JP6887387B2

JP6887387B2 - 高収量および高力価でラムノリピッドを生産するための半連続方法

Info

Publication number: JP6887387B2
Application number: JP2017557995A
Authority: JP
Inventors: ロヒサーン，ナッタポーン
Original assignee: ステパンカンパニー
Priority date: 2015-05-05
Filing date: 2016-05-04
Publication date: 2021-06-16
Anticipated expiration: 2036-05-04
Also published as: CA2984762C; WO2016179249A1; KR20180002826A; PL3292210T3; MX2017014101A; DK3292210T3; AU2016258621B2; AU2016258621A1; BR112017023334B1; JP2018514222A; EP3292210A1; EP3292210A4; BR112017023334A2; US10144943B2; CN107735495A; ZA201707712B; ES2792029T3; KR102695293B1; EP3292210B1; US20160326561A1

Description

ラムノリピッドを生産するための、ラムノリピッド生産微生物の半連続発酵法が提供される。発酵はバッチプロセスで行ってよいが、発酵の最後に１つまたは複数のラムノリピッドを含む発酵培地の少なくとも約７０％を抜き取り、新しい培養培地（原料）を代わりに供給する。

異なる２つの液体間の表面張力を下げる特性を有する、界面活性糖脂質タイプのバイオサーファクタントであるラムノリピッド（ＲＬ）は、乳化剤、洗浄剤および発泡剤として幅広く用いられている［１〜３］。ラムノリピッドは、汚染土壌から原油を効率的に除去し、その乳化特性によって油流出のバイオレメディエーションを手助けする、いわゆる「増進回収法（ＥＯＲ）」が可能であることが示されている［４］。それらは、抗菌性および抗真菌性の特性から、農業にも用いられている。ラムノリピッドは、現在、ＺＯＮＩＸとして販売されている農業用抗真菌製品および保存タンクから油を洗浄するための工業用洗浄製品、ＲＥＣＯで入手可能である。

シュードモナス属（Pseudomonas）および大腸菌（E. coli）は、さまざまな炭素源および窒素源からラムノリピッド（ＲＬ）を生産できることが示されている［５］。シュードモナス属（Pseudomonas）は大腸菌（E. coli）より高いＲＬ収量および力価を生じるが［５、６］、ＲＬ濃度は、発酵プロセスを商業的に実現可能にするほど高くない。さまざまな炭素源、遺伝子組換え株、および達成するために最も効果的な経路であると思われる発酵戦略を含む、ＲＬ生産能を増加するためのいくつかの取り組みが行われてきた。

バッチおよびフェッドバッチ発酵は、シュードモナス属（Pseudomonas）を用いた最も一般的な発酵プロセスである［７〜１１］。バッチ発酵は、最も簡便な培養方法であり［７、８］、原料（炭素源）は開始時に接種材料と共に発酵槽に添加される。発酵は、微生物によって原料がすべて利用されるまで行われ、次いで発酵槽は閉鎖され、新しいバッチが開始される［９］。他方、フェッドバッチは、バッチ発酵であるが、原料が十分に利用された後、発酵の間、原料（炭素源）が添加される［９〜１１］。最良の最新の報告されたＲＬ力価（生産能）は、緑膿菌（P. aeruginosa）のフェッドバッチ発酵から得られた、約０．５８〜０．７２ｇ／Ｌ／ｈである［１０］。しかし、このプロセスは、９０〜１２０時間後、新しいフェッドバッチの開始前に発酵槽の閉鎖を必要とする。同様に、米国特許第５，６５８，９７３号は、１６７時間後に７８ｇ／Ｌのラムノリピッドを生産したと報告し［８］、これは操作には長すぎる。

本明細書では、１つまたは複数のラムノリピッドを含む複数の発酵物を生産する半連続発酵法であって、
（ａ）少なくとも１つの炭素源、少なくとも１つの窒素源、少なくとも１つのリン源、少なくとも１つのマグネシウム源、少なくとも１つのカリウム源、少なくとも１つの硫黄源、少なくとも１つの塩化物源、および少なくとも１つのナトリウム源を含む培養培地で、約２から約５日間、ラムノリピッド生産微生物を培養して、１つまたは複数のラムノリピッドを含む第１の発酵培地を得ること、
（ｂ）（ａ）で得られた１つまたは複数のラムノリピッドを含む発酵培地の少なくとも約７０％、より特定すると約７０％から約８０％の間、または代わりに、約７０から約９０％の間を除去すること、
（ｃ）（ｂ）で除去された１つまたは複数のラムノリピッドを含む前記発酵培地を、ステップ（ａ）に記載の組成を有する培養培地で置き換えること、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１回反復し、ラムノリピッドを含む次の発酵物を得ること
を含み、
前記ステップ（ａ）〜（ｃ）は、少なくとも約３０日間反復可能である、半連続発酵法が提供される。

特定の実施形態において、前記ラムノリピッド生産微生物は、約２５〜４０℃の温度、より特定すると約３０〜３７℃の温度、および／または約５．５から約９のｐＨ、より特定すると約６〜８．６のｐＨで培養してもよい。ステップ（ｃ）で、新しい培養培地で置き換えた後、発酵開始時のｐＨは、特定の実施形態において、約６〜７、好ましくは６．２〜６．５であってよい。発酵のｐＨは、発酵の間、制御する必要はない。

別の特定の実施形態において、前記方法は１つまたは複数の微量栄養素を含む組成物を添加することをさらに含む。特定の実施形態において、前記微量栄養素は、約２０ｍｇ／Ｌ以下で存在する。特定の実施形態において、前記微量栄養素は、約１ｍｇ／Ｌから約１４ｍｇ／Ｌの間で存在する。前記組成物は、１日あたり全発酵物体積の０．１％ｖ／ｖで、毎日または連続的のいずれかで添加してもよい。

