BR102021010052A2 - Processo para obtenção de extratos promotores do crescimento microbiano de origem vegetal e de origem microbiana, extratos promotores do crescimento microbiano, processo para obtenção de biomassa de microrganismos fotossintetizantes, biomassa de microrganismos fotossintetizantes, e usos da biomassa de microrganismos fotossintetizantes - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de biomassa de microrganismos fotossintetizantes como microalgas e/ou cianobactérias, modificados geneticamente, incluindo os organismos modificados geneticamente, preferencialmente Dunaliella salina, Chlorella vulgaris e Arthrospira platensis, e de seus subprodutos, a partir do cultivo de microrganismos fotossintetizantes estimulado por promotores de crescimento microbiano, sejam estes promotores de origem vegetal ou microbiana. A biomassa de microrganismos fotossintetizantes obtida, bem como dos metabólitos produzidos, incluindo ácidos nucleicos, proteinas, peptideos, aminoácidos, polissacarídeos, pigmentos e ácidos graxos para aplicações como nutracêuticos, matérias-primas das indústrias de alimentos, para uso humano ou animal, em indústrias de cosméticos, bem como em biofertilizantes, biossurfactantes, fitormônios, biocombustiveis, biorremediação e geração de energia.

Description

PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE EXTRATOS PROMOTORES DO CRESCIMENTO MICROBIANO DE ORIGEM VEGETAL E DE ORIGEM MICROBIANA, EXTRATOS PROMOTORES DO CRESCIMENTO MICROBIANO, PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE BIOMASSA DE MICRORGANISMOS FOTOSSINTETIZANTES, BIOMASSA DE MICRORGANISMOS FOTOSSINTETIZANTES, E USOS DA BIOMASSA DE MICRORGANISMOS FOTOSSINTETIZANTES CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se insere no campo da Biologia, mais precisamente na área da Biotecnologia, e descreve um processo de obtenção de biomassa de microrganismos fotossintetizantes como microalgas e/ou cianobactérias, incluindo os organismos modificados geneticamente, e de seus subprodutos tais como, proteinas, carotenoides, pigmentos, ácidos graxos e carboidratos, entre outros, a partir do cultivo de microrganismos fotossintetizantes estimulado por promotores de crescimento microbiano, sejam estes promotores de origem vegetal ou microbiana. A biomassa de microrganismos fotossintetizantes obtida, bem como dos metabólitos produzidos, incluindo ácidos nucleicos, proteínas, peptídeos, aminoácidos, polissacarídeos, pigmentos e ácidos graxos, são utilizados para aplicações como nutracêuticos, matérias-primas das indústrias de alimentos, para uso humano ou animal, em indústrias de cosméticos, bem como em biofertilizantes, biossurfactantes, fitormônios, biocombustíveis, biorremediação e geração de energia.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Microrganismos fotossintetizantes, como cianobactérias e microalgas, são encontrados no meio marinho, em água doce e no solo, sendo considerados responsáveis por, pelo menos, 60% da produção primária da Terra. A importância dos microrganismos fotossintetizantes, microalgas e cianobactérias, tem crescido notavelmente devido à sua capacidade de produzir substâncias naturais de grande valor econômico, especialmente corantes naturais, proteínas e peptídeos (BOROWITZKA, M. A. High-value products from microalgae—their development and commercialisation. Journal of Applied Phycology, v. 25, n. 3, p. 743-756, 2013; ARIEDE, M. B. et al. Cosmetic attributes of algae - A review. Algal Research, v. 25, p. 483-487, 2017) .

[003] Microalgas são organismos eucariontes, unicelulares e fotossintetizantes que apresentam grande potencial para produção de ãcidos graxos, pigmentos como os carotenoides e clorofila, bem como outros metabólitos, com potencial atividade antifúngica, antibacteriana e antiviral (DE JESUS RAPOSO, M. F. ; DE MORAIS, A. M. B. ; DE MORAIS, R. M. S. C. Marine polysaccharides from algae with potential biomedical applications. Marine Drugs, v.l3, n 5, p. 2967 -3028, 2015; DE JESUS RAPOSO, M. F.; DE MORAIS, R. M. S. C.; DE MORAIS, A. M. M. B. Health applications of bioactive compounds from marine microalgae. Life Sciences, v. 93, p. 479-486, 2013), além de sua utilização no tratamento de efluentes industriais (WANG, C. et al. Nitrogen and phosphorus removal from municipal wastewater by the green alga Chlorella sp. Journal of Environmental Biology, v. 110, p. 496-502, 2012; CAPORGNO, M. P. et al. Microalgae cultivation in urban wastewater: Nutrient removal and biomass production for biodiesel and methane. Algal Research, v. 10, p. 232-239, 2015), despertando interesse nas indústrias de alimentos, farmacêuticas e de cosméticos (ARIEDE, M. B. et al. Cosmetic attributes of algae - A review. Algal Research, v. 25, p. 483-487, 2017; CEZARE-GOMES, E. A. et al. Potential of Microalgae Carotenoids for Industrial Application. Appl Biochem Biotechnol, v. 188, p. 602-634, 2019).

[004] A Dunaliella salina é um microrganismo de grande interesse comercial por possuir diversos componentes em sua biomassa, como proteína, glicerol e carotenoides. Destaca-se, em acumular, por meio da indução de estresse com o incremento da luminosidade, por exemplo, β-caroteno (carotenogênese), potente antioxidante com atividade pró-vitamina A. Possui aplicações em diversas áreas, como na saúde, alimentos, ração animal e cosméticos, sendo utilizada como anti-inflamatório, imunomodulador, agente hepatoprotetor, preparações multivitaminicas, entre outras (CEZARE-GOMES, E. A. et al. Potential of Microalgae Carotenoids for Industrial Application. Appl Biochem Biotechnol, v. 188, p. 602-634, 2019) . A produção em larga escala da D. salina ainda é um desafio, pois a taxa de crescimento celular é baixa, desenvolver promotores de crescimento celular e consequentemente a obtenção de biomoléculas é de grande valia nesse processo.

[005] A Chlorella vulgaris produz biomassa rica em proteínas e carotenoides, como a luteína, são consideradas como seguras para o consumo humano, reconhecida como GRAS. Pode ser aplicada na coloração de alimentos, de peixes e aves, aditivo em alimentos infantis, além de apresentar propriedades antioxidantes e anticâncer, eficiente na prevenção da degeneração macular (CEZARE-GOMES, E. A. et al. Potential of Microalgae Carotenoids for Industrial Application. Appl Biochem Biotechnol, v. 188, p. 602-634, 2019) .

[006] A biomassa de microrganismos fotossintetizantes é uma reserva de biomoléculas de alto valor agregado, nas quais algumas espécies apresentam vias metabólicas que permitem o acúmulo de grandes quantidades de compostos orgânicos, como: carotenoides, que são acumulados pelas células em resposta ao estresse das condições ambientais; sacarose ou prolina, que dão proteção às células contra alta salinidade; polissacarídeos extracelulares, que protegem a célula da dessecação; ácidos graxos insaturados, que induzem alterações na viscosidade da membrana, promovendo barreira contra variações térmicas e salinidade, bem como atuam como reserva energética; e proteínas, que além de suas funções estruturais ou enzimáticas, também podem servir como reserva de energia. Os principais produtos atualmente comercializados são carotenoides, ficobilinas, ácidos graxos, polissacarideos, vitaminas e esteroides, entre outros compostos biologicamente ativos (DE JESUS RAPOSO, M. F. ; DE MORAIS, R. M. S. C. ; DE MORAIS, A. M. M. B. Bioactivity and applications of sulphated polysaccharides from marine microalgae. Marine Drugs, v. 11, n. I, p. 233-252, 2013.; MOROCHO-JÁCOME et al. (Bio)Technological aspects of microalgae pigments for cosmetics. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 104, p. 9513-9522, 2020).

[007] Cianobactérias, como a Arthrospira platensis, são microrganismos fotossintetizantes que requerem apenas nutrientes inorgânicos como água e luz para seu crescimento, caracterizado por altas velocidades, quando comparadas com as células vegetais (BOROWITZKA, M. A. High-value products from microalgae—their development and commercialisation. Journal of Applied Phycology, v. 25, n. 3, p. 743-756, 2013) .

[008] Temperatura, pH e luminosidade são parâmetros ambientais que conhecidamente interferem no crescimento de A. platensis. Além desses fatores, o meio de cultivo exerce papel fundamental no seu crescimento e composição. Sabe-se que a quantidade e qualidade da fonte de nitrogênio usada no meio de cultura podem influenciar no conteúdo de proteína, bem como em outros constituintes dessa biomassa, tais como lipídeos e suas frações, e pigmentos (FERREIRA, L. S. et al. A new approach to ammonium sulphate feeding for fed-batch Arthrospira (Spirulina) platensis cultivation in tubular photobioreactor. Biotechnology progress, v. 26, n. 5, p. 1271-1277, 2010; VIEIRA, D. C. M. et al. Simultaneous use of urea and potassium nitrate for Arthrospira (Spirulina) platensis cultivation. Biotechnology journal, v. 7, n. 5, p. 649-55, 2012; CARVALHO, J. C. M. et al. Microalgae bioreactors. In: BAJPAI, R. ; PROKOP, A.; ZAPPI M. (Ed.). Algal Biorefineries: Volume 1: Cultivation of Cells and Products. First ed. Springer, Dordrecht, 2014. p. 83-126; MOROCHO-JÁCOME, A. L. et al. Simultaneous use of sodium nitrate and urea as nitrogen sources improves biomass composition of Arthrospira platensis cultivated in a tubular photohioreactor. Engineering in Life Sciences, v. 16, n. 4, p. 338-347, 2016) .

