KR101531842B1 - 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법에 관한 것으로, 그 목적은 바이오연료나 오일 유래 유용물질의 생산을 위하여, 수분이 있는 상태의 오일 함유 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용하여 다양한 활용처를 가지는 유리지방산 형태로 오일을 고효율로 직접 추출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 구성은 a) 오일 함유 미생물을 포함한 배양액에 산 촉매 및 술폰산기와 벤젠기를 갖는 음이온 계면활성제를 첨가한 혼합물을 준비하는 단계; b) 상기 혼합물을 가열하여 유리지방산 형태의 오일을 추출하는 단계;를 포함하여 구성된 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법을 발명의 특징으로 한다.

Description

미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법{High-yield extraction of free fatty acid using acid catalyst and surfactant from microorganism}

본 발명은 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법에 관한 것으로, 자세하게는 바이오연료나 오일 유래 유용물질의 생산을 위하여 기존 원료(대두, 유채, 팜 등)에 비해 오일 생산량이 매우 높은 오일 함유 미생물로부터 트리글리세리드 형태가 아닌 유리지방산 형태로 오일을 직접 추출하는 방법에 관한 것이다.

바이오디젤은 식물성 기름 또는 동물성 유지로부터 생산된 지방산의 메틸 또는 에틸 에스테르 화합물로 정의된다. 바이오디젤은 기존 경유에 비해 일산화탄소, 미세먼지, 탄화수소, 독성물질 등 대기 오염물질 배출을 크게 줄일 수 있어 친환경 자동차 연료로 적합하다. 또한 바이오디젤의 연소에서 나오는 이산화탄소는 다시 식물의 광합성 기작에 의해 흡수, 고정되므로 이산화탄소의 순 배출이 거의 없어, 전 세계적으로 이산화탄소 중립 연료(CO₂-neutral fuel)로 큰 주목을 받고 있다.

국내에서도 바이오디젤의 보급 확대가 국제사회에서 도입하려는 이산화탄소 배출 규제에 대한 가장 현실적 대응 방안이라는 판단 하에 2002년부터 2006년까지 수도권과 전라북도 등에서 바이오디젤 시범 보급 사업을 시행한 후 2006년 7월부터 바이오디젤 보급을 전국으로 확대하였다. 또한 정유사가 구입하는 바이오디젤의 물량을 매년 높여 바이오디젤이 널리 보급되도록 하였다. 2010년부터 바이오디젤 2%를 경유에 혼합한 BD5 (바이오디젤 5% 이하 혼합 경유)가 연간 40만kL 규모로 기존 인프라와 주유소를 통해 보급되고 있다.

바이오디젤은 연료로서 뿐만 아니라 공해성 석유제품을 대체하는 화학물질의 중간체로 사용함으로써 그 응용성이 급격하게 확장되고 있는 산업이다. 바이오디젤은 친환경 제품인 생분해성 계면활성제, 합성 윤활유 그리고 저독성 용제의 제조 원료로 사용되고 있으므로 EU 등 선진국에서 법적/제도적으로 장려 정책을 강도 높게 시행하고 있어 성장성이 기대된다. 또한 바이오디젤 플랜트 산업은 결합형 지식산업이자 벤처기업형 산업, 차세대 전략산업 및 국제산업이라는 산업적 특징이 있으며, 기술적으로는 기술집약적 첨단사업이자 정부의 정책적 의지가 강하게 작용하는 유망 산업으로 평가받고 있다.

그러나 현재 바이오디젤은 주로 콩, 유채 등의 식용작물에서 추출한 식물성 기름을 이용해 생산하고 있으며, 이는 곡물가격 상승을 유발해 아프리카와 같은 빈곤 국가와 저소득층의 식량난을 가중시킨다는 비판을 받고 있다. 또한 늘어나는 바이오디젤의 수요에 맞추어 팜유와 같은 원료 생산을 위해 광범위한 열대우림 또는 산림이 개발되고 있으며, 이는 오히려 지구온난화를 부추긴다는 지적도 있다. 더욱이 우리나라는 바이오디젤의 원료(예: 대두유 또는 팜유) 대부분을 해외에서 수입하고 있으므로 수급 및 가격이 석유자원과 유사하게 대외적인 상황 변화에 크게 의존할 가능성이 높다.

