BR102017020787A2 - Processo de microencapsulação celular por alginato de sódio de leveduras do gênero candida para a produção de soforolipídeos - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se ao processo de imobilização celular por microencapsulação com alginato de sódio de leveduras do gênero candida para a produção de soforolipídeos que se destaca pela ampla aplicação industrial. o processo descrito contorna ou supera os fatores que impedem a redução de custos de produção de soforolipídeos com a utilização do bioprocesso de imobilização de células por microencapsulação em alginato de sódio.

Description

PROCESSO DE MICROENCAPSULAÇÃO CELULAR POR ALGINATO DE SÓDIO DE LEVEDURAS DO GÊNERO CANDIDA PARA A PRODUÇÃO DE SOFOROLIPÍDEOS

Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se ao processo de imobilização celular por microencapsulação com alginato de sódio de leveduras do gênero Candida para a produção de soforolipídeos que se destaca pela ampla aplicação industrial.

Antecedentes da Invenção [002] Os surfactantes são compostos anfipáticos ou anfifílicos constituídos de uma porção hidrofóbica/apolar e uma porção hidrofílica/polar, que permite que compostos apolares sejam solubilizados em solventes polares ou vice-versa (óleo/água ou água/óleo). Sua estrutura anfipática confere aos surfactantes diversas propriedades como detergentes, dispersantes, umectantes, espumantes, estabilizantes, emulsificantes, solubilizantes e lubrificantes (DESAI; BANAT, 1997; NITSCHKE; PASTORE, 2002; GAUTAM; TYAGI, 2006).

[003] Estes compostos podem ser utilizados em diversos setores como químico, têxtil, papel e celulose, cosméticos, farmacêutico, higiene pessoal, agrícola e alimentos. O mercado global de surfactantes é um dos maiores e de grande importância dentro da classe dos compostos químicos industriais (ABOULHASSAN et al., 2006; REZNIK et al., 2010). Esse mercado foi avaliado em US$30,65 bilhões em 2015, com um crescimento constante de 4,4% estimado chegar em 2024 ao valor de US$45,16 bilhões (ACMITE MARKET INTELLIGENCE, 2016; GRAND VIEW RESEARCH, 2016).

[004] Os surfactantes são produzidos pela indústria petroquímica e são produtos derivados da cadeia da produção do petróleo. Devido a grande utilização uma considerável quantidade de surfactantes é liberada no meio ambiente levando a problemas de poluição ambiental, devido a uma baixa taxa de biodegradação e uma alta toxicidade aquática (MANN; BIDWELL, 2001). Contudo, existe uma tendência mundial em substituir os surfactantes de origem

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2/9 petroquímica por surfactantes naturais, denominados como biossurfactantes. Esta tendência deve-se principalmente: (a) superioridade dos biossurfactantes devido as suas propriedades; (b) crescente preocupação ambiental, (c) leis ambientais mais severas e (d) utilização de recursos renováveis para a produção (DESAI; BANAT, 1997; NITSCHKE; PASTORE, 2003; BOGAERT, VAN et al., 2007).

[005] Os biossurfactantes são surfactantes naturais produzidos por microrganismos, que possuem propriedades muito semelhantes aos surfactantes de origem petroquímica e são superiores, especialmente, pela sua natureza ecológica e sustentável (NGUYEN et al., 2010; PENFOLD et al., 2011). Dentre os biossurfactantes os soforolipídeos são compostos por um dissacarídeo sefarose (2' -O-p-D-glicopiranosil-1-p-D-glicopiranose) unidos por ligação β-glicosídica a uma longa cadeia de ácido graxo (GORIN et al., 1961).

[006] Os soforolipídeos são um dos mais promissores biossurfactantes conhecidos e oferecem diversas vantagens sobre os surfactantes sintéticos ou de origem petroquímica como: estabilidade em uma ampla faixa de pH, temperatura e salinidade (CHANDRAN; DAS, 2012), baixa toxicidade, alta biodegrabilidade e aceitabilidade ecológica (BAEK et al., 2003; LI et al., 2012), podem ser produzidos em grandes quantidades (PEKIN et al., 2005), possuem baixa capacidade de formação de espuma e alta detergência que facilita a sua aplicação em diversas áreas (HIRATA et al., 2009) e podem ser produzidos a partir de recursos renováveis (ZHOU; KOSARIC, 1995) ou resíduos industriais (ASHBY et al., 2005).