[009] Considerando que a A. platensis é constituída por aproximadamente 50 % de carbono, a utilização do dióxido de carbono no cultivo desta cianobactéria pode contribuir consideravelmente para a diminuição do custo de produção, bem como a redução de emissão deste poluente na atmosfera. A biofixação deste gás pela A. platensis reduziria os problemas ambientais como o aumento da temperatura global e a acidificação dos oceanos. Adiclonalmente, a A. platensis pode crescer mixotroficamente (BOROWITZKA, M. A. High-value products from microalgae—their development and commercialisation. Journal of Applied Phycology, v. 25, n. 3, p. 743-756, 2013), aproveitando o carbono orgânico presente em quantidades elevadas nas águas residuárias (COPPENS, J. et al. Kinetic exploration of nitrate-accumulating microalgae for nutrient recovery. Applied microbiology and biotechnology, v. 98, n. 19, p. 8377-87, 2014; CAPORGNO, M. P. et al. Microalgae cultivation in urban wastewater: Nutrient removal and biomass production for biodiesel and methane. Algal Research, v. 10, p. 232-239, 2015). 0 nitrogênio é ο segundo elemento mais abundante da célula e deve ser adicionado ao cultivo. Embora os nitratos sejam tradicionalmente utilizados, outras fontes de nitrogênio de baixo custo como sais de amônio (BEZERRA, R. P. et al. Influence of ammonium chloride feeding time and light intensity on the cultivation of Spirulina (Arthrospira) platensis. Biotechnology and Bioengineering, v. 100, n. 2, p. 297-305, 2008; FERREIRA, L. S. et al. A new approach to ammonium sulphate feeding for fed-batch Arthrospira (Spirulina) platensis cultivation in tubular photobioreactor. Biotechnology progress, v. 26, n. 5, p. 1271-1277, 2010) e/ou ureia (SÁNCHEZ-LUNA, L. D. et al. Influence of pH, temperature, and urea molar flowrate on Arthrospira platensis fed-batch cultivation: A kinetic and thermodynamic approach. Biotechnology and Bioengineering, v. 96, n. 4, p. 702 - 711, 2007; MOROCHO JÁCOME, A. L. et al. Kinetic and thermodynamic investigation of Arthrospira (Spirulina) platensis fed-batch cultivation in a tubular photobioreactor using urea as nitrogen source. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, v. 87, n. 11, p. 1574-1583, 2012; VIEIRA, D. C. M. et al. Simultaneous use of urea and potassium nitrate for Arthrospira (Spirulina) platensis cultivation. Biotechnology journal, v. 7, n. 5, p. 649-55, 2012) , contribuem na viabilização do cultivo deste microrganismo.

[010] De um modo geral, em cultivos em larga escala e no meio ambiente, os microrganismos fotossintetizantes crescem em cocultura com bactérias. Pode haver uma relação de simbiose entre esses microrganismos, onde as bactérias produzem substâncias orgânicas que são liberadas no meio de cultivo, como vitaminas e hormônios, que favorecem o crescimento dos microrganismos fotossintetizantes (FUENTES, J. et al. Impact of Microalgae-Bacteria Interactions on the Production of Algal Biomass and Associated Compounds. Marine Drugs, v. 14, n.5, 2016), e estes, por sua vez, liberam oxigénio, por sua atividade fotossintética, utilizado pelas bactérias (LANANAN et. al. Symbiotic bioremediation of aquaculture wastewater in reducing ammonia and phosphorus utilizing Effective Microorganism (EM-1) and microalgae (Chlorella sp.) . International Biodeterioration & Biodegradation, v. 95, p.l27-134. 2014) . Adicionalmente, a morte de microrganismos fotossintetizantes libera compostos que são utilizados como nutrientes pelas bactérias. No entanto, a adição de fontes de carbono orgânicas em cultivos de microrganismos fotossintetizantes, como por exemplo, glicose, sacarose, lactato, entre outros, podem aumentar muito o crescimento de bactérias, prejudicando o crescimento dos microrganismos fotossintetizantes, de modo que em processos mixotróficos e heterotróficos de cultivos de microrganismos fotossintetizantes é mais vantajoso o uso de cepas axênicas. Por outro lado, sabe-se que os microrganismos fotossintetizantes são dependentes de vitaminas para seu crescimento, de modo que em muitos meios de cultivo de microrganismos fotossintetizantes há a adição destas, principalmente vitaminas do complexo B.

[011] O uso de extratos de plantas, raizes e tubérculos está amplamente descrito na literatura, devido ã atividade farmacológica de seus constituintes.

[012] Colocassia esculenta tem sido usada na medicina tradicional por apresentar propriedades antifúngica e anticâncer (PRAJAPATI, R. et al. Colocasia esculenta: A potent indigenous plant. International journal of Nutrition, Pharmacology, Neurological Diseases, v. 1, n. 2, p. 90, 2011). Zingiber officinale é um tubérculo muito conhecido na culinária mundial, bem como na medicina tradicional, pela ação supressora de tosses da administração de extratos de seu rizoma (BERA, Κ. et al. Structural Elements and Cough Suppressing Activity of Polysaccharides from Zingiber officinale Rhizome. v. 30, p. 105-111, 2016). A raiz de Chicorium intybus é utilizada há milênios como substituto do café e aditivo em cervejas e outras bebidas. Seu principal constituinte é a inulina, um polímero de frutose com ligações glicosideas β (2→1). A inulina é considerada como prebiótico. Além disso, a raiz de chicória vem sendo utilizada como suplemento alimentar por conter fibras solúveis que não são hidrolisadas por enzimas digestivas X. et al. The physiological functions and pharmaceutical applications of inulin: A review. Carbohydrate Polymers, v. 246, p. 116589, 2020).

[013] A obtenção de fruto-ollgossacarídeos a partir de fontes vegetais como as exemplificadas acima, pode ocorrer seja por extração direta, ou por hidrólise direta da inulina, além disso, também pode ocorrer por síntese a partir de atividade enzimática. Dentre estes métodos, o primeiro é o menos utilizado, devido ao baixo rendimento (MACEDO, L. L. , VIMERCATI, W. C., ARAÚJO, C. S., Fruto-oligossacarídeos: aspectos nutricionais, tecnológicos e sensoriais. Brazilian, Journal of Food Technology, 23, e2019080, 2020).

[014] Em feiras livres e nos entrepostos de alimentos, o desperdício de alimentos de partes comumente não consumíveis é enorme, e isso ocorre não somente no Brasil, mas no mundo inteiro. Embora programas de aproveitamento deste material sejam desenvolvidos, em 2010, o entreposto CEAGESP teve um custo de R$111,08 por tonelada de resíduo direcionado aos aterros (FAGUNDES, P. R. S., SILVA, R. O. P., NACHILUK, K., MONDINI, L. Aproveitamento dos resíduos gerados no entreposto terminal de São Paulo da CEAGESP. Informações econômicas, 242, 3, p. 65-73, 2012), incluindo verduras e frutas.

[015] Fruto-oligossacarideos têm sido empregados em cultivos de bactérias como promotores de crescimento (HARTEMINK, R.; VAN LAERE, K. M. J.; ROMBOUTS, F. M. Growth of enterobacteria on fructo-oligosaccharides. Journal of Applied Microbiology, v. 83, n. 3, p. 367-374, 1997; CHEN, Y. S.; SRIONNUAL, S.; ONDA, T.; YANAGIDA, F. Effects of prebiotic oligosaccharides and trehalose on growth and production of bacteriocins by lactic acid bacteria. Lett Appl Microbiol., v. 45, n. 2, p. 190-193, 2007), embora não tenha sido encontrado sua adição em cultivos envolvendo simultaneamente bactérias e microrganismos fotossintetizantes.

[016] A bactéria Bacillus atrophaeus é Gram-positiva, aeróbica, não patogênica e formadora de esporos (HARWOOD, C. R. Bacillus subtilis and its relatives: molecular biological and industrial workhorses. Trends in Biotechnology, v. 10, p. 247-256, 1992). Devido à sua estrutura complexa e alta resistência aos desgastes físicos e químicos, essa bactéria tem sido objeto de investigação, sendo utilizada como microrganismo padrão em estudos; na avaliação de sistemas de esterilização, produtos e processos; como agente de biocontrole e promotor de crescimento de plantas; além de produtor de biomoléculas (SELLA, S. R. B. R.; VANDENBERGHE, L. P. S.; SOCCOL, C. R. Bacillus atrophaeus: Main characteristics and biotechnological applications - A review. Critical Reviews in Biotechnology, v. 35, n. 4, p. 533-545, 2014).

[017] As estirpes de B. atrophaeus exibiram bioatividade significativa contra fungos patogênicos de plantas e proclamam que a cepa é promissora quanto à produção de substância antimicrobiana. Este antifúngico apresentou estabilidade térmica e ativa em uma ampla faixa de pH de 5,0 a 10,0 (RAJAOFERA, M. J. N. et al. Antifungal activity of the bioactive substance from Bacillus atrophaeus strain HAB-5 and its toxicity assessment on Danio rerio. Pesticide Biochemistry and Physiology, v. 147, p. 153-161, 2018).

[018] 0 Bacillus megaterium tem sido reportado como produtor de vitamina B12 (BIEDENDIECK et al., Metabolic engineering of cobalamin (vitamin B12) production in Bacillus megaterium. Microbial Biotechnology, v.3, n.l, p. 24-37, 2010), o que pode favorecer o crescimento de microrganismos fotossintetizantes.

