BR112017023334B1 - Método semicontínuo para produção de uma pluralidade de meios de fermentação compreendendo um ou mais ramnolipídeos - Google Patents
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Abstract
MÉTODO SEMICONTÍNUO PARA A PRODU.ÇÃO DE PLURALIDADE DE FERMENTAÇÕES COMPREENDENDO RAMNOLIPÍDIOS. É provido um método de fermentação semicontínuo de um microrganismo produtor de ramnolipídio para produção de ramnolipídios. A fermentação pode ser conduzida como um processo por batelada, mas, no final da fermentação, pelo menos cerca de 70% do meio de fermentação compreendendo um ou mais ramnolipídios é extraído e o novo meio de cultura (matéria-prima) é alimentado como substituição. Este processo pode ser repetido por pelo menos cerca de um mês sem ter que sacrificar a titulação e rendimento de RL. Isso permite que o fermentador seja utilizado em uma capacidade maior com menos inatividade para limpeza em comparação com estratégias de fermentação por batelada e batelada alimentada.
Description
[0001] É provido um método de fermentação semicontínuo de um microrganismo produtor de ramnolipídeo para produção de ramnolipídeos. A fermentação pode ser conduzida como um processo por batelada, mas no final da fermentação, pelo menos cerca de 70% do meio de fermentação compreendendo um ou mais ramnolipídeos é extraído e o novo meio de cultura (matéria-prima) é alimentado como substituição.
[0002] Ramnolipídeos (RL), um biotensoativo do tipo glicolipídio ativo por interface, tendo as propriedades para reduzir a tensão superficial entre dois líquidos diferentes, são amplamente utilizados como emulsificantes, detergentes e agentes espumantes [1-3]. Os ramnolipídeos mostram-se capazes de remover eficientemente petróleo bruto de solo contaminado e facilitar a biorremediação de derrames de óleo devido às suas propriedades de emulsificação, denominada "recuperação melhorada de óleo (EOR)" [4]. Também têm sido utilizados na agricultura devido às suas propriedades antimicrobianas e antifúngicas. Os ramnolipídeos estão atualmente disponíveis em um produto antifúngico agrícola comercializado como ZONIX e em um produto de limpeza industrial, RECO, para limpeza de óleo de tanques de armazenamento.
[0003] Os gêneros Pseudomonas e E. coli mostram-se capazes de produzir ramnolipídeo (RL) a partir de uma variedade de fontes de carbono e nitrogênio [5]. Embora o gênero Pseudomonas produza maiores titulações e rendimentos de RL do que E. coli [5, 6], a concentração de RL não é suficientemente alta para produzir um processo de fermentação comercialmente viável. Várias abordagens foram realizadas para aumentar a produtividade de RL, incluindo diferentes fontes de carbono, cepas geneticamente modificadas e estratégia de fermentação, que parece ser a rota de alcance mais eficaz.
[0004] Fermentações por batelada e batelada alimentada são o processo de fermentação mais comum com Pseudomonas [7-11]. Fermentação por batelada é o método de cultivo mais simples [7,8] em que matéria-prima (fonte de carbono) é adicionada no fermentador no início com o inóculo. A fermentação ocorre até que a matéria-prima seja completamente utilizada pelos microrganismos, então, o fermentador é desligado e a nova batelada é iniciada [9]. A batelada alimentada, por outro lado, é fermentação por batelada, mas com a adição de matéria- prima (fonte de carbono), após a matéria-prima ser totalmente utilizada, durante o curso de fermentação [9-11]. A melhor titulação de RL reportada atualizada (produtividade) é cerca de 0,58-0,72 g/l/h obtida de fermentação por batelada alimentada de P. aeruginosa [10]. No entanto, este processo exige o desligamento do fermentador após 90-120 horas antes do início de uma nova batelada alimentada. Da mesma forma, a patente dos Estados Unidos 5.658.973 relatou que 78 g/l de ramnolipídeos foram produzidos após 167 horas [8], o que é muito longo para operação. Tabela 1: Sumário de vários processos de fermentação de ramnolipídeo (RL) por P. aeruginosa
[0005] É aqui provido um método de fermentação semicontínuo para produção de uma pluralidade de fermentações compreendendo um ou mais ramnolipídeos, compreendendo (a) Cultura de um microrganismo produtor de ramnolipídeo em meio de cultura compreendendo pelo menos uma fonte de carbono, pelo menos uma fonte de nitrogênio, pelo menos uma fonte de fósforo, pelo menos uma fonte de magnésio, pelo menos uma fonte de potássio, pelo menos uma fonte de enxofre, pelo menos uma fonte de cloreto e pelo menos uma fonte de sódio entre cerca de 2 a cerca de 5 dias para obter um primeiro meio de fermentação compreendendo um ou mais ramnolipídeos; (b) Remoção de pelo menos cerca de 70% e, mais particularmente, entre cerca de 70% a cerca de 80% ou, alternativamente, entre cerca de 70 a cerca de 90% do meio de fermentação compreendendo um ou mais ramnolipídeos obtidos em (a); (c) Substituição do referido meio de fermentação compreendendo um ou mais ramnolipídeos removidos em (b) com meio de cultura tendo a composição apresentada na etapa (a); (d) Repetição das etapas (a)-(c) pelo menos uma vez para obter uma fermentação subsequente compreendendo ramnolipídeos, em que as referidas etapas (a)-(c) podem ser repetidas por pelo menos cerca de 30 dias.
