CN115446107A - 一种鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤的方法，包括：利用铜绿假单胞杆菌发酵制备鼠李糖脂；获取蚯蚓种，然后对土壤进行预处理后投放鼠李糖脂溶液；设置引水渠和辅助饲养基孔，并在辅助饲养基孔中投放有机肥；投放蚯蚓种后进行土壤处理修复；本发明整体工艺设计合理，通过鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤，具备高效、绿色环保、低成本、工艺简单、易操作的优点，利于推广实施。

Description

一种鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤的方法
技术领域
本发明属于污染土壤修复技术领域，具体一种鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤的方法。
背景技术
二恶英是一种环境中普遍存在的持久性有机污染物，其毒性相当于人们熟知的剧毒物质氰化物的130倍、砒霜的900倍。大量的动物实验表明，很低浓度的二噁英就对动物表现出致死效应。
自然界本身不存在二恶英，它是许多含氯化工处理过程中无意识合成的一种副产品，例如城市和医院固体垃圾焚烧，有机含氯化合物的合成和使用，钢铁冶炼，造纸和纸漂白，废旧电子器件处理，木材和秸杆燃烧以及水泥窑、汽车尾气的排放等。土壤作为二恶英的天然汇集地，上述过程中产生的二恶英可以通过大气干湿沉降、有机氯农药的施用、污水污泥农用以及废弃物的堆放等多种途径进入土壤环境。
土壤中的二恶英极为稳定，自然情况下降解速度极慢，具有高度的持久性。现有技术中通常采用光降解、化学降解、物理降解以及生物修复来处理土壤中的二恶英。而生物修复具有低耗、高效和环境友好的特点，是近年来得到广泛重视的一种土壤修复手段。随着更多的高效降解菌株的分离，降解条件的探索，生物修复将在土壤二恶英污染治理方面发挥重要的作用。
发明内容
本发明的目的：通过常见的生物表面活性剂——鼠李糖脂以及用于修复受污染土壤的模式生物——蚯蚓联合修复二恶英污染土壤，通过鼠李糖脂改变蚯蚓肠道和土壤中微生物群落的丰度、组成和代谢来实现对二恶英污染土壤的绿色修复，提出一种鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤的方法。
本发明的技术方案为：一种鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤的方法，包括：
S1、鼠李糖脂的制备
利用铜绿假单胞杆菌发酵制备鼠李糖脂，备用；
S2、获取蚯蚓种
S3、土壤预处理
对待修复的污染土壤进行松土处理，去除杂物后将表面耙平，形成处理层；其中，松土深度为30～50cm深度；
S4、土壤修复处理
S4-1、鼠李糖脂溶液的投放
将鼠李糖脂与去离子水混合制备得到浓度为300～1000mg/L的鼠李糖脂溶液，然后对S3所形成的处理层按照2～3L/m2的施加量施加鼠李糖脂溶液，再次对土壤进行松土处理致使鼠李糖脂溶液与土壤混合均匀；
S4-2、土壤再处理
在S4-1处理后的处理层内每间隔3～5m设置深度为20～30cm、顶部宽度为10～15cm、底部宽度为5～8cm纵截面为等腰梯形结构的引水渠；并在所述引水渠上每间隔8～10m设置内径为30～50cm、深度为30～50cm的辅助饲养基孔；在所述辅助饲养基孔中投放占辅助饲养基孔容积40～60％的有机肥；
S4-3、蚯蚓种的投放
按照30～80条/m2的投放密度将蚯蚓种投放至污染土壤中；
S4-4、土壤处理修复
利用所述引水渠保持污染土壤含水率为40～50％，保持在该含水量的条件下持续修复12d；然后在自然条件下修复21～30d。
说明：设置引水渠是为了土壤修复处理的前期能够保持污染土壤含水量，而辅助饲养基孔的设置且投放有机肥能够促使有机肥随引水渠补水过程渗透至土壤中。
进一步地，所述步骤S1中，所述发酵制备鼠李糖脂的方法为：