ESTADO DA TÉCNICA

[019] Existem no estado da técnica, vários trabalhos realizados e relacionados à utilização de componentes extraídos de plantas e/ou microrganismos heterotróficos para estimular o crescimento e desenvolvimento de microrganismos fotossintetizantes, por exemplo:

[020] O documento PI1007370 (A2) revela que o crescimento de algas, mediante a multiplicação celular durante os estágios de crescimento exponencial e pós-exponencial, pode ser estimulado por reguladores de crescimento de plantas ou miméticos. Tal documento fornece um método para aumentar a multiplicação celular de algas, devido à presença de regulador de crescimento de planta, que irá propiciar o aumento de biomassa e produção de bioprodutos de valor agregado, como componentes lipídicos e carboidratos.

[021] O documento em nome de Lin et al., 2017 (LIN, B. et al. Plant growth regulators promote lipid and carotenoid accumulation in Chlorella vulgaris, J. Appl Phycol., v. 30, p. 1549-1561, 2017) investigou através da utilização da cepa Chlorella vulgaris, microalga de alta importância comercial, os efeitos das diferentes concentrações de oito reguladores de crescimento de plantas no acúmulo de lipídios, compostos como ácidos graxos poli-insaturados, proteínas e carotenoides. Adicionalmente, foi verificado que as expressões transcricionais de genes de síntese de ácidos graxos com a finalidade de compreender o mecanismo molecular da bioacumulação de lipídios em C. vulgaris em resposta aos reguladores de crescimento de plantas por meio de qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction) em tempo real. Ainda, ο referido documento demonstra que esses reguladores são uma ferramenta útil para induzir o acúmulo de lipídios, proteínas solúveis, carotenoides, e ácidos graxos poli-insaturados. Sendo assim, o tratamento com reguladores de crescimento de plantas foi considerado uma ferramenta útil para produção de biodiesel e outros metabólitos de alto valor agregado, como carotenoides, a partir da biomassa microalgal.

[022] O documento em nome de Bradley (1991) (BRADLEY, P. M. Plant hormones do have a role in controlling growth and development of algae, J. Phycol., v. 27, p. 317-321, 1991) reuniu estudos relacionados a hormônios de crescimento de plantas associados ao desenvolvimento de algas axênicas, em que os hormônios de plantas são capazes de afetar o crescimento e desenvolvimento de algas marinhas. Então, as algas, sob a ação de hormônios vindos de plantas, possivelmente criaram mecanismos capazes de responder diretamente a esses estímulos, produzindo diversos compostos fenôlicos e/ou hormônios endógenos que estimulam a divisão celular.

[023] Destaca-se que até o momento não existem informações na literatura utilizando extratos de plantas, raízes e/ou tubérculos prevendo suas ações como promotores de crescimento bacteriano e/ou de outros microrganismos heterotrôficos na cocultura de microrganismos fotossintetizantes. De fato, como visto acima, o interesse no uso de extratos de plantas, raízes e/ou tubérculos em cultivos de microrganismos fotossintetizantes decorrem de sua ação direta nestes.

[024] Nos últimos anos, têm havido estudos sobre a associação de comunidades bacterianas com microalgas, onde tem sido observado que as bactérias produzem substâncias que estimulam o crescimento das microalgas, inclusive com o aumento da síntese de macromoléculas como carboidratos, lipídios e pigmentos.

[025] O documento US 8.778.660 B2 revela o aumento do crescimento celular de microalgas, como Chlamydomonas e Neochloris oleoabundans, em um menor espaço de tempo, através da cocultura destas com Methylotrophs facultativas de pigmentação rosa, conhecidas como bactérias PPFM (Pink-Pigmented Facultative Methylotrophs). Ao se utilizar uma variante mutante dessa bactéria, foi proporcionada uma maior disponibilidade de vitamina B12 para as microalgas, tendo influência no desenvolvimento celular, na obtenção de biocombustível, além de outros compostos.

[026] O documento em nome de Fuentes et al. (2016) (FUENTES, J. L. et al. Impact of Microalgae-Bacteria Interactions on the Production of Algal Biomass and Associated Compounds. Marine Drugs, v. 14, n. 5, p. 100, 2016) descreve algumas interações entre bactérias e algas que podem estimular o aumento da produção da biomassa de microalgas a um menor custo, bem como favorecer o acúmulo de lipídeos e carboidratos. Isso se deve ao fato de as comunidades bacterianas fornecerem vitaminas e metabólitos importantes para o desenvolvimento das microalgas, tais como vitamina B12, sidéforos, vibrioferrina, N-acil-homoserina lactonas (AHLs), conhecida por ser uma molécula sinalizadora de "quorum sensing".

[027] O documento em nome de Krug et al. (2020) (KRUG, L. et al. Plant Growth-Promoting Methylobacteria Selectively Increase the Biomass of Biotechnologically Relevant Microalgae, Frontiers in Microbiology, v. 11, n. 427, p. 1-12, 2020) revela que uma proporção equilibrada entre microalgas e bactérias simbióticas leva à promoção de crescimento microalgal após experimentos de cocultivo com o gênero bacteriano Methylobacterium e as espécies de microalgas Chlorela vulgaris, Scenedesmus vacuolatus e Haematococcus lacustres, demonstrando que a exploração dessas relações simbióticas poderiam ser uma ferramenta biotecnológica promissora.

[028] Ο documento em nome de Gonzalez e Bashan (2000) (GONZALEZ, L. E.; BASHAN,Y. Increased Growth of the Microalga Chlorella vulgaris when Coimmobilized and Cocultured in Alginate Beads with the Plant-Growth-Promoting Bacterium Azospirillum brasilense, Applied and Environmental Microbiology, v. 66, n. 4, p. 1527-1531, 2000) demonstrou que ao utilizar a bactéria A. brasllense, conhecida por ser promotora do crescimento de plantas, na coimobilização da microalga C. vulgaris em pequenas esferas de alginato, resulta em um aumento do crescimento dessa microalga e também proporciona o aumento da produção de pigmentos.

[029] Assim, de uma forma não prevista no estado da técnica, no caso do extrato de origem bacteriana, as bactérias são produzidas isoladamente e posteriormente rompidas, com o intuito de liberar do interior da célula vitaminas e metabólitos, incluindo vitaminas do complexo B, cofatores e coenzimas, que são capazes de promover o aumento do crescimento de microrganismos fotossintetizantes. O uso de extratos bacterianos, ou de outros microrganismos heterotróficos, não caracteriza cocultura, uma vez que estes microrganismos se encontram inativados em decorrência da lise celular e/ou outra operação unitária que promova a esterilização deles.

[030] Portanto, a presente invenção propõe um extrato proveniente de plantas para promover o crescimento bacteriano de espécies que vivem em cocultura com microalgas de modo que, ao promover o crescimento das bactérias presentes no meio de cultivo em cocultura com microalgas, seja aumentada a biossíntese e liberação no meio de cultivo de compostos que atendam a necessidade nutricional dos microrganismos fotossintetizantes a serem cultivados, melhorando sua produtividade. Adicionalmente, visando uma ação direta dos componentes celulares bacterianos no favorecimento do crescimento dos microrganismos fotossintetizantes, desenvolveu um extrato de bactérias para adição em cultivo de microrganismos fotossintetizantes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[031] A presente invenção tem por objetivo propor um processo de obtenção de biomassa de microrganismos fotossintetizantes como microalgas e/ou cianobactérias, incluindo os organismos modificados geneticamente, preferencialmente Dunaliella salina, Chlorella vulgaris e Arthrospira platensis, e de seus subprodutos tais como, proteínas, carotenoides, pigmentos, ácidos graxos e carboidratos, entre outros, a partir do cultivo de microrganismos fotossintetizantes estimulado por promotores de crescimento microbiano, sejam estes promotores de origem vegetal ou microbiana. Dessa forma, a presente invenção propõe em uma primeira modalidade, um processo para obtenção de extratos promotores do crescimento microbiano de origem vegetal. Em sua segunda modalidade propõe um processo para obtenção de extratos promotores do crescimento microbiano de origem microbiana. Em sua terceira modalidade propõe os extratos promotores de crescimento microbiano previamente obtidos. Em sua quarta modalidade propõe um processo para obtenção de biomassa de microrganismos fotossintetizantes utilizando os extratos promotores de crescimento. Em sua quinta modalidade propõe a biomassa de microrganismos fotossintetizantes e seus componentes, bem como em sua sexta modalidade, o uso da biomassa de microrganismos fotossintetizantes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[032] Para obter uma total e completa visualização do objetivo desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme segue.

[033] A Figura 1 apresenta um fluxograma mostrando todas as modalidades abordadas na presente invenção.

[034] A Figura 2 apresenta um gráfico da curva de crescimento celular (mg L -1) dos cultivos da Ά. platensis em meio padrão (●), meio padrão com adição de extrato de chicória fresca (■) e meio padrão com adição de extrato de chicória seca (□) .

[035] A Figura 3 apresenta um gráfico da curva de crescimento celular (105 células. mL-1) dos cultivos da D. salina axênica, sem o extrato de bactéria B. atrophaeus ATCC 9372 (f/2) e com o extrato de bactéria B. atrophaeus ATCC 9372 (f/2 + E).

[036] A Figura 4 apresenta um gráfico da curva de crescimento celular (105 células. mL-1) dos cultivos da D. salina xênica, sem o extrato de bactéria B. atrophaeus ATCC 9372 (f/2) e com o extrato de bactéria B. atrophaeus ATCC 9372 (f/2 + E).

[037] A Eigura 5 apresenta um gráfico da curva de crescimento celular (expressa em absorbância a 682 nm) dos cultivos da C. vulgaris xênica, sem o extrato de bactéria B. atrophaeus ATCC 9372 (Bold) e com o extrato de bactéria B. atrophaeus ATCC 9372 (Bold + E).

