CN108251464A - 利用微生物发酵产生油脂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用微生物发酵产生油脂的方法，该方法包括如下步骤：对产油微生物的种子液进行发酵培养，至对数生长期时投加表面活性剂，继续培养至稳定期，得到发酵液；离心发酵液，分别收集上清液和沉淀物；从上清液中提取出油脂，以及破碎沉淀物并提取油脂。本发明的产油微生物以乙酸作为碳源，并通过添加表面活性剂促进产油微生物从细胞内分泌油脂到细胞外的方法，提高了细胞外油脂产量及总的油脂产量，同时简化了油脂提取过程，不仅降低了微生物油脂的生产成本，而且还减少了微生物油脂提取过程中的能量消耗，为其规模化生产提供新的途径，具有较大的应用前景。

Description

利用微生物发酵产生油脂的方法
技术领域
本发明属于微生物油脂合成技术领域，具体涉及一种利用微生物发酵产生油脂的方法。
背景技术
生物柴油因其具有可再生性、能量密度高和易生物降解等优势，被认为是化石柴油的潜在替代品，而微生物油脂可以用作生物柴油的生产原料，替代植物油脂(大豆、玉米)和动物油脂等油脂。微生物油脂的生产过程主要包括微生物的培养和油脂提取，前期的微生物培养过程主要受碳源价格限制造成培养成本增加，后期的油脂提取过程的消耗约占生物柴油生产总成本的40％。研究发现在产油酵母菌的细胞被破坏后加入高浓度的非离子型表面活性剂(Triton X‐100、Brij 58)等可促进真菌分泌脂肪酸至胞外(Tamano,K.，Miura,A.，Koike,H.High‐efficiency extracellular release of free fatty acids fromAspergillus oryzae using non‐ionic surfactants.J.Biotechnol,2017,248,9‐14)。近年来有学者通过基因改造的方式促进产油酵母菌分泌细胞外游离脂肪酸，也有主要通过改变培养条件促进酵母菌利用有机碳源合成油脂，如采用序批式培养方式、提高培养基的C/N以及调节培养基的pH值等。另外，也有研究者发现通过加入阴离子型表面活性剂，如油酸钾和硬脂酸钠，可提高酵母菌胞内油脂含量。
因此，寻求一种高效且低能耗的微生物油脂的生产方式具有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术中微生物油脂提取过程能耗大和成本高的不足，目的是提供一种利用微生物发酵产生油脂的方法。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种利用微生物发酵产生油脂的方法，其包括如下步骤：
(1)、对产油微生物的种子液进行发酵培养，至对数生长期(OD600≈10‐12)时投加表面活性剂，继续培养至稳定期，得到发酵液；
(2)、离心发酵液，分别收集上清液和沉淀物；
(3)、从上清液中提取出油脂，以及破碎沉淀物并提取油脂。
在步骤(1)中，表面活性剂为聚氧乙烯醚(Brij58)，投加量为0.1‐1.0g/L。
在步骤(1)中，产油微生物为能够利用乙酸产油脂的酵母菌。
步骤(1)中的发酵培养包括：将经过第一培养基的产油微生物的种子液以体积比5‐10％接种至第二培养基中进行发酵培养。
其中，第一培养基(即YPD培养基)包括如下成分：1±0.2g葡萄糖、0.5±0.3g鱼粉蛋白胨和0.5±0.3g酵母提取物。
第二培养基为液体培养基；液体培养基包括：20±10g/L乙酸、0.5827±0.0005g/L酵母提取物、0.0777±0.0002g/L硫酸铵、0.4±0.1g/L磷酸二氢钾和1.5±0.3g/L七水硫酸镁。
实际上，液体培养基的转速为150‐200rpm。
液体培养基中初始pH值为7.0±0.5，温度为29.5‐30.5℃；碳氮比(C/N)为(100±15):1。
在步骤(2)中，离心力为4000±200×g，离心的时间为5±10min。