上記記載の方法は、消泡剤を添加することをさらに含んでもよい。前記消泡剤は、炭素またはシリコンベースの消泡剤であってよい。

上記記載のプロセスは、発酵をバッチプロセスで行うことを可能にするが、発酵の最後に１つまたは複数のラムノリピッドを含む発酵培地の少なくとも約７０％を抜き取り、新しい培養培地（原料）を代わりに供給する。このプロセス（ステップ（ｄ））は、ＲＬ収量および力価を犠牲にしないで、少なくとも約１カ月間、別の実施形態においては、約１８０日まで反復可能である。バッチおよびフェッドバッチ発酵戦略と比較して、クリーンアップのためのより少ない休止時間とより高い能力で発酵槽を利用できるようにする。上記のように、前記プロセス、ステップ（ｄ）は少なくとも１回反復する。特定の実施形態において、前記プロセス、ステップ（ｄ）は少なくとも５回反復する。

特定の実施形態において、前記方法は、少なくとも約４５ｇ／Ｌ、より特定すると約６０〜８０ｇ／Ｌのラムノリピッド濃度を、約１．６ｇ／Ｌ／ｈに達するラムノリピッド生産能（力価）で生産する。特定の実施形態において、炭素源が油である場合、約０．８％ｗ／ｖ以下の残留油組成物のみがステップ（ｂ）で検出される。

定義
数値の範囲が提供される場合、文脈上明らかに他の意味で示されていなければ、下限値の単位の十分の一までの、その範囲の上限と下限との間に存在する各値、および、その規定の範囲の任意の他の規定の値または間に存在する値は、本発明の範囲内に包含されると理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、より小さい範囲に独立して含まれる場合があり、本発明の範囲内にも包含され、規定の範囲の特に除外された任意の限界値となる場合もある。規定の範囲が境界の一方または両方を含む場合、これらの含まれた境界のいずれかまたは両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。

別段に定義されない限り、本明細書に用いられるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されることと同義である。本明細書に記載のものと類似のまたは同等な任意の方法および材料も、本発明の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料が記載されている。

本開示に引用されるすべての出版物および特許は、その内容全体が参照により組み込まれている。本明細書中で、本発明が先行発明のためにそのような開示に先行する権利を認められていないという承認として理解されるべきものは何もない。参照により組み込まれる材料が本明細書と相反するまたは一貫性がない範囲では、本明細書は任意のそのような材料に取って代わることになる。

本明細書および添付の請求項において使用する場合、単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈上明らかに他の意味で示されていなければ、複数の参照を含むことに注意しなければならない。

別段の指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも（at least）」という用語は、一連のすべての要素を表すことが理解されなければならない。当業者であれば、単なる日常的実験を使用して、本明細書に記載する本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識し、または確認することができる。そのような均等物は、本発明によって包含されることを意図する。本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、文脈上別段の要求がなければ、「含む（comprise）」という言葉、ならびに「含む（comprises）」および「含んでいる（comprising）」などの変形は、記載する整数もしくはステップ、または整数もしくはステップの群を含むことを含意するが、あらゆる他の整数もしくはステップ、または整数もしくはステップの群を除外するものではないことが理解されよう。したがって、「含んでいる（comprising）」、「含んでいる（including）」、「含有する（containing）」、「有する（having）」などの用語は、拡張的にまたはオープンエンドで制限なく読み取られるものとする。本明細書で用いられる場合、「含んでいる（comprising）」という用語は、「含有する（containing）」という用語、または場合によっては、本明細書で用いられる場合、「有する（having）」という用語に置き換えることができる。

本明細書に定義されるように、「ラムノリピッド」は、１つまたは複数の一般的に直鎖状の飽和または不飽和β−ヒドロキシ−カルボン酸部分を含む脂質部分および１つまたは複数の単位のラムノースの糖部分を有する糖脂質を表す。

糖部分と脂質部分は、糖部分のラムノース部分の１−ＯＨ基と脂質部分のβ−ヒドロキシ−カルボン酸の３−ＯＨ基との間のβ−グリコシド結合を介して結合している。したがって、１つのカルボン酸部分のカルボキシル基が、ラムノリピッド末端を画定する。２つ以上のラムノース部分がラムノリピッドに含まれる場合、脂質部分に結合していないラムノース部分の各々は、１，４β−グリコシド結合を介して別のラムノース部分へ結合している。２つ以上のβ−ヒドロキシ−カルボン酸がラムノリピッドに存在する実施形態において、β−ヒドロキシ−カルボン酸部分は、互いに独立して選択される。それぞれの複数のβ−ヒドロキシカルボン酸部分のβ−ヒドロキシカルボン酸部分は、一部の実施形態では同一であってもよい。一部の実施形態では、それらは互いに異なる。

本明細書に定義されるように、「微量栄養素組成物」は、約２０ｍｇ／Ｌ以下の量で存在する微量栄養素を含む組成物である。

「培養培地」、「発酵培地」という用語は同意語であり、同じ意味で用いられる。

ラムノリピッドを生産する半連続発酵法の概略図である。実施例４において、ステップ（ａ）〜（ｃ）を３１日以上反復した発酵の間のｐＨ変化を示す図である。実施例５において、接種後または新しい培養培地で充填後の発酵の間のｐＨ変化を示す図である。

１つまたは複数のラムノリピッドを含む複数の発酵物を生産する半連続発酵法が本明細書で提供される。特定の実施形態において、ラムノリピッドは、構造（Ｉ）

を有してもよく、式中、ｍ＝２、１または０、特に、１または０であり、ｎ＝１もしくは０、または特に１であり、Ｒ^１およびＲ^２は独立して、２〜２４個、好ましくは５〜１３個の炭素原子を有する互いに同一または異なる有機基であり、特に、場合により分岐状であり、場合により置換されており、特に、ヒドロキシル置換されており、場合により不飽和であり、特に、場合によりモノ不飽和、ジ不飽和またはトリ不飽和のアルキル基であり、好ましくはペンテニル、ヘプテニル、ノネニル、ウンデセニルおよびトリデセニル、ならびにｏ＝１〜２３、好ましくは４〜１２である（ＣＨ２）ｏ−ＣＨ_３からなる群から選択される基である。

主鎖ならびに分枝の両者は、例えばＮ、Ｏ、Ｓ、ＳｅもしくはＳｉなどのヘテロ原子をさらに含んでいてもよく、または炭素原子がこれらのヘテロ原子の１つによって置き換えられていてもよい。脂肪族部分は、１つまたは複数の官能基で置換されていても非置換であってもよい。置換基は、任意の官能基、例えばアミノ、アミド、カルボニル、カルボキシル、ヒドロキシル、ニトロ、チオおよびスルホニルとしてもよいが、これらに限定されない。