[038] A Figura 6 apresenta uma fotografia dos frascos de cultivos de C. vulgaris em meio com extrato bacteriano (A) e em meio padrão (B).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[039] A presente invenção refere-se a um processo para obtenção de biomassa de microrganismos fotossintetizantes utilizando extratos promotores do crescimento microbiano previamente obtidos a partir tanto de plantas e/ou suas partes quanto do cultivo de microrganismos heterotróficos, conforme representado na Figura 1.

[040] Em uma primeira modalidade, a presente invenção refere-se a um processo para obtenção de extratos promotores do crescimento microbiano de origem vegetal, isto é, a partir de plantas e/ou suas partes. Estes têm por finalidade principal favorecer ao crescimento bacteriano no meio de cultivo de microrganismos fotossintetizantes, que, por conseguinte, aumentam o crescimento dos microrganismos fotossintetizantes pela produção de substâncias que favorecem seu crescimento, embora possam ter uma ação direta como promotores de crescimento dos microrganismos fotossintetizantes.

[041] Os promotores de crescimento provenientes de extratos de plantas podem ser obtidos de qualquer parte, como raizes, tubérculos, caules, folhas, flores, sementes, frutos podendo ser de raiz de chicória (Cichorium intybus), sisal (Agave), gengibre (Zingiber officinale) , não sendo descartado o uso de outras plantas. A planta e/ou suas partes podem ser usadas diretamente e/ou lavadas e/ou higienizadas e/ou desinfetadas e/ou esterilizadas anteriormente ao uso.

[042] O processo de preparo do extrato das plantas ocorre a partir de qualquer parte delas, secas ou in natura, preferencialmente trituradas, em diferentes granulometrias, com tamanhos de partícula preferencialmente menores que 10 mm, mais preferencialmente menores que 5 mm, mais preferencialmente ainda menores que 1 mm, com uso de solvente que permita a extração, em temperaturas de 10°C a 150°C, preferencialmente temperatura ambiente, das substâncias promotoras de crescimento bacteriano e/ou de microrganismos fotossintetizantes. O tempo de extração pode ser de 5 minutos a 8 horas, preferencialmente menor que 4 horas, mais preferencialmente ainda menor que 2 horas. Os solventes preferenciais são ãgua ou etanol, embora possam ser utilizados outros solventes, como hexano, metanol, isopropanol, propanol, acetato de etila, acetona, éter etílico, ácido acético, bem como misturas desses solventes, em diferentes proporções, conferindo diferentes condições de polaridade para o processo extrativo. Podem ser utilizados bases e ácidos, orgânicos ou inorgânicos, para alcalinização ou acidificação, respectivamente, do solvente ou mistura de solventes empregado na extração. A proporção de sólido, em termos de matéria seca, no solvente ou mistura de solventes empregado no processo de extração pode ser de 0, 1% a 40%, preferencialmente menor que 30%, mais preferencialmente ainda menor que 20%. O termo "água" empregado na presente invenção refere-se ã água potável. destilada, deionizada, ou obtida por osmose reversa, ou submetida a processo de esterilização.

[043] O processo de extração pode ser feito com ou sem agitação mecânica, preferencialmente com agitação mecânica. Após o processo de extração, o extrato pode ser recuperado de várias formas para a obtenção da fração liquida, na forma de solução ou suspensão. A separação do solvente ou mistura de solventes contendo o(s) composto(s) extraido(s) do material particulado pode ocorrer por sedimentação, filtração e/ou centrifugação. Os extratos podem ser de consistência sólida, semissólida ou preferencialmente liquida e são preparados a partir de plantas, e outras fontes naturais como bactérias e outros microrganismos capazes de produzir substâncias promotoras de crescimento. Podem ser utilizados métodos como decocção, infusão, maceração, percolação, difusão, extração com CO2 supercrítico, extração assistida por micro-ondas, extração assistida por ultrassom, entre outros. O processo pode ser de tipo sequencial ou exaustivo até a total obtenção de substâncias promotoras.

[044] Na obtenção dos extratos, as plantas e/ou microrganismos podem ser hidrolisados por processos químicos, alcalinos ou ácidos, e/ou pela ação de enzimas de degradação, como celulases, pectinases, hemicelulases, xilanases e/ou ligninases, dentre outras enzimas, que também levam ã formação/ liberação de promotores de crescimento microbiano, sendo denominados também como extratos a seguir. Da mesma forma que na obtenção do extrato sem hidrólise química ou enzimática, após este processo de obtenção do extrato, ele pode ser recuperado de várias formas para a obtenção da fração líquida, na forma de solução ou suspensão, e seguir para o armazenamento em temperatura ambiente e/ou refrigerado e/ou congelado.

[045] As plantas selecionadas devem ser coletadas em época apropriada. As partes de plantas utilizadas para o preparo do extrato podem ser frescas (in natura) ou secas, reduzidas de tamanho por trituração ou em moinho de bolas e/ou de facas e/ou de martelos ou outro método de abrasão. Quando necessário, são utilizados métodos naturais (em regiões com boa ventilação, baixa umidade e altas temperaturas) e artificiais para secagem por estufa de ventilação forçada, estufa convencional, camada delgada, micro-ondas, entre outros. Após a extração, os materiais indesejáveis e residuais podem ser eliminados por diferentes processos como decantação, centrifugação, e preferencialmente filtração nas suas diversas variações (ultrafiltração, microfiltração, etc), não descartando outros métodos de separação.

[046] Após a remoção de compostos indesejados do extrato, ele pode ser concentrado por processos de evaporação, com remoção parcial ou total do solvente, preferencialmente com uso de vácuo, ou ser seco por processo de liofilização ou secagem por atomização, preferencialmente, por ser de menor custo.

[047] Em uma segunda modalidade, a presente invenção refere-se a um processo para obtenção de extratos promotores do crescimento microbiano de origem microbiana, isto é, a partir do cultivo de microrganismos heterotróficos. Podem ser adicionados extratos de microrganismos heterotróficos, incluindo os organismos modificados geneticamente, preferencialmente extratos de bactérias, no cultivo de microrganismos fotossintetizantes, incluindo os organismos modificados geneticamente. Promotores de crescimento microbiano provenientes de microrganismos heterotróficos também compreendem desde células inativas de microrganismos, seus metabólitos, fragmentos celulares, enzimas, peptídeos, entre outras organelas, na forma integra ou fragmentada.

[048] Os microrganismos heterotróficos, incluindo os organismos modificados geneticamente, preferencialmente bactérias, mais preferencialmente Bacillus spp., mais preferencialmente ainda Bacillus atrophaeus podem ser cultivados preferencialmente em biorreator de mistura, biorreator tipo torre, e suas variações, por processos descontínuos, semicontínuos, contínuos e suas variações, ou preferencialmente por descontínuos alimentados, em condições aeróbias ou anaeróbias, dependendo da espécie de microrganismo utilizada, preferencialmente aeróbica, preferencialmente em condições estéreis, em valores de pH de 2,5 a 11,0, preferencialmente com valores entre 5,5 a 8,5 mais preferencialmente na faixa de 6,0 a 8,0 , podendo ter faixa mais estreita de valor de pH, ou este valor pode ser fixado, dependendo da espécie de microrganismo utilizado. A temperatura de cultivo pode ser de 20°C a 70°C, preferencialmente de 28°C a 40°C, mais preferencialmente ainda na faixa de 32°C a 38°C.

[049] Os processos podem ter diferentes valores de aeração de 0,001 a 5 vvm, com concentração de oxigénio dissolvido de 0 a 7 mg/L, preferencialmente de 0,2 a 2,5 mg/L, mais preferencialmente ainda de 0,7 a 1,8 mg/L. As fontes de oxigênio podem ser ar comprimido, oxigênio puro ou a mistura de gases, fornecidos na mesma linha ou em linhas separadas. O ar e/ou gás contendo oxigênio pode ser filtrado por filtração esterilizante em filtros absolutos ou ser filtrado em filtros de profundidade, podendo ser aplicados os dois tipos de filtração. Os cultivos são preferencialmente sob condições de esterilidade ou assépticas, embora seja admitida a presença de outros microrganismos, com ou sem adição de antiespumantes.

[050] A salinidade do meio pode estar em uma faixa de 0,0% a 5,0 %, preferencialmente 0,5% a 1,0%.

[051] Poderão ser utilizados diferentes tipos de fonte de carbono, incluindo óleos, açúcares, glicerol, polímeros, entre outros compostos. Preferencialmente, utilizar fonte de carbono como sacarose, glicose, frutose, glicerol, hidrolisados de amidos, hidrolisados de celulose, amido e outros polímeros fermentáveis, em concentrações de 50 mg/L a 250 g/L no biorreator.

[052] Também podem ser utilizadas diferentes fontes de nitrogênio, incluindo fontes orgânicas, naturais ou sintéticas (obtidas por síntese química), e/ou inorgânicas, bem como outros nutrientes orgânicos. Preferencialmente, utilizar fontes inorgânicas como nitrato de amônio, sulfato de amônio, cloreto de amónio, amónia, hidróxido de amónio, nitrato de sódio, nitrato de potássio, bem como orgânicas, como ureia, hidrolisados proteicos de origem vegetal, animal e/ou microbiana, entre outras. Podem ser utilizadas misturas de fontes de nitrogênio inorgânicas e/ou orgânicas. Bem como também são adicionadas ao meio fontes de fósforo, potássio e outros nutrientes e micronutrientes inorgânicos, além da adição de vitaminas, incluindo vitaminas do complexo B, principalmente que atendam às necessidades nutricionais do metabolismo microbiano. Fontes de fósforo incluem ácido fosfórico e seus sais, podendo ser citados fosfato bibásico de sódio, fosfato bibásico de potássio, fosfato monobásico de sódio, fosfato monobásico de potássio, fosfato trissódico, fosfato tripotássico, fosfato diamónico, fosfato monoamônico, entre outros. Fontes de potássio incluem cloreto de potássio, nitrato de potássio, sulfato de potássio, fosfato monobásico de potássio, fosfato bibásico de potássio, fosfato tripotássico, entre outros. Outros elementos inorgânicos envolvem sais de cálcio, ferro, magnésio, manganês, zinco, cobre, cobalto, molibdênio, ácido bórico, entre outros. Vitaminas a serem adicionadas aos meios de cultivos podem ser cianocobalamina, biotina, tiamina, riboflavina, niacina, ácido fólico, pantotenato, entre outras, ou fontes naturais delas, como extrato de levedura e água de maceração de milho, por exemplo.