在步骤(3)中，沉淀物中油脂的提取过程为：离心后收集沉淀物，并用生理盐水进行清洗；破碎沉淀物中的微生物细胞，并结合有机溶剂萃取从而提取出油脂。
在步骤(3)中，上清液中油脂的提取的过程为：将上清液用有机溶剂萃取后得到下层液；用0.15±0.5wt％的氯化钠溶液对下层液进行清洗，氮吹得到油脂。
其中，有机溶剂为甲醇、氯仿以体积比1:1‐1:1.5的混合液。
在步骤(3)中，油脂包括油酸、棕榈酸、亚油酸和硬脂酸。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
第一、本发明采用乙酸作为发酵培养基的碳源，其与以葡萄糖等糖类物质作为碳源相比，不仅降低了发酵培养过程中的碳源成本，而且还提高了碳源的转化率和油脂的含量，从而解决了产油微生物的培养过程中由于碳源价格受到限制的问题。
第二、本发明在发酵培养过程中添加表面活性剂进行油脂提取的方法，相比与目前的油脂提取方法(物理破碎和有机溶剂萃取相结合)，其能量输入较小，不仅简化了油脂提取过程，而且还降低了微生物油脂的提取成本，为未来微生物油脂的规模化生产提供可能性。
总之，本发明的产油微生物以乙酸作为碳源，并通过添加表面活性剂促进产油微生物从细胞内分泌油脂到细胞外的方法，提高了细胞外油脂产量及总的油脂产量，同时简化了油脂提取过程，不仅降低了微生物油脂的生产成本，而且还减少了微生物油脂提取过程中的能量消耗，为其规模化生产提供新的途径，具有较大的应用前景。
附图说明
图1为本发明的实施例和对比例中酵母菌在发酵培养过程中添加不同浓度的表面活性剂的胞内油脂产量、胞外油脂产量和油脂含量的示意图。
图2为本发明的实施例和对比例中酵母菌在发酵培养过程中添加不同浓度的表面活性剂的碳源转化率和油脂总产量的示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种利用微生物发酵产生油脂的方法。
本发明的实施例和对比例中的产油微生物均采用能够利用乙酸产油脂的酵母菌，具体为Cryptococcus curvatus MUCL 29819，购买于日本技术与评估国家研究所生物资源中心(Biological Resource Center,National Institute of Technology andEvaluation,Tokyo,Japan)。
本发明的实施例和对比例中的酵母菌的种子培养过程为：
将保藏的酵母菌的菌种在麦芽汁琼脂平板上活化后接种至50mL的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(即：YPD培养基)内，并在250mL锥形瓶中富集培养36h，培养温度为30℃，转速为200rpm。
其中，YPD培养基中含有1g葡萄糖、0.5g鱼粉蛋白胨和0.5g酵母提取物(YE)，初始pH值为6.0。
本发明的实施例和对比例的发酵培养过程中液体培养基为：
液体培养基含有20g/L乙酸、0.5827g/L酵母提取物(YE)、0.0777g/L硫酸铵((NH4)2SO4)、0.4g/L磷酸二氢钾(KH2PO4)和1.5g/L七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)，初始pH值为7.0。
<利用微生物发酵产生油脂的方法>
利用微生物发酵产生油脂的方法包括如下步骤：
(1)、将产油微生物的菌种在第一培养基(即YPD培养基)中进行培养，得到产油微生物的种子液；
(2)、将产油微生物的种子液接种至第二培养基(即液体培养基)中进行发酵培养，定期监测培养过程中产油微生物的生长情况；
(3)、待发酵培养过程至对数生长期OD600≈10‐12(即发酵培养两天后)时，在液体培养基内投加表面活性剂继续培养至稳定期，即产油微生物不再生长时结束培养，得到发酵液；
(4)、发酵培养结束后，离心发酵液并分别收集浑浊的上清液和沉淀物；
(5)、从上清液中提取出油脂，以及破碎沉淀物并提取油脂。
在步骤(2)中，产油微生物的种子液的体积比可以为5‐10％，优选为5％。