[007] Encontram aplicações em diversas áreas como: Agricultura (YOO et al., 2005), alimentos (YUAN et al., 2012), biomédica (HARDIN et al., 2007), biorremediação (KANG et al., 2010), cosméticos (NGUYEN; SABATINI, 2011) e indústria petrolífera (ELSHAFIE et al., 2013).

[008] Apesar das inúmeras vantagens e aplicações que os soforolipídeos possuem sobre os surfactantes sintéticos, a produção em larga escala e o processo de separação/purificação são fatores que elevam os custos e são um grande obstáculo para os soforolipídeos tornarem-se competitivos economicamente perante os surfactantes (SAHARAN et al., 2011). Para

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3/9 diminuir os custos da produção em larga escala e da separação/purificação (downstream) diversas estratégias podem ser adotadas: (a) desenvolvimento de novos bioprocessos mais eficientes na produção, como a imobilização celular; (b) otimização do meio e condições de cultivo e (c) desenvolvimento de processos que otimizem a extração e purificação dos soforolipídeos, como é possível através da imobilização celular (NITSCHKE et al., 2004; MAKKAR et al., 2011; SAHARAN et al., 2011).

[009] Os bioprocessos para a produção desse biossurfactante vem como uma solução para transpor essas dificuldades. O processo de fermentação microbiana pode gerar o produto em composição e quantidade desejada. Assim os processos fermentativos tipo batelada, batelada alimentada e contínua, podem ser propostos para uma eficiente produção de soforolipídeos. A produção em batelada em frascos agitados (shake flasks) vem sendo utilizada para a produção em pequena escala, ideal para estudos iniciais de produção (DAVEREY et al., 2009; KIM et al., 2009).

[010] Após os estudos iniciais de produção, maiores volumes são utilizados assim os biorreatores de bancada e de maiores volumes são testados (OTTO et al., 1999; SHAH et al., 2009). Existem produções descritas na literatura em biorreator de bancada e trabalhando na forma de batelada alimentada (RAU et al., 2001; KIM et al., 2009), onde ocorre adição controlada de substratos que previne o efeito inibitório dos substratos no crescimento celular e na produção dos soforolipídeos (RAU et al., 1996).

[011] Para a produção de soforolipídeos, alguns fatores são limitantes para a redução de custos: (a) necessidade da obtenção de uma alta concentração de células para o inóculo do processo fermentativo (CASAS et al., 1997); (b) a produção utilizando células livres aumenta os custos de manutenção dos equipamentos (reatores) devido a adesão de células em eletrodos/sensores e normalmente ocorrem obstrução de dutos nestes equipamentos (KITAMOTO et al., 1992, 2002; IMURA et al., 2013); (c) os processos de produção e separação dos soforolipídeos não são integrados (PALME et al., 2010); (d) o acúmulo de soforolipídeos e outros metabólitos no meio de fermentação,

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4/9 durante a produção promove um efeito inibitório e tóxico para os microrganismos (PALME et al., 2010).

[012] Considerando as dificuldades de produção de soforolipídeos com células livres a imobilização celular ou microencapsulação surge como uma alternativa viável para otimizar a produção. A imobilização celular compreende o confinamento de células microbianas (por exemplo leveduras do gênero Candida) dentro de uma determinada matriz (alginato de cálcio) preservando suas atividades metabólicas e capacidade fermentativa (KAREL et al., 1985).

[013] Esta técnica oferece diversas vantagens sobre a fermentação com células livres como: (a) aumento da produtividade, uma vez que a maior concentração de células microbianas imobilizadas permite uma maior eficiência na síntese de metabólitos; (b) redução de custos de manutenção dos equipamentos (reatores) pois não ocorrem os problemas de adesão de células aos eletrodos/sensores e obstrução de sensores; (c) simplifica e reduz os custos no processo de separação dos soforolipídeos (“downstream”), pois as esferas contendo as células imobilizadas são separadas por processos mais simples e de baixo custo; (d) as esferas com as células imobilizadas podem ser reutilizadas (ciclos de reutilização) diminuindo os custos com relação a obtenção de novas células (inoculo) que é necessário no processo de produção por células livres; (f) as células imobilizadas estão protegidas em um microambiente contra metabólitos tóxicos, inibição pelos produtos formados e as altas concentrações de substratos presentes no meio necessários para a síntese de soforolipídeos (DEVI; SRIDHAR, 2000; KOURKOUTAS et al., 2004; ZHOU et al., 2009; ZHAO; XIA, 2010).