[0006] Em uma modalidade particular, o referido microrganismo produtor de ramnolipídeo pode ser cultivado em uma temperatura de cerca de 25-40°C e, mais particularmente, em uma temperatura de cerca de 30-37°C e/ou em um pH de cerca de 5,5 a cerca de 9 e, mais particularmente, em um pH de cerca de 6-8,6. O pH no início da fermentação após o novo meio de cultura ser substituído na etapa (c) pode, em uma modalidade particular, ser em torno de 6-7, preferencialmente, 6,2-6,5. O pH da fermentação não precisa ser controlado durante o curso da fermentação.
[0007] Em outra modalidade particular, o referido método ainda compreende a adição de uma composição compreendendo um ou mais micronutrientes. Em uma modalidade particular, o referido micronutriente está presente em não mais do que cerca de 20 mg/l. Em uma modalidade particular, o referido micronutriente está presente entre cerca de 1 mg/l a cerca de 14 mg/l. A referida composição pode ser adicionada tanto diariamente ou continuamente a 0,1% v/v de volume de fermentação total por dia.
[0008] O método apresentado acima pode ainda compreender a adição de um agente antiespumante. O referido agente antiespumante pode ser agente antiespumante à base de silicone ou carbono.
[0009] O processo apresentado acima permite que a fermentação seja conduzida como um processo por batelada, mas, no final da fermentação, pelo menos cerca de 70% do meio de fermentação compreendendo um ou mais ramnolipídeos é extraído e o novo meio de cultura (matéria-prima) é alimentado como substituição. Este processo (etapa (d)) pode ser repetido por pelo menos cerca de um mês e, em outra modalidade, até cerca de 180 dias sem ter que sacrificar a titulação e rendimento de RL. Isso permite que o fermentador seja utilizado em uma capacidade maior com menos inatividade para limpeza em comparação com estratégias de fermentação por batelada e batelada alimentada. Como observado acima, a referida etapa de processo (d) é repetida pelo menos uma vez. Em uma modalidade particular, a referida etapa de processo (d) é repetida pelo menos 5 vezes.
[0010] Em uma modalidade particular, o referido método produz concentrações de ramnolipídeo de pelo menos cerca de 45 g/l e, mais particularmente, cerca de 60-80 g/l com produtividade de ramnolipídeo (titulação) tão alta quanto cerca de 1,6 g/l/h. Em uma modalidade particular, quando a fonte de carbono é um óleo, existe apenas uma composição de óleo residual de não mais do que cerca de 0,8% em p/v detectada na etapa (b).
[0011] Quando um intervalo de valores é provido, entende-se que cada valor intermediário, até o décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto expresse claramente o contrário, entre o limite superior e inferior desse intervalo e qualquer outro valor declarado ou intermediário naquele intervalo indicado é englobado pela invenção. Os limites inferior e superior desses intervalos menores podem independentemente ser incluídos nos intervalos menores e são também englobados pela invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído no intervalo indicado. Quando o intervalo indicado inclui um ou ambos os limites, os intervalos que excluem um ou ambos os limites incluídos também são incluídos na invenção.
[0012] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado comumente compreendido por uma pessoa versada na técnica à que pertence esta invenção. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos também possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos.
[0013] Todas as publicações e patentes citadas nesta descrição são incorporadas por referência na sua totalidade. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não tem o direito de antedatar tal divulgação em virtude da invenção anterior. Na medida em que o material incorporado por referência contradiga ou seja inconsistente com esta especificação, a especificação substituirá qualquer material do tipo.
[0014] Deve-se notar que, tal como utilizado aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um/uma", "e" e "o/a" incluem referências plurais a menos que o contexto dite claramente o contrário.
[0015] Salvo indicação em contrário, o termo "pelo menos" precedente a uma série de elementos deve ser entendido para se referir a cada elemento na série. Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de comprovar utilizando nada mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção aqui descrita. Tais equivalentes são considerados abrangidos pela presente invenção. Ao longo desta especificação e das reivindicações a seguir, a menos que o contexto exija o contrário, a palavra "compreender", e variações como "compreende" e "compreendendo", será entendida como implicando a inclusão de uma etapa ou número inteiro declarado ou grupo de etapas ou números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outra etapa ou número inteiro ou grupo de etapas ou números inteiros. Dessa forma, os termos "compreendendo", "incluindo", "contendo", "tendo" etc. devem ser lidos de forma ampla e aberta e sem limitação. Quando usado neste documento, o termo "compreendendo" pode ser substituído pelo termo "contendo" ou, às vezes, quando usado aqui, com o termo "tendo".
[0016] Tal como aqui definido, um "ramnolipídio" se refere a um glicolipídio que tem uma porção lipídica que inclui uma ou mais, porções de ácido e-hidróxi-carboxílico saturado ou insaturado tipicamente linear e uma porção de sacarídeo de uma ou mais unidades de ramnose.