ラムノリピッド生産微生物
上記のように、方法は、ラムノリピッド生産微生物を培養することを含む。ラムノリピッド生産微生物は、ラムノリピッドを生産する宿主細胞であってもよい。ラムノリピッドを生産する組換え宿主細胞は、ＲｈｌＡ遺伝子もしくはそのオーソログ、および／またはＲｈｌＢ遺伝子もしくはそのオーソログ、および／またはＲｈｌＣ遺伝子もしくはそのオーソログ、および／またはＲｈｌＲ遺伝子もしくはそのオーソログ、および／またはＲｈｌＩ遺伝子もしくはそのオーソログ、および／またはＲｈｌＧ遺伝子もしくはそのオーソログ、ならびにその他を発現する細菌細胞などの宿主細胞であってもよい。

あるいは、「ラムノリピッド生産微生物」は、適した条件下でラムノリピッドを合成／生産する能力を有する細菌などの任意の微生物であってもよく、放線菌門（Actinobacteria）、フィルミクテス門（Fimicutes）およびプロテオバクテリア門（Proteobacteria）の細菌を含むがこれに限定されない。特定の実施形態においては、ラムノリピッド生産微生物は、ガンマプロテオバクテリア綱（Gammaproteobacteria）の細菌である。さらなる実施形態においては、ラムノリピッド生産微生物は、シュードモナス目（Pseudomonadales）の細菌である。さらに別のさらなる実施形態においては、ラムノリピッド生産微生物は、シュードモナス科（Pseudomonadacae）の細菌である。さらなる実施形態においては、ラムノリピッド生産微生物は、シュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes）、緑膿菌（P. aeruginosa）、シュードモナス・クロロラフィス（P. chlororaphis）、シュードモナス・クレマンシー（P. clemancea）、シュードモナス・コリエレア（P. collierea）、シュードモナス・フルオレッセンス（P. fluorescens）、シュードモナス・ルテオラ（P. luteola）、シュードモナス・プチダ（P. putida）、シュードモナス・スタッツェリ（P. stutzeri）およびシュードモナス・テッシデア（P. teessidea）などのシュードモナス属（Pseudomonas）の細菌である。さらなる実施形態においては、ラムノリピッド生産微生物は緑膿菌（P. aeruginosa）である。

培養培地
ラムノリピッド含有微生物は、培養培地で培養する。前記培養培地は、少なくとも１つの炭素源、少なくとも１つの窒素源、少なくとも１つのリン源、少なくとも１つの硫黄源、少なくとも１つのナトリウム源、少なくとも１つのマグネシウム源、少なくとも１つのカリウム源、少なくとも１つの硫黄源および少なくとも１つの塩化物源を含む。

炭素源は、単糖、例えばグルコース、二糖、例えばスクロース、糖アルコール、例えばグリセロール、長鎖アルカン、例えばｎ−ヘキサデカン、カプリル酸（オクタン酸とも命名される）などの脂肪酸、植物油（新しいまたは廃棄されたもの、例えば大豆油）またはそれらの混合物、有機酸（例えば乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸）、アルコール（例えばエタノール）、およびこれらの混合物であってもよい。特定の実施形態において、炭素源は、オリーブ油、菜種油、オリーブ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、キャノーラ油および大豆油からなる群から選択される植物油である。炭素源は、約６％〜約１２％ｗ／ｗの量で存在してもよい。

窒素源は、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、食肉抽出物、ペプトン、およびコーンスティープリカーであってもよい。特定の実施形態において、窒素源はＮａＮＯ_３である。さらに別の実施形態においては、窒素は約１〜１０ｇ／Ｌの量で存在してもよい。

リン源は、特定の実施形態においてＨ_３ＰＯ_４またはＫ_２ＨＰＯ_４であってもよい。さらに別の特定の実施形態においては、前記リンは、約１〜１０ｇ／Ｌの量で存在する。

マグネシウムイオンは、特定の実施形態においてＭｇＳＯ_４＊７Ｈ２Ｏおよび／またはＭｇＣｌ_２であってもよい。特定の実施形態において、マグネシウムは、約０．０１〜１ｇ／Ｌの量で存在する。

カリウムは、ＫＣｌおよび／またはＫＯＨであってもよい。特定の実施形態において、カリウムは、約０．１〜約２ｇ／Ｌの量で存在する。

ナトリウムは、ＮａＣｌ、ＮａＮＯ_３、およびＮａＯＨであってもよい。特定の実施形態において、前記ナトリウムイオンは、約１〜１５ｇ／Ｌの量で存在する。

塩化物はＫＣｌおよびＮａＣｌであってもよい。特定の実施形態において、前記塩化物イオンは、約０．１〜１ｇ／Ｌの量で存在する。

硫黄は、Ｈ_２ＳＯ_４であってもよい。特定の実施形態において、前記硫黄イオンは、約０．１〜１ｇ／Ｌの量で存在する。

硫黄源、塩化物源および窒素源は、出願番号第１４／９９２，９９５号に記載された手順を用いて入手可能な発酵培地を含む、酸処理し熟成させた微生物の水層、または水性液相もしくは水相とも呼ばれるものから得られてもよい。具体的な実施形態においては、１つまたは複数のラムノリピッドを含む発酵培地または培養培地は、少なくとも約１日および約２４〜７２時間の間、約０〜３０℃の間でインキュベートすることによって熟成させてもよい。特定の実施形態において、熟成させた水性培地は、酸で処理してもよく、そのため、培養培地は約１．５〜２．５、優先的には約２．０５〜約２．１５のｐＨに調整される。酸は、酢酸または鉱酸などの有機酸であり得る。好ましい実施形態においては、酸は、鉱酸、例えばＨＣｌ、Ｈ_２ＳＯ_４、ＨＮＯ_３、またはＨ_３ＣｌＯ_４である。結果として、水性液相、油相および固相が生成される。水性液相は当技術分野で既知の手順を用いて、および具体的な実施形態においては、上記の方法（例えば、濾過、またはデカンテーションと組み合わせた遠心分離もしくは沈殿）を用いて除去する。