[014] Portanto, os fatores que impedem a redução de custos de produção de soforolipídeos (obtenção de altas concentrações de células para a obtenção de inoculo, custos de manutenção mais elevados de equipamentos provocados pelas células livres e efeito inibitório na produção por metabólitos, altas concentrações de substratos e inibição pelos produtos sintetizados) podem ser contornados e ou superados com a utilização do bioprocesso de imobilização de células por microencapsulação em alginato de cálcio.

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5/9 [015] A patente BR 10 2015 001684-0, intitulada “Processo de imobilização da levedura Sacharomyces cerevisiae e esponja polimérica obtida a partir deste processo”, descreve o processo de imobilização da levedura Saccharomyces cerevisae em suporte de quitosana, carboximetilcelulose e alginato através de liofilização para a formação da esponja polimérica, com a finalidade de produção de etanol.

[016] A invenção PI 0905590-8, intitulada “Processo industrial de imobilização de um consórcio de microrganismos presentes no Kefir biologicus, bem como de seus bioativos, por meio da formação de microcápsulas de alginato de cálcio modificado”, descreve um método para imobilizar os microrganismos presentes no kefir utilizando alginato de cálcio com a finalidade de conservar o microrganismo para aumentar o período de validade e sua aplicação em cosméticos e alimentos.

[017] A patente BR 11 2017 013934-0, intitulado “Método para imobilização de um oligonucleotídeo identificado em um substrato polimérico não modificado, métodos para imobilização de uma molécula de interesse em um substrato polimérico não modificado, não modificado por dessorção, micromatrizes, e kit de diagnóstico”, descreve o método de imobilização de oligonucleotídeo por substrato polimérico.

[018] A patente BR 10 2015 020148-6, intitulada “Processo de obtenção de um suporte sólido para imobilização de enzimas, suporte sólido de fibra de coco verde, processo de imobilização de enzimas e derivado obtido”, descreve o método de imobilização de enzimas em outro tipo de suporte.

[019] A patente BR 11 2015 025912-0, intitulado “Processo de imobilização para obter um inoculante biológico estimulador do crescimento vegetal, suporte de teca, e, inoculante biológico estimulador de crescimento”, descreve o método de imobilização de um inoculante biológico.

[020] A patente BR 11 2016 015450-9 intitulada “Processo para produção de um biofertilizador compreendendo os passos de fermentação do estado sólido, imobilização através das nanopartículas de alófano e uma segunda

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6/9 fermentação; e o dito biofertilizador”, descreve o método de imobilização de um consórcio de microrganismos em alófano para a produção de um biofertilizador.

[021] A patente BR 10 2012 23115-8 intitulada “Processo de obtenção de um biossurfactante produzido por cândida guilliermondi”, descreve a produção de um biossurfactante por células livres utilizando óleo vegetal residual de fritura, resíduo de cana de açúcar e resíduo de refinaria de milho.

[022] A patente BR 10 2013 012754-0 intitulado “Reação do biossurfactante conhecido como ramnolipídeos derivado de uma fermentação biológica com microrganismo, mais hidróxido de sódio gerando um biossurfactante modificado (sal do biossurfactante mais água)”, refere-se a produção de biossurfactante ramnolipídeos por outro organismo.

[023] A patente BR 11 2015 009139-3 intitulado “Processo de produção de soforose a partir de soforolipídeos”, refere-se a utilização de soforolipídeos para a produção de soforose através de reação química e não por microrganismos.

[024] A invenção ES 2297516T3 intitulado “Método in vitro/in vivo para el cultivo de células de tejudo conjuntivo o células precursoras de lãs mismas, que comprende la etapa de poner em contacto dichas células com uma matriz que comprende alginato polisulfatado”, refere-se a imobilização de células do tecido conjuntivo para reparo de cartilagem.