[053] Para a obtenção do extrato dos microrganismos heterotróficos, as células provenientes do cultivo ainda úmidas podem ser separadas preferencialmente por centrifugação em uma faixa de 2500 a 20000 rpm por até 60 minutos, preferencialmente a 4000 rpm por 30 minutos, sob refrigeração ou a temperatura ambiente, preferencialmente entre 20 °C e 30 °C, mas também podem ser utilizadas técnicas de floculação, microfiltração, filtração com ou sem uso de vácuo, filtração em tambor a vácuo, entre outros métodos, e ressuspensas em água, em solução salina, em soluções tampão e/ou outros solventes, rompidas por processos mecânicos, incluindo abrasão por pérolas de vidro, de diferentes diâmetros, preferencialmente rompimento em reatores ou moinhos de bolas, com esferas de cerâmica, vidro, aço inoxidável, ligas de alta dureza, como de zircônio, titânio, silício, bem como de outros tipos de materiais, rompimento por ultrassom, em um único ciclo ou em ciclos repetitivos, com homogeneizador de elevada pressão que podem ocorrer por operação descontinua ou contínua em ampla faixa de pressão, preferencialmente a 250 MPa. Métodos com variação de temperatura, preferencialmente, congelamento e descongelamento realizados com ampla ou mínima variação de temperatura, no intervalo de 100 °C a -18 °C, mais preferencialmente entre 70 °C e -5 °C, mais preferencialmente ainda entre 37 °C e 0 °C, preferencialmente com ciclos de repetições, também podem ser utilizados como métodos físicos de rompimento celular.

[054] Os métodos químicos de rompimento celular incluem o tratamento da biomassa com álcalis, detergentes, entre outros e os métodos biotecnológicos incluem enzimas. Esses métodos de rompimento celular podem se constituir como únicos, ou podem ser utilizados em sequência, em distintas ordens. Os lipídios podem ser removidos previamente a estes tratamentos por meio de solventes orgânicos, como hexano, acetato de etila, acetona, etanol, metanol, propanol, isopropanol, butanol, éter etílico, éter de petróleo, ácido acético, puros ou em mistura, ou por meio de extração por fluído supercrítico. Essa biomassa úmida pode ser proveniente de qualquer parte do processo, sendo possível sua obtenção também de biomassa conservada sob congelamento, ou mesmo resfriada. Alternativamente, pode ser utilizada biomassa seca para o processo de rompimento celular, passando pelos mesmos processos que o indicado para biomassa úmida, porém com sua hidratação prévia em água, meio e/ou solução salina ou tamponado. 0 termo "água" empregado na presente invenção refere-se à água potável, destilada, deionizada, ou obtida por osmose reversa, ou submetida a processo de esterilização. A fração lipídica, total ou parcialmente removida dos microrganismos heterotróficos, in natura ou purificada, preferencialmente in natura, pode ser utilizada para aplicações industriais, como produção de biodiesel, em cosméticos, produtos domissanitários, rações e como matéria-prima na indústria de alimentos.

[055] A proporção de sólido, em termos de matéria seca, no solvente ou mistura de solventes empregado no processo de extração pode ser de 0,1% a 40%, preferencialmente menor que 30%, mais preferencialmente ainda menor que 20%.

[056] Enzimas de degradação, incluindo pectinases, xilanases, quitinases, zimolase, celulases, glucanases, manases, lisozima, entre outras podem ser usadas para incrementar a biodisponibilidade dos promotores de crescimento no extrato de microrganismos heterotróficos.

[057] Em uma terceira modalidade, a presente invenção refere-se aos extratos promotores de crescimento microbiano previamente obtidos. Os extratos, contendo compostos em solução e/ou em suspensão, contendo os promotores de crescimento, provenientes de plantas ou de microrganismos heterotróficos. podem ser armazenados in natura ou concentrados, sob refrigeração ou congelamento, bem como secos, por diferentes métodos de secagem previamente ao armazenamento.

[058] Opcionalmente, os extratos podem sofrer tratamentos para separação de suas frações. Os extratos, com promotores de crescimento, provenientes de plantas ou de microrganismos heterotróficos, solubilizados e/ou em suspensão, podem ser filtrados, inclusive utilizando-se filtração tangencial, filtração com ou sem uso de vácuo, filtração em tambor a vácuo, e/ou centrifugados em operações isoladas ou combinadas em funil, com ou sem auxilio de vácuo, em filtro de tambor rotativo e/ou concentrador a vácuo (speed vac) . A secagem do extrato, preferencialmente concentrado em nível adequado para processos subsequentes, pode ser por aquecimento em estufa de secagem, túneis de secagem, esteira de secagem, em sistema corrente e/ou contracorrente, utilizando além do ar, outros agentes secadores, como gases inertes e vapor superaquecido e/ou por liofilização e/ou secagem por aspersão ou atomização, também conhecida por spray drying e/ou secadores a vácuo com calor fornecido ao material por condução através do aquecimento dos suportes ou radiação.

[059] Os extratos na forma liquida podem ser esterilizados de forma descontinua ou continua, preferencialmente utilizando o método denominado "HTST" (high temperature short time) utilizando, preferencialmente, 145° C por 3 segundos. Também podem ser esterilizados por microfiltração.

[060] Em uma quarta modalidade, a presente invenção refere-se a um processo para obtenção de biomassa de microrganismos fotossintetizantes utilizando os extratos como promotores de crescimento, preferencialmente suas frações, adicionados diretamente ao meio de cultivo, seja durante seu preparo ou adicionado ao meio de cultivo após o inicio de cultivo destes microrganismos.

[061] Os microrganismos fotossintetizantes compreendem as classes Bacillariophyceae, Chlorophyceae, Chrysophyceae, Coccolithophyceae, Cyanophyceae, Euglenophyceae, Eustigmatophyceae, Labyrinthulomycetes, Prymnesiophyceae, Trebouxiophyceae, entre outras. Preferencialmente, dentro destas classes descritas, se encontram os seguintes exemplos: Arthrospira (Spirulina) sp., Synechocistls sp., Ankistrodesmus sp., Botryococcus sp., Scenedesmus sp., Chlorella sp., Dunallella sp., Haematococcus pluvialis, Isochrysis galbana, Monoraphidium sp., Euglena gracilis, Nannochloropsis oculata, Navicula sp., Cryptomonas sp., Isochrysis sp., Schizochytrium sp. e Lagerheimia sp., podendo ser utilizadas outras espécies.

[062] Os promotores de crescimento auxiliam no desenvolvimento da biomassa de microrganismo fotossintetizante, sendo eles biomoléculas, tais como oligossacarídeos, fruto-oligossacarídeos, preferencialmente a inulina, elementos minerais, sais, vitaminas, peptídeoglicanos, aminoácidos, peptídeos, entre outros. Os oligossacarídeos a que se referem esta invenção compreendem os fruto-oligossacarídeos (FOS), galacto-oligossacarídeo (GOS), isomalto-oligossacarídeo (IMO), oligossacarídeos da soja, xilo-oligossacarídeos (XOS), entre outros.

[063] Os promotores de crescimento podem ser provenientes de extratos de plantas ou de microrganismos heterotróficos, em diferentes graus de pureza, usados da forma como obtidos, ou concentrados. Estes compostos podem ser de origem comercial, podendo ser um extrato bruto ou com elevada pureza. Podem ser utilizados promotores de somente uma fonte, vegetal ou microbiana, preferencialmente bacteriana, podendo optar por se utilizar o extrato vindo de uma ou mais espécies de plantas e/ou microrganismos heterotróficos, de modo que os extratos se complementem quanto à funcionalidade, no qual os extratos das plantas estimulariam as bactérias do cultivo xênico a produzir compostos nutricionais importantes para o crescimento dos microrganismos fotossintetizantes, enquanto que os extratos microbianos, através da lise celular, total ou parcial, teriam seus metabólitos direcionados para o estímulo do crescimento de microrganismos fotossintetizantes, com favorecimento diretamente do crescimento dos microrganismos fotossintetizantes tanto em cultivos xênicos como axênicos. As proporções dos extratos de plantas e microrganismos heterotróficos podem variar entre 0,01% a 99,99%, a depender do tipo de microrganismo fotossintetizante de interesse a ser cultivado. Esses extratos podem ser misturados previamente a serem adicionados no meio de cultivo, ou podem ser adicionados separadamente, de modo que a mistura ocorra somente no meio de cultivo. Preferencialmente, os extratos, quando de duas ou mais fontes, por facilidade podem ser adicionados separadamente no meio de cultivo.

[064] Ao meio de cultivo, podem ser adicionadas também substâncias que visem complementar a ação dos promotores de crescimento, aumentando o crescimento celular, seja de bactérias ou de microrganismos fotossintetizantes, que crescem em cocultura, com aumento do crescimento de microrganismos fotossintetizantes. Os extratos podem ser adicionados em teores, considerando sua base seca, em valores de 0,001% a 10%, mais preferencialmente, na faixa de 0,01% a 5%, mais preferencialmente ainda na faixa de 0,1% a 0,5%.