[0017] A porção de sacarídeo e a porção lipídica estão ligadas através de uma ligação β-glicosidica entre o grupo 1-OH de uma porção de ramnose da porção de sacarídeo e o grupo 3-OH de um ácido e—hidróxi-carboxílico da porção lipídica. Dessa forma, o grupo carboxílico de uma porção de ácido carboxílico define o fim do ramnolipídio. Quando mais de uma porção de ramnose é incluída em um ramnolipídio, cada uma das porções de ramnose não ligadas à porção lipídica é ligada à outra porção de ramnose através de uma ligação 1,4 e-glicosídica. Em modalidades em que dois ou mais ácidos e-hidróxi-carboxílicos estão presentes em um ramnolipídio, as porções de ácido β-Md^xi-carbox^i^ são selecionadas independentemente umas das outras. Porções de ácido β-hidróxi carboxílico de uma respectiva pluralidade de porções de ácido β-hidróxi carboxílico podem, em algumas modalidades, ser idênticas. Em algumas modalidades, elas são diferentes umas das outras.
[0018] Tal como aqui definido, uma "composição de micronutrientes" é uma composição compreendendo um micronutriente presente em uma quantidade não superior a cerca de 20 mg/l.
[0019] Os termos "meio de cultura" e "meio de fermentação" são sinônimos e são utilizados de forma intercambiável.
[0020] A Figura 1 é uma representação esquemática do método de fermentação semicontínuo para produção de ramnolipídeos.
[0021] A Figura 2 mostra a alteração de pH durante o curso da fermentação com as etapas (a)-(c) sendo repetidas por mais de 30 dias no Exemplo 4.
[0022] A Figura 3 mostra a alteração de pH durante o curso de fermentação após pós-inoculação ou após preenchimento com o novo meio de cultura no Exemplo 5.
[0023] É aqui provido um método de fermentação semicontínuo para produção de uma pluralidade de fermentações compreendendo um ou mais ramnolipídeos. Em uma modalidade particular, o ramnolipídeo pode ter a estrutura (I). em que m=2, 1 ou 0, em particular, 1 ou 0, n=1 ou 0 ou, em particular, 1, R1 e R2=independentemente de outro radical orgânico idêntico ou diferente com 2 a 24, preferencialmente, 5 a 13, átomos de carbono, em particular, opcionalmente ramificado, opcionalmente substituído, em particular, substituído por hidroxil, opcionalmente insaturado, em particular, opcionalmente mono-, di- ou tri-insaturado, radical alquil, preferencialmente, um selecionado do grupo que consiste em pentenil, heptenil, nonenil, undecenil e tridecenil e (CH2)o-CH3, em que o=1 a 23, preferencialmente, 4 a12.
[0024] Ambas a cadeia principal, bem como as ramificações podem ainda conter heteroátomos como, por exemplo, N, O, S, Se ou Si ou um átomo de carbono pode ser substituído por um desses heteroátomos. Uma porção alifática pode ser substituída ou não substituída por um ou mais grupos funcionais. Os substituintes podem ser qualquer grupo funcional, como, por exemplo, mas sem limitação, amino, amido, carbonil, carboxil, hidroxil, nitro, tio e sulfonil.
[0025] Como observado acima, o método compreende a cultura de um microrganismo produtor de ramnolipídio. Um microrganismo produtor de ramnolipídeo pode ser uma célula hospedeira que produz ramnolipídeos. Uma célula hospedeira recombinante que produz ramnolipídeos pode ser uma célula hospedeira, tal como uma célula bacteriana que expressa um gene RhlA ou seu ortólogo e/ou um gene RhlB ou seu ortólogo, e/ou um gene RhlC ou seu ortólogo, e/ou gene RhlR ou seu ortólogo, e/ou gene RhlI ou seu ortólogo, e/ou gene RhlG ou seu ortólogo e outros.
[0026] Alternativamente, um "microrganismo produtor de ramnolipídio" pode ser qualquer microrganismo, tal como bactéria, que tenha a capacidade de sintetizar/produzir ramnolipídeos sob condições adequadas, incluindo, sem limitação, a bactéria do filo Actinobactéria, Fimicutes e Proteobactéria. Em uma modalidade particular, o microrganismo produtor de ramnolipídeo é uma bactéria da classe Gammaproteobacteria. Em outra modalidade, o microrganismo produtor de ramnolipídeo é uma bactéria da ordem Pseudomonadales. Ainda em outra modalidade adicional, o microrganismo produtor de ramnolipídeo é uma bactéria da família Pseudomonadacae. Ainda em outra modalidade, o microrganismo produtor de ramnolipídeo é uma bactéria do gênero Pseudomonas, tal como P. alcaligenes, P. aeruginosa, P. chlororaphis, P. clemancea, P. collierea, P. fluorescens, P. luteola, P. putida, P. stutzeri e P. teessidea. Em uma modalidade adicional, o microrganismo produtor de ramnolipídeo é P. aeruginosa.
[0027] O microrganismo contendo ramnolipídeo é cultivado em meio de cultura. O referido meio de cultura compreende pelo menos uma fonte de carbono, pelo menos uma fonte de nitrogênio, pelo menos uma fonte de fósforo, pelo menos uma fonte de enxofre, pelo menos uma fonte de sódio, pelo menos uma fonte de magnésio, pelo menos uma fonte de potássio, pelo menos uma fonte de enxofre e pelo menos uma fonte de cloreto.