培養培地は乳化剤をさらに含んでもよい。特定の実施形態において、乳化剤は、アラビアゴム、グアーゴムおよびラムノリピッドからなる群から選択される。さらに別の特定の実施形態においては、前記培養培地中で乳化剤の炭素源に対する割合は、約０．１％〜約２０％ｗ／ｗの間である。さらに別の特定の実施形態においては、前記乳化剤は、約５〜１０重量％の量で存在してもよい。

特定の実施形態において、培養培地または発酵培地は当技術分野で既知の方法を用いて滅菌する。これらの方法は、濾過、加熱、化学または紫外線放射に基づくものとしてもよい。特定の実施形態において、加熱に基づく処理は、湿熱滅菌、特にオートクレーブによるものとしてもよい。

一実施形態においては、水性培地（例えば発酵培地）は、上記手順の１つによって滅菌してもよい。別の実施形態においては、発酵培地は、上記手順の２つ以上によって滅菌してもよく、これらの滅菌は、任意の順序であり得る。発酵の第１サイクルの間、発酵中に滅菌してもよいが、その後のサイクルでは別の容器で滅菌するべきである。

微量栄養素組成物
上記のように、前記方法は、微量栄養素溶液または組成物を添加することをさらに含んでもよい。前記微量栄養素は、微量のＦｅ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｎａとしてもよい。特定の実施形態において、前記微量栄養素はＦｅ、Ｍｎ、Ｚｎ、ＮａまたはＣｕの塩である。より特定の実施形態においては、前記微量栄養素組成物は、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｚｎ、ＮａおよびＣｕの塩を含む。組成物は、濾過によって滅菌してもよい。

特定の実施形態においては、前記Ｃｕ塩は、少なくともＣｕＣｌ_２＊２Ｈ_２ＯおよびＣｕＳＯ_４＊５Ｈ_２Ｏの１つであり、微量栄養素溶液において約０．５〜３ｇ／Ｌの量で存在してもよく、前記Ｍｎ塩は、少なくともＭｎＳＯ４＊Ｈ_２ＯおよびＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏの１つであり、微量栄養素溶液において約０．１〜１．５ｇ／Ｌの量で存在してもよく、前記Ｚｎ塩は、ＺｎＳＯ_４＊７Ｈ_２ＯまたはＺｎＣｌ_２であり、微量栄養素溶液において約０．５〜３ｇ／Ｌの量で存在してもよく、前記Ｆｅ塩は少なくともＦｅＣｌ_３＊６Ｈ_２ＯまたはＦｅＳＯ_４の１つであり、微量栄養素溶液において約０．１〜１ｇ／Ｌの量で存在してもよく、前記ナトリウム塩はＮａ_３Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７＊２Ｈ_２Ｏであり、微量栄養素溶液において約１〜５ｇ／Ｌの量で存在してもよい。
［実施例］

培養培地の調製
ラムノリピッド生産のための緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の発酵用の培養培地中の８％大豆油の組成を以下の表２に示す。アラビアゴムは、大豆油の１０％ｗ／ｗで用いられる。

培養培地を作製するために、アラビアゴムを最初に脱イオン水に溶解し、別々の容器にて４０〜４５℃で毎分１５０〜２５０回転で撹拌し、５％ｗ／ｗアラビアゴム溶液を得る。すべてのアラビアゴムを水に溶解させるために、このステップには少なくとも３０分かかる。２番目に、キッチンブレンダーなどのブレンダーを用いて、大豆油および５％アラビアゴム溶液を脱イオン水と混合する。十分に混合され、エマルション（すなわち溶液がミルク様の白色になる）が得られたことを確認する。大豆油のエマルションが得られた後、撹拌しながらＨ_３ＰＯ_４をエマルションに添加し、Ｈ_３ＰＯ_４が十分に溶解した後で次の化学物質ＮａＯＨを添加する。次の化学物質、ＭｇＳＯ_４次いでＫＣｌ次いでＮａＮＯ_３および最後がＨ_２ＳＯ_４、を撹拌しながらエマルションに添加する。次の化学物質を添加する前に、エマルション中で十分に溶解したことを確認する。培養培地を次いで蒸気滅菌できる（オートクレーブ）。

微量栄養素組成物の調製
微量栄養素の組成を表３に示す。各々の塩濃度は、ｇ／Ｌ（微量栄養素溶液）であることに注意されたい。

すべての化学物質は、ＡＣＳグレード（入手可能な最高純度）である。撹拌しながら、Ｎａ_３Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７＊２Ｈ_２Ｏを脱イオン水へ最初に添加する。すべてが溶解した後、次の化学物質であるＦｅＣｌ_３＊６Ｈ_２Ｏを添加することができる。表に列挙したすべての化学物質を、ＦｅＣｌ_３＊６Ｈ_２Ｏ、次いでＺｎＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ、次いでＣｕＣｌ_２＊２Ｈ_２Ｏ、次いでＣｕＳＯ_４＊５Ｈ_２Ｏ、最後にＭｎＳＯ_４＊Ｈ_２Ｏの順序で溶液に添加するまで、このステップを反復する。微量栄養素は、０．２ミクロン滅菌濾過を用いて滅菌可能である。微量栄養素を蒸気オートクレーブ滅菌してはならない。

緑膿菌（P. aeruginosa（Schroeter）Migula（Ｒ４株））の種培養
ＡＴＣＣ＃５５７３４から入手したＲ４株を、最初に４０ｇ／ＬＴｒｙｐｔｉｃＳｏｙＡｇａｒ含有寒天プレートに、３２℃で１８〜２４時間、接種する。Ｒ４コロニーが形成された後、次いで、単一コロニーを振盪チューブ内の、５ｍｌの２０ｇ／ＬＬＢブロス（Ｌｅｎｎｏｘ）中３７℃で２０〜２４時間培養する。最終ＯＤ_６００は約３〜５であり、振盪チューブ内のＬＢブロス（Ｌｅｎｎｏｘ）溶液は黄色から緑色へ変化する。次いで振盪チューブから得られたＲ４培養物を、２０ｇ／ＬＬＢブロス（Ｌｅｎｎｏｘ）含有振盪フラスコに１％の接種で接種し、３７℃で２０〜２４時間インキュベートする。発酵に必要なＲ４の十分な接種材料を生じさせるために、このプロセスを必要に応じて反復する。ＬＢブロス（Ｌｅｎｎｏｘ）は、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ＃３０２２から入手し、１０ｇ／ＬＴｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ酵母エキスおよび５ｇ／ＬＮａＣｌを含む。