이러한 상황에서 국내의 에너지 안보는 석유뿐만 아니라 석유대체연료에서도 위협을 받고 있는 실정으로 저가의 원료 또는 국내 자원을 이용할 수 있는 방안을 마련하는 것이 절실하다. 일부 국내 업체에서는 국내에서 생산되는 폐식용유를 이용하여 바이오디젤을 생산하고 있지만, 해마다 증가하는 바이오디젤 목표량을 채우기 위해서는 더 많은 양의 원료유를 필요로 한다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 기존 대두유 또는 팜유 대신에 미세조류를 원료로 활용하는 기술이 '차세대 바이오디젤 기술'로 많은 관심을 받고 있다.

미세조류는 물, 이산화탄소와 햇빛을 이용하여 성장이 가능하며, 황무지, 해안가, 바다 등 어디서든 배양할 수 있어 기존 육상작물과 토지나 공간 측면에서 상호 경쟁하지 않는다. 또한 미세조류는 배양조건에 따라 생체 내에 많은 양의 오일 (최대 70%)을 축적하며, 단위 면적당 오일 생산량이 콩과 같은 기존 식용작물에 비해 50-100배 이상 높아 대체 생물원유로서의 가능성이 매우 높다.

이로부터 단위 면적당 오일 생산량이 육상식물에 비해 매우 우수한 미세조류에 기반한 바이오디젤 생산기술에 대한 관심이 높아지고 있다 (표 1 참조).

에너지 작물	오일 생산량 (L/ha)
옥수수	172
대두	446
카놀라	1,190
자트로파	1,892
코코넛	2,689
팜	5,950
미세조류	58,700

미세조류 및 기존 에너지 작물의 오일 생산량(출처: 제3차 신재생에너지 기술개발 및 이용 보급 기본계획)

또한 기능성 화장품의 원료로 미세조류로부터 추출한 오일 중 일부 성분을 사용하거나, 의약품의 원료 성분을 추출할 수 있다.

한 예로 항산화 효과가 있는 아스타잔틴(Astaxanthin)은 화장품, 식품, 의약품, 영양제 및 사료의 원료로 적용이 가능하다. DHA(docosa hexaenoic acid), EPA(eicosapentaenoic acid)를 포함하는 오메가-3 지방산 또한 미세조류로부터 추출할 있는 대표적인 오일의 예이다.

미세조류는 단일세포의 광합성 생물로 3~30μm의 크기에 담수나 해수에서 서식한다. 이산화탄소를 흡수하고 산소를 배출하며, 오일 및 유용물질을 함유하고 있다.

또한 미세조류는 육상식물에 비해 성장률이 매우 빠르고, 대량으로 고농도 배양이 가능하며, 극한 환경에서도 성장이 가능하다는 장점을 가진다.

또한 미세조류는 사용 가능한 오일 성분이 바이오매스의 30 ~ 70%에 달하므로, 기존 작물에 비해 높은 연료 생산성을 나타낸다.

따라서 미세조류 이용 오일 및 유용물질 제조 기술은 단위면적 당 높은 생산성을 나타내어 자원 확보가 용이하고 식량 자원과의 경쟁이 없으므로 국내 실정에 적합하다고 할 수 있다. 미세조류 외에도 박테리아, 효모, 진균 등의 미생물도 오일을 함유하고 있으므로, 이들 미생물로부터 추출한 오일을 바이오디젤 생산 원료나 유용물질 추출 원료로 이용하는 것도 가능하다.