[0028] A fonte de carbono pode ser um monossacarídeo, por exemplo, glicose, a dissacarídeo, por exemplo, sacarose, um álcool de açúcar, por exemplo, glicerol, um alcano de cadeia longa, por exemplo, n-hexadecano, um ácido graxo, tal como ácido caprílico (também denominado ácido octanoico), óleos vegetais (fresco ou residual; por exemplo, óleo de soja) ou suas misturas, ácidos orgânicos (por exemplo, ácido lático, ácido acético, ácido cítrico, ácido propiônico), álcoois (por exemplo, etanol) e misturas destes. Em uma modalidade particular, uma fonte de carbono é um óleo vegetal selecionado do grupo que consiste em óleo de oliva, óleo de colza, óleo de oliva, óleo de milho, óleo de girassol, óleo de canola e óleo de soja. A fonte de carbono pode estar presente na quantidade de cerca de 6% a cerca de 12% em p/p.
[0029] A fonte de nitrogênio pode ser sulfato de amônio, fosfato de amônio, ureia, extrato de levedura, extrato de carne, peptona e milhocina. Em uma modalidade particular, a fonte de nitrogênio é NaNO3. Em ainda outra modalidade, o nitrogênio pode estar presente na quantidade de cerca de 1-10 g/l.
[0030] A fonte de fósforo pode, em uma modalidade particular, ser H3PO4 ou K2HPO4. Em outra modalidade particular, o referido fósforo está presente na quantidade de cerca de 1-10 g/l.
[0031] O íon de magnésio, em uma modalidade particular, pode ser MgSO4 * 7H2O e/ou MgCl2. Em uma modalidade particular, o magnésio está presente na quantidade de cerca de 0,01-1 g/l.
[0032] O potássio pode ser KCl e/ou KOH. Em uma modalidade particular, o potássio está presente na quantidade de cerca de 0,1 a cerca de 2 g/l.
[0033] O sódio pode ser NaCl, NaNO3 e NaOH. Em uma modalidade particular, o referido íon de sódio está presente na quantidade de cerca de 1-15 g/l.
[0034] O cloreto pode ser KCl e NaCl. Em uma modalidade particular, o referido íon de cloreto está presente na quantidade de cerca de 0,1-1 g/l.
[0035] O enxofre pode ser H2SO4. Em uma modalidade particular, o referido íon de enxofre está presente na quantidade de cerca de 0,1-1 g/l.
[0036] As fontes de enxofre, cloreto e nitrogênio podem ser derivadas da camada aquosa ou também referidas como a fase líquida aquosa ou fase aquosa de um tratamento ácido e microrganismo amadurecido contendo meio de fermentação obteníveis utilizando os procedimentos descritos no pedido n°. de série 14/992.995. Em uma modalidade específica, a fermentação ou meio de cultura compreendendo um ou mais ramnolipídeos pode ser amadurecido por incubação por pelo menos cerca de 1 dia e entre cerca de 24-72 horas a cerca de 0-30°C. Em uma modalidade particular, o meio aquoso amadurecido pode ser tratado com ácido, de forma que o meio de cultura seja ajustado para um pH de cerca de 1,5 a 2,5, preferencialmente, cerca de 2,05 a cerca de 2,15. O ácido pode ser um ácido orgânico, tal como ácido acético, ou um ácido mineral. Em uma modalidade preferida, o ácido é um ácido mineral, por exemplo, HCl, H2SO4, HNO3 ou H3ClO4. Como resultado, uma fase líquida aquosa, uma fase oleosa e uma fase sólida são geradas. A fase líquida aquosa é removida utilizando procedimentos conhecidos na técnica e, em uma modalidade específica, utilizando métodos apresentados acima (por exemplo, filtração, centrifugação ou sedimentação combinada com decantação).
[0037] O meio de cultura pode ainda compreender um emulsificante. Em uma modalidade particular, o emulsificante é selecionado do grupo que consiste em goma Arábica, goma guar e ramnolipídeos. Em ainda outra modalidade particular, a razão de emulsificante para fonte de carbono no referido meio de cultura é entre cerca de 0,1% a cerca de 20% em p/p. Em ainda outra modalidade particular, o referido emulsificante pode estar presente na quantidade de cerca de 5-10% em peso.
[0038] Em uma modalidade particular, o meio de cultura ou fermentação é esterilizado usando métodos conhecidos na técnica. Esses métodos podem ser à base de filtração, à base de calor, à base de substância química ou à base de radiação ultravioleta. Em uma modalidade particular, o tratamento à base de calor pode ser através de esterilização por calor úmido, particularmente, em autoclave.
[0039] Em uma modalidade, o meio aquoso (por exemplo, meio de fermentação) pode ser esterilizado por um dos procedimentos acima. Em outra modalidade, os meios de fermentação podem ser esterilizados por mais de um dos procedimentos apresentados acima e essas esterilizações podem ser em qualquer ordem. Podem ser esterilizados na fermentação durante o primeiro ciclo de fermentação, mas devem ser esterilizados em outro vaso em ciclos subsequentes.
[0040] Como observado acima, o referido método pode ainda compreender a adição de uma composição ou solução de micronutrientes. O referido micronutriente pode ser um traço de Fe, Mn, Zn, Cu, Na. Em uma modalidade particular, o referido micronutriente é um sal de Fe, Mn, Zn, Na ou Cu. Em uma modalidade mais particular, a referida composição de micronutriente compreende Sais de Fe, Mn, Zn, Na e Cu. A composição pode ser esterilizada por filtração.
