구리, 망간, 몰리브덴 및 코발트와 같은 미량 원소; 인산염으로부터의 인; 및 다른 성장 자극 성분을 포함하는 무기 영양소가 본 시스템들의 배지에 포함될 수 있다. 나아가, 비타민, 필수 아미노산 및 미량 원소의 공급원은 예컨대 옥수수 가루와 같은 고운 가루 또는 굵은 가루의 형태로, 효모 추출물, 감자 추출물, 소고기 추출물, 콩 추출물, 바나나 껍질 추출물 등과 같은 추출물들의 형태로, 또는 정제된 형태로 포함될 수 있다. 아미노산, 예컨대 단백질의 생합성에 유용한 것들, 또한 포함될 수 있다.
일 구현예에서, 무기질 또는 미네랄 염 또한 포함될 수 있다. 무기염은 예컨대 인산이수소칼륨(potassium dihydrogen phosphate), 인산수소이칼륨(dipotassium hydrogen phosphate), 인산수소이나트륨(disodium hydrogen phosphate), 황산마그네슘(magnesium sulfate), 염화마그네슘(magnesium chloride), 황산철(iron sulfate), 염화철(iron chloride), 황산망간(manganese sulfate), 염화망간(manganese chloride), 황산아연(zinc sulfate), 염화납(lead chloride), 황산구리(copper sulfate), 염화칼슘(calcium chloride), 탄산칼슘(calcium carbonate), 탄산나트륨(sodium carbonate)일 수 있다. 이러한 무기염은 독립적으로 또는 2개 이상의 조합으로 사용될 수 있다.
본 시스템(10)의 배양 배지는 질소원을 추가로 포함할 수 있다. 질소원은 예컨대 질산칼륨(potassium nitrate), 질산암모늄(ammonium nitrate), 황산암모늄(ammonium sulfate), 인산암모늄(ammonium phosphate), 암모니아(ammonia), 요소(urea) 및 염화암모늄(ammonium chloride)과 같은 무기물 형태, 또는 단백질, 아미노산, 효모 추출물, 효모 자기분해물(yeast autolysates), 옥수수 펩톤(corn peptone), 카제인 가수분해물(casein hydrolysate) 및 콩 단백질(soybean protein)과 같은 유기물 형태일 수 있다. 이러한 질소원은 독립적으로 또는 2개 이상의 조합으로 사용될 수 있다.
미생물은 플랑크톤 형태로 또는 생물막으로서 성장할 수 있다. 생물막의 경우에 있어서, 탱크(100)는 그 안에 미생물이 생물막 상태로 성장할 수 있는 기질(substrate; 도시되지 않음)을 가질 수 있다. 이 시스템은 또한 예컨대 생물막 성장 특성을 촉진하거나 및/또는 향상시키는 자극(전단 응력 등)을 가할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 적어도 하나의 미생물 및/또는 이 미생물에 의해 생산된 적어도 하나의 미생물 성장 부산물을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 최종 조성물 중의 미생물은 활성 또는 비활성 형태 및/또는 생장 세포(vegetative cells), 포자(spores), 균사체(mycelia), 분생자(conidia) 및/또는 임의의 형태의 미생물 번식체 형태일 수 있다. 최종 조성물은 미생물이 성장한 배지를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 최종 조성물은 또한 건조 형태 또는 액체 형태일 수 있다.
일 구현예에서, 미생물 기반 조성물은 발효 후에 추가로 가공될 필요가 없다(예를 들어, 효모, 대사 산물 및 잔류 탄소원은 소포로피드로부터 분리될 필요가 없다). 최종 산물의 물리적 특성(예를 들어, 점도, 밀도 등)은 또한 당 업계에 공지된 다양한 화학 물질 및 물질을 사용하여 조정될 수 있다.
일 구현예에서, 미생물 기반 조성물은 미생물 대사 산물을 포함하지만 미생물은 포함하지 않으며, 여기서 미생물은 대사 산물 및/또는 다른 배양 배지 성분으로부터 분리된다. 미생물 성장 부산물을 생산하는 방법은 관심 부산물을 추출, 농축 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 현지의 필요에 따라 재료 및 방법에 대한 맞춤화를 추가로 제공한다. 예를 들어, 미생물 배양법은 현지 토양 또는 특정 유정 또는 오염 부위에 위치한 미생물을 성장시키는 데 사용될 수 있다. 유리하게는, 일부 구현예에서, 이러한 미생물은 유익하고 현지의 필요에 보다 순응할 수 있다.