종래 오일 함유 미생물로부터 오일을 추출하는 방법으로는, 용매추출법(미생물의 여러 가지 성분 중에서 오일을 잘 용해할 수 있는 추출 용매를 사용하여 미생물로부터 오일을 용매상으로 분리하는 방법), 마이크로파 이용법(마이크로파가 미생물의 세포벽을 파괴함으로써 세포 내용물을 밖으로 배출시키면, 이 중에서 오일 성분을 분리하는 방법, 열수처리법(미생물이 분사되어 있는 수용액의 온도를 물의 끓는점 이상으로 올리면 고온, 고압 상태가 되어 세포벽이 깨지고 세포 내용물이 밖으로 나오게 함으로써 오일 성분을 분리하는 방법), 효소처리법(효소를 사용하여 미생물의 세포벽을 분해함으로써 오일을 얻는 방법), 압착법(미생물을 압착하여 오일을 짜내는 방법) 등의 다양한 방법을 이용할 수 있다.

이들 오일 추출법은 대부분이 미생물의 세포벽을 일부 붕괴시킴으로서 세포벽 내부에 있는 오일을 밖으로 내보내는 기작을 포함하며, 붕괴된 세포벽의 내부나 외부에 존재하는 오일의 회수를 위해서는 일반적으로 유기용매를 이용한다.

하지만 상기 용매추출법은 건조된 시료에 대해 적용되는 가장 흔히 이용되는 방법으로 효율은 높으나 수분에 의해 추출율이 저해를 받으므로 시료를 건조하기 위한 에너지 비용이 높은 단점을 가진다.

또한 마이크로파 장치는 추출시간을 단축시킬 수 있는 장점은 있으나, 초기 시설 투자비를 필요로 한다.

또한 열수추출법은 산업적 오일 생산을 위해 열수추출법의 적용을 고려할 수 있으나 세포벽의 두께가 얇은 미생물의 처리에는 적당하지만, 클로렐라와 같이 세포벽이 두꺼운 종의 처리에는 세포벽이 쉽게 깨지지 않아 효율이 낮은 단점이 있다.

또한 효소처리법은 아직 효소 비용이 높아 처리 후 재사용을 위한 공정이나 장치가 필요하다는 단점이 있다.

또한 압착법은 미세조류의 크기에 따라 효율이 좌우된다는 단점이 있다.

따라서 산업적 이용을 위한 오일 추출을 위해서는 시료를 건조하지 않고 수분이 있는 상태에서 적용가능하며, 설치비나 재료비를 최소화함으로써 많은 공정이나 높은 비용 없이 높은 효율로 세포벽을 붕괴하고 오일을 회수할 수 있는 공정을 개발할 필요가 있다.

상기한 추출방법 중 바이오연료 및 유용물질 생산에 이용할 수 있는 원료로서의 바이오오일을 추출하기 위해서 가장 일반적으로 사용되는 용매추출법의 경우 수분이 적을수록 오일 추출율이 증가하지만, 오일 함유 미생물로부터 수분을 제거하기 위해서는 추가적인 에너지비용이 소요된다는 단점이 있다.

오일 함유 미생물로부터 바이오연료를 포함하는 유용물질을 생산하는 과정은, 오일 함유 미생물을 대량생산하고, 수분을 일부 제거한 미생물을 수확하며, 오일 추출법을 적용하여 오일을 추출한 후에 바이오디젤, 화장품, 의약품 등의 원료로 사용하는 것이다(도 7 참조).

오일 함유 미생물로부터 추출된 오일은 일반적으로 트리글리세리드와 유리지방산을 동시에 함유하고 있다. 바이오디젤 전환시 트리글리세리드만 있으면 염기 촉매 공정으로 공정이 단순화되지만 두 가지가 혼합되어 있을 경우 유리지방산이 염기촉매와 반응해 비누를 형성하여 오일의 손실을 야기하고 바이오디젤 층과 물 층의 분리를 저해한다(도 8 참조).

반면 추출된 오일이 모두 유리지방산으로만 존재한다면 적은 양의 산 촉매를 이용하여 쉽게 바이오디젤로 전환이 가능하다.

따라서 트리글리세리드와 유리지방산이 혼합물로 존재하는 오일 대신 오일 성분을 단일화시키는 것이 다음 공정을 단순화할 수 있는 바람직한 방법이다.