[0041] Em modalidade particulares, o referido sal de Cu é pelo menos um de CuCl2 * 2H2O e CuSO4 * 5H2O e pode estar presente na quantidade de cerca de 0,5-3 g/l de solução de micronutrientes; o referido sal de Mn é pelo menos um de MnSO4 * H2O e MnC^4H2O e pode estar presente na quantidade de cerca de 0,1-1,5 g/l de solução de micronutrientes; o referido sal de Zn é ZnSO4 * 7H2O ou ZnCl2 e pode estar presente na quantidade de cerca de 0,5-3 g/l de solução de micronutrientes; o referido sal de Fe é pelo menos um de FeCl3 * 6H2O ou FeSO4 e pode estar presente na quantidade de cerca de 0,1-1 g/l de solução de micronutrientes; o referido sal de sódio é Na3C6H5O7 * 2H2O e pode estar presente na quantidade de cerca de 1-5 g/l de solução de micronutrientes.
[0042] Uma composição de 8% de óleo de soja no meio de cultura para a fermentação de Pseudomonas aeruginosa para produção de ramnolipídeos é mostrada na Tabela 2 abaixo. Goma Arábica é usada em 10% em p/p de óleo de soja. Tabela 2: Composição de Meio de Cultura
[0043] Para produzir o meio de cultura, goma Arábica é primeiro dissolvida em água desionizada para obter 5% em p/p de solução de goma Arábica sob agitação a 150-250 rpm e a 40-45C em um recipiente separado. Esta etapa levará pelo menos 30 minutos para permitir completa dissolução de goma Arábica em água. Após, mistura de óleo de soja e 5% de solução de goma Arábica com água desionizada usando um misturador, tal como liquidificador. Assegure que seja bem misturado para obter uma emulsão (isto é, a solução se torna branca como leite). Após a emulsão de óleo de soja ser obtida, H3PO4 é adicionado na emulsão sob agitação e a substância química seguinte, NaOH, é adicionada após H3PO4 ser bem dissolvido. As substâncias químicas seguintes, que são MgSO4, em seguida, KCl, em seguida, NaNO3 e, por último, H2SO4, são adicionadas na emulsão sob agitação. Antes da adição da substância química seguinte, assegure que esteja bem dissolvida na emulsão. O meio de cultura pode, então, ser esterilizado por vapor (autoclave).
[0044] A composição de micronutrientes é mostrada na Tabela 3. Note que a concentração de cada sal é em g/l de solução de micronutriente. Tabela 3: Composição de Micronutriente
[0045] Todas como substâncias químicas são grau ACS (maior pureza disponível). Na3C6H5O7 * 2H2O é, primeiramente, adicionado em água desionizada usando agitação. Após estar totalmente dissolvido, a substância química seguinte, que é FeCl3 * 6H2O pode ser adicionada. Esta etapa é repetida até todas as substâncias químicas listadas na tabela sejam adicionadas na solução na ordem de FeCl3 * 6H2O, em seguida, ZnSO4 * 7H2O, em seguida, CuCl2 * 2H2O, em seguida, CuSO4 * 5H2O e, por último, MnSO4 * H2O. O micronutriente pode ser esterilizado utilizando uma filtração esterilizada de 0,2 mícron. Não utilizar autoclave de vapor no micronutriente.
[0046] A cepa de R4 obtida de ATCC #55734 foi, primeiramente, inoculada em placas de ágar contendo 40 g/l de Agar Tríptico de Soja a 32°C por 18-24 horas. Após as colônias de R4 serem formadas, uma única colônia é, então, cultivada em 5 ml de 20 g/l de Caldo LB (Lennox) em um tubo de agitação a 37°C por 20-24 horas. O OD600 final é cerca de 3-5 e a solução de Caldo LB (Lennox) no tubo de agitação mudará de amarelo para verde. Em seguida, a cultura de R4 obtida de um tubo de agitação é inoculada em um frasco de agitação contendo 20 g/l de Caldo LB (Lennox) a 1% de inoculação e incubada a 37°C por 20-24 horas. Este processo é repetido conforme necessário a fim de gerar inóculo suficiente de R4 necessário para a fermentação. O Caldo LB (Lennox) é obtido de Sigma Aldrich #3022 que contém 10 g/l de Triptona, 5 g/l de extrato de levedura e 5 g/l de NaCl.
[0047] A fermentação de P. aeruginosa (Schroeter) Migula obtida de ATCC #55734 (R4) é realizada em biorreator de 10 litros e é esquematicamente apresentada na Figura 1. Inicia-se com a preparação de 8 litros do meio de cultura de 8% de óleo de soja e 10% em p/p de goma Arábica para óleo de soja no fermentador 10. As substâncias químicas utilizadas no meio de cultura no Exemplo 1 são de grau ACS (maior pureza disponível). Após esterilização do meio ambiente, a temperatura é arrefecida até 37°C usando uma camisa de aquecimento e inicia-se a agitação (250 rpm). Uma vez que a temperatura está estável a 37°C, ar filtrado de 0,2 mícron é fornecido ao fermentador através da linha de aeração (#4) a 1,5 l/min e o fermentador é inoculado com 2,5% (200 ml) de inóculo de R4 obtido do Exemplo 3 pela linha #1. 8 ml de micronutriente esterilizado por filtro preparado no Exemplo 2 são depois adicionados ao fermentador através da linha #2 uma vez por dia. Caso o micronutriente não possa ser adicionado diariamente, 8 ml de micronutriente são diluídos em 32 ml de água desionizada (por dia) para serem adicionados continuamente no fermentador a 40 ml/dia usando uma bomba peristáltica. Antiespumante à base de silício (Sigma Aldrich #85390) é automaticamente adicionado para reduzir a espuma durante a fermentação através da linha #3.