其中，产油微生物的种子液的体积比即为在发酵培养过程中，产油微生物的种子液在液体培养基中所占的体积。
产油微生物主要包括酵母菌、真菌和藻类为主的真核微生物及以细菌为主的原核微生物，本发明优选酵母菌作为产油微生物。
实际上，酵母菌利用有机废弃物的水解产物如挥发性混合脂肪酸等积累的油脂进行培养，从而降低了培养成本。
在步骤(2)中，产油微生物在发酵培养过程中，在氮磷限制条件下，可以利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源。Huang等发现在以20g/L葡萄糖和20g/L乙酸溶液(碳氮比为200)分别培养产油酵母菌的过程中，葡萄糖中每克碳转化0.145g油脂(即碳源转化率为0.145g/g碳)，此时酵母菌中油脂的含量为13.7％；乙酸中每克碳转化0.187g油脂(即碳源转化率为0.187g/g碳)，此时酵母菌中油脂的含量为23.5％(Huang,X.F.,Liu,J.N.,Lu,L.J..Culture strategies for lipid production using acetic acid assole carbon source by Rhodosporidium toruloides.Bioresour.Technol.2016,206,141‐9)；另外，本发明也以40g/L葡萄糖和40g/L乙酸溶液分别培养产油酵母菌，以乙酸溶液培养的产油酵母菌中油脂的含量为74.1％，以葡萄糖培养的产油酵母菌中油脂的含量为41.5％，前者(乙酸溶液)的油脂含量是后者(葡萄糖)的油脂含量的1.8倍。因此，与葡萄糖等易于被大多数产油微生物利用的碳源相比，产油酵母菌利用乙酸作为碳源的转化效率较高，并可获得的油脂含量较高；另外，乙酸属于廉价碳源，从而大大降低了培养成本。因此，本发明优选乙酸作为碳源。
步骤(2)中的发酵培养在有氧环境的液体培养基中进行，液体培养基包括如下成分：乙酸、酵母提取物、硫酸铵((NH4)2SO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)和七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)，其中，发酵培养的方式为批示培养，液体培养基需灭菌后备用。
实际上，液体培养基的转速可以为150‐200rpm，优选为200rpm；液体培养基中初始pH值可以为7.0±0.5，优选为7.0；温度可以为29.5‐30.5℃，优选为30.5℃；碳氮比(C/N)可以为(100±15):1，优选为100:1。
在步骤(3)中，表面活性剂为聚氧乙烯醚(Brij58)，投加量可以为0.1‐1.0g/L，优选为0.1g/L；投加时间为发酵培养2天后。
其中，投加表面活性剂的原理为：表面活性剂与细胞膜磷脂分子相似，具有极性头和非极性尾部，二者可发生替代、“互溶”等作用，从而改变细胞膜的结构及功能，影响物质的跨膜传输及胞内降解等行为。随着表面活性剂的加入，表面活性剂可以通过形成膜脂的胶束并在微生物的细胞膜上形成孔道从而提高细胞膜的通透性，影响微生物的代谢过程，促进细胞内的代谢产物分泌到细胞外，如柠檬酸、脂肪酸等，然后直接采用有机溶剂进行萃取，从而减少物理预处理的能量输入。当表面活性剂浓度升高至溶菌浓度(即细胞壁浓度)时，其逐步将细胞膜磷脂分子增溶至液相，形成混合胶束，使得原始细胞膜逐步收缩至消失，进而破坏细胞的活性，对微生物有致死作用，从而不能将油脂不断地积累起来。表面活性剂对细胞膜的作用大小取决于表面活性剂与磷脂的相对浓度，因此，表面活性剂的溶菌浓度与菌株、表面活性剂的种类相关。例如，当非离子型表面活性剂PEG‐200的投加量为0‐0.5g/L时，对产油酵母菌T.fermentants的生长抑制作用随浓度的增加而增加，而对产油酵母菌T.cutaneum没有明显的影响。