본 발명에 따른 배양법은 영양 배지 단위 당 미생물 산물의 수율을 실질적으로 증가시킬 뿐만 아니라 생산 작업의 단순성을 개선한다. 나아가, 배양 공정은 발효 종료 후 미생물을 농축해야 할 필요성을 제거하거나 줄일 수 있다.
유리하게는, 본 발명의 방법은 복잡한 장비나 높은 에너지 소비를 필요로 하지 않으므로, 미생물 및 이의 대사 산물을 대규모로 생산하기 위한 자본 및 노동 비용을 감소시킨다.
미생물 기반 산물의 제조
본 발명은 유용한 미생물 기반 산물을 생산하는 데 이용될 수 있으며, 이는 미생물 및/또는 미생물 성장 부산물 및 선택적으로 성장 배지 및/또는 추가 성분, 예컨대 물, 담체, 보조제, 영양소, 점도 조절제 및 기타 활성제를 포함하는 산물을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 미생물 기반 산물은 단순히 미생물 및/또는 이 미생물 및/또는 임의의 잔류 영양소에 의해 생산된 미생물 성장 부산물을 함유하는 발효 배지이다. 발효 산물은 추출 또는 정제 없이 직접 사용될 수 있다. 원하는 경우, 추출 및 정제는 당업자에게 공지된 표준 추출 방법 또는 기술을 사용하여 쉽게 달성될 수 있다.
미생물 기반 산물 중의 미생물은 활성 또는 비활성 형태 및/또는 생장 세포(vegetative cells), 포자(spores), 균사체(mycelia), 분생자(conidia) 및/또는 임의의 형태의 미생물 번식체 형태일 수 있다. 미생물-기반 산물은 추가적인 안정화, 보존 및 저장 없이 사용될 수 있다. 유리하게는, 이 미생물 기반 산물의 직접적인 사용에 의해 미생물의 높은 생존력이 유지되고, 이물질 및 바람직하지 않은 미생물로부터의 오염 가능성이 감소되며, 미생물 성장 부산물의 활성이 유지된다.
도 1~4를 참조하여, 미생물 성장의 결과물인 미생물 및/또는 배지는 반응기 시스템(10)으로부터 제거되고, 즉시 사용하기 위해 예컨대 배관을 통해 이송될 수 있다.
다른 구현예에서, 조성물(미생물, 배지 또는 미생물과 배지)은 예컨대 의도된 용도, 고려되는 적용 방법, 발효 탱크(100)의 크기 및 미생물 성장 설비로부터 사용 위치로의 임의의 운송 방식을 고려하여, 적절한 크기의 용기(도시되지 않음)에 배치될 수 있다. 따라서, 미생물 기반 조성물이 배치되는 용기는 예컨대 1 갤런 내지 1,000 갤런 이상일 수 있다. 다른 구현예에서, 이 용기는 2 갤런, 5 갤런, 25 갤런 이상이다. 미생물 기반 조성물은 하나의 용기에서 다른 미생물 기반 조성물과 조합될 수 있다.
반응기 시스템(10)으로부터 미생물 기반 조성물을 수확한 후, 수확된 산물이 용기에 배치 및/또는 파이프로 이송(또는 사용을 위해 달리 이송됨)될 때 추가 성분이 첨가될 수 있다. 첨가제는 예컨대 완충제, 담체, 동일 또는 다른 설비에서 제조된 다른 미생물 기반 조성물, 점도 조절제, 보존제, 미생물 성장을 위한 영양소, 식물 성장을 위한 영양소, 추적제, 살충제, 제초제, 동물 사료, 식품 및 사용 목적에 맞는 기타 성분일 수 있다.
유리하게는, 본 발명에 따르면, 미생물 기반 산물은 미생물이 성장한 브로스를 포함할 수 있다. 이 산물은 예컨대 중량 기준으로 적어도 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% 또는 100% 브로스일 수 있다. 산물 중 바이오매스의 양은 중량 기준으로 예컨대 0% 내지 100%이며 이들 사이의 모든 백분율을 포함할 수 있다.