즉 오일을 전부 유리지방산 형태로 추출할 수 있다면 산업에의 활용이 훨씬 손쉬워진다.

따라서 오일의 회수율을 높이면서 동시에 오일을 단일 성분인 유리지방산 형태로 전부 추출할 수 있는 공정을 개발하여 미생물로부터 추출된 오일을 산업적 측면에서 쉽게 활용할 수 있도록 할 필요가 있다.

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상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 바이오연료나 오일 유래 유용물질의 생산을 위하여, 수분이 있는 상태의 오일 함유 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용하여 다양한 활용처를 가지는 유리지방산 형태로 오일을 고효율로 직접 추출하는 방법을 제공하는데 있다.

상기한 바와 같은 목적을 달성하고 종래의 결점을 제거하기 위한 과제를 수행하는 본 발명은 a) 오일 함유 미생물을 포함한 배양액에 산 촉매 및 술폰산기와 벤젠기를 갖는 음이온 계면활성제를 첨가한 혼합물을 준비하는 단계;

b) 상기 혼합물을 가열하여 유리지방산 형태의 오일을 추출하는 단계;를 포함하여 구성된 것을 특징으로 하는 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법을 제공함으로서 달성된다.

바람직한 실시예로, 상기 b) 단계 후, c) 수득된 혼합물에 유기용매를 첨가하여 유리지방산이 포함된 유기용매층과 미생물 잔해가 포함된 층으로 상분리하는 단계; 를 더 포함하여 구성된 것을 특징으로 하는 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법.

바람직한 실시예로, 상기 c)단계 후, d) 상기 미생물 잔해가 포함된 층으로부터 유리지방산이 포함된 층을 별도로 분리한 후 상기 유기용매를 제거하는 단계; 를 더 포함하여 구성할 수 있다.

바람직한 실시예로, 상기 오일 함유 미생물은 미세조류, 박테리아, 효모, 진균 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

바람직한 실시예로, 상기 산 촉매는 황산, 염산, 질산 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

바람직한 실시예로, 상기 계면활성제는 도데실벤젠술폰산나트륨 (SDBS, Sodium Dodecyl Benzene Sulfonate)일 수 있다.

바람직한 실시예로, 상기 배양액 중 오일 함유 미생물의 농도는 20 ~ 300g/L일 수 있다.

바람직한 실시예로, 상기 혼합물 중 산 촉매의 농도는 0.5 ~ 10% (w/w)일 수 있다.

바람직한 실시예로, 상기 혼합물 중 계면활성제의 농도는 0.1 ~ 5% (w/w) 일 수 있다.

바람직한 실시예로, 상기 유기용매는 헥산, 메탄올, 클로로포름 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

상기와 같은 특징을 갖는 본 발명은 바이오연료나 오일 유래 유용물질의 생산을 위하여, 기존의 원료(대두, 유채, 팜 등)에 비해 오일 생산량이 매우 높은 오일 함유 미생물로부터 트리글리세리드 형태가 아닌 유리지방산 형태로 오일을 직접 추출하는 방법에 관한 것으로, 수분이 있는 상태에서 유리지방산 추출이 가능한 상기 유리지방산 추출 방법에 의하여, 원하는 물질의 추출을 위하여 선택되는 특정 미생물로부터 유리지방산 성분의 추출이 가능한 장점과,

또한 계면활성제의 첨가로 미생물로부터 직접 유리지방산 성분을 다량으로 추출 가능한 장점과,

또한 미생물 추출 오일을 원료로 생산가능한 바이오디젤 등의 바이오연료 전환에 사용되는 전환 촉매의 양을 획기적으로 줄일 수 있다는 장점과,

또한 다량으로 추출된 유리지방산을 바이오디젤로 전환하여 국내 원료를 이용한 바이오디젤의 보급이 가능해진다는 장점과,

또한 바이오디젤 전환시 사용되는 산 촉매의 양을 획기적으로 줄임으로써 반응기 부식 문제를 해결하고, 폐수처리 양을 줄일 수 있다는 장점과,

또한 오일 함유 미생물로부터 오일을 추출하기 위하여 필요로 하는 공정비용 상승 문제를 개선함으로서 경제성 있는 유리지방산의 생산이 가능한 장점을 가진 유용한 발명으로 산업상 그 이용이 크게 기대되는 발명이다.