S1-11、发酵培养
将铜绿假单胞杆菌经过活化后置于第一液体发酵培养基中在温度为35～37℃、振荡转速为230～250r/min的条件下发酵培养4～7d，得到发酵液；
S1-12、提取鼠李糖脂
将发酵液在7000～7500r/min的条件下离心处理20～25min除去菌体取上清液，然后利用萃取法提取得到鼠李糖脂。
进一步地，所述步骤S1-11中，所述第一液体发酵培养基成分为：甘油40～50g/L、酵母膏0.2g/L、NaNO36.5g/L、KH2PO41.0g/L、NaCl0.5g/L、Na2HPO4·12H2O1.0g/L、FeSO4·7H2O0.3g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、去离子水1000ml，pH＝6.5～7.0。
进一步地，所述步骤S1-12中，所述萃取法为：利用浓度为98％的硫酸调节上清液pH至1～1.5，在4～8℃条件下静置10～12h；然后用体积比为2：1的氯仿-甲醇混合液等体积萃取上清液，静置分层后取下层；然后对中层利用氯仿-甲醇混合液进行二次萃取，静置分层后取下层；合并两次萃取液后蒸干溶剂得到鼠李糖脂。
进一步地，所述步骤S1中，所述发酵制备鼠李糖脂的方法为：
S1-21、发酵培养
将铜绿假单胞杆菌经过活化后置于第二液体发酵培养基中在温度为28～32℃、振荡转速为280～300r/min的条件下发酵培养8～10d，得到发酵液；
S1-22、提取鼠李糖脂
将发酵液在5000～5500r/min的条件下离心处理25～30min除去菌体取上清液，然后利用膜分离法提取得到鼠李糖脂。
进一步地，所述步骤S1-21中，所述第二液体发酵培养基成分为：豆油100～120g/L、酵母膏0.2g/L、NaNO36.5g/L、KH2PO41.0g/L、NaCl0.5g/L、Na2HPO4·12H2O1.0g/L、FeSO40.1g/L、MgSO40.3g/L、去离子水1000ml，pH＝6.0～6.5。
进一步地，所述步骤S1-22中，所述膜分离法为：使用双蒸水将发酵液稀释5～20倍后，利用截留分子量为10000的滤膜在25℃、0.5Mpa、200～300L/h的条件下进行超滤处理；然后利用截留分子量为300的滤膜将超滤液在25℃、1.0Mpa条件下进行纳滤处理，蒸干溶剂得到鼠李糖脂。
进一步地，所述有机肥按照质量百分比由40～50％的畜禽粪便、15～25％秸秆、5～10％锯末以及余量的落叶进行发酵制备得到。
说明：畜禽粪便具体可为猪、牛、羊、鸡、鸭等任意一种或多种饲养畜禽的粪便，秸秆具体可为小麦、玉米、水稻、大豆等任意一种或多种成熟农作物的秸秆；锯末、落叶均不作具体限定；畜禽粪便、秸秆、锯末、落叶均根据区域就地取材以减少运输成本。
更进一步地，所述发酵的方法为：按所述比例将秸秆、落叶、锯末混合粉碎后与畜禽粪便混合，得到混合基质；向混合基质中加入发酵剂并加水至混合基质含水量为40～50％，向混合基质中加入发酵剂并加水至混合基质含水量为40～50％,堆积发酵1～3d后进行翻堆，覆盖塑料薄膜持续发酵21～30d；其中，持续发酵过程中每隔3～5d翻堆一次。
说明：蚯蚓的生命活动可以直接进行或间接影响土壤中污染物的迁移和转化，利用该发酵方法制备得到的有机肥能够有效地促进蚯蚓的活性，使其生命活动更加活跃；其中，发酵剂为市售有机肥发酵剂，具体使用量按照实际产品指导标准进行使用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明整体工艺设计合理，通过鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤，能够有效地改变土壤中微生物的代谢途径，鼠李糖脂作为生物活性剂的加入会增加二恶英等污染物的生物利用度，从而刺激胁迫微生物的反应，而蚯蚓活动产生的酶和优势细菌能够有效地对污染物进行降解，具备高效、绿色环保、低成本的特性；且添加的有机肥能够为蚯蚓的生长提供养分，促进蚯蚓活性；且本发明工艺具备工艺简单、易操作的特点，利于推广实施。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图；