本发明的表面活性剂优选为非离子型表面活性剂聚氧乙烯醚(Brij58)的原因是：非离子型表面活性剂聚氧乙烯醚(Brij58)的亲水基为羟基，亲油基为碳氢链，亲水基和亲油基以醚键结合，当聚氧乙烯醚(Brij58)的浓度为0.08mmol/L时，细胞膜的表面排满一层定向排列的单分子膜，从而形成碳氢链向内，羟基向外的分子缔合体，即胶束，此时临界胶束浓度为0.08mmol/L，随着聚氧乙烯醚(Brij58)浓度的不断增大至溶菌浓度前，非离子型表面活性剂聚氧乙烯醚(Brij58)与酵母菌细胞膜的磷脂分子发生替代或嵌入其中，形成膜脂胶束，从而改变酵母菌细胞膜的通透性，促使细胞内的油脂溢出至细胞外，进而提高细胞外油脂的产量及油脂总产量。另外，本发明加入1.0g/L聚氧乙烯醚(Brij58)时，外溢的油脂比例最高达到46.6％，而加入相同浓度的茶皂素、曲拉通‐100等表面活性剂时，外溢的油脂比例分别为19.2％、13.2％，因此，聚氧乙烯醚促进油脂外溢的效果显著；同时，随着外溢的油脂比例的提高，碳源向油脂的转化效率也有所提高，即加入1.0g/L聚氧乙烯醚时，碳源转化率为0.54g/g碳，而加入相同浓度的茶皂素、曲拉通‐100等表面活性剂时，碳源转化率分别为0.35g/g碳、0.39g/g碳，因此，本发明采用聚氧乙烯醚作为表面活性剂，其提高外溢油脂的比例和碳源转化率的效果均显著。
而本发明采用在发酵培养的过程中(即对数生长期)添加0.1‐1g/L的表面活性剂的方法来提高产油酵母菌的油脂产量。原因是：由于表面活性剂与细胞膜磷脂分子相似，可发生替代作用，因此，当表面活性剂存在时会“攻击”细胞膜，影响物质的传输与代谢，从而影响细胞活性。当酵母菌处于对数生长期时，生长活性较高，对外界不利环境的耐受性较好，此时加入表面活性剂可减少其对酵母菌生长活性的影响，同时提高细胞膜的通透性，使产油酵母菌在将油脂从细胞内分泌至细胞外时仍能保持其细胞活性，作为“产油工厂”来不断积累油脂。
在步骤(4)中，离心力可以为4000±200×g，优选为4000×g；离心的时间可以为5±10min，优选为5min。
在步骤(5)中，上清液中油脂的提取的过程为：在分液漏斗内用有机溶剂萃取上清液，得到第一下层液并倒出；在倒出第一下层液的分液漏斗内加入有机溶剂再次进行萃取，得到第二下层液；将第一下层液和第二下层液混合得到第一混合液，将第一混合液用0.15±0.5wt％的氯化钠溶液进行清洗，并离心得到第三下层液，氮吹第三下层液得到微生物油脂，即胞外油脂。
在步骤(5)中，沉淀物中油脂的提取的过程为用机械研磨破碎和有机溶剂萃取相结合的方法：即离心后收集沉淀物，并用生理盐水进行清洗；干燥沉淀物后，将沉淀物中的微生物细胞用玻璃珠以3500±200rpm的转速研磨10‐15s，然后将其置入分液漏斗内用有机溶剂进行萃取，得到第四下层液并倒出；在倒出第四下层液的分液漏斗内加入有机溶剂再次进行萃取，得到第五下层液；将第四下层液和第五下层液混合得到第二混合液，将第二混合液用0.15±0.5wt％的氯化钠溶液进行清洗，并离心得到第六下层液，氮吹第六下层液得到微生物油脂，即胞内油脂。
实际上，油脂包括油酸、棕榈酸、亚油酸和硬脂酸；油酸属于单不饱和脂肪酸，亚油酸属于多不饱和脂肪酸，硬脂酸和棕榈酸属于饱和脂肪酸。
其中，玻璃珠的直径可以为0.5±0.2mm，优选为0.5mm；转速优选为3500rpm，研磨的时间优选为10s。
有机溶剂可以为甲醇、氯仿以体积比1:1‐1:5的混合液，有机溶剂优选为甲醇、氯仿以体积比1:1的混合液。
以下结合附图所示实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：
本实施例的利用酵母菌发酵产生油脂的方法包括如下步骤：
(1)、将产油酵母菌的菌种在YPD培养基中进行培养，得到产油酵母菌的种子液；
(2)、将体积比5％的产油酵母菌的种子液接种至液体培养基中进行发酵培养，液体培养基的转速为200rpm，液体培养基中初始pH值为7.0，温度为30.5℃，碳氮比(C/N)为100：1，乙酸的质量浓度为20g/L；
(3)、待发酵培养过程至对数生长期OD600≈10‐12(即发酵培养两天后)时，在液体培养基内投加0.1g/L的Brij58(作为表面活性剂)后继续培养至稳定期，得到发酵液；