脱イオン水および大豆油に対して１０％ｗ／ｗのアラビアゴム（乳化剤として）を用いたラムノリピッドの半連続発酵
ＡＴＣＣ＃５５７３４（Ｒ４）から入手した緑膿菌（P. aeruginosa（Schroeter）Migula）の発酵を、１０Ｌバイオリアクターで行い、図１に図式的に記載する。発酵槽１０内に、８％大豆油および大豆油に対して１０％ｗ／ｗのアラビアゴムの８Ｌの培養培地の調製から開始する。実施例１において培養培地に用いられる化学物質は、ＡＣＳグレード（入手可能な最高純度）である。培養培地の滅菌後、循環水方式加熱ジャケットを用いて、温度を３７℃へ冷却し、撹拌を開始する（毎分２５０回転）。温度が３７℃で安定したら、０．２ミクロン濾過空気を、通気ライン（＃４）を通して発酵槽へ１．５Ｌ／分で供給し、ライン＃１を通して発酵槽に、実施例３で得られたＲ４の２．５％（２００ｍｌ）接種材料を接種する。次いで、実施例２で調製したフィルター滅菌された８ｍｌの微量栄養素をライン＃２を通して発酵槽へ１日１回添加する。微量栄養素を毎日添加することができない場合、ペリスタポンプを用いて発酵槽に４０ｍｌ／日で連続的に添加するために、８ｍｌの微量栄養素を３２ｍｌの脱イオン水（１日あたり）中に希釈する。シリコンベースの消泡剤（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ＃８５３９０）を、発酵の間、泡を消すために、ライン＃３を通して自動的に添加する。

発酵は、３７℃の温度で、培養培地の最初のｐＨは６．２で、発酵の間のｐＨは制御せずに行う。％溶存酸素（％ＤＯ）を１５％〜２０％に保つために、必要に応じて撹拌速度を自動的に上げる。増殖速度の間、微生物の酸素消費量に対応するために、接種の４０〜４８時間後に空気流量が１．５から３．５Ｌ／分へ増加する前に、撹拌速度を毎分５００回転に上げる。接種の６０時間後、ｐＨがわずかに下がった（または安定した）後で、ｐＨは増加する。さらに、撹拌および空気流量は最低値（それぞれ毎分２５０回転および１．５Ｌ／分）であるにもかかわらず％ＤＯは増加し、７２時間で発酵が完了したことを示す。このことは、１つまたは複数のラムノリピッドを含む発酵培地中の残留大豆油が０．８％未満であることで確認することができる。

次いで、ペリスタポンプを開始して、１つまたは複数のラムノリピッドを含む６Ｌ（全量の７５％）の発酵培地をライン＃５を通して除去する。いわゆる「抜き取り＃１」である６Ｌのブロスを除去したら、滅菌タンク２０で調製した、滅菌したばかりの６Ｌの８％大豆油培養培地を、重力送りを用いて発酵槽１０へ供給する。発酵開始のｐＨは６．５である。上記段落に記載された発酵パラメータを用いる。この場合、４８時間後、発酵は完了し、１つまたは複数のラムノリピッドを含む発酵培地の７５％を抜き取る準備ができている（抜き取り＃２）。続いて、滅菌した大豆油培養培地の次のバッチを、滅菌タンク２０から供給する。ラムノリピッド収量および力価に損失の兆候なく、プロセスを６週間反復した後、発酵槽を洗浄のために閉鎖する。抜き取りと各々の抜き取りの間の発酵中のｐＨ変化を図２に示す。ラムノリピッド（ＲＬ）濃度および力価を以下の表４に示す。１２回すべての抜き取りのラムノリピッド（ＲＬ）濃度は、少なくとも６２ｇ／Ｌ、最大７９ｇ／Ｌである。ＲＬ生産能（力価）は、０．９２〜１．６１ｇ／Ｌ／ｈである。

連続的に微量栄養素添加し、大豆油に脱イオン水および５％ｗ／ｗアラビアゴムを用いたラムノリピッドの半連続発酵
使用する培養培地の組成を表５に示す。大豆油に対して５％ｗ／ｗのアラビアゴムを含む、７．３Ｌの８％大豆油を実施例１の記載と同様に調製する。本実施例で用いられるすべての化学物質は、不純物含有の工業グレードである。

発酵槽に接種するために５％（３６０ｍｌ）のＲ４接種材料を用いること、および１つまたは複数のラムノリピッドを含む７７％の発酵培地（５．６Ｌ）を抜き取ること、および新しい培養培地が大豆油に対して５％ｗ／ｗのアラビアゴムを含むことを除き、発酵は実施例４と同様に行う。微量栄養素は、実施例２の記載と同様に調製する。７．３ｍｌの微量栄養素を３２．７ｍｌの脱イオン水（１日あたり）中に希釈することによって、ペリスタポンプを用いて４０ｍｌ／日の流量で連続的に添加する。シリコンベースの消泡剤（ＤＯＷＡＦＥ−１５１０）を、発酵の間、泡を消すために、自動的に添加した。％溶存酸素（％ＤＯ）を１５％〜２０％に保つために、１．５Ｌ／分の空気流量を用い、必要に応じて撹拌速度を自動的に上げる。撹拌を遅いままにし、それによって泡立ちの問題を減らすために、純粋酸素を０．００５〜０．１Ｌ／分で発酵槽にさらに添加する。接種後または新しい培養培地で充填後の発酵中の代表的なｐＨ変化を図３に示す。ラムノリピッド（ＲＬ）濃度および力価を以下の表６に示す。

連続的に２×微量栄養素添加し、脱イオン水および大豆油に対して５％ｗ／ｗのアラビアゴムを用いたラムノリピッドの半連続発酵
本実施例において、培養培地および発酵パラメータは、用いる微量栄養素の量が２倍であることを除いて、実施例５に示したものと同一である。１４．６ｍｌの微量栄養素（実施例２において調製した）を２６．４ｍｌの脱イオン水（１日あたり）中に希釈することによって、ペリスタポンプを用いて４０ｍｌ／日の流量で連続的に添加する。％溶存酸素（％ＤＯ）を１５％〜２０％に保つために、１．５Ｌ／分の空気流量を用い、必要に応じて撹拌速度を自動的に上げる。撹拌を遅いままにし、それによって泡立ちの問題を減らすために、空気流の１０〜３０％で純粋酸素を発酵槽にさらに添加し全流量を一定の１．５Ｌ／分に保つ。ラムノリピッド（ＲＬ）濃度および力価を以下の表７に示す。