선택적으로, 산물은 사용 전에 저장될 수 있다. 저장 시간은 짧은 것이 바람직하다. 따라서, 저장 시간은 60일, 45일, 30일, 20일, 15일, 10일, 7일, 5일, 3일, 2일, 1일 또는 12시간 미만일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 생 세포가 산물에 존재하는 경우, 산물은 예컨대 20℃, 15℃, 10℃ 또는 5℃ 미만과 같은 차가운 온도에서 저장된다. 반면, 바이오 계면활성제 조성물은 전형적으로 주위 온도(ambient temperature)에서 저장될 수 있다.
본 발명은 많은 경우에 유리한 결과를 달성하기 위해 미생물 기반 산물뿐만 아니라 이 산물에 대한 용도를 제공하는데, 이는 하나 이상의 미생물 기반 산물을 원하는 부위에 적용함으로써 예컨대 개선된 생물 정화, 광업, 석유 및 가스 생산; 식품 생산과 가공; 폐기물 폐기와 처리; 가축 및 기타 동물의 건강 증진; 및 식물의 건강 및 생산성 증진을 포함한다. 미생물 기반 산물은 예컨대 미생물 접종제, 살충제, 영양원, 치료제, 화장품 및/또는 건강 제품, 세정제 및/또는 바이오 계면활성제로서 작용할 수 있다. 일 구현예에서, 배양 공정 후에 얻어진 발효 산물(예를 들어, 미생물 및/또는 대사 산물)은 전형적으로 상업적 가치가 높다.
미생물은 배양 브로스 및/또는 배양 바이오매스로서 조성물에 존재할 수 있다. 배양 브로스 및/또는 바이오매스는 건조되어(예를 들어, 분무-건조), 관심 산물을 생산할 수 있다. 바이오매스는 공지된 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 분리, 디캔팅, 분리와 디캔팅의 조합, 한외여과 또는 미세여과에 의해 분리될 수 있다.
일 구현예에서, 배양 산물은 동물 사료 또는 인간을 위한 식품 보충제로 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 배양 산물은 높은 영양 함량을 가진다. 그 결과, 보다 높은 비율의 배양 산물이 예컨대 완전한 동물 사료에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 사료 조성물은 사료의 15% 내지 사료의 100% 범위의 변형된 배양 산물을 포함한다.
배양 산물은 적어도 하나 이상의 지방, 지방산, 인지질과 같은 지질, 비타민, 필수 아미노산, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 스테롤, 효소 및 예컨대 철, 구리, 아연, 망간, 코발트, 요오드, 셀레늄, 몰리브덴, 니켈, 불소, 바나듐, 주석 및 실리콘과 같은 미량 미네랄이 풍부할 수 있다. 펩티드는 하나 이상의 필수 아미노산을 함유할 수 있다.
일 구현예에서, 필수 아미노산은 변형된 미생물 내부에 캡슐화된다. 필수 아미노산은 미생물에 의해 발현되는 이종 폴리펩티드에 함유된다. 원하는 경우, 이종 펩티드는 적절한 미생물(예를 들어, 진균)의 봉입체에 발현되고 저장된다.
본 발명의 미생물 및 미생물 성장 부산물은 또한 광석과 같은 기질의 형질 전환에 사용될 수 있으며, 여기서 형질 전환된 기질은 산물이다.
구체적 구현예에서, 본 발명의 시스템은 예컨대 작물의 생명력을 증진시키기 위한 맞춤형 농산물의 현지 생산 가능; 작물 수확량의 향상; 식물의 면역 반응 강화; 곤충, 해충 및 질병에 대한 저항력 향상; 곤충, 선충, 질병 및 잡초의 방제; 식물의 영양 개선; 농업, 임업 및 목초지 토양의 영양 성분 개선; 개선되고 보다 효율적인 물의 사용 촉진에 의해, 농업 생산성을 향상시킨다.
일 구현예에서, 미생물 기반 산물은 토양, 종자 또는 식물 부분에 적용되어 작물 수율 및/또는 식물 건강 및 성장을 향상시킬 수 있다. 유리하게는, 미생물 기반 산물은 선충과 다른 해충 및 해충에 의해 야기되는 상응하는 질병을 효과적으로 방제하는 데 사용될 수 있으며, 이와 함께 수율이 증가할 수 있다.