도 1은 본 발명의 한 실시예에 따른 미생물로부터 유리지방산을 추출하는 단계를 보인 예시도이고,
도 2는 본 발명의 한 실시예에 따른 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 추출법에서 황산 및 SDBS 농도에 따른 미세조류의 오일 추출율 변화를 보인 그래프이고,
도 3은 본 발명의 한 실시예에 따른 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 추출법에서 황산 및 SDBS 농도에 따른 미세조류의 유리지방산 함량 변화를 보인 그래프이고,
도 4는 본 발명과 대비되는 비교예 1에 따른 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 추출법에서 황산 및 SDS 농도에 따른 미세조류의 유리지방산 함량 변화를 보인 그래프이고,
도 5는 본 발명의 한 실시예에 따른 산 촉매와 계면활성제 SDBS를 이용하여 추출된 유리지방산의 바이오디젤 전환 FAME 함량 변화를 보인 그래프이고,
도 6은 본 발명의 한 실시예에 따른 헥산-메탄올 용매를 이용하여 추출된 오일의 바이오디젤 전환 FAME 함량 변화를 보인 그래프이고,
도 7은 일반적인 오일 함유 미생물로부터 유용물질 생산 경로를 보인 예시도이고,
도 8은 일반적인 오일의 바이오디젤 전환 반응식이다.

이하 본 발명의 실시 예인 구성과 그 작용을 첨부도면에 연계시켜 상세히 설명하면 다음과 같다. 또한 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다.

도 1은 본 발명의 한 실시예에 따른 미생물로부터 유리지방산을 추출하는 단계를 보인 예시도이다.

도시된 바와 같이 본 발명에 따라 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법은 a) 오일 함유 미생물을 포함한 배양액에 산 촉매와, 술폰산기와 벤젠기를 갖는 음이온 계면활성제를 첨가한 혼합물을 준비하는 단계(S100)와; b) a)단계의 상기 혼합물을 가열하여 유리지방산 형태의 오일을 추출하는 단계(S200);로 이루어진다.

또한 b) 단계 후, c) 수득된 혼합물에 유기용매를 첨가하여 유리지방산이 포함된 유기용매층과 미생물 잔해가 포함된 층으로 상분리하는 단계(S300);를 더 포함할 수 있다.

또한 상기 c)단계 후, d) 상기 미생물 잔해가 포함된 층으로부터 유리지방산이 포함된 층을 별도로 분리한 후 상기 유기용매를 제거하는 단계(S400);를 더 포함하여 구성할 수 있다.

전술한 바와 같이 미생물을 건조하지 않고 수분이 있는 상태에서 용매추출법을 이용하여 미생물로부터 오일을 추출하는 경우, 미생물을 건조하여 수분이 거의 없는 상태에서 용매추출법을 시행하는 경우보다 오일 추출율이 현저히 떨어지고, 이를 해결하기 위해 미생물로부터 수분을 제거하기 위해서는 추가적인 공정으로 인하여 바이오오일의 생산비용을 증가시킨다는 단점이 있다.

따라서 본 발명은 수분이 있는 상태의 미생물로부터 용매추출법을 이용하여 효율적으로 오일을 추출하기 위하여, 미생물을 포함한 배양액에 산 촉매 그리고 술폰산기와 벤젠기를 갖는 음이온 계면활성제를 첨가후 가열하여 미생물의 세포벽을 약화시키거나 붕괴시키면서 트리글리세리드의 분해를 촉진시켜 높은 수율로 유리지방산을 얻을 수 있다.

상기 혼합물을 가열하는 온도는 120 ~ 180℃, 가열시간은 5 ~ 60분이 적합하다.