[065] Os cultivos dos microrganismos fotossintetizantes, incluindo os organismos modificados geneticamente, podem ocorrer em reatores abertos ou fechados, com luz natural ou artificial, com diferentes sistemas de circulação de células, em temperaturas de 20 a 45°C, preferencialmente entre 25 a 32°C, sendo a faixa de temperatura delimitada conforme aquela ótima para o crescimento do microrganismo fotossintetizante que está sendo cultivado. Para cultivos de microalgas, como D. salina e C. vulgaris, mais preferencialmente ainda, deve se trabalhar com temperatura no meio de 25°C enquanto no cultivo de A. platensis, mais preferencialmente ainda, deve se trabalhar com temperatura no meio de 32°C. Os processos de cultivo empregados podem ser semicontinuo, continuo, descontinuo e/ou descontinuo alimentado, em condições estéreis ou assépticas, podendo ser admitida a presença de outros organismos no sistema. Os cultivos poderão ser em condições heterotróficas, mixotróficas ou fotoautotróficas. Os cultivos poderão ser realizados com ou sem controle de valor de pH, sendo preferencialmente realizado seu controle, por meio de adição de álcalis e/ou gás carbônico, puro ou em misturas, com manutenção de faixas de pH ideais de crescimento dos microrganismos fotossintetizantes, ou com fixação de um valor, com controle automático dos valores, por meio do acionamento de dispositivos que liberem as substâncias para controle de pH no meio de cultivo. Preferencialmente, gás carbônico pode ser usado como substância de controle de pH. Os valores de pH podem ser de 4,0 a 11,0, mas as faixas de trabalho mais estreitas poderão ser utilizadas, dependendo do microrganismo fotossintetizante a ser cultivado.

[066] Em uma quinta realização, a presente invenção refere-se ã biomassa de microrganismos fotossintetizantes e seus componentes. Durante o cultivo dos microrganismos fotossintetizantes, preferencialmente ao final do cultivo, a biomassa destes microrganismos será preferencialmente separada do meio de cultivo residual, e as células produzidas e/ou meio de cultivo serão utilizados para a recuperação do produto de interesse, podendo ser utilizados diferentes processos para esta finalidade, incluindo processos físicos, químicos e/ou enzimáticos, em diferentes combinações e etapas. As moléculas de interesse poderão ser purificadas e/ou modificadas, dependendo da finalidade de uso. A biomassa de microrganismos fotossintetizantes, em relação à sua massa seca, pode conter de 1% a 20% de cinzas, 10% a 80% de proteínas, 10% a 60% de carboidratos e 10 a 80% de lipídios. O grau de purificação das moléculas de interesse obtidas a partir da biomassa microbiana pode ser de 5% a 100%, mais preferencialmente de 15 a 100%, mais preferencialmente ainda de 80 a 100%.

[067] Em uma sexta modalidade, a presente invenção refere-se ao uso da biomassa de microrganismos fotossintetizantes, bem como dos metabólitos produzidos, incluindo ácidos nucleicos, proteínas, peptídeos, aminoácidos, polissacarideos, pigmentos e ácidos graxos para aplicações como nutracêuticos, matérias-primas das indústrias de alimentos, para uso humano ou animal, em indústrias de cosméticos, bem como em biofertilizantes, biossurfactantes, fitormônios, biocombustíveis, biorremediação e geração de energia.

EXEMPLOS DA INVENÇÃO ■ Cultivo de Arthrospira platensis com adição de extrato de chicória. Manutenção da A. platensis e preparo de inoculo

[068] A cianobactéria A. platensis foi mantida em meio padrão (Tabela 1), contendo nitrato de sódio como fonte de nitrogênio (SCHLӦSSER, U. G. Ber. Deutsch. Bot. Ges. Bd. , v. 95, p. 181-276, 1982) . Para o preparo de inóculo, uma alíquota da cultura de A. platensis mantida no laboratório foi transferida, sob condições assépticas, para um tubo de ensaio contendo 10 mL de meio de cultivo liquido padrão (SCHLӦSSER, U. G. Ber. Deutsch. Bot. Ges. Bd. , v. 95, p. 181-276, 1982) . Após quinze dias, a suspensão celular (fração celular e meio de cultivo) foi transferida para frascos Erlenmeyer de 500 mL, contendo 200 mL do mesmo meio de cultivo previamente citado. Estes frascos foram mantidos em agitador rotativo com frequência de agitação de 100 rpm, temperatura de 32 ± 1 °C e intensidade luminosa de 6 klux (72 μmοl fótons m-2 s-1) por cerca de seis a oito dias, até atingir a fase exponencial de crescimento celular. Após esse período, a suspensão celular de A. platensis foi filtrada, lavada com solução fisiológica, e ressuspensa em meio de cultivo padrão. Esta suspensão serviu de inóculo para todos os cultivos realizados. A concentração celular inicial de cada cultivo em fotobiorreator tubular foi de 425 ± 25 mg .

* Solução de metais - PIV (mg L : Na2EDTA, 750; FeCl3.6H20, 97; MnCl2.4H20, 41; ZnCl2, 5; C0CI2.6H2O, 2; Na2Mo04.2H20, 4.
** Solução de micronutrientes - CHU (mg L-1) : Na2EDTA, 50; H3BO3, 618; CUSO4.5H2O, 19,6; ΖnSO4.7Η2O, 44; CoCl2.6H2O, 20; MnCl2.4H2O, 12,6; Na2MoO4.2H2O, 12,6.

Cultivos realizados

[069] Foram utilizados três tipos de cultivo: experimento com meio padrão (EP) , (SCHLӦSSER, 1982); experimento com meio padrão (SCHLӦSSER, 1982) adicionado de extrato de chicória fresca (EF); experimento com meio padrão (SCHLӦSSER, 1982) adicionado de extrato de chicória seca (ES). Os ensaios foram realizados em duplicata.

[070] No experimento com adição de chicória fresca (EF), para a preparação do extrato de chicória fresca (úmida), utilizou-se 3,7 g de raizes frescas de Cichorium intybus lavadas e picadas, que foram trituradas com 150 mL de água destilada, sendo que 100 mL desta solução foram adicionadas em cada fotobiorreator tubular, que, imediatamente antes desta operação, havia sido inoculado com A. platensis em meio Schlӧsser.

[071] No experimento com adição de chicória seca (ES), para a preparação do extrato de chicória seca, foi necessário a remoção da umidade por secagem, das raizes de Cichorium intybus lavadas e picadas previamente, em estufa à 55 °C até a estabilização do peso. Assim que atingido o peso constante, 2,33 g deste material foram adicionados a 150 mL de água destilada e aquecidos em micro-ondas por 3 minutos em potência máxima. A solução foi filtrada em tela de 50 μm e 100 mL deste extrato e foram adicionados ao fotobiorreator tubular, que, imediatamente antes desta operação, havia sido inoculado com A. platensis em meio Schlӧsser.

[072] Ο fotobiorreator tubular utilizado foi do tipo air-lift. Ele é constituído de tubos transparentes de diâmetro interno de 1,0 cm. 0 volume total do sistema foi de 3,5 L e o volume iluminado correspondeu a 2,0 L, com fluxo da cultura de 40 ± 1 L h-1. A intensidade luminosa foi obtida, por meio de lâmpadas fluorescentes com valor em 120 μmol fótons m-2 s-1, controlada por um medidor de intensidade luminosa LICOR LI-250A (Lincoln, NE). A temperatura foi mantida em 32 ± 1 °C.

Resultados de concentração celular máxima (Xm) e produtividade em células (Px)

[073] A Figura 2 relaciona a concentração celular (X) do meio padrão com os meios modificados contendo extratos de chicória fresco e seco. Observou-se, que nos cultivos em que se adicionou o extrato de chicória fresco, houve um aumento na concentração celular máxima (Xm) em relação ao padrão Schlӧsser. Esta Figura permite observar que em ambos os extratos, o valor de Xm foi maior quando do uso de extrato de chicória, embora a diferença maior tenha ocorrido quando do uso de extrato de chicória fresco.

[074] Na Tabela 2 pode-se observar que o valor da concentração celular máxima (Xm) aumentou 52,9%, respectivamente, com adição de extrato de chicória fresca no meio padrão, quando comparadas com os resultados obtidos com o crescimento celular somente em meio padrão. Mesmo com o uso de extrato de chicória seca, ocorreu um aumento da concentração celular máxima em relação ao padrão, correspondendo a 16,1%. Esses resultados evidenciam o efeito positivo que houve ao adicionar o extrato de chicória no cultivo de A. platensis.

■ Cultivo de Dunaliella salina e Chlorella vulgaris com adição de extrato de bactéria Manutenção dos microrganimos e preparo do inoculo

[075] A bactéria Bacillus atrophaeus ATCC 9372 foi a cepa utilizada para o preparo de extrato. Manteve-se em solução de acetato de cálcio 0,02 M e hidróxido de cálcio 0,14% (p/v), em forma de suspensão matriz. O preparo do inóculo de B. atrophaeus ATCC 9372, sob condições assépticas, ocorreu em frascos Erlenmeyer com capacidade de 100 mL, adicionando-se 1mL da suspensão matriz em 99 mL de meio TSB, incubando-se a 37°C a 150 rpm por 24 horas. O crescimento foi acompanhado por contagem de colônias.