본 발명에 의해 제조되는 조성물은 또한 미생물 석유 회수 증진과 같은 광범위한 석유 산업 응용에 사용될 수 있다. 이 응용은, 이에 한정되지 않지만, 원유 회수의 증진; (시추공으로 석유의 흐름을 개선시키기 위해) 석유 및 가스 정(well)의 자극; 로드(rods), 튜빙, 라이너, 탱크 및 펌프와 같은 장비로부터 파라핀, 아스팔텐(asphaltenes) 및 스케일과 같은 오염물 및/또는 장애물의 제거; 석유 및 가스 생산 및 이송 장비의 부식 방지; 원유 및 천연 가스 내의 H2S 농도의 감소; 원유의 점도 감소; 중질 원유 및 아스팔텐을 경질 탄화수소 유분으로 개질; 탱크, 유선(flowlines) 및 수송관(pipelines)의 세정; 선택적 및 비선택적 막힘으로 인한 수공법 시 석유의 이동성 향상; 및 시추 유체(drilling fluids)와 파쇄 유체(fracturing fluids)를 포함한다.
석유 및 가스 생산자에 의해 사용될 때, 본 발명의 시스템은 미생물 기반 유전 조성물의 비용을 낮추는 데 이용될 수 있고, 고분자, 용제, 효소, 시추 유체, 응축액, 파쇄 모래 및 비즈, 유화제, 계면활성제 및 당 업계에 알려진 다른 물질과 같은 기타 화학적 강화제와 함께 이용될 수 있다.
미생물 기반 산물의 현지 생산
본 발명의 특정 구현예에서, 미생물 성장 설비는 신선한 고밀도의 관심 미생물 및/또는 미생물 성장 부산물을 원하는 규모로 생산한다. 미생물 성장 설비는 적용 위치 또는 그 근처에 위치할 수 있다. 도 1~4를 참조하여, 이 설비는 회분식, 준-연속식 또는 연속식 배양으로 고밀도의 미생물 기반 조성물을 생산하기 위해 본 발명의 하나 또는 복수의 반응기 시스템(10)을 포함한다.
본 발명의 미생물 성장 설비는 미생물 기반 산물이 사용될 위치(예를 들어, 감귤 과수원)에 위치할 수 있다. 예를 들어, 미생물 성장 설비는 사용 위치로부터 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 15, 10, 5, 3 또는 1 마일 미만일 수 있다.
미생물 기반 산물이 통상적인 미생물 생산의 미생물 안정화, 보존, 저장 및 수송 공정에 의존하지 않고 지역적으로 생성될 수 있기 때문에, 훨씬 더 높은 밀도의 미생물이 생성될 수 있어서, 현장 적용에 사용하기 위해 더 적은 부피의 미생물 기반 산물을 필요로 하거나 원하는 효능을 달성하기 위해 필요한 경우 훨씬 더 높은 밀도의 미생물의 적용을 가능하게 한다. 미생물 기반 산물의 현지 생산은 또한 세포 안정화의 필요성을 제거하고 산물에 성장 배지가 포함되는 것을 촉진한다. 배지는 현지 사용에 특히 적합한, 발효 중에 생성된 제제를 함유할 수 있다.
현지에서 생산된 고밀도의 강력한 미생물 배양물은 한동안 공급망에 남아 있는 것보다 현장에서 더 효과적이다. 본 발명의 미생물 기반 산물은 발효 성장 배지에 존재하는 대사 산물 및 영양소로부터 세포가 분리되는 전통적인 산물에 비해 특히 유리하다. 운송 시간이 단축되면 현지 수요에 따라 필요한 시간과 양으로 신선한 배치의 미생물 및/또는 그 대사 산물을 생산하고 배송할 수 있다.
본 발명의 미생물 성장 설비는 미생물 자체, 미생물 대사 산물 및/또는 미생물이 성장하는 배지의 다른 성분을 포함하는 신선한 미생물 기반 조성물을 생산한다. 원하는 경우, 이 조성물은 고밀도의 생장 세포 또는 번식체, 또는 생장 세포 및 번식체의 혼합물을 가질 수 있다.