[025] A patente WO1996034840A1 intitulado “Fertilizante bacteriano y procedimento de obtencion”, refere-se a imobilização do microrganismo Azotobacter vinelandii em suporte de alginato para a produção de um biofertilizante.

[026] Concluiu-se por meio da busca de anterioridade que, não há patentes que descrevam a imobilização de leveduras Candida para a produção de soforolipídeos (biosurfactantes) por células imobilizadas. A invenção aqui proposta apresenta elevada importância para a produção de soforolipídeos. A imobilização permite o reaproveitamento das células para a produção dos soforolipídeos, diminui os custos relativos a fase de obtenção de inoculo, e os custos de manutenção de equipamentos.

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V*

Sumário da Invenção [027] A presente invenção descreve um processo de produção de soforolipídeos por meio de imobilização celular por microencapsulação com alginato de sódio de leveduras do gênero Candida. O processo descrito contorna ou supera os fatores que impedem a redução de custos de produção de soforolipídeos com a utilização do bioprocesso de imobilização de células por microencapsulação em alginato de sódio.

Descrição Detalhada da Invenção [028] O referido invento consiste na microencapsulação de leveduras do gênero Candida em matriz de alginato de cálcio para a produção de soforolipídeos. A etapa inicial do invento consiste na dissolução do alginato de sódio na concentração de 2 a 3% (massa/volume), após a dissolução a solução deve ser autoclavada por 10 minutos e deixada em repouso por 24 horas a 4°C. As células de leveduras do gênero Candida utilizadas no processo de imobilização são obtidas por fermentação em frascos agitados em meio contendo em g/L: 100 de glicose, 100 de óleo de girassol e 5 de extrato de levedura, incubadas a 30°C por 48 horas. Ao final a biomassa obtida deve ser centrifugada e lavada com solução de cloreto de sódio (0,9%) por três vezes (CIANI et al., 2015).

[029] A biomassa lavada em uma concentração entre 2 a 5% (biomassa/volume de alginato) é misturada com a solução alginato de sódio (FIG 1a). A suspensão obtida é bombeada por uma bomba peristáltica (FIG 1b) gotejada em uma solução de cloreto de cálcio (CaCl2) na concentração entre 0,1 e 0,3 mol/L (FIG 1c). A polimerização ocorre pela troca dos íons sódio pelos íons cálcio (FIG 1d), as esferas permanecem 24 horas na solução de CaCl₂ até completa polimerização (FIG 1e). As células microencapsuladas foram utilizadas para o processo de fermentação (produção) (FIG 2) de soforolipídeos no meio de fermentação g/L: 100 de glicose, 100 de óleo de girassol, 0,1 de extrato de levedura e uma combinação de sais. Os parâmetros avaliados foram produção de soforolipídeos (P) e eficiência de imobilização (Yi). Para a produção de soforolipídeos o meio de fermentação e as células microencapsuladas (FIG 2a) foram incubadas sob agitação a 200 rpm com temperatura mantida a 30°C por um período de 120 horas (FIG 2B).

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8/9 [030] A composição do meio de fermentação foi avaliado pela influência da suplementação de sais ao meio de fermentação para a produção de soforolipídeos por células imobilizadas, foram utilizados os sais K₂HPO₄, CaCl₂, MgSO4 e ZnSO4. O processo de produção de soforolipídeos foi realizado de acordo com o planejamento fatorial com quatro variáveis e dois níveis (fatorial 2⁴) totalizando 16 ensaios (BOX et al., 2005). A Tabela 1 mostra o delineamento fatorial com os níveis das variáveis com seus valores decodificados e os resultados obtidos na eficiência de imobilização (Yi) e produção de soforolipídeos (P).

[031] Ao final de 120 horas o processo foi interrompido (FIG 3a) através da separação das esferas com células imobilizadas por tamização (FIG 3b). Estas esferas também podem ser transferidas para um novo meio de fermentação (FIG 3d) e serem reutilizados em um novo processo fermentativo (FIG 3e) (a reutilização pode ser realizada por até 4 ciclos). Através da dissolução das esferas com citrato de sódio 5% e quantificação das células contidas nas esferas pode ser calculado a eficiência de imobilização (Yi), que representa a porcentagem de células que se encontram retidas no suporte (FIG 3c). Quanto maior o valor, mais eficiente é o processo de microencapsulação (RAZMOVSKI; VUCUROVIC, 2012).

