JP6887387B2 - 高収量および高力価でラムノリピッドを生産するための半連続方法 - Google Patents
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Description
(a)少なくとも1つの炭素源、少なくとも1つの窒素源、少なくとも1つのリン源、少なくとも1つのマグネシウム源、少なくとも1つのカリウム源、少なくとも1つの硫黄源、少なくとも1つの塩化物源、および少なくとも1つのナトリウム源を含む培養培地で、約2から約5日間、ラムノリピッド生産微生物を培養して、1つまたは複数のラムノリピッドを含む第1の発酵培地を得ること、
(b)(a)で得られた1つまたは複数のラムノリピッドを含む発酵培地の少なくとも約70%、より特定すると約70%から約80%の間、または代わりに、約70から約90%の間を除去すること、
(c)(b)で除去された1つまたは複数のラムノリピッドを含む前記発酵培地を、ステップ(a)に記載の組成を有する培養培地で置き換えること、
(d)ステップ(a)〜(c)を少なくとも1回反復し、ラムノリピッドを含む次の発酵物を得ること
を含み、
前記ステップ(a)〜(c)は、少なくとも約30日間反復可能である、半連続発酵法が提供される。
数値の範囲が提供される場合、文脈上明らかに他の意味で示されていなければ、下限値の単位の十分の一までの、その範囲の上限と下限との間に存在する各値、および、その規定の範囲の任意の他の規定の値または間に存在する値は、本発明の範囲内に包含されると理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、より小さい範囲に独立して含まれる場合があり、本発明の範囲内にも包含され、規定の範囲の特に除外された任意の限界値となる場合もある。規定の範囲が境界の一方または両方を含む場合、これらの含まれた境界のいずれかまたは両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。
上記のように、方法は、ラムノリピッド生産微生物を培養することを含む。ラムノリピッド生産微生物は、ラムノリピッドを生産する宿主細胞であってもよい。ラムノリピッドを生産する組換え宿主細胞は、RhlA遺伝子もしくはそのオーソログ、および/またはRhlB遺伝子もしくはそのオーソログ、および/またはRhlC遺伝子もしくはそのオーソログ、および/またはRhlR遺伝子もしくはそのオーソログ、および/またはRhlI遺伝子もしくはそのオーソログ、および/またはRhlG遺伝子もしくはそのオーソログ、ならびにその他を発現する細菌細胞などの宿主細胞であってもよい。
ラムノリピッド含有微生物は、培養培地で培養する。前記培養培地は、少なくとも1つの炭素源、少なくとも1つの窒素源、少なくとも1つのリン源、少なくとも1つの硫黄源、少なくとも1つのナトリウム源、少なくとも1つのマグネシウム源、少なくとも1つのカリウム源、少なくとも1つの硫黄源および少なくとも1つの塩化物源を含む。
上記のように、前記方法は、微量栄養素溶液または組成物を添加することをさらに含んでもよい。前記微量栄養素は、微量のFe、Mn、Zn、Cu、Naとしてもよい。特定の実施形態において、前記微量栄養素はFe、Mn、Zn、NaまたはCuの塩である。より特定の実施形態においては、前記微量栄養素組成物は、Fe、Mn、Zn、NaおよびCuの塩を含む。組成物は、濾過によって滅菌してもよい。
[実施例]
ラムノリピッド生産のための緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)の発酵用の培養培地中の8%大豆油の組成を以下の表2に示す。アラビアゴムは、大豆油の10%w/wで用いられる。
微量栄養素の組成を表3に示す。各々の塩濃度は、g/L(微量栄養素溶液)であることに注意されたい。
ATCC#55734から入手したR4株を、最初に40g/L Tryptic Soy Agar含有寒天プレートに、32℃で18〜24時間、接種する。R4コロニーが形成された後、次いで、単一コロニーを振盪チューブ内の、5mlの20g/L LBブロス(Lennox)中37℃で20〜24時間培養する。最終OD600は約3〜5であり、振盪チューブ内のLBブロス(Lennox)溶液は黄色から緑色へ変化する。次いで振盪チューブから得られたR4培養物を、20g/L LBブロス(Lennox)含有振盪フラスコに1%の接種で接種し、37℃で20〜24時間インキュベートする。発酵に必要なR4の十分な接種材料を生じさせるために、このプロセスを必要に応じて反復する。LBブロス(Lennox)は、Sigma Aldrich #3022から入手し、10g/L Tryptone、5g/L酵母エキスおよび5g/L NaClを含む。