图2是本发明处理层内引水渠与辅助饲养基孔的局部结构示意图；
图3是本发明处理层内引水渠与辅助饲养基孔的局部俯视图；
图4是本发明处理层内引水渠与辅助饲养基孔的局部剖视图；
其中，1-引水渠、2-辅助饲养基孔。
具体实施方式
实施例1
如图1所示的一种鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤的方法，包括：
S1、鼠李糖脂的制备
S1-11、发酵培养
将铜绿假单胞杆菌经过活化后置于第一液体发酵培养基中在温度为35℃、振荡转速为230r/min的条件下发酵培养4d，得到发酵液；其中，第一液体发酵培养基成分为：甘油40g/L、酵母膏0.2g/L、NaNO36.5g/L、KH2PO41.0g/L、NaCl0.5g/L、Na2HPO4·12H2O1.0g/L、FeSO4·7H2O0.3g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、去离子水1000ml，pH＝6.5；
S1-12、提取鼠李糖脂
将发酵液在7000r/min的条件下离心处理20min除去菌体取上清液，然后利用萃取法提取得到鼠李糖脂；其中，萃取法为：利用浓度为98％的硫酸调节上清液pH至1，在4℃条件下静置10h；然后用体积比为2：1的氯仿-甲醇混合液等体积萃取上清液，静置分层后取下层；然后对中层利用氯仿-甲醇混合液进行二次萃取，静置分层后取下层；合并两次萃取液后蒸干溶剂得到鼠李糖脂；
S2、获取蚯蚓种
获取无病无伤且具有明显环状、体重在3.0±0.5g的成熟威廉腔环蚓；
S3、土壤预处理
对待修复的污染土壤进行松土处理，去除杂物后将表面耙平，形成处理层；其中，松土深度为30cm深度；
S4、土壤修复处理
S4-1、鼠李糖脂溶液的投放
将鼠李糖脂与去离子水混合制备得到浓度为300mg/L的鼠李糖脂溶液，然后对S3所形成的处理层按照2L/m2的施加量施加鼠李糖脂溶液，再次对土壤进行松土处理致使鼠李糖脂溶液与土壤混合均匀；
S4-2、土壤再处理
如图2、3、4所示，在S4-1处理后的处理层内每间隔3m设置深度为20cm、顶部宽度为10cm、底部宽度为5cm纵截面为等腰梯形结构的引水渠1；并在引水渠1上每间隔8m设置内径为30cm、深度为30cm的辅助饲养基孔2；在辅助饲养基孔2中投放占辅助饲养基孔2容积40％的有机肥；有机肥按照质量百分比由40％的畜禽粪便、15％秸秆、5％锯末以及余量的落叶进行发酵制备得到；其中，发酵的方法为：按比例将秸秆、落叶、锯末混合粉碎后与畜禽粪便混合，得到混合基质；向混合基质中加入发酵剂并加水至混合基质含水量为40％，堆积发酵1d后进行翻堆，覆盖塑料薄膜持续发酵21d；其中，持续发酵过程中每隔3d翻堆一次；发酵剂为市售有机肥发酵剂，具体使用量按照实际产品指导标准进行使用；
S4-3、蚯蚓种的投放
按照30条/m2的投放密度将蚯蚓种投放至污染土壤中；
S4-4、土壤处理修复
利用引水渠1保持污染土壤含水率为40％，保持在该含水量的条件下持续修复12d；然后在自然条件下修复21d。
实施例2
如图1所示的一种鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤的方法，包括：
S1、鼠李糖脂的制备
S1-11、发酵培养
将铜绿假单胞杆菌经过活化后置于第一液体发酵培养基中在温度为36℃、振荡转速为240r/min的条件下发酵培养4～7d，得到发酵液；其中，第一液体发酵培养基成分为：甘油45g/L、酵母膏0.2g/L、NaNO36.5g/L、KH2PO41.0g/L、NaCl0.5g/L、Na2HPO4·12H2O1.0g/L、FeSO4·7H2O0.3g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、去离子水1000ml，pH＝6.8；