일 구현예에서, 미생물 성장 설비는 미생물 기반 산물이 사용될 장소(예를 들어, 감귤 과수원)의 예컨대 300 마일, 200 마일 또는 심지어 100 마일 내에 위치한다. 유리하게는, 이에 따라서 특정 위치에서 사용하기 위해 조성물을 맞출 수 있다. 미생물 기반 조성물의 제형 및 효능은 적용 시 특정 현지 조건, 예컨대 어떤 토양 유형, 식물 및/또는 작물이 처리되고 있는지; 조성물이 적용되는 계절, 기후 및/또는 시기; 및 어떤 모드 및/또는 적용률이 사용되는지 등에 따라 맞춤화될 수 있다.
유리하게는, 분산된 미생물 성장 설비는, 업스트림 가공 지연, 공급망 병목 현상, 부적절한 저장 및 예컨대 실행 가능한 높은 세포 수 제품과 세포가 원래 성장했던 연관 배지 및 대사 산물의 적시 배송과 적용을 방해하는 기타 우발 상황 등으로 인해 제품 품질이 저하되는, 원거리 산업 규모의 생산자에게 의존하는 현 문제에 대한 해결책을 제공한다.
나아가, 조성물을 현지에서 생산함으로써, 그 제형과 효능이 특정 지점 및 적용 시점에 존재하는 조건에 따라 실시간으로 조정될 수 있다. 이는 중앙 위치에서 미리 제조되고 예컨대 주어진 위치에 대해 최적이 아닐 수 있는 정해진 비율과 제형을 갖는 조성물에 비해 이점을 제공한다.
미생물 성장 설비는 미생물 기반 산물을 맞춤화할 수 있는 능력으로 인해 제조 다양성을 제공하여 목적지 지역과의 시너지 효과를 개선한다. 유리하게는, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 시스템은 자연 발생의 지역 미생물 및 그의 대사 부산물의 능력을 활용한다.
개별 반응기 시스템(10)의 배양 시간은 예컨대 1 내지 7일 이상일 수 있다. 배양 산물은 임의의 다양한 방법으로 수확할 수 있다.
현지 생산 및 예컨대 발효로부터 24 시간 이내의 배송의 결과로서 순수한 고밀도의 세포 조성물 및 실질적으로 낮은 운송 비용이 얻어진다. 보다 효과적이고 강력한 미생물 접종원의 개발이 급속히 발전할 것이라는 전망을 감안할 때, 소비자는 미생물 기반 산물을 신속하게 제공할 수 있는 이 능력의 혜택을 크게 누릴 수 있다.
선행 기술에 따른 미생물 바이오 계면활성제의 배양은 복수의 단계를 필요로 하는 복잡하고 시간 및 자원을 소비하는 공정이다. 본 발명은 이 공정을 단순화하고 비용을 줄이는 장비, 장치, 방법 및 시스템을 제공한다. 본 발명은 또한 신규 조성물 및 이 조성물의 용도를 제공한다.
실시예
예시를 위해 제공된 아래 실시예에 의해 본 발명 및 그것의 많은 장점이 더 잘 이해될 것이다. 아래 실시예는 본 발명의 방법, 적용, 구현예 및 변형의 일부를 예시한다. 이는 본 발명을 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 본 발명과 관련하여 다수의 변경 및 수정이 이루어질 수 있다.
실시예 1: 스테인레스 스틸 "큐브" 발효 반응기 시스템
도 1~4를 참조하여, "큐브"는 550 갤런의 스테인레스 스틸 탱크(100)를 포함한다. 이 유닛(10)은 5 × 5 피트이고, 높이는 약 6 피트이다. 유닛(10)에는 발효 동안 온도, DO 및 pH 수준을 모니터링하는 프로브(150)에 연결된 PLC(170)가 장착되어 있다. 유닛(10)에는 또한 자동화된 증기 멸균 사이클(도시되지 않음)이 구비되어 있다.