[0048] A fermentação é realizada a uma temperatura de 37°C com o pH inicial do meio de cultura de 6,2 sem controle de pH durante o curso da fermentação. A taxa de agitação aumenta automaticamente conforme necessário para manter a porcentagem de oxigênio dissolvido (% DO) em 15%-20%. A taxa de agitação sobe para 500 rpm antes da taxa de fluxo de ar aumentar de 1,5 para 3,5 l/min em 40-48 horas após a inoculação para manter a demanda de oxigênio dos micróbios durante a taxa de crescimento. Após 60 horas de pós-inoculação, o pH é elevado após diminuir ligeiramente (ou permanece estável). Além disso, a % DO aumenta enquanto a agitação e o fluxo de ar estão nos valores mais baixos (250 rpm e 1,5 l/min, respectivamente) indicando que a fermentação está concluída em 72 horas. Isso pode ser confirmado com óleo de soja residual em meio de fermentação compreendendo um ou mais ramnolipídeos inferior a 0,8%.
[0049] A bomba peristáltica é, então, iniciada para remover 6 litros (75% do total) do meio de fermentação compreendendo um ou mais ramnolipídeos através da linha #5. Uma vez que 6 litros de caldo são removidos, o que é chamado de "Extração #1", os 6 litros recém- esterilizados de meio de cultura com 8% de óleo de soja preparados no tanque esterilizado 20 são alimentados no fermentador 10 usando uma alimentação por gravidade. O pH da fermentação inicial é 6,5. Os parâmetros de fermentação descritos no parágrafo acima são utilizados. Neste caso, após 48 horas, a fermentação é concluída e 75% do meio de fermentação compreendendo um ou mais ramnolipídeos fica pronto para ser extraído (Extração #2). Posteriormente, a batelada seguinte de meio de cultura de óleo de soja esterilizado é alimentada a partir do tanque esterilizado 20. O processo se repete por 6 semanas sem sinal de perda de titulações e rendimentos de ramnolipídeo antes de o fermentador ser desligado para limpeza. Uma mudança de pH durante o curso da fermentação entre a extração e para cada extração é mostrada na Figura 2. A concentração de ramnolipídeo (RL) e titulação são mostrados na Tabela 4 abaixo. A concentração de ramnolipídeo (RL) de todas as 12 extrações é pelo menos 62 g/l a 79 g/l. A produtividade de RL (titulação) é de 0,92-1,61 g/l/h. Tabela 4: Titulação e Concentração de Ramnolipídeo durante Fermentação Semicontínua com Óleo de soja
[0050] A composição do meio de cultura usado na Tabela 5. 7,3 litros de 8% de óleo de soja com 5% em p/p de goma Arábica para óleo de soja são preparados conforme descrito no Exemplo 1. Todas as substâncias químicas usadas neste exemplo são de grau industrial contendo impurezas. Tabela 5: Composição de Meio de Cultura p/5% de Goma Arábica, 8% de Óleo de Soja e 5% de Inóculo de R4
[0051] A fermentação é realizada como no Exemplo 4, exceto que 5% (360 ml) de inóculo de R4 são usados para inocular o fermentador e 77% do meio de fermentação compreendendo um ou mais ramnolipídeos (5,6 l) são extraídos e o novo meio de cultura contém 5% em p/p de goma Arábica para óleo de soja. O micronutriente é preparado conforme descrito no Exemplo 2. Diluindo-se 7,3 ml de micronutriente em 32,7 ml de água desionizada (por dia), ele é adicionado continuamente na taxa de fluxo de 40 ml/dia usando uma bomba peristáltica. Antiespumante à base de silício (DOW AFE-1510) é automaticamente adicionado para reduzir a espuma durante a fermentação. A taxa de agitação aumenta automaticamente conforme necessário para manter a % de oxigênio dissolvido (% DO) a 15%-20% com taxa de fluxo de ar de 1,5 l/min. Oxigênio puro é ainda adicionado ao fermentador a 0,005 - 0,1 l/min a fim de manter a agitação baixa e, assim, menos problemas de formação de espuma. Uma alteração típica no pH durante o curso da fermentação pós-inoculação ou após preenchimento com o novo meio de cultura é mostrada na Figura 3. A concentração de ramnolipídeo (RL) e titulação são mostradas na Tabela 6 abaixo. Tabela 6: Titulação e Concentração de Ramnolipídeo usando Método Semicontínuo usando 5% de Inóculo de R4