S1-12、提取鼠李糖脂
将发酵液在7300r/min的条件下离心处理22min除去菌体取上清液，然后利用萃取法提取得到鼠李糖脂；其中，萃取法为：利用浓度为98％的硫酸调节上清液pH至1.3，在5℃条件下静置11h；然后用体积比为2：1的氯仿-甲醇混合液等体积萃取上清液，静置分层后取下层；然后对中层利用氯仿-甲醇混合液进行二次萃取，静置分层后取下层；合并两次萃取液后蒸干溶剂得到鼠李糖脂；
S2、获取蚯蚓种
获取无病无伤且具有明显环状、体重在3.0±0.5g的成熟威廉腔环蚓；
S3、土壤预处理
对待修复的污染土壤进行松土处理，去除杂物后将表面耙平，形成处理层；其中，松土深度为40cm深度；
S4、土壤修复处理
S4-1、鼠李糖脂溶液的投放
将鼠李糖脂与去离子水混合制备得到浓度为500mg/L的鼠李糖脂溶液，然后对S3所形成的处理层按照2.5L/m2的施加量施加鼠李糖脂溶液，再次对土壤进行松土处理致使鼠李糖脂溶液与土壤混合均匀；
S4-2、土壤再处理
如图2、3、4所示，在S4-1处理后的处理层内每间隔4.5m设置深度为25cm、顶部宽度为12cm、底部宽度为6cm纵截面为等腰梯形结构的引水渠1；并在引水渠1上每间隔9m设置内径为40cm、深度为40cm的辅助饲养基孔2；在辅助饲养基孔2中投放占辅助饲养基孔2容积50％的有机肥；有机肥按照质量百分比由45％的畜禽粪便、20％秸秆、8％锯末以及余量的落叶进行发酵制备得到；其中，发酵的方法为：按比例将秸秆、落叶、锯末混合粉碎后与畜禽粪便混合，得到混合基质；向混合基质中加入发酵剂并加水至混合基质含水量为45％，堆积发酵2d后进行翻堆，覆盖塑料薄膜持续发酵28d；其中，持续发酵过程中每隔4d翻堆一次；发酵剂为市售有机肥发酵剂，具体使用量按照实际产品指导标准进行使用；
S4-3、蚯蚓种的投放
按照60条/m2的投放密度将蚯蚓种投放至污染土壤中；
S4-4、土壤处理修复
利用引水渠1保持污染土壤含水率为45％，保持在该含水量的条件下持续修复12d；然后在自然条件下修复28d。
实施例3
如图1所示的一种鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤的方法，包括：
S1、鼠李糖脂的制备
S1-11、发酵培养
将铜绿假单胞杆菌经过活化后置于第一液体发酵培养基中在温度为37℃、振荡转速为250r/min的条件下发酵培养7d，得到发酵液；其中，第一液体发酵培养基成分为：甘油50g/L、酵母膏0.2g/L、NaNO36.5g/L、KH2PO41.0g/L、NaCl0.5g/L、Na2HPO4·12H2O1.0g/L、FeSO4·7H2O0.3g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、去离子水1000ml，pH＝7.0；
S1-12、提取鼠李糖脂
将发酵液在7500r/min的条件下离心处理25min除去菌体取上清液，然后利用萃取法提取得到鼠李糖脂；其中，萃取法为：利用浓度为98％的硫酸调节上清液pH至1.5，在8℃条件下静置12h；然后用体积比为2：1的氯仿-甲醇混合液等体积萃取上清液，静置分层后取下层；然后对中层利用氯仿-甲醇混合液进行二次萃取，静置分层后取下层；合并两次萃取液后蒸干溶剂得到鼠李糖脂；
S2、获取蚯蚓种
获取无病无伤且具有明显环状、体重在3.0±0.5g的成熟威廉腔环蚓；
S3、土壤预处理
对待修复的污染土壤进行松土处理，去除杂物后将表面耙平，形成处理层；其中，松土深度为50cm深度；
S4、土壤修复处理
S4-1、鼠李糖脂溶液的投放
将鼠李糖脂与去离子水混合制备得到浓度为1000mg/L的鼠李糖脂溶液，然后对S3所形成的处理层按照3L/m2的施加量施加鼠李糖脂溶液，再次对土壤进行松土处理致使鼠李糖脂溶液与土壤混合均匀；
S4-2、土壤再处理