(4)、发酵培养结束后，离心发酵液并分别收集上清液和沉淀物，离心力为4000×g，离心的时间为5min；
(5)、从上清液中提取出油脂，以及破碎沉淀物并提取油脂。
实际上，油脂包括油酸、棕榈酸、亚油酸和硬脂酸。
其中，上清液和沉淀物中的油脂的具体提取过程分别为：
上清液中油脂的提取的过程为：在分液漏斗内用有机溶剂萃取30mL上清液，得到第一下层液并倒出；在倒出第一下层液的分液漏斗内加入有机溶剂再次进行萃取，得到第二下层液；将第一下层液和第二下层液混合得到第一混合液，将第一混合液用0.15wt％的氯化钠溶液进行清洗，并离心得到第三下层液，氮吹第三下层液得到油脂。
沉淀物中油脂的提取的过程为用机械研磨破碎和有机溶剂萃取相结合的方法：即离心后收集沉淀物，并用生理盐水进行清洗；干燥沉淀物后，将沉淀物中的微生物细胞用玻璃珠(直径为0.5mm)以3500rpm的转速研磨10s，然后将其置入分液漏斗内用有机溶剂进行萃取，得到第四下层液并倒出；在倒出第四下层液的分液漏斗内加入有机溶剂再次进行萃取，得到第五下层液；将第四下层液和第五下层液混合得到第二混合液，将第二混合液用0.15wt％的氯化钠溶液进行清洗，并离心得到第六下层液，氮吹第六下层液得到油脂。
其中，有机溶剂为甲醇、氯仿以体积比1:1的混合液。
实际上，液体培养基的转速在150‐200rpm之内、液体培养基中初始pH值在7.0±0.5之内、温度在29.5‐30.5℃之内、碳氮比(C/N)在(100±15):1之内都是可以的。
表面活性剂Brij58的投加量在0.1‐1.0g/L之内是可以的。
离心力在4000±200×g之内、离心的时间在5±10min之内均是可以的。
实施例2：
本实施例的利用酵母菌发酵产生油脂的方法包括如下步骤：
(1)、将产油酵母菌的菌种在YPD培养基中进行培养，得到产油酵母菌的种子液；
(2)、将体积比5％的产油酵母菌的种子液接种至液体培养基中进行发酵培养，液体培养基的转速为200rpm，液体培养基中初始pH值为7.0，温度为30.5℃，碳氮比(C/N)为100：1，乙酸的质量浓度为20g/L；
(3)、待发酵培养过程至对数生长期OD600≈10‐12(即发酵培养两天后)时，在液体培养基内投加0.5g/L的Brij58(作为表面活性剂)后继续培养至稳定期，得到发酵液；
(4)、发酵培养结束后，离心发酵液并分别收集上清液和沉淀物，离心力为4000×g，离心的时间为5min；
(5)、从上清液中提取出油脂，以及破碎沉淀物并提取油脂。
实际上，油脂包括油酸、棕榈酸、亚油酸和硬脂酸。
其中，上清液和沉淀物中的油脂的具体提取过程分别为：
上清液中油脂的提取的过程为：在分液漏斗内用有机溶剂萃取30mL上清液，得到第一下层液并倒出；在倒出第一下层液的分液漏斗内加入有机溶剂再次进行萃取，得到第二下层液；将第一下层液和第二下层液混合得到第一混合液，将第一混合液用0.15wt％的氯化钠溶液进行清洗，并离心得到第三下层液，氮吹第三下层液得到油脂。
沉淀物中油脂的提取的过程为用机械研磨破碎和有机溶剂萃取相结合的方法：即离心后收集沉淀物，并用生理盐水进行清洗；干燥沉淀物后，将沉淀物中的微生物细胞用玻璃珠(直径为0.5mm)以3500rpm的转速研磨10s，然后将其置入分液漏斗内用有机溶剂进行萃取，得到第四下层液并倒出；在倒出第四下层液的分液漏斗内加入有机溶剂再次进行萃取，得到第五下层液；将第四下层液和第五下层液混合得到第二混合液，将第二混合液用0.15wt％的氯化钠溶液进行清洗，并离心得到第六下层液，氮吹第六下层液得到油脂。
实际上，有机溶剂为甲醇、氯仿以体积比1:1的混合液。
实施例3：
本实施例的利用酵母菌发酵产生油脂的方法包括如下步骤：
(1)、将产油酵母菌的菌种在YPD培养基中进行培养，得到产油酵母菌的种子液；
(2)、将体积比5％的产油酵母菌的种子液接种至液体培养基中进行发酵培养，液体培养基的转速为200rpm，液体培养基中初始pH值为7.0，温度为30.5℃，碳氮比(C/N)为100：1，乙酸的质量浓度为20g/L；