유닛(10)은 2 마력의 위생 밀폐형 혼합 모터(111)를 포함하는 내부 혼합 시스템(110)을 갖는다. 혼합 모터(111)는 임펠러(113)를 갖는 금속 샤프트(112)에 회전 가능하게 부착된다. 임펠러(113)는 탱크의 상단으로부터 하단으로 탱크 액체를 밀어 보내는 것을 돕기 위해 22 인치 축류 폭기 터빈 및/또는 소형 8 인치 선박 프로펠러를 포함한다. 샤프트(112)와 임펠러(113)는 혼합을 향상시키기 위해 대각선 축(예를 들어, 수직으로부터 15 내지 60°의 축)상에서 회전한다.
온도 제어는 재킷을 사용하지 않고, 대신 인라인 250~400K 열교환기(122a, 122b)를 갖는 2개의 고효율 외부 루프(120a, 120b)를 통해 탱크 액체를 순환시키는 2개의 1~2 마력 순환 펌프(123a, 123b)를 포함하는 외부 순환 시스템(120)을 사용한다.
펌프(123a, 123b)는 반응기 시스템(10)에서 설정 온도를 유지하기 위해 통과 배양물 주위에서 냉각 또는 가열된 액체를 펌핑한다. 이 2개의 순환 펌프(123a, 123b)는 예컨대 분당 250 내지 400 갤런의 액체를 탱크(100) 하단으로부터 열교환기(122a, 122b)를 통해 탱크(100) 상단으로 다시 이송한다. 열교환기(122a, 122b)는 수도 및 선택적으로 냉각기에 부착되며, 이는 배양물 주변에서 분당 약 13 갤런의 속도로 흐른다.
유닛(10)은 30~80 psi의 압력에서 배양물 리터 당 및 분당 1 내지 5 리터의 여과된 공기, 또는 약 50~100 CFM 또는 20~60 CFM의 공기를 배양물에 제공할 수 있는 폭기 시스템(130)을 포함한다. 일부 구현예에서, 유닛(10)은 약 40 CFM인 1L/L의 흡입 공기를 필요로 한다.
폭기 시스템(130)이 이를 통해 배양물에 공기를 공급하는 살포 시스템(140)이 유닛(10)에 장착되어 있다. 살포 시스템 (140)은 4개의 주문 제작된, 2 마이크론의 소결 스테인레스 스틸 폭기 장치(141)를 포함한다.
실시예 2: 작동
실시예 1에 기재된 바와 같은 운반형 및 분배 가능한 스테인레스 스틸 반응기가 미생물 기반 산물을 생산하는 데 사용된다. 이 반응기 시스템은 먼저 3 단계의 방법으로 멸균된다.
도 1~4를 참조하여, 반응기 시스템(10)(예를 들어, 탱크(100), 살포시스템(140), 내부 혼합 시스템(110), 외부 순환 시스템(120) 포함)의 내부 표면은 상업용 소독제로 세척된다. 그 후, 반응기 시스템(10)은 3%의 과산화수소수로 분무된다. 최종적으로, 반응기 시스템(10)의 내부는 운반형 스티머를 이용하여 약 105℃ 내지 110℃에서 스팀 처리된다.
배양 배지 영양 성분은 오토클레이브(도시되지 않음)를 사용하여 오염 제거된다. 배양 배지에 사용되는 물은 인라인 자외선 수 살균기(도시되지 않음)를 사용하여 자외선 살균되고, 예컨대 0.1 마이크론 워터 필터를 통하여 여과된다. 배양 배지 성분을 반응기에 첨가하기 위해 연동 펌프(도시되지 않음)가 사용된다.
발효 온도는 배양되는 미생물 및/또는 미생물 성장 부산물에 따라 일반적으로 약 22 내지 28℃ 사이이어야 한다.
배양되는 미생물 및/또는 미생물 성장 부산물에 따라 pH는 약 2.0 내지 약 7.0, 바람직하게는 약 3.0 내지 약 6.5 사이이어야 한다. 또한, 오염 가능성을 더 줄이기 위해, 배양 공정은 제1 pH 범위에서 시작하여 제1 pH 범위보다 높거나 낮은 제2 pH 범위로 조정될 수 있다.
이러한 배양 조건하에서, 발효 24시간 내지 20일 후에 산업적으로 유용한 바이오매스, 바이오 계면활성제 및 기타 대사 산물이 생산된다. 발효가 완료되면, 배양물은 반응기 시스템(10)으로부터 수확되어 다양한 산업적 목적으로 적용될 수 있다.