如图2、3、4所示，在S4-1处理后的处理层内每间隔5m设置深度为30cm、顶部宽度为15cm、底部宽度为8cm纵截面为等腰梯形结构的引水渠1；并在引水渠1上每间隔8～10m设置内径为50cm、深度为50cm的辅助饲养基孔2；在辅助饲养基孔2中投放占辅助饲养基孔2容积60％的有机肥；有机肥按照质量百分比由50％的畜禽粪便、25％秸秆、10％锯末以及余量的落叶进行发酵制备得到；其中，发酵的方法为：按比例将秸秆、落叶、锯末混合粉碎后与畜禽粪便混合，得到混合基质；向混合基质中加入发酵剂并加水至混合基质含水量为50％，堆积发酵3d后进行翻堆，覆盖塑料薄膜持续发酵30d；其中，持续发酵过程中每隔5d翻堆一次；发酵剂为市售有机肥发酵剂，具体使用量按照实际产品指导标准进行使用；
S4-3、蚯蚓种的投放
按照80条/m2的投放密度将蚯蚓种投放至污染土壤中；
S4-4、土壤处理修复
利用引水渠1保持污染土壤含水率为50％，保持在该含水量的条件下持续修复12d；然后在自然条件下修复30d。
实施例4
与实施例1不同的是：步骤S1中，发酵制备鼠李糖脂的方法为：
S1-21、发酵培养
将铜绿假单胞杆菌经过活化后置于第二液体发酵培养基中在温度为28℃、振荡转速为280r/min的条件下发酵培养8d，得到发酵液；其中，第二液体发酵培养基成分为：豆油100g/L、酵母膏0.2g/L、NaNO36.5g/L、KH2PO41.0g/L、NaCl0.5g/L、Na2HPO4·12H2O1.0g/L、FeSO40.1g/L、MgSO40.3g/L、去离子水1000ml，pH＝6.0；
S1-22、提取鼠李糖脂
将发酵液在5000r/min的条件下离心处理25min除去菌体取上清液，然后利用膜分离法提取得到鼠李糖脂；其中，膜分离法为：使用双蒸水将发酵液稀释5倍后，利用截留分子量为10000的滤膜在25℃、0.5Mpa、200L/h的条件下进行超滤处理；然后利用截留分子量为300的滤膜将超滤液在25℃、1.0Mpa条件下进行纳滤处理，蒸干溶剂得到鼠李糖脂。
实施例5
与实施例2不同的是：步骤S1中，发酵制备鼠李糖脂的方法为：
S1-21、发酵培养
将铜绿假单胞杆菌经过活化后置于第二液体发酵培养基中在温度为30℃、振荡转速为290r/min的条件下发酵培养9d，得到发酵液；其中，第二液体发酵培养基成分为：豆油110g/L、酵母膏0.2g/L、NaNO36.5g/L、KH2PO41.0g/L、NaCl0.5g/L、Na2HPO4·12H2O1.0g/L、FeSO40.1g/L、MgSO40.3g/L、去离子水1000ml，pH＝6.3；
S1-22、提取鼠李糖脂
将发酵液在5200r/min的条件下离心处理28min除去菌体取上清液，然后利用膜分离法提取得到鼠李糖脂；其中，膜分离法为：使用双蒸水将发酵液稀释15倍后，利用截留分子量为10000的滤膜在25℃、0.5Mpa、250L/h的条件下进行超滤处理；然后利用截留分子量为300的滤膜将超滤液在25℃、1.0Mpa条件下进行纳滤处理，蒸干溶剂得到鼠李糖脂。
实施例6
与实施例3不同的是：步骤S1中，发酵制备鼠李糖脂的方法为：
S1-21、发酵培养
将铜绿假单胞杆菌经过活化后置于第二液体发酵培养基中在温度为32℃、振荡转速为280～300r/min的条件下发酵培养10d，得到发酵液；其中，第二液体发酵培养基成分为：豆油120g/L、酵母膏0.2g/L、NaNO36.5g/L、KH2PO41.0g/L、NaCl0.5g/L、Na2HPO4·12H2O1.0g/L、FeSO40.1g/L、MgSO40.3g/L、去离子水1000ml，pH＝6.5；
S1-22、提取鼠李糖脂
将发酵液在5500r/min的条件下离心处理30min除去菌体取上清液，然后利用膜分离法提取得到鼠李糖脂；其中，膜分离法为：使用双蒸水将发酵液稀释20倍后，利用截留分子量为10000的滤膜在25℃、0.5Mpa、300L/h的条件下进行超滤处理；然后利用截留分子量为300的滤膜将超滤液在25℃、1.0Mpa条件下进行纳滤处理，蒸干溶剂得到鼠李糖脂。
实验例