ATCC#55734(R4)から入手した緑膿菌(P. aeruginosa(Schroeter)Migula)の発酵を、10Lバイオリアクターで行い、図1に図式的に記載する。発酵槽10内に、8%大豆油および大豆油に対して10%w/wのアラビアゴムの8Lの培養培地の調製から開始する。実施例1において培養培地に用いられる化学物質は、ACSグレード(入手可能な最高純度)である。培養培地の滅菌後、循環水方式加熱ジャケットを用いて、温度を37℃へ冷却し、撹拌を開始する(毎分250回転)。温度が37℃で安定したら、0.2ミクロン濾過空気を、通気ライン(#4)を通して発酵槽へ1.5L/分で供給し、ライン#1を通して発酵槽に、実施例3で得られたR4の2.5%(200ml)接種材料を接種する。次いで、実施例2で調製したフィルター滅菌された8mlの微量栄養素をライン#2を通して発酵槽へ1日1回添加する。微量栄養素を毎日添加することができない場合、ペリスタポンプを用いて発酵槽に40ml/日で連続的に添加するために、8mlの微量栄養素を32mlの脱イオン水(1日あたり)中に希釈する。シリコンベースの消泡剤(Sigma Aldrich #85390)を、発酵の間、泡を消すために、ライン#3を通して自動的に添加する。
使用する培養培地の組成を表5に示す。大豆油に対して5%w/wのアラビアゴムを含む、7.3Lの8%大豆油を実施例1の記載と同様に調製する。本実施例で用いられるすべての化学物質は、不純物含有の工業グレードである。
本実施例において、培養培地および発酵パラメータは、用いる微量栄養素の量が2倍であることを除いて、実施例5に示したものと同一である。14.6mlの微量栄養素(実施例2において調製した)を26.4mlの脱イオン水(1日あたり)中に希釈することによって、ペリスタポンプを用いて40ml/日の流量で連続的に添加する。%溶存酸素(%DO)を15%〜20%に保つために、1.5L/分の空気流量を用い、必要に応じて撹拌速度を自動的に上げる。撹拌を遅いままにし、それによって泡立ちの問題を減らすために、空気流の10〜30%で純粋酸素を発酵槽にさらに添加し全流量を一定の1.5L/分に保つ。ラムノリピッド(RL)濃度および力価を以下の表7に示す。
本実施例で用いた培養培地組成を表8に示す。
100Lの培養培地(実施例5などの組成)を実施例1と同様に調製し、120Lバイオリアクターにおいて滅菌する。その組成を表10に示す。R4株の種培養は、実施例2に従って調製する。振盪フラスコ内の20g/LのLBブロスLennox中で37℃で24時間インキュベートした2.9LのR4株を100Lの発酵槽に接種する。
50mlの培養培地(以下の組成)を、250ml振盪フラスコで実施例1と同様に調製する。その組成を表12に示す。オートクレーブ滅菌し、室温まで冷却した後、振盪フラスコに5%のR4株の凍結保存物を接種する。凍結保存物は、OD600が3〜4の70%R4試験管培養物を30%グリセロールと混合し、−80℃で保存することによって得る。インキュベーションは、37℃で92時間、シェーカーで、微量栄養素を添加せずに行う。接種の92時間後、ラムノリピッド濃度は、5個の振盪フラスコの平均で47±3g/Lである。
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20 滅菌タンク
本発明は次の実施態様を含む。
[1]1つまたは複数のラムノリピッドを含む複数の発酵物を生産する半連続方法であって、
(a)グルコース、脂肪アルコール、脂肪酸、または植物油、例えばオリーブ油、菜種油、オリーブ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、キャノーラ油および大豆油などの少なくとも1つの炭素源、NaNO 3 、尿素およびNH 4 Clなどの少なくとも1つの窒素源、H 3 PO 4 およびK 2 HPO 4 などの少なくとも1つのリン源、MgSO 4 *7H 2 OおよびMgCl 2 などの少なくとも1つのマグネシウム源、KClおよびKOHなどの少なくとも1つのカリウム源、H 2 SO 4 などの少なくとも1つの硫黄源、KClおよびNaClなどの少なくとも1つの塩化物源、ならびにNaCl、NaNO 3 、およびNaOHなどの少なくとも1つのナトリウム源、ならびに場合によりアラビアゴム、グアーゴムおよびラムノリピッドなどの乳化剤を含む培養培地で、約2から約5日間、ラムノリピッド生産微生物を培養して、ラムノリピッドを含む第1の発酵培地を得ること、