그 후, 반응기 시스템(10)은 다시 멸균되고 동일한 미생물 기반 산물 또는 다른 미생물 기반 산물을 발효시키기 위해 재사용될 수 있다. 예를 들어, 반응기 시스템 (10)은 SLP의 생산을 위해 스타르메렐라 봄비콜라를 배양하고, 본 방법에 따라 멸균된 다음, SLP를 다시 생산하거나 MEL의 생산을 위한 슈도지마 애피디스와 같은 다른 미생물을 배양하는 데 사용될 수 있다.
실시예 3: 소포로리피드 생산을 위한 "큐브" 발효 시스템의 사용
본 시스템은 생산 배양물의 오염 없이 산업 규모로 소포로리피드(SLP)를 생산하는 데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 반응기 시스템 (10)에는 스타르메렐라 봄비콜라 효모가 접종된다. 배양 배지는 탄소원과 지질을 포함하고, 200 ppm 이하의 순수한 소포로리피드가 보충된다.
효모와 배양 배지는 호기성 조건하에서 바이오매스의 초기 축적에 충분한 시간 동안(전형적으로 약 24시간 내지 약 48시간) pH 3.0~3.5에서 인큐베이션된다. 온도는 22 내지 28℃로 유지되고 용존 산소 농도는 (100% 주변 공기의) 15% 내지 30% 내로 유지된다. 초기 바이오매스 축적이 달성되면, pH를 5.5로 조정하고 공정이 계속된다.
배양물이 pH 3.5로 산성화될 때, 발효 공정이 계속되며, 배지에 충분한 SLP가 축적될 때까지 pH를 이 수준으로 안정적으로 유지한다. 그 후, SLP는 후속 공정 및/또는 직접 사용을 위해 발효 배지로부터 회수된다.
실시예 4: 만노실에리트리톨 리피드 생산을 위한 "큐브" 발효 시스템의 사용
슈도지마 애피디스의 종자 배양물은 pH 6.2에서 생산된다. 종자 배양물을 위한 배지는 아래 성분(g/L)으로 구성된다:
포도당 50 g
NH4NO3 1 g
KH2PO4 0.5 g
K2HPO4 0.5 g
MgSO4 0.2 g
효모 추출물 1 g
종자 배양물은 30℃에서 이틀 동안 배양된다. 도 1~4를 참조하여, 이는 본 발명의 반응기 시스템(10)에서 MEL을 생산하기 위한 접종원으로서 사용된다. pH 6.2에서 MEL 생산을 위한 배지는 아래 성분(g/L 또는 ㎖/L)을 포함한다:
NaNO3 2 g
KH2P43 0.2 g
MgSO4 0.2 g
효모 추출물 1 g
H2O 920 ㎖
카놀라유 80 ㎖(별도로 오토클레이브 처리).
배지의 부피는 원하는 부피에서 카놀라유 부피를 뺀 값으로 조정된다. 이 배지에는 또한 최대 200 ppm의 순수한 소포로리피드가 보충될 수 있다.
효모는 호기성 조건하에서 바이오매스의 초기 축적에 충분한 시간 동안(전형적으로 약 24시간 내지 약 48시간) 배양 배지에서 인큐베이션된다. 배양 온도는 27~30℃, DO는 5~30%(또는 15~20%), 공기 순환은 1 V/Vm이다. 발효 2일 후, H2O 중의 40 g/L 에리트리톨을 첨가한다. 발효 공정이 계속되며, 배지에 충분한 MEL이 축적될 때까지 pH를 안정적으로 유지한다. 총 발효 시간은 15일이다.
생산될 수 있는 총 MEL 농도는 50 내지 100 g/L이다. 효모 세포의 불활성화가 필요하다면 온도는 70~90℃로 상승될 수 있다. 유성 층(MEL)은 이후 수집되고, 본 발명의 방법을 포함하여 다양한 용도를 위한 미생물 기반 산물로서 제조될 수 있다.