[032] O sobrenadante do meio de fermentação é adicionado ao funil de separação com acetato de etila na proporção de (1:1) para extração do soforolipídeo. A fase apolar do funil (que contém o soforolipídeos extraídos) é submetido a rotaevaporação (FIG 3h). A fração retida no processo de rotaevaporação é dissolvida com uma mistura de hexano e metanol:H2O contendo os soforolipídeos é evaporado em estufa a 80°C e os soforolipídeos obtidos (produção de soforolipídeos (P) são quantificados por gravimetria (FIG 3j) (LANGER et al., 2006; PALME et al., 2010).

[033] Para a variável eficiência de imobilização (Yi %), a análise de variância (Tabela 2) mostra que para um nível de confiança de 95% somente o fator CaCl2 foi significativo para a eficiência de imobilização ativa. O coeficiente de determinação para a eficiência de imobilização (R²) foi de 0,9735997, indicando que 97,36% da variância obtida pode ser explicada pelo modelo utilizado. Para

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9/9 a variável produção de soforolipídeos (P) a análise de variância (Tabela 3) mostra que para um nível de confiança de 95%, somente o fator K₂HPO₄ foi significante. Os sais testados não apresentaram interações significativas. O coeficiente de determinação calculado R² foi de 0,98367, indicando que 98,347% da variação pode ser explicada pelo modelo utilizado.

[034] O meio de fermentação para a produção de soforolipídeos portanto deve ser constituído de Glicose, Óleo de Girassol, Extrato de Levedura, CaCl2 e K2HPO4.

Legenda das Figuras

Figura 1 Processo de imobilização celular por microencapsulação de leveduras do gênero Candida para a produção de soforolipídeos.

Figura 2 Processo de fermentação por células imobilizadas em alginato de cálcio (FIG. 1a) em shaker orbital a 30°C, 200 rpm por 120 horas (FIG 2b).

Figura 3 Processo de reutilização das células imobilizadas, quantificação da eficiência de imobilização (Yi) e produção de soforolipídeos (P).

Claims (2)

REIVINDICAÇÕES

1. PROCESSO DE MICROENCAPSULAÇÃO CELULAR POR ALGINATO DE SÓDIO DE LEVEDURAS DO GÊNERO CANDIDA PARA A PRODUÇÃO DE SOFOROLIPÍDEOS, caracterizada por referir-se a microencapsulação de leveduras do gênero Candida em matriz de alginato de cálcio para a produção de soforolipídeos; o processo se inicia com a dissolução do alginato de sódio na concentração de 2 a 3% (massa/volume); após a dissolução, a solução deve ser autoclavada por 10 minutos e deixada em repouso por 24 horas a 4°C; A biomassa de leveduras do gênero Candida, lavada é misturada com a solução alginato de sódio em uma concentração entre 2 a 5% (biomassa/volume de alginato) (FIG 1a); A suspensão obtida é bombeada por uma bomba peristáltica (FIG 1b) gotejada em uma solução de cloreto de cálcio (CaCl₂) na concentração entre 0,1 e 0,3 mol/L (FIG1c); A polimerização ocorre pela troca dos íons sódio pelos íons cálcio (FIG 1d), as esferas permanecem 24 horas na solução de CaCl2 até completa polimerização (FIG 1e)

2. PROCESSO DE SÍNTESE DE SOFOROLIPÍDEOS POR CÉLULAS IMOBILIZADAS DE LEVEDURAS DO GENERO CANDIDA IMOBILIZADA EM ALGINATO DE SÓDIO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por, para que a produção de soforolipídeos por células microencapsuladas ocorra, as microcápsulas devem ser adicionadas na proporção entre 5 a 10% (volume microcápsulas /volume meio de fermentação), incubadas sob agitação continua em temperatura entre 25 e 30 ^oC, e utilizado o meio de fermentação (FIG 2) com a seguinte composição em g/L: 100 de glicose, 100 de óleo de girassol, 0,1 de extrato de levedura, 3,5 de K2HPO4 e 2,5 CaCl2