８％大豆油と、冷水道水８５％／１つまたは複数のラムノリピッドを含む発酵培地からの廃水流水性上層１５％とを用いたラムノリピッドの半連続発酵
本実施例で用いた培養培地組成を表８に示す。

廃水流水性上層は、２０１６年１月１１日に出願された、米国特許出願第１４９９２９９５号（前記出願の実施例３を参照）に記載された手順を用いて得ることができる。簡潔に言えば、廃水流水性上層は、浄化された発酵ブロスから得られる。浄化されたブロスは、ｐＨ６．０〜６．５で停止している緑膿菌（P. aeruginosa）含有発酵培地を周囲条件下で約２日間熟成させることによって作製する。バイオマスはこの熟成プロセスに用いた容器の底部に沈殿し、透明な上清は、除去後、浄化されたブロスである。プロセスの次のステップは、ｐＨが約２．１になるまで濃硫酸などの酸を添加することである。ラムノリピッドは溶液から沈殿し、本ステップに用いる容器の底部に、固相および油性の液相を形成する。固相および油性の液相の分離は、遠心分離によって加速することができる。固相および油性の液相を、水性上相または上層から分離し、廃棄またはリサイクルすることができる。上記に言及した水性の層は、Ｈ_２ＳＯ_４および微量栄養素の源であり、この水性の層１５％ｗ／ｗを、残部である冷水道水中の８％大豆油と共に培養培地に用いる。廃水流水性上層を最初に１ミクロンで濾過して、使用前に大粒子を除去する。

１５％の廃水流水性上層および冷水道水と共に８％大豆油を含有する７．３Ｌの培養培地を、大豆油、水性上層および冷水道水を最初にキッチンブレンダーを用いて混合することによって調製する。すべてを十分に混合した後、Ｈ_３ＰＯ_４、ＮａＯＨ、ＭｇＳＯ_４、ＫＣｌおよびＮａＮＯ_３を、撹拌しながら、この順序で、溶液へ添加する。培養培地を次いで蒸気滅菌できる（オートクレーブ）。本実施例で用いられるすべての化学物質は、不純物含有の工業グレードである。

発酵は、実施例５と同一のパラメータで行う。微量栄養素組成物を連続的に添加する。撹拌を遅いままにし、それによって泡立ちの問題を減らすために、空気流の１０〜３０％で純粋酸素を発酵槽にさらに添加し全流量を一定の１．５Ｌ／分に保つ。ラムノリピッド（ＲＬ）濃度および力価を以下の表９に示す。

１００Ｌスケールにおけるラムノリピッドの半連続発酵
１００Ｌの培養培地（実施例５などの組成）を実施例１と同様に調製し、１２０Ｌバイオリアクターにおいて滅菌する。その組成を表１０に示す。Ｒ４株の種培養は、実施例２に従って調製する。振盪フラスコ内の２０ｇ／ＬのＬＢブロスＬｅｎｎｏｘ中で３７℃で２４時間インキュベートした２．９ＬのＲ４株を１００Ｌの発酵槽に接種する。

発酵は、３７℃の温度で、培養培地の最初のｐＨは６．２で、発酵の間のｐＨは制御せずに行う。シリコンベースの消泡剤（ＤＯＷＡＦＥ−１５１０）を５０％の脱イオン水で希釈し、次いで使用前にオートクレーブ滅菌する。発酵の間、泡を消すために、消泡剤を自動的に添加する。撹拌は、１７Ｌ／分の空気と共に、毎分１５０回転である。％溶存酸素（％ＤＯ）を１５％〜２０％に保つために、必要に応じて撹拌速度を自動的に上げる。実施例２と同様に組成が調製された８００ｍｌの微量栄養素を２．２Ｌの脱イオン水で希釈し、したがって、それを連続的に３７５ｍｌ／日で８日間供給する。

９％大豆油（以下の表１０の組成）含有の７０Ｌの培養培地を実施例１と同様に調製し、抜き取りより１日前に、異なる１００Ｌのバイオリアクターで滅菌する。接種の１０５時間後、ｐＨは約７で一定のままであった後、上昇し始める。発酵は１１５時間、ｐＨ７．３で完了する。

接種１１５時間後に、次いで、ペリスタポンプを開始して、１つまたは複数のラムノリピッドを含む発酵培地を７０Ｌ（全量の７０％）除去する。いわゆる「抜き取り＃１」である７０Ｌのブロスを除去したら、滅菌したばかりの７０Ｌの９％大豆油培養培地を、ペリスタポンプを用いて発酵槽へ供給する。発酵開始のｐＨは６．５である。上記段落に記載された発酵パラメータを用いる。この場合、７０時間後、発酵はｐＨ７．１４で完了する。ラムノリピッド（ＲＬ）濃度および力価を以下の表１１に示す。

微量栄養素なしの振盪フラスコ実験
５０ｍｌの培養培地（以下の組成）を、２５０ｍｌ振盪フラスコで実施例１と同様に調製する。その組成を表１２に示す。オートクレーブ滅菌し、室温まで冷却した後、振盪フラスコに５％のＲ４株の凍結保存物を接種する。凍結保存物は、ＯＤ_６００が３〜４の７０％Ｒ４試験管培養物を３０％グリセロールと混合し、−８０℃で保存することによって得る。インキュベーションは、３７℃で９２時間、シェーカーで、微量栄養素を添加せずに行う。接種の９２時間後、ラムノリピッド濃度は、５個の振盪フラスコの平均で４７±３ｇ／Ｌである。