[0052] Neste exemplo, o meio de cultura e parâmetros de fermentação são os mesmos mostrados no Exemplo 5, exceto que a quantidade de micronutriente usado é duplicada. Diluindo-se 14,6 ml de micronutriente (preparado no Exemplo 2) em 26,4 ml de água desionizada (por dia), ele é adicionado continuamente na taxa de fluxo de 40 ml/dia usando uma bomba peristáltica. A taxa de agitação automaticamente aumenta conforme necessário para manter a % de oxigênio dissolvido (% DO) a 15%-20% com taxa de fluxo de ar de 1,5 l/min. Oxigênio puro é ainda adicionado ao fermentador a 10-30% de fluxo de ar para manter a taxa de fluxo total constante a 1,5 l/min a fim de manter a agitação baixa e, assim, menos problemas de formação de espuma. A titulação e concentração de ramnolipídeo (RL) são mostradas na Tabela 7 abaixo. Tabela 7: Titulação e Concentração de RL durante Fermentação Semicontínua com 2X de Micronutriente
[0053] A composição do meio de cultura usado neste Exemplo é mostrada na Tabela 8. Tabela 8: Meio de cultura com camada aquosa
[0054] O fluxo de resíduos da camada superior aquosa pode ser obtido usando os procedimentos descritos no Pedido dos Estados Unidos N°. de Série 14992995, depositado em 11 de janeiro de 2016 (ver Exemplo 3 do referido pedido). Resumidamente, o fluxo de resíduos da camada superior aquosa é obtido a partir de caldo de fermentação clarificado. O caldo clarificado é feito permitindo que o meio de fermentação contendo P. aeroginosa, com pH de 6,0 a 6,5, amadureça em condições ambientes por cerca de 2 dias. A biomassa se instala no fundo do vaso utilizado para este processo de amadurecimento e o sobrenadante claro, após remoção, é o caldo clarificado. A etapa seguinte do processo é para adicionar ácido, tal como ácido sulfúrico concentrado, até que o pH seja cerca de 2,1. Os ramnolipídeos se precipitam da solução e formam uma fase líquida oleosa e uma fase sólida no fundo do vaso utilizado para esta etapa. A separação das fases líquida oleosa e sólida pode ser acelerada por centrifugação. As fases líquida oleosa e sólida são separadas da camada ou fase superior aquosa, que pode ser descartada ou reciclada. A camada aquosa acima mencionada é uma fonte de H2SO4 e micronutrientes dos quais 15% em p/p são usados no meio de cultura com 8% de óleo de soja no equilíbrio de água corrente gelada. A camada superior aquosa com fluxo de resíduos é primeiramente filtrada a 1 mícron para remover partículas grandes antes da sua utilização.
[0055] 7,3 litros do meio de cultura contendo 8% de óleo de soja com 15% da camada superior aquosa com fluxo de resíduos e água corrente gelada são preparados misturando-se, primeiramente, óleo de soja, camada superior aquosa e água corrente gelada usando um liquidificador. Depois de todos estarem bem misturados, H3PO4, NaOH, MgSO4, KCl e NaNO3 são adicionados à solução naquela ordem sob agitação. O meio de cultura pode, então, ser esterilizado por vapor (autoclave). Todas as substâncias químicas usadas neste exemplo são de grau industrial contendo impurezas.
[0056] A fermentação é realizada nos mesmos parâmetros que o Exemplo 5. A composição de micronutrientes é adicionada continuamente. Oxigênio puro é ainda adicionado ao fermentador a 1030% do fluxo de ar para manter a taxa de fluxo total constante a 1,5 l/min para manter a agitação baixa e assim, menos problemas de formação de espuma. A titulação e concentração de ramnolipídeo (RL) são mostradas na Tabela 9 abaixo. Tabela 9: Titulação e Concentração de RL durante a Fermentação Semicontínua (Camada Aquosa)
[0057] 100 litros do meio de cultura (composição como no Exemplo 5) são preparados como no Exemplo 1 e esterilizados em biorreator de 120 litros. Sua composição é mostrada na Tabela 10. Cultura de semente de cepa de R4 é preparada de acordo com o Exemplo 2. O fermentador de 100 litros é inoculado com 2,9 litros de cepa de R4 incubada em um frasco de agitação a 37°C por 24 horas em 20 g/l Caldo LB Lennox.
[0058] A fermentação é realizada a uma temperatura de 37°C com o pH inicial do meio de cultura de 6,2 sem controle de pH durante o curso da fermentação. Antiespumante à base de silício (DOW AFE- 1510) é diluído com 50% de água desionizada que é, então, autoclavado antes da utilização. O antiespumante é automaticamente adicionado para reduzir a espuma durante a fermentação. A agitação é a 150 rpm com 17 l/min de ar. A taxa de agitação aumenta automaticamente conforme necessário para manter a porcentagem de oxigênio dissolvido (% DO) em 15%-20%. 800 ml de micronutriente preparados e composição conforme o Exemplo 2 são diluídos com 2,2 litros de água desionizada e, portanto, são alimentados continuamente a 375 ml/dia por 8 dias.