(3)、待发酵培养过程至对数生长期OD600≈10‐12(即发酵培养两天后)时，在液体培养基内投加1.0g/L的Brij58(作为表面活性剂)后继续培养至稳定期，得到发酵液；
(4)、发酵培养结束后，离心发酵液并分别收集上清液和沉淀物，离心力为4000×g，离心的时间为5min；
(5)、从上清液中提取出油脂，以及破碎沉淀物并提取油脂。
实际上，油脂包括油酸、棕榈酸、亚油酸和硬脂酸。
其中，上清液和沉淀物中的油脂的具体提取过程分别为：
上清液中油脂的提取的过程为：在分液漏斗内用有机溶剂萃取30mL上清液，得到第一下层液并倒出；在倒出第一下层液的分液漏斗内加入有机溶剂再次进行萃取，得到第二下层液；将第一下层液和第二下层液混合得到第一混合液，将第一混合液用0.15wt％的氯化钠溶液进行清洗，并离心得到第三下层液，氮吹第三下层液得到油脂。
沉淀物中油脂的提取的过程为用机械研磨破碎和有机溶剂萃取相结合的方法：即离心后收集沉淀物，并用生理盐水进行清洗；干燥沉淀物后，将沉淀物中的微生物细胞用玻璃珠(直径为0.5mm)以3500rpm的转速研磨10s，然后将其置入分液漏斗内用有机溶剂进行萃取，得到第四下层液并倒出；在倒出第四下层液的分液漏斗内加入有机溶剂再次进行萃取，得到第五下层液；将第四下层液和第五下层液混合得到第二混合液，将第二混合液用0.15wt％的氯化钠溶液进行清洗，并离心得到第六下层液，氮吹第六下层液得到油脂。
实际上，有机溶剂为甲醇、氯仿以体积比1:1的混合液。
对比例1：
本对比例的利用酵母菌发酵产生油脂的方法包括如下步骤：
(1)、将产油酵母菌的菌种在YPD培养基中进行培养，得到产油酵母菌的种子液；
(2)、将体积比5％的产油酵母菌的种子液接种至液体培养基中进行发酵培养，液体培养基的转速为200rpm，液体培养基中初始pH值为7.0，温度为30.5℃，碳氮比(C/N)为100：1，乙酸的质量浓度为20g/L；
(3)、发酵培养结束后，离心发酵液并分别收集上清液和沉淀物，离心力为4000×g，离心的时间为5min；
(4)、从上清液中提取出油脂，以及破碎沉淀物并提取油脂。
实际上，油脂包括油酸、棕榈酸、亚油酸和硬脂酸。
其中，上清液和沉淀物中的油脂的具体提取过程分别为：
上清液中油脂的提取的过程为：在分液漏斗内用有机溶剂萃取30mL上清液，得到第一下层液并倒出；在倒出第一下层液的分液漏斗内加入有机溶剂再次进行萃取，得到第二下层液；将第一下层液和第二下层液混合得到第一混合液，将第一混合液用0.15wt％的氯化钠溶液进行清洗，并离心得到第三下层液，氮吹第三下层液得到油脂。
沉淀物中油脂的提取的过程为用机械研磨破碎和有机溶剂萃取相结合的方法：即离心后收集沉淀物，并用生理盐水进行清洗；干燥沉淀物后，将沉淀物中的微生物细胞用玻璃珠(直径为0.5mm)以3500rpm的转速研磨10s，然后将其置入分液漏斗内用有机溶剂进行萃取，得到第四下层液并倒出；在倒出第四下层液的分液漏斗内加入有机溶剂再次进行萃取，得到第五下层液；将第四下层液和第五下层液混合得到第二混合液，将第二混合液用0.15wt％的氯化钠溶液进行清洗，并离心得到第六下层液，氮吹第六下层液得到油脂。
实际上，有机溶剂为甲醇、氯仿以体积比1:1的混合液。
综上，将实施例1至实施例3、对比例1中上清液中提取的油脂(胞外油脂)和沉淀物中提取的油脂(胞内油脂)分别进行测试。其中，胞内油脂产量(g/L)＝胞内油脂含量(％)×酵母菌生物量(g/L)，胞外油脂产量(g/L)＝上清液的油脂质量(g)÷上清液的取样体积(L)，油脂总产量(g/L)＝胞外油脂产量(g/L)+胞内油脂产量(g/L)。
由图1可知，与未添加表面活性剂Brij58的油脂相比，加入不同浓度的表面活性剂Brij58可提高油脂的含量，最高可达68％；随着添加表面活性剂Brij58浓度的增加，上清液中提取的油脂(即胞外油脂)的产量从0.86g/L增加至1.33g/L。另外，投加1.0g/L的表面活性剂Brij58可使胞外油脂占总油脂产量的比例达至47％。