(b)(a)で得られた1つまたは複数のラムノリピッドを含む前記発酵培地の少なくとも約70%を除去すること、
(c)(b)で除去された1つまたは複数のラムノリピッドを含む前記発酵培地を、ステップ(a)に記載の組成を有する培養培地で置き換えること、
(d)ステップ(a)〜(c)を少なくとも1回反復し、ラムノリピッドを含む次の発酵物を得ること
を含み、
前記ステップ(a)〜(c)は、少なくとも約30日間反復可能であり、
前記方法が、ステップ(a)の前記培養培地に、(1)1日あたり全発酵物体積の0.1%v/vで、微量栄養素溶液において20mg/L以下の濃度で1つまたは複数の微量栄養素を含む組成物を添加すること、および/または(2)炭素ベースまたはシリコンベースの消泡剤などの消泡剤を場合により添加することをさらに含む、半連続方法。
[2]前記ラムノリピッド生産微生物が、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)などのシュードモナス属(Pseudomonas)微生物である、上記[1]に記載の方法。
[3]前記乳化剤が約0.1〜20重量%の量で存在し、前記炭素源が約6〜12重量%の濃度で存在し、前記窒素源が約1〜4g/Lの量で存在し、前記リン源が約1〜3g/Lの量で存在し、前記マグネシウムイオンが約0.001〜0.2g/Lの量で存在し、前記カリウムイオンが約0.1から約1g/Lの量で存在し、前記ナトリウムイオンが約1〜10g/Lの量で存在し、前記塩化物イオンが約0.1〜1g/Lの量で存在し、前記硫黄イオンが約0.1〜1g/Lの量で存在する、上記[1]〜[2]に記載の方法。
[4]前記微量栄養素が、FeCl 3 *6H 2 OもしくはFeSO 4 などのFe塩、MnSO 4 *H 2 OおよびMnCl 2 ・4H 2 OなどのMn塩、ZnSO 4 *7H 2 OもしくはZnCl 2 などのZn、Na 3 C 6 H 5 O 7 *2H 2 O、NaC 6 H 7 O 7 およびNa 2 C 6 H 6 O 7 などのNa塩、またはCuCl 2 *2H 2 OおよびCuSO 4 *5H 2 OなどのCu塩である、上記[1]〜[3]に記載の方法。
[5]前記Cu塩が微量栄養素溶液において約0.5〜3g/Lの量で存在し、前記Mnが微量栄養素溶液において約0.1〜1.5g/Lの量で存在し、前記Zn塩が微量栄養素溶液において約0.5g/Lの量で存在し、前記Fe塩が微量栄養素溶液において約0.1〜1g/Lの量で存在し、および/または前記ナトリウム塩が微量栄養素溶液において約1〜5g/Lの量で存在する、上記[4]に記載の方法。
[6]前記微量栄養素組成物を連続的に添加する、上記[1]〜[5]に記載の方法。
[7]前記微量栄養素組成物を毎日添加する、上記[1]〜[6]に記載の方法。
[8]前記シュードモナス属(Pseudomonas)を約30〜37℃の温度および/または約6〜8.6のpHで培養する、上記[1]〜[7]に記載の方法。
[9]ステップ(d)を少なくとも約30日間反復する、上記[1]〜[8]に記載の方法。
Claims (13)
- 1つまたは複数のラムノリピッドを含む複数の発酵物を生産する半連続方法であって、
(a)(i) 少なくとも1つの炭素源、(ii) 少なくとも1つの窒素源、(iii) 少なくとも1つのリン源、(iv) 少なくとも1つのマグネシウム源、(v) 少なくとも1つのカリウム源、(vi)少なくとも1つの硫黄源、(vii) 少なくとも1つの塩化物源、(viii) 少なくとも1つのナトリウム源、ならびに(ix) 乳化剤を含む培養培地で、2から5日間、ラムノリピッドを生産する緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)を培養して、1つまたは複数のラムノリピッドを含む第1の発酵培地を得ること、