参考文献
[1] Randhawa et al. (2014) “Rhamnolipid biosurfactants-past, present, and future scenario of global market”, Frontiers in Microbiology 5:1-7.
[2] Muller et al. (2012) “Rhamnolipids-Next generation surfactants?”, J Biotechnol 162(4):366-80.
[3] Banat et al. (2010) “Microbial biosurfactants production, applications and future potential” Appl. Microbiol. Biotechnol. 87:427-444.
[4] Wang et al (2007) “Engineering Bacteria for Production of Rhamnolipid as an Agent for Enhanced Oil Recovery” Biotech. and Bioeng. 98: 842-853.
[5] Wittgens et al. (2011) “Growth independent rhamnolipid production from glucose using the non-pathogenic Pseudomonas putida KT2440” Microbial Cell Factories 10: 80-98.
[6] Nitschke et al (2011) “Rhamnolipids and PHAs: Recent reports on Pseudomonas-derived molecules of increasing industrial interest” Proc Biochem 46: 621-630.
[7] Gong et al (2015) “Rhamnolipid production, characterization and fermentation scale-up by Pseudomonas aeruginosa with plant oils” Biotechnol Lett 37: 2033-2038.
[8] Giani et al (1997) “Pseudomonas Aeruginosa and its use in a process for the biotechnological preparation of L-rhamnose” US Patents#5,658,973.
[9] Mcneil and Harvey (2008) “Practical fermentation technology” John Wiley & Sons Ltd, England.
[10] Zhu et al (2012) “Enhanced rhamnolipids production by Pseudomonas aeruginosa based on a pH stage-controlled fed-batch fermentation process, Bioresource Technology 117: 208-213.
[11] Ghomi et al (2012) “Comparison between batch and fed-batch production of rhamnolipid by Pseudomonas aeruginosa”Iranian J Biotech 10: 263-269.
[12] Camilios et al (2009) “Production of rhamnolipids in solid-state cultivation: characterization downstream processing and application in the cleaning of contaminated soil” Biotechnol J 4: 748-755.

１０発酵槽
２０滅菌タンク

本発明は次の実施態様を含む。
［１］１つまたは複数のラムノリピッドを含む複数の発酵物を生産する半連続方法であって、
（ａ）グルコース、脂肪アルコール、脂肪酸、または植物油、例えばオリーブ油、菜種油、オリーブ油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、キャノーラ油および大豆油などの少なくとも１つの炭素源、ＮａＮＯ _３、尿素およびＮＨ _４Ｃｌなどの少なくとも１つの窒素源、Ｈ _３ＰＯ _４およびＫ _２ＨＰＯ _４などの少なくとも１つのリン源、ＭｇＳＯ _４＊７Ｈ _２ＯおよびＭｇＣｌ _２などの少なくとも１つのマグネシウム源、ＫＣｌおよびＫＯＨなどの少なくとも１つのカリウム源、Ｈ _２ＳＯ _４などの少なくとも１つの硫黄源、ＫＣｌおよびＮａＣｌなどの少なくとも１つの塩化物源、ならびにＮａＣｌ、ＮａＮＯ _３、およびＮａＯＨなどの少なくとも１つのナトリウム源、ならびに場合によりアラビアゴム、グアーゴムおよびラムノリピッドなどの乳化剤を含む培養培地で、約２から約５日間、ラムノリピッド生産微生物を培養して、ラムノリピッドを含む第１の発酵培地を得ること、
（ｂ）（ａ）で得られた１つまたは複数のラムノリピッドを含む前記発酵培地の少なくとも約７０％を除去すること、
（ｃ）（ｂ）で除去された１つまたは複数のラムノリピッドを含む前記発酵培地を、ステップ（ａ）に記載の組成を有する培養培地で置き換えること、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１回反復し、ラムノリピッドを含む次の発酵物を得ること
を含み、
前記ステップ（ａ）〜（ｃ）は、少なくとも約３０日間反復可能であり、
前記方法が、ステップ（ａ）の前記培養培地に、（１）１日あたり全発酵物体積の０．１％ｖ／ｖで、微量栄養素溶液において２０ｍｇ／Ｌ以下の濃度で１つまたは複数の微量栄養素を含む組成物を添加すること、および／または（２）炭素ベースまたはシリコンベースの消泡剤などの消泡剤を場合により添加することをさらに含む、半連続方法。
［２］前記ラムノリピッド生産微生物が、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）などのシュードモナス属（Pseudomonas）微生物である、上記［１］に記載の方法。
［３］前記乳化剤が約０．１〜２０重量％の量で存在し、前記炭素源が約６〜１２重量％の濃度で存在し、前記窒素源が約１〜４ｇ／Ｌの量で存在し、前記リン源が約１〜３ｇ／Ｌの量で存在し、前記マグネシウムイオンが約０．００１〜０．２ｇ／Ｌの量で存在し、前記カリウムイオンが約０．１から約１ｇ／Ｌの量で存在し、前記ナトリウムイオンが約１〜１０ｇ／Ｌの量で存在し、前記塩化物イオンが約０．１〜１ｇ／Ｌの量で存在し、前記硫黄イオンが約０．１〜１ｇ／Ｌの量で存在する、上記［１］〜［２］に記載の方法。
［４］前記微量栄養素が、ＦｅＣｌ _３＊６Ｈ _２ＯもしくはＦｅＳＯ _４などのＦｅ塩、ＭｎＳＯ _４＊Ｈ _２ＯおよびＭｎＣｌ _２・４Ｈ _２ＯなどのＭｎ塩、ＺｎＳＯ _４＊７Ｈ _２ＯもしくはＺｎＣｌ _２などのＺｎ、Ｎａ _３Ｃ _６Ｈ _５Ｏ _７＊２Ｈ _２Ｏ、ＮａＣ _６Ｈ _７Ｏ _７およびＮａ _２Ｃ _６Ｈ _６Ｏ _７などのＮａ塩、またはＣｕＣｌ _２＊２Ｈ _２ＯおよびＣｕＳＯ _４＊５Ｈ _２ＯなどのＣｕ塩である、上記［１］〜［３］に記載の方法。
［５］前記Ｃｕ塩が微量栄養素溶液において約０．５〜３ｇ／Ｌの量で存在し、前記Ｍｎが微量栄養素溶液において約０．１〜１．５ｇ／Ｌの量で存在し、前記Ｚｎ塩が微量栄養素溶液において約０．５ｇ／Ｌの量で存在し、前記Ｆｅ塩が微量栄養素溶液において約０．１〜１ｇ／Ｌの量で存在し、および／または前記ナトリウム塩が微量栄養素溶液において約１〜５ｇ／Ｌの量で存在する、上記［４］に記載の方法。
［６］前記微量栄養素組成物を連続的に添加する、上記［１］〜［５］に記載の方法。
［７］前記微量栄養素組成物を毎日添加する、上記［１］〜［６］に記載の方法。
［８］前記シュードモナス属（Pseudomonas）を約３０〜３７℃の温度および／または約６〜８．６のｐＨで培養する、上記［１］〜［７］に記載の方法。
［９］ステップ（ｄ）を少なくとも約３０日間反復する、上記［１］〜［８］に記載の方法。