由上海某生物科技有限公司购得1株编号为ATCC15442的铜绿假单胞杆菌，并由实施例1步骤S1制备得到鼠李糖脂，然后与去离子水混合制备得到浓度为300mg/L的鼠李糖脂溶液；
由江苏淮安某蚯蚓养殖公司购买蚯蚓，并由实施例1步骤S2筛选得到蚯蚓种；
原始土壤采集至安徽省合肥市某废气钢厂中：采用5点采样法在5-20cm深度处进行采集，干燥后过2mm筛后得到原始土壤；并采用HRGC/HRMS超微量分析法检测原始土壤中二恶英浓度为4.61ng/kg；
有机肥采用40％的牛粪、15％的小麦秸秆、5％锯末以及余量的松针落叶进行发酵制备得到；其中，发酵剂采用饲料批准文号/登记证号为：豫饲添(2015)2335的市售发酵剂；
设置5组处理实验：
第一实验组、5000g原始土壤；
第二实验组、5000g原始土壤+5条蚯蚓种；
第三实验组、5000g原始土壤+10ml鼠李糖脂溶液；
第四实验组、5000g原始土壤+5条蚯蚓种+3ml鼠李糖脂溶液；
第五实验组、5000g原始土壤+5条蚯蚓种+3ml鼠李糖脂溶液+2g有机肥；
每组实验都在保持污染土壤含水率为40％的条件下持续修复12d；然后再在自然条件下修复21d；每3天采集5g土壤样品并进行生物量分析得到如表1所示结果；
表1：5组处理实验21d内土壤样品的生物量分析结果
Figure BDA0003820394500000131
结论：由第一实验组21d内土壤样品的生物量分析结果可已看出，前12天由于保持土壤最大持水能力的40％导致将土壤中的二恶英稀释致使土壤样品中二恶英浓度略低于原始土壤中二恶英浓度；
由第一实验组、第二实验组、第三实验组、第四实验组、第五实验组可以看出，第四实验组和第五实验组对土壤中二恶英具备较为有效的降解效果；其中，第五实验组降解率为90.6％且满足世界卫生组织对土壤中二恶英的控制标准0.60ng/kg；
由第一实验组、第二实验组、第三实验组可以看出鼠李糖脂和蚯蚓两个因素，蚯蚓对二恶英的降解具备较重的影响；
由第二实验组、第四实验组、第五实验组可以看出鼠李糖脂溶液能够有效地促进蚯蚓对土壤中二恶英的降解效率；
由第四实验组、第五实验组可以看出有机肥的添加能够促进二恶英的降解效果，其可能由于有机肥有效地促进了蚯蚓的活性。

Claims (9)

1.一种鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤的方法，其特征在于，包括：
S1、鼠李糖脂的制备
利用铜绿假单胞杆菌发酵制备鼠李糖脂，备用；
S2、获取蚯蚓种
S3、土壤预处理
对待修复的污染土壤进行松土处理，去除杂物后将表面耙平，形成处理层；其中，松土深度为30～50cm深度；
S4、土壤修复处理
S4-1、鼠李糖脂溶液的投放
将鼠李糖脂与去离子水混合制备得到浓度为300～1000mg/L的鼠李糖脂溶液，然后对S3所形成的处理层按照2～3L/m2的施加量施加鼠李糖脂溶液，再次对土壤进行松土处理致使鼠李糖脂溶液与土壤混合均匀；
S4-2、土壤再处理
在S4-1处理后的处理层内每间隔3～5m设置深度为20～30cm、顶部宽度为10～15cm、底部宽度为5～8cm纵截面为等腰梯形结构的引水渠(1)；并在所述引水渠(1)上每间隔8～10m设置内径为30～50cm、深度为30～50cm的辅助饲养基孔(2)；在所述辅助饲养基孔(2)中投放占辅助饲养基孔(2)容积40～60％的有机肥；
S4-3、蚯蚓种的投放
按照30～80条/m2的投放密度将蚯蚓种投放至污染土壤中；
S4-4、土壤处理修复
利用所述引水渠(1)保持污染土壤含水率为40～50％，保持在该含水量的条件下持续修复12d；然后在自然条件下修复21～30d。
2.如权利要求1所述的一种鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤的方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述发酵制备鼠李糖脂的方法为：
S1-11、发酵培养