[076] A microalga Dunaliella salina foi mantida em meio liquido de cultivo padrão "f/2" (GUILLARD, R. R. L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. In: Culture of marine invertebrate animals, Smith W.L., Chanley M.H. (eds), p. 29-60, 1975). Para o preparo do meio "f/2", adicionou-se 1 mL de cada solução estoque de nutrientes (Tabela 3) através de um filtro de 0,22 μm em água do mar previamente autoclavada, em quantidade suficiente para preparo de 1 litro de meio. As soluções estoques de nutrientes foram preparadas com água deionizada. 0 inoculo de D. salina foi preparado sob condições assépticas. Repiques sucessivos das células foram realizados transferindo-se 10 mL de suspensão celular para frasco Erlenmeyer de 250 mL contendo 90 mL de meio "f/2", incubando as células a 25°C a 110 rpm, pH 7,0 ± 0,2 e intensidade luminosa de 80 (±10) μmol fótons m-2. s-1 por até 10 dias, quando foram coletadas para o preparo do inóculo dos cultivos, antes da estabilização do crescimento celular. O crescimento das microalgas foi acompanhado por contagem celular em câmara de Neubauer.

[077] A microalga Chlorella vulgaris foi mantida em meio líquido de cultivo padrão Bold (BISCHOFF, Harry William, BOLD, Harold C. Some Soil Algae from Enchanted Rock and Related Algal Species. Austin, Tex: University of Texas, Phycologlcal Studies, n. IV, 1963) (Tabela 4). Para o preparo do inoculo de C. vulgaris, repiques sucessivos das células foram realizados transferindo-se 10 mL de suspensão celular para frasco Erlenmeyer de 250 mL contendo 90 mL de meio Bold, incubando as células a 25°C a 110 rpm, pH= 7,3 ± 0,2 e intensidade luminosa de 80 (±10) μmol fótons m-2. s-1 por até 10 dias, quando foram coletadas para o preparo do inoculo dos cultivos sob condições assépticas, antes da estabilização do crescimento celular. O crescimento das microalgas foi acompanhado por medida de absorbância a 682 nm.

* Mix Vitaminas (mg L-1) : B12, 135/ B8, 25/ Bl, 1100.
** Solução de metais - PIV (mg L-1) : Na2EDTA, 750/ FeCl3.6H2O, 97/ MnCl2.4H2O, 41/ ZnCl2, 5/ CoCl2.6H2O, 2; Na2MoO4.2H2O, 4.

Experimentos realizados

[078] Para ambas as microalgas, foram realizados cultivos com seus respectivos meios padrão (meio "f/2" para D. salina e meio Bold para C. vulgaris) , bem como experimentos com os correspondentes meios padrão, adicionados de extrato da bactéria B. atrophaeus, de forma a se obter a concentração de 0,5% do extrato da bactéria nos meios resultantes (meios modificados). Os cultivos foram realizados, em triplicata, em frascos Erlenmeyer com capacidade total de 250 mL, com 100 mL de meio de cultivo. Os cultivos foram conduzidos a 25°C, com agitação de 110 rpm, pH= 7,0 ± 0,2, no caso da D. salina e pH= 7,3 ± 0,2 para C. vulgaris, com intensidade luminosa de 80 (±10) μmol fótons m-2. s-1 por até 26 dias. A concentração celular de D. salina foi acompanhada por número de células mL-1 por contagem em câmara de Neubauer e a concentração de C. vulgaris foi acompanhada por densidade óptica a 682 nm. A seguir é apresentado o detalhamento da obtenção do extrato da bactéria B. atrophaeus.

[079] Para obtenção da biomassa de B. atrophaeus, que foi a matéria-prima para o preparo dos extratos desta bactéria, inicialmente, foi realizado o cultivo dela em um biorreator Infors HT com capacidade de 10L, constituído por um agitador e chicanas, a 37° C por 12 horas em processo descontinuo alimentado. Ο inoculo de B. atrophaeus, obtido de acordo com o apresentado no item anterior, foi adicionado ao biorreator em meio padrão TSB, com concentração inicial de 2g.L-1. A temperatura do meio de cultivo foi mantida em 37 ± 1° C, com aeração de 0,2 vvm. Foi empregado o processo descontinuo alimentado, com alimentação de solução de glicose de concentração de 400 g L-1, com vazão de 60 mL.h-1 até a estabilização do crescimento celular. O valor Inicial de pH foi de 7,3 ± 0,2. Após o cultivo da bactéria, a biomassa foi centrifugada a 4000 rpm por 30 minutos e lavada com água destilada para a remoção dos sais. As células dessa suspensão foram rompidas com pérolas de 1 mm e agitação vigorosa por 50 minutos. Removeram-se as pérolas, e o liquido foi evaporado em estufa, e a biomassa foi triturada com auxilio do almofariz e pistilo. Esse material foi denominado extrato da bactéria.

Resultados dos crescimentos celulares das biomassas de microalgas

[080] A Figura 3 demonstra as curvas de crescimento de D. salina axênica no meio f/2 e no meio f/2 + E (extrato de B. atrophaeus ATCC 9372) . Observa-se que houve um aumento da biomassa quando se utilizou 0,5% de extrato de B. atrophaeus ATCC 9372 no meio de cultura (f/2 + E) , quando comparada ao melo de cultura padrão (f/2).

[081] A cepa D. salina axênica em meio de cultura com extrato bacterlano atingiu a concentração celular de 1,6 x 107 células.mL-1 com estabilização em 26 dias de cultivo, enquanto em meio de cultura padrão, a concentração máxima foi 1,1 x 106 células.mL-1 com estabilização da concentração celular em 7 dias, sendo que a concentração inicial de ambas foi de 1,8 x 105 células .mL-1.

[082] Na Figura 4, avaliaram-se os cultivos de D. salina xênica, em meio de cultura padrão (sem extrato bacteriano), sendo que o cultivo nessas condições, foi estabilizado em 5,0 x 106 células.mL-1 em 14 dias, e em meio modificado (0,5% de extrato bacteriano), observou-se que em 24 dias o cultivo ainda não havia estabilizado, resultando crescimento celular em 1,7 x 107 células.mL-1.

[083] Assim, independentemente de ser com D. salina axênica ou xênica, ao final do cultivo, a concentração celular de D. salina em meio modificado, com adição de extrato de bactéria, foi superior quando comparado com crescimento em meio padrão.

[084] Nos cultivos de C. vulgaris, na Figura 5, pode ser observado que houve maior aumento da concentração celular no meio modificado (Bold + extrato de B. atrophaeus ATCC 9372) em comparação ao crescimento em meio padrão (Bold) . Esse aumento pode ser justificado devido à essa espécie possuir a capacidade de crescimento heterotrófico, bem como da presença de nutrientes orgânicos no extrato, como vitaminas, que pode ter acelerado o crescimento celular. Os cultivos partiram de uma concentração celular correspondente à absorbância de 0,10 e houve a estabilização em 17 dias de cultivo em meio padrão, no qual a concentração de biomassa foi correspondente à absorbância de 3,02, e no meio modificado a concentração celular correspondeu ã absorbância de 7,12 em 24 dias de cultivo. De fato, na Figura 6 fica evidente a diferença de coloração, onde o tom mais escuro indica maior concentração celular de C. vulgaris cultivada em meio com extrato bacteriano (A) em comparação ao meio padrão (B).

[085] Embora a invenção tenha sido amplamente descrita, é óbvio para aqueles versados na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas sem que as referidas alterações não estejam cobertas pelo escopo da invenção.

Claims (39)

1. Processo para obtenção de extratos promotores do crescimento microbiano a partir de plantas e/ou suas partes caraterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

   • (a) Trituração das plantas e/ou suas partes;
   • (b) Hidrólise química e/ou enzimática; e
   • (c) Extração.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as plantas e/ou suas partes são selecionadas do grupo consistindo principalmente em raízes de chicória (Cichorium intybus), sisal (Agave), gengibre (Zingiber officinale), tubérculos, caules, folhas, flores, sementes e frutos.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (a) as partes das plantas secas ou in natura são reduzidas de tamanho principalmente por trituração, em moinho de bolas e/ou de facas e/ou de martelos e outro método de abrasão, diferentes granulometrias, com tamanhos de partícula preferencialmente menores que 10 mm, mais preferencialmente menores que 5 mm, mais preferencialmente ainda menores que 1 mm, com uso de solvente, em temperaturas de 10°C a 150°C, preferencialmente temperatura ambiente, de 5 minutos a 8 horas, preferencialmente menores que 4 horas, mais preferencialmente ainda menores que 2 horas.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que opcionalmente são utilizados métodos naturais e artificiais de secagem selecionados do grupo consistido principalmente em ventilação, baixa umidade, altas temperaturas, estufa de ventilação forçada, estufa convencional, camada delgada, e micro-ondas.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa (b) as plantas e/ou microrganismos são hidrolisados por processos químicos alcalinos ou ácidos e/ou pela ação de enzimas de degradação.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que as enzimas de degradação são selecionadas do grupo consistindo principalmente em celulases, pectinases, hemicelulases, xilanases e ligninases.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que para etapa (c) os solventes são selecionados do grupo consistindo principalmente em água, etanol, hexano, metanol, isopropanol, propanol, acetato de etila, acetona, éter etílico, ácido acético, bem como misturas desses solventes, em diferentes proporções, bases, ácidos, orgânicos e inorgânicos, preferencialmente água e etanol.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a proporção de sólido no solvente ser de 0,1% a 40%, preferencialmente menor que 30%, mais preferencialmente ainda menor que 20%.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a extração é realizada preferencialmente com agitação mecânica, em que a fração líquida, contendo os compostos extraídos do material particulado, é separada do material particulado, preferencialmente por sedimentação, filtração e centrifugação.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que, após a separação da fase liquida do material particulado, os materiais indesejáveis residuais, em suspensão ou solução, são eliminados principalmente por filtração, decantação, e centrifugação, preferencialmente por filtração e suas variações ultrafiltração e microfiltração.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o extrato é concentrado por processos de evaporação, com remoção parcial ou total do solvente, preferencialmente com uso de vácuo, e ser seco principalmente por processo de liofilização e secagem por atomização, preferencialmente secagem por atomização.
12. Processo para obtenção de extratos promotores do crescimento microbiano a partir do cultivo de microrganismos heterotróficos caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