Claims

１つまたは複数のラムノリピッドを含む複数の発酵物を生産する半連続方法であって、
（ａ）(i) 少なくとも１つの炭素源、(ii) 少なくとも１つの窒素源、(iii) 少なくとも１つのリン源、(iv) 少なくとも１つのマグネシウム源、(v) 少なくとも１つのカリウム源、(vi)少なくとも１つの硫黄源、(vii) 少なくとも１つの塩化物源、(viii) 少なくとも１つのナトリウム源、ならびに(ix) 乳化剤を含む培養培地で、２から５日間、ラムノリピッドを生産する緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）を培養して、１つまたは複数のラムノリピッドを含む第１の発酵培地を得ること、
（ｂ）（ａ）で得られた１つまたは複数のラムノリピッドを含む前記第１の発酵培地の少なくとも７０％を除去すること、
（ｃ）（ｂ）で除去された１つまたは複数のラムノリピッドを含む前記第１の発酵培地を、ステップ（ａ）に記載の組成を有する培養培地で置き換えること、
（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１回反復し、１つまたは複数のラムノリピッドを含む次の発酵物を得ること
を含み、
少なくとも４５ｇ／Ｌのラムノリピッドが生産される、
半連続方法。
前記方法が、前記培養培地に、
(x) １つまたは複数の微量栄養素を、２０ｍｇ総微量栄養素／Ｌ培養培地以下の濃度で、微量栄養素組成物の形態で添加すること、および／または
(xi) 消泡剤を添加すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記乳化剤が０．１〜２０重量％の量で存在し、前記炭素源が６〜１２重量％の濃度で存在し、前記窒素源が１〜４ｇ／Ｌの量で存在し、前記リン源が１〜３ｇ／Ｌの量で存在し、前記マグネシウム源が０．００１〜０．２ｇ／Ｌの量で存在し、前記カリウム源が０．１から１ｇ／Ｌの量で存在し、前記ナトリウム源が１〜１０ｇ／Ｌの量で存在し、前記塩化物源が０．１〜１ｇ／Ｌの量で存在し、前記硫黄源が０．１〜１ｇ／Ｌの量で存在する、請求項１に記載の方法。
前記微量栄養素組成物が、Ｆｅ塩、Ｍｎ塩、Ｚｎ塩、Ｎａ塩、またはＣｕ塩を含む、請求項２に記載の方法。
前記Ｃｕ塩が微量栄養素組成物において０．５〜３ｇ／Ｌの量で存在し、前記Ｍｎ塩が微量栄養素組成物において０．１〜１．５ｇ／Ｌの量で存在し、前記Ｚｎ塩が微量栄養素組成物において０．５〜３ｇ／Ｌの量で存在し、前記Ｆｅ塩が微量栄養素組成物において０．１〜１ｇ／Ｌの量で存在し、および／または前記ナトリウム塩が微量栄養素組成物において１〜５ｇ／Ｌの量で存在する、請求項４に記載の方法。
前記微量栄養素組成物を連続的に添加する、請求項２または４に記載の方法。
前記微量栄養素組成物を毎日添加する、請求項２または４に記載の方法。
前記緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）を３０〜３７℃の温度および／または６〜８．６のｐＨで培養する、請求項１に記載の方法。
ステップ（ｄ）を少なくとも３０日間反復する、請求項１に記載の方法。
前記微量栄養素組成物が溶液である、請求項２または４に記載の方法。
(i) 前記少なくとも１つの炭素源が、グルコース、脂肪アルコール、脂肪酸、または植物油であり、前記植物油が、オリーブ油、菜種油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、キャノーラ油または大豆油であり、
(ii) 前記少なくとも１つの窒素源が、ＮａＮＯ _３、尿素またはＮＨ _４Ｃｌであり、
(iii) 前記少なくとも１つのリン源が、Ｈ _３ＰＯ _４またはＫ _２ＨＰＯ _４であり、
(iv) 前記少なくとも１つのマグネシウム源が、ＭｇＳＯ _４＊７Ｈ _２ＯまたはＭｇＣｌ _２であり、
(v) 前記少なくとも１つのカリウム源が、ＫＣｌまたはＫＯＨであり、
(vi) 前記少なくとも１つの硫黄源が、Ｈ _２ＳＯ _４であり、
(vii) 前記少なくとも１つの塩化物源が、ＫＣｌまたはＮａＣｌであり、
(viii) 前記少なくとも１つのナトリウム源が、ＮａＣｌ、ＮａＮＯ _３、またはＮａＯＨであり、かつ／または、
(ix) 前記乳化剤が、アラビアゴムまたはグアーゴムである、
請求項１に記載の方法。
前記Ｆｅ塩がＦｅＣｌ _３＊６Ｈ _２ＯまたはＦｅＳＯ _４であり、
前記Ｍｎ塩がＭｎＳＯ _４＊Ｈ _２ＯまたはＭｎＣｌ _２＊４Ｈ _２Ｏであり、
前記Ｚｎ塩がＺｎＳＯ _４＊７Ｈ _２ＯまたはＺｎＣｌ _２であり、
前記Ｎａ塩がＮａ _３Ｃ _６Ｈ _５Ｏ _７＊２Ｈ _２Ｏ、ＮａＣ _６Ｈ _７Ｏ _７またはＮａ _２Ｃ _６Ｈ _６Ｏ _７であり、かつ／または、
前記Ｃｕ塩がＣｕＣｌ _２＊２Ｈ _２ＯまたはＣｕＳＯ _４＊５Ｈ _２Ｏである、
請求項４に記載の方法。
前記消泡剤が、炭素ベースまたはシリコンベースの消泡剤である、請求項２に記載の方法。