由图2可知，与未添加表面活性剂Brij58的油脂相比，添加表面活性剂Brij58后可提高油脂总产量和碳源转化率，当添加1.0g/L表面活性剂Brij58时，油脂总产量提高了24％，可达2.84g/L。
总之，本发明的产油微生物以乙酸作为碳源，并通过添加表面活性剂促进产油微生物从细胞内分泌油脂到细胞外的提取方法，提高了细胞外油脂及总的油脂产量，同时简化了油脂提取过程，不仅降低了微生物油脂的生产成本，而且还减少了微生物油脂提取过程中的能量消耗，为其规模化生产提供新的途径，具有较大的应用前景。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用微生物发酵产生油脂的方法，其特征在于：其包括如下步骤：
(1)、对产油微生物的种子液进行发酵培养，至对数生长期时投加表面活性剂，继续培养至稳定期，得到发酵液；
(2)、离心所述发酵液，收集上清液；
(3)、从所述上清液中提取出油脂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述表面活性剂为聚氧乙烯醚，投加量为0.1‐1.0g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述产油微生物为能够利用乙酸产油脂的酵母菌。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中的发酵培养包括：将经过第一培养基的所述产油微生物的种子液以体积比5‐10％接种至第二培养基中进行发酵培养。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述第一培养基包括：1±0.2g葡萄糖、0.5±0.3g鱼粉蛋白胨和0.5±0.3g酵母提取物。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述第二培养基为液体培养基；
优选地，所述液体培养基包括：20±10g/L乙酸、0.5827±0.0005g/L酵母提取物、0.0777±0.0002g/L硫酸铵、0.4±0.1g/L磷酸二氢钾和1.5±0.3g/L七水硫酸镁。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述液体培养基的转速为150‐200rpm；和/或，
所述液体培养基中初始pH值为7.0±0.5，温度为29.5‐30.5℃；碳氮比为(100±15):1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述离心后收集沉淀物，并用生理盐水进行清洗；破碎所述沉淀物中的微生物细胞，并结合有机溶剂萃取从而提取出油脂；和/或，
步骤(3)中，所述提取的过程为：将所述上清液用有机溶剂萃取后得到下层液；用0.15±0.5wt％的氯化钠溶液对所述下层液进行清洗，氮吹得到油脂。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂为甲醇、氯仿以体积比1:1‐1:1.5的混合液。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述油脂包括油酸、棕榈酸、亚油酸和硬脂酸。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112641660A (zh) * 2021-01-12 2021-04-13 江苏瑞霆生物科技有限公司 一种高稳定性植物油料发酵自包载体的制备方法和产品及其应用
CN113423838A (zh) * 2019-02-18 2021-09-21 慕尼黑科技大学 一种生产微生物脂质的方法