(b)(a)で得られた1つまたは複数のラムノリピッドを含む前記第1の発酵培地の少なくとも70%を除去すること、
(c)(b)で除去された1つまたは複数のラムノリピッドを含む前記第1の発酵培地を、ステップ(a)に記載の組成を有する培養培地で置き換えること、
(d)ステップ(a)〜(c)を少なくとも1回反復し、1つまたは複数のラムノリピッドを含む次の発酵物を得ること
を含み、
少なくとも45g/Lのラムノリピッドが生産される、
半連続方法。 - 前記方法が、前記培養培地に、
(x) 1つまたは複数の微量栄養素を、20mg総微量栄養素/L培養培地以下の濃度で、微量栄養素組成物の形態で添加すること、および/または
(xi) 消泡剤を添加すること
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記乳化剤が0.1〜20重量%の量で存在し、前記炭素源が6〜12重量%の濃度で存在し、前記窒素源が1〜4g/Lの量で存在し、前記リン源が1〜3g/Lの量で存在し、前記マグネシウム源が0.001〜0.2g/Lの量で存在し、前記カリウム源が0.1から1g/Lの量で存在し、前記ナトリウム源が1〜10g/Lの量で存在し、前記塩化物源が0.1〜1g/Lの量で存在し、前記硫黄源が0.1〜1g/Lの量で存在する、請求項1に記載の方法。
- 前記微量栄養素組成物が、Fe塩、Mn塩、Zn塩、Na塩、またはCu塩を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記Cu塩が微量栄養素組成物において0.5〜3g/Lの量で存在し、前記Mn塩が微量栄養素組成物において0.1〜1.5g/Lの量で存在し、前記Zn塩が微量栄養素組成物において0.5〜3g/Lの量で存在し、前記Fe塩が微量栄養素組成物において0.1〜1g/Lの量で存在し、および/または前記ナトリウム塩が微量栄養素組成物において1〜5g/Lの量で存在する、請求項4に記載の方法。
- 前記微量栄養素組成物を連続的に添加する、請求項2または4に記載の方法。
- 前記微量栄養素組成物を毎日添加する、請求項2または4に記載の方法。
- 前記緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)を30〜37℃の温度および/または6〜8.6のpHで培養する、請求項1に記載の方法。
- ステップ(d)を少なくとも30日間反復する、請求項1に記載の方法。
- 前記微量栄養素組成物が溶液である、請求項2または4に記載の方法。
- (i) 前記少なくとも1つの炭素源が、グルコース、脂肪アルコール、脂肪酸、または植物油であり、前記植物油が、オリーブ油、菜種油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、キャノーラ油または大豆油であり、
(ii) 前記少なくとも1つの窒素源が、NaNO 3 、尿素またはNH 4 Clであり、
(iii) 前記少なくとも1つのリン源が、H 3 PO 4 またはK 2 HPO 4 であり、
(iv) 前記少なくとも1つのマグネシウム源が、MgSO 4 *7H 2 OまたはMgCl 2 であり、
(v) 前記少なくとも1つのカリウム源が、KClまたはKOHであり、
(vi) 前記少なくとも1つの硫黄源が、H 2 SO 4 であり、
(vii) 前記少なくとも1つの塩化物源が、KClまたはNaClであり、
(viii) 前記少なくとも1つのナトリウム源が、NaCl、NaNO 3 、またはNaOHであり、かつ/または、
(ix) 前記乳化剤が、アラビアゴムまたはグアーゴムである、
請求項1に記載の方法。 - 前記Fe塩がFeCl 3 *6H 2 OまたはFeSO 4 であり、
前記Mn塩がMnSO 4 *H 2 OまたはMnCl 2 *4H 2 Oであり、
前記Zn塩がZnSO 4 *7H 2 OまたはZnCl 2 であり、
前記Na塩がNa 3 C 6 H 5 O 7 *2H 2 O、NaC 6 H 7 O 7 またはNa 2 C 6 H 6 O 7 であり、かつ/または、
前記Cu塩がCuCl 2 *2H 2 OまたはCuSO 4 *5H 2 Oである、
請求項4に記載の方法。 - 前記消泡剤が、炭素ベースまたはシリコンベースの消泡剤である、請求項2に記載の方法。
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