将铜绿假单胞杆菌经过活化后置于第一液体发酵培养基中在温度为35～37℃、振荡转速为230～250r/min的条件下发酵培养4～7d，得到发酵液；
S1-12、提取鼠李糖脂
将发酵液在7000～7500r/min的条件下离心处理20～25min除去菌体取上清液，然后利用萃取法提取得到鼠李糖脂。
3.如权利要求2所述的一种鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤的方法，其特征在于，所述步骤S1-11中，所述第一液体发酵培养基成分为：甘油40～50g/L、酵母膏0.2g/L、NaNO36.5g/L、KH2PO41.0g/L、NaCl0.5g/L、Na2HPO4·12H2O1.0g/L、FeSO4·7H2O0.3g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、去离子水1000ml，pH＝6.5～7.0。
4.如权利要求2所述的一种鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤的方法，其特征在于，所述步骤S1-12中，所述萃取法为：利用浓度为98％的硫酸调节上清液pH至1～1.5，在4～8℃条件下静置10～12h；然后用体积比为2：1的氯仿-甲醇混合液等体积萃取上清液，静置分层后取下层；然后对中层利用氯仿-甲醇混合液进行二次萃取，静置分层后取下层；合并两次萃取液后蒸干溶剂得到鼠李糖脂。
5.如权利要求1所述的一种鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤的方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述发酵制备鼠李糖脂的方法为：
S1-21、发酵培养
将铜绿假单胞杆菌经过活化后置于第二液体发酵培养基中在温度为28～32℃、振荡转速为280～300r/min的条件下发酵培养8～10d，得到发酵液；
S1-22、提取鼠李糖脂
将发酵液在5000～5500r/min的条件下离心处理25～30min除去菌体取上清液，然后利用膜分离法提取得到鼠李糖脂。
6.如权利要求5所述的一种鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤的方法，其特征在于，所述步骤S1-21中，所述第二液体发酵培养基成分为：豆油100～120g/L、酵母膏0.2g/L、NaNO36.5g/L、KH2PO41.0g/L、NaCl0.5g/L、Na2HPO4·12H2O1.0g/L、FeSO40.1g/L、MgSO40.3g/L、去离子水1000ml，pH＝6.0～6.5。
7.如权利要求5所述的一种鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤的方法，其特征在于，所述步骤S1-22中，所述膜分离法为：使用双蒸水将发酵液稀释5～20倍后，利用截留分子量为10000的滤膜在25℃、0.5Mpa、200～300L/h的条件下进行超滤处理；然后利用截留分子量为300的滤膜将超滤液在25℃、1.0Mpa条件下进行纳滤处理，蒸干溶剂得到鼠李糖脂。
8.如权利要求1所述的一种鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤的方法，其特征在于，所述有机肥按照质量百分比由40～50％的畜禽粪便、15～25％秸秆、5～10％锯末以及余量的落叶进行发酵制备得到。
9.如权利要求8所述的一种鼠李糖脂和蚯蚓联合修复二恶英污染土壤的方法，其特征在于，所述发酵的方法为：按所述比例将秸秆、落叶、锯末混合粉碎后与畜禽粪便混合，得到混合基质；向混合基质中加入发酵剂并加水至混合基质含水量为40～50％，堆积发酵1～3d后进行翻堆，覆盖塑料薄膜持续发酵21～30d；其中，持续发酵过程中每隔3～5d翻堆一次。
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