Claims (21)

  1. 하나의 수직 평행 육면체 탱크;
    카오스 혼합 구조;
    살포 시스템; 및
    발효 파라미터를 모니터링하고 조절하기 위한 프로그램 가능형 논리 제어기(programmable logic controller; PLC)를 포함하되,
    카오스 혼합 구조가 내부 혼합 장치와 외부 순환 시스템을 포함하며, 외부 순환 시스템이 이중의 온도 제어 시스템인, 미생물 및/또는 미생물 대사 산물을 생산하기 위한 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 외부 순환 시스템이 이중-벽 탱크나 외부 온도 제어 재킷에 대한 필요성을 제거하는, 시스템.
  3. 제2항에 있어서, 내부 혼합 장치가 탱크의 상단에 위치한 혼합 모터를 포함하고, 혼합 모터가 거기에 부착된 금속 샤프트를 가지며, 금속 샤프트가 탱크 내로 연장되며 임펠러가 고정되어 있고, 모터와 샤프트가 수직으로부터 15 내지 60°의 대각선 축상에서 회전하는, 시스템.
  4. 제3항에 있어서, 임펠러가 4날 러쉬톤(Rushton) 임펠러인, 시스템.
  5. 제2항에 있어서, 외부 순환 시스템이 제1 및 제2 외부 루프를 포함하고, 이 각각이 쉘-튜브 열교환기를 포함하며, 제1 및 제2 루프 각각에 액체를 탱크 하단으로부터 열교환기를 통해 탱크 상단으로 다시 이송시키는 펌프가 고정되어 있는, 시스템.
  6. 제5항에 있어서, 루프가 수원(water source)에 부착되어 있는, 시스템.
  7. 제5항에 있어서, 루프가 냉각기에 부착되어 있는, 시스템.
  8. 제1항에 있어서, 살포 시스템이 복수의 스테인리스 스틸 미세 다공성 폭기 장치를 포함하고, 각각의 다공성 폭기 장치가 1 마이크론 이하 직경의 복수의 구멍을 갖는 스테인레스 스틸 파이프를 포함하며, 이 파이프가 공기 공급원에 부착되어 있는, 시스템.
  9. 제8항에 있어서, 살포 시스템이 4개의 폭기 장치를 포함하는, 시스템.
  10. 제1항에 있어서, PLC가 pH 프로브, 용존 산소 프로브 및 온도 프로브에 연결되어 있고, pH, DO 및 온도를 자동으로 조절하도록 프로그램되어 있는, 시스템.
  11. 오염 없이 미생물 및/또는 미생물 대사 산물을 생산하기 위한 방법으로서,
    물과 영양 성분을 포함하는 배양 배지를 제1항 내지 제10항의 시스템에 첨가하는 단계;
    시스템에 생균을 접종하는 단계;
    선택적으로, 시스템에 살균제를 첨가하는 단계; 및
    배양물 내에서 원하는 세포 농도 및/또는 원하는 대사 산물 농도를 달성하기 위한 시간 동안 시스템을 작동시키는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 미생물이 효모인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 효모가 스타르메렐라 봄비콜라(Stamerella bombicola), 위커하모마이세스 아노말루스(Wickerhamomyces anomalus ) 또는 슈도지마 애피디스(Pseudozyma aphidis)인, 방법.
  14. 제11항에 있어서, 미생물 대사 산물이 바이오 계면활성제인, 방법.
  15. 제11항에 있어서, 제1항의 시스템에서 접종 전에 배양 배지가 멸균되는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 배양 배지가 오토클레이브에 의해 멸균되는, 방법.
  17. 제11항에 있어서, 배양 배지의 물이 자외선(UV) 살균 및/또는 서브 마이크론 필터를 이용하여 여과되는, 방법.
  18. 제11항에 있어서, 영양 성분이 하나 이상의 탄수화물 공급원, 하나 이상의 지질원, 하나 이상의 미네랄 염, 하나 이상의 미량 영양 공급원 및 하나 이상의 질소원을 포함하는, 방법.
  19. 제11항에 있어서, 살균제가 항생제 또는 소포로리피드인, 방법.
  20. 제11항에 있어서, 미생물 및/또는 미생물 대사 산물을 시스템으로부터 수확하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 미생물 대사 산물이 미생물로부터 분리되고, 선택적으로 농축 및/또는 정제되는, 방법.
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