    • (a) Separação das células;
    • (b) Secagem, opcionalmente;
    • (c) Extração de lipídeos;
    • (d) Ressuspensão;
    • (e) Rompimento Celular; e
    • (f) Hidrólise química e/ou enzimática.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os microrganismos heterotróficos são selecionados do grupo consistindo preferencialmente em bactérias, mais preferencialmente Bacillus spp., mais preferencialmente ainda Bacillus atrophaeus.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os microrganismos heterotróficos são cultivados preferencialmente em biorreator de mistura, biorreator tipo torre, e suas variações, por processos descontínuos, semicontínuos, contínuos e suas variações, e preferencialmente por descontínuos alimentados, em condições aeróbias ou anaeróbias, preferencialmente aeróbicas, preferencialmente em condições estéreis, em valores de pH de 2,5 a 11,0, preferencialmente com valores entre 5,5 a 8,5 mais preferencialmente na faixa de 6,0 a 8,0, em temperatura de cultivo de 20°C a 70°C, preferencialmente de 28°C a 40°C, mais preferencialmente ainda na faixa de 32°C a 38°C.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que os processos apresentam valores de aeração de 0,001 a 5 vvm, com concentração de oxigênio dissolvido de 0 a 7 mg/L, preferencialmente de 0,2 a 2,5 mg/L, mais preferencialmente ainda de 0,7 a 1,8 mg/L, em que as fontes de oxigênio são selecionadas do grupo consistindo em ar comprimido, oxigênio puro ou a mistura de gases, fornecidos na mesma linha ou em linhas separadas.
16. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o meio de cultivo apresenta uma salinidade na faixa de 0,0% a 5,0 %, preferencialmente 0,5% a 1, 0%.
17. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as fontes de carbono utilizadas no meio de cultivo são selecionadas do grupo principalmente dos óleos, açúcares, glicerol e polímeros consistindo em sacarose, glicose, frutose, glicerol, hidrolisados de amidos, hidrolisados de celulose, amido e outros polímeros fermentáveis, em concentrações de 50 mg/L a 250 g/L no biorreator.
18. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as fontes de nitrogênio utilizadas no meio de cultivo são selecionadas do grupo principalmente das fontes orgânicas e/ou inorgânicas consistindo em nitrato de amônio, sulfato de amônio, cloreto de amónio, amónia, hidróxido de amónio, nitrato de sódio, nitrato de potássio, ureia, hidrolisados proteicos de origem vegetal, animal e/ou microbiana, misturas de fontes de nitrogênio inorgânicas e/ou orgânicas.
19. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que na etapa (a) as células obtidas são separadas principalmente por centrifugação, floculação, microfiltração, filtração com ou sem uso de vácuo, filtração em tambor à vácuo, preferencialmente por centrifugação em uma faixa de 2500 a 20000 rpm por até 60 minutos, preferencialmente a 4000 rpm por 30 minutos.
20. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que na etapa (d) as células provenientes do cultivo são ressuspensas principalmente em água, em soluções contendo sais, preferencialmente solução salina, em soluções tampão, em que o conteúdo lipídico, total ou parcialmente, são previamente removidos com uso de solventes selecionados do grupo consistindo principalmente em hexano, acetato de etila, acetona, etanol, metanol, propanol, isopropanol, butanol, éter etílico, éter de petróleo, ácido acético, puros ou em mistura, ou por meio de extração por fluido supercrítico.
21. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que na etapa (e) , as células são rompidas por processos mecânicos selecionados do grupo consistindo em abrasão por pérolas de vidro, de diferentes diâmetros, preferencialmente rompimento em reatores ou moinhos de bolas, com esferas de cerâmica, vidro, aço inoxidável, ligas de alta dureza, principalmente zircônio, titânio, e silício, rompimento por ultrassom, em um único ciclo ou em ciclos repetitivos, com homogeneizador de elevada pressão por operação descontinua ou continua em ampla faixa de pressão, preferencialmente a 250 Mpa.
22. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que na etapa (e), as células são rompidas ainda por processos físicos selecionados do grupo consistindo em métodos com variação de temperatura, preferencialmente, congelamento e descongelamento realizados, no intervalo de 100 °C a -18 °C, mais preferencialmente entre 70 °C e -5 °C, mais preferencialmente ainda entre 37 °C e 0 °C, preferencialmente com ciclos de repetições.
23. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que na etapa (e), as células são rompidas ainda por processos químicos selecionados do grupo consistindo principalmente em tratamento da biomassa com álcalis, detergentes e enzimas.
24. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que na etapa (f), as enzimas de degradação são selecionadas do grupo consistindo principalmente em pectinases, xilanases, quitinases, zimolase, celulases, glucanases, manases e lisozima.
25. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 24, caracterizado pelo fato de que os materiais indesejáveis residuais, em suspensão ou solução são eliminados principalmente por filtração, decantação, e centrifugação, preferencialmente por filtração e suas variações ultrafiltração e microfiltração.
26. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 25, caracterizado pelo fato de que o extrato é concentrado por processos de evaporação.
27. Extratos promotores de crescimento microbiano obtidos conforme os processos definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizados pelo fato de que são selecionados do grupo das biomoléculas consistindo principalmente em oligossacarídeos, preferencialmente, galacto-oligossacarídeo (GOS), isomalto-oligossacarídeo (IMO), oligossacarídeos da soja, xilo-oligossacarídeos (XOS), fruto-oligossacarídeos (FOS), mais preferencialmente a inulina, elementos minerais, sais, vitaminas, peptideoglicanos, aminoácidos, e peptídeos.
28. Extratos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que são secos principalmente por aquecimento em estufa de secagem, túneis de secagem, esteira de secagem, em sistema corrente e/ou contracorrente, utilizando além do ar, gases inertes e vapor superaquecido, por liofilização, secagem por aspersão ou atomização, secadores à vácuo com calor fornecido ao material por condução através do aquecimento dos suportes ou radiação.
29. Extratos, de acordo com a reivindicação 27, caracterizados pelo fato de que na forma liquida são esterilizados de forma descontinua ou continua, principalmente pelos métodos HTST e por microfiltração, preferencialmente pelo método HTST, a 145 °C por 3 segundos.
30. Processo para obtenção de biomassa de microrganismos fotossintetizantes utilizando os extratos promotores de crescimento conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

    • (a) Secagem;
    • (b) Armazenamento;
    • (c) Concentração;
    • (d) Separação de frações;
    • (e) Concentração/Secagem;
    • (f) Cultivo de microrganismos fotossintetizantes; e
    • (g) Separação (Fase Líquida/Biomassa).
31. Processo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que os organismos fotossintetizantes são selecionados do grupo principalmente das classes Bacillariophyceae, Chlorophyceae, Chrysophyceae, Coccolithophyceae, Cyanophyceae, Euglenophyceae, Eustigmatophyceae, Labyrinthulomycetes, Prymnesiophyceae e Trebouxiophyceae consistindo principalmente em Arthrospira (Spirulina) sp., Synechocistis sp., Ankistrodesmus sp., Botryococcus sp., Scenedesmus sp., Chlorella sp., Dunaliella sp., Haematococcus pluvialis, Isochrysis galhana, Monoraphidium sp., Euglena gracilis, Nannochloropsis oculata, Navicula sp., Cryptomonas sp., Isochrysis sp., Schizochytrium sp. e Lagerheimia sp.
32. Processo, de acordo com a reinvindicação 30, caracterizado pelo fato de que as proporções dos extratos promotores de crescimento variarem entre 0,01 % a 99,99 %, e são preferencialmente adicionados separadamente no meio do cultivo em valores de 0,001% a 10%, mais preferencialmente, na faixa de 0,01% a 5%, mais preferencialmente ainda na faixa de 0,1% a 0,5%.
33. Processo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o cultivo dos microrganismos fotossintetizantes ocorre em reatores abertos ou fechados, com luz natural ou artificial, com diferentes sistemas de circulação de células, em temperaturas de 20 a 45°C, preferencialmente entre 25 a 32°C.
34. Processo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que os processos de cultivo empregados são semicontínuo, continuo, descontinuo e/ou descontinuo alimentado, em condições estéreis ou assépticas, em condições heterotróficas, mixotróficas ou fotoautotróficas.
35. Processo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o controle do pH é preferencialmente feito com adição de gás carbônico, com valores de pH variando de 4,0 a 11,0.
36. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 35, caracterizado pelo fato de que são obtidos ainda os metabólitos selecionados do grupo consistindo principalmente em ácidos nucleicos, proteinas, peptideos, aminoácidos, polissacarideos, pigmentos e ácidos graxos.
37. Biomassa de microrganismos fotossintetizantes obtido conforme o processo definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 36, caracterizada pelo fato de que compreende em relação á sua massa seca, de 1% a 20% de cinzas, 10% a 80% de proteínas, 10% a 60% de carboidratos e 10 a 80% de lipídios.
38. Biomassa, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o grau de purificação das moléculas a partir da biomassa microbiana ser de 5% a 100%, mais preferencialmente de 15 a 100%, mais preferencialmente ainda de 80 a 100%.
39. Uso da biomassa fotossintetizante conforme definida em qualquer uma das reivindicações 37 e 38, caracterizados pelo fato de ser principalmente para aplicações como nutracêuticos, matérias-primas das indústrias de alimentos, para uso humano ou animal, em indústrias de cosméticos, bem como em biofertilizantes, biossurfactantes, fitormõnios, biocombustíveis, biorremediação e geração de energia.

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