CN113897403A (zh) * 2021-10-09 2022-01-07 南京师范大学 提高产油微生物的油脂产量的方法和微生物油脂的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102443605A (zh) * 2011-11-04 2012-05-09 上海交通大学 用非离子表面活性剂渗透萃取发酵微生物胞内产物的方法
CN102559790A (zh) * 2012-02-07 2012-07-11 清华大学 一种提高产油微生物发酵生产微生物油脂的方法
KR101531842B1 (ko) * 2014-04-15 2015-06-29 한국에너지기술연구원 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법
CN105524952A (zh) * 2016-02-04 2016-04-27 同济大学 一种利用剩余污泥发酵产酸并合成微生物油脂的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102443605A (zh) * 2011-11-04 2012-05-09 上海交通大学 用非离子表面活性剂渗透萃取发酵微生物胞内产物的方法
CN102559790A (zh) * 2012-02-07 2012-07-11 清华大学 一种提高产油微生物发酵生产微生物油脂的方法
KR101531842B1 (ko) * 2014-04-15 2015-06-29 한국에너지기술연구원 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법
CN105524952A (zh) * 2016-02-04 2016-04-27 同济大学 一种利用剩余污泥发酵产酸并合成微生物油脂的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TAMANO，KOICHI等: "High-efficiency extracellular release of free fatty acids from Aspergillus oryzae using non-ionic surfactants", 《JOURNAL OF BIOTECHNOL》 *
XIANG-FENG HUANG等: "Enhancement of extracellular lipid production by oleaginous yeast through preculture and sequencing batch culture strategy with acetic acid", 《BIORESOURCE TECHNOLOGY》 *
胡志强: "表面活性剂胶束溶液中萃取发酵红曲色素的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *
胡洋: "油脂酵母利用粗甘油发酵产微生物油脂的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113423838A (zh) * 2019-02-18 2021-09-21 慕尼黑科技大学 一种生产微生物脂质的方法
CN112641660A (zh) * 2021-01-12 2021-04-13 江苏瑞霆生物科技有限公司 一种高稳定性植物油料发酵自包载体的制备方法和产品及其应用
CN112641660B (zh) * 2021-01-12 2021-10-22 江苏瑞霆生物科技有限公司 一种高稳定性植物油料发酵自包载体的制备方法和产品及其应用
CN113897403A (zh) * 2021-10-09 2022-01-07 南京师范大学 提高产油微生物的油脂产量的方法和微生物油脂的制备方法
CN113897403B (zh) * 2021-10-09 2024-04-16 南京师范大学 提高产油微生物的油脂产量的方法和微生物油脂的制备方法

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