[0059] 70 litros de meio de cultura contendo 9% de óleo de soja (composição na Tabela 10 abaixo) são preparados como no Exemplo 1 e são esterilizados em um biorreator de 100 litros diferente um dia antes da extração. Após 105 horas de pós-inoculação, o pH começa a aumentar depois de permanecer constante em torno de 7. A fermentação é concluída com 115 horas com um pH de 7,3. Tabela 10: Composição de 9% de Meio de Cultura de Óleo de Soja (70 l)
[0060] Após 115 horas de pós-inoculação, a bomba peristáltica é, então, iniciada para remover 70 litros (70% do total) do meio de fermentação compreendendo um ou mais ramnolipídeos. Uma vez que 70 litros de caldo são removidos, o que é denominado "Extração#1", os 70 litros recém-esterilizados de 9% de meio de cultura de óleo de soja são alimentados no fermentador usando uma bomba peristáltica. O pH de fermentação inicial é de 6,5. Os parâmetros de fermentação descritos no parágrafo acima são usados. Neste caso, após 70 horas, a fermentação é concluída com um pH a 7,14. A titulação e concentração de ramnolipídeo (RL) são mostradas na Tabela 11 abaixo. Tabela 11: Titulação e Concentração de RL (Escala de 100 l)
[0061] 50 ml de meio de cultura (composição como abaixo) são preparados como o Exemplo 1 em um frasco de agitação de 250 ml. Sua composição é mostrada na Tabela 12. Após serem autoclavados e arrefecidos até a temperatura ambiente, os frascos de agitação são inoculados com 5% de matéria-prima congelada de cepa de R4. A matéria-prima congelada é obtida da mistura de 70% de cultura de tubo R4 tendo OD600 de 3-4 com 30% de glicerol e armazenado a -80°C. A incubação é realizada a 37°C em um agitador por 92 horas sem a adição de micronutriente. Após 92 horas pós-inoculação, as concentrações de ramnolipídeo são, em média, 47±3 g/l para 5 frascos de agitação. Tabela 12: Concentração de Meio de Cultura para Uso em Fermentação sem Micronutriente
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Claims (9)
1. Método semicontínuo para produção de uma pluralidade de meios de fermentação compreendendo um ou mais ramnolipídeos, caracterizado por compreender: (a) Cultura de um microorganismo produtor de ramnolipídeo em meio de cultura compreendendo pelo menos uma fonte de carbono, selecionada de glicose, álcoois graxos, ácidos graxos ou um óleo vegetal, selecionado de óleo de oliva, óleo de colza, óleo de milho, óleo de girassol, óleo de canola e óleo de soja, pelo menos uma fonte de nitrogênio, selecionada de NaNO3, ureia e NH4Cl, pelo menos uma fonte de fósforo, selecionada de H3PO4 e K2HPO4, pelo menos uma fonte de magnésio, selecionada de MgSO4^7H2O e MgCh, pelo menos uma fonte de potássio, selecionada de KCl e KOH, pelo menos uma fonte de enxofre, selecionada de H2SO4, pelo menos uma fonte de cloro, selecionada de KCl e NaCl, e pelo menos uma fonte de sódio, selecionada de NaCl, NaNO3 e NaOH e um emulsificante selecionado de goma Arábica, goma guar e ramnolipídeos, a cultura sendo realizada entre 2 a 5 dias para obter um primeiro meio de fermentação compreendendo um ou mais ramnolipídeos; (b) Remoção de pelo menos 70% do volume total do meio de fermentação compreendendo um ou mais ramnolipídeos obtidos em (a); (c) Substituição do referido meio de fermentação compreendendo um ou mais ramnolipídeos removidos em (b) com meio de cultura tendo a composição apresentada na etapa (a); (d) Repetição das etapas (a)-(c) pelo menos uma vez para obter uma fermentação subsequente compreendendo ramnolipídeos, em que pelo menos 45 g/l de ramnolipídeos são produzidas, em que as referidas etapas (a)-(c) são capazes de serem repetidas por pelo menos 30 dias e em que o referido microorganismo produtor de ramnolipídeo é Pseudomonas aeroginosa.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido método adicionalmente compreende adicionar ao dito meio de cultura da etapa (a) (1) uma composição compreendendo um ou mais micronutrientes em uma concentração de não mais do que 20 mg/l da solução micronutriente a 0,1% v/v de volume de fermentação total por dia e/ou (2) um agente antiespumante selecionado de antiespumante à base de silicone ou carbono.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido emulsificante está presente na quantidade de 0,1 - 20% em peso, a referida fonte de carbono está presente em uma concentração de 6 -1 2% em peso, a referida fonte de nitrogênio está presente na quantidade de 1 - 4 g/l, a referida fonte de fósforo está presente na quantidade de 1 - 3 g/l, a referida fonte de magnésio está presente na quantidade de 0,001 - 0,2 g/l, a referida fonte de potássio está presente na quantidade de 0,1 - 1 g/l, a referida fonte de sódio está presente na quantidade de 1 - 10 g/l, a referida fonte de cloro está presente na quantidade de 0,1 - 1 g/l, a referida fonte de enxofre está presente na quantidade de 0,1 - 1 g/l.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido micronutriente é um sal de Fe, selecionado de FeCl3^6H2O ou FeSO4, um sal de Mn, selecionado de MnSO4^O e MnCl2^4H2O, um sal de Zn, selecionado de ZnSO4^7H2O ou ZnCh, um sal de Na, selecionado de Na3CβH5θ7^2H2θ, NaCβHyO? e Na2CβH6θ7, ou um sal de Cu, selecionado de CuC^2H2O e CuSO4^5H2O.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o referido sal de Cu está presente na quantidade de 0,5-3 g/l de solução de micronutriente, o referido sal de Mn está presente na quantidade de 0,1-1,5 g/l de solução de micronutriente, o referido sal de Zn está presente na quantidade de 0,5 g/l, o referido sal de Fe está presente na quantidade de 0,1 - 1 g/l de solução de micronutriente e/ou o referido sal de Na está presente na quantidade de 1 - 5 g/l de solução de micronutriente.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a referida composição de micronutriente é adicionada continuamente.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a referida composição de micronutriente é adicionada diariamente.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida Pseudomonas aeroginosa é cultivada em uma temperatura de 30-37°C e/ou em um pH de 6 - 8,6.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (d) é repetida por pelo menos 30 dias.
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