상기 온도 보다 낮은 온도에서는 산 촉매가 효율적으로 작용하지 못하여 오일 추출율이 감소하며, 상기 온도보가 높은 온도에서는 산 촉매에 의한 반응기 부식이 가속화되기 때문이다. 또한 계면활성제에 의한 트리글리세리드의 유리지방산 전환은 상온보다 가열시 향상되고, 상기 온도조건에서는 트리글리세리드의 유리지방산 전환이 촉진된다.

그리고 가열시간이 상기 시간 보다 짧으면 산 촉매와 미생물의 접촉시간이 짧아 오일 추출율이 낮으며, 상기 시간보다 가열시간이 길면 긴 반응시간으로 인하여 바이오오일 생산효율이 감소한다. 또한 가열시간이 상기 시간 보다 짧으면 계면활성제와 트리글리세리드의 접촉시간이 짧아 유리지방산 함량이 낮으며, 60분 이내에 계면활성제에 의한 트리글리세리드의 유리지방산 전환이 마무리된다.

상기에서 술폰산기와 벤젠기를 갖는 음이온 계면활성제를 사용한 이유는 미생물로부터 오일을 추출하는 단계에서 오일을 모두 트리글리세리드 형태가 아닌 유리지방산으로 형태로 추출되도록 트리글리세리드를 분해하기 위함이다.

미생물로부터 추출된 오일은 유리지방산(free fatty acid)과 트리글리세리드(triglyceride)의 혼합물로 존재한다. 미생물로부터 추출된 오일을 산 촉매를 이용하여 바이오디젤로 전환시 산 촉매에 의해 트리글리세리트 부분이 유리지방산으로 먼저 분해된 후 유리지방산 부분이 다시 산 촉매의 에스테르화 반응에 의해 바이오디젤로 전환되므로, 트리글리세리드의 분해와 에스테르화 반응 두 가지 공정이 바이오디젤 전환 과정 중에 포함된다.

따라서 미생물로부터 오일 추출 단계에서 오일을 전부 유리지방산 형태로 추출할 수 있다면, 바이오디젤 전환 단계에서는 에스테르화 반응만 수행하게 되므로 반응이 단순해지고, 사용되는 산 촉매의 양도 줄일 수 있게 된다.

이처럼 본 발명에 사용된 술폰산기와 벤젠기를 갖는 음이온 계면활성제는 트리글리세리드의 유리지방산으로의 분해를 도울 수 있게 된다.

본 발명은 수득된 상기 혼합물에 유기용매를 첨가하여 유리지방산이 포함된 유기용매층과 미생물 잔해가 포함된 층으로 상분리하는 단계; 를 포함할 수 있다.

즉, 미생물과 산 촉매 및 계면활성제를 포함한 혼합물로부터 유리지방산을 효율적으로 회수하기 위해서는 유기용매를 사용하는 것이 바람직하다.

유리지방산은 유기용매 층으로 이동하며 산 촉매와 계면활성제 및 미생물 잔해는 물 층으로 이동하여 서로 층분리되므로 유기용매를 사용함으로서 유리지방산의 분리 효율을 높일 수 있다.

또한 유기용매층과 미생물 잔해층은 두 층간의 밀도차에 의하여 분리되는 특성이 있으므로, 중력침강에 의해 상분리하거나, 시간을 줄이기 위해서 원심분리를 수행할 수 있다.

또한 본 발명은 유기용매를 첨가하여 유리지방산이 포함된 유기용매층과 미생물 잔해가 포함된 층으로 상분리 후, 미생물 잔해가 포함된 층으로부터 유리지방산이 포함된 층을 별도로 분리한 후 상기 유기용매를 제거하는 단계; 를 포함할 수 있다.

이전 단계에서 산 촉매 및 계면활성제 처리 후 유기용매와 일정시간 교반 후 정치시키면 미생물 잔해가 포함된 층과 유리지방산이 포함된 용매층으로 나뉘며, 유리지방산이 포함된 층을 회수하여 유기용매를 증발시키면 최종적으로 유리지방산을 얻을 수 있다.

본 발명에 사용되는 오일 함유 미생물은 미세조류, 박테리아, 효모, 진균 중에서 선택된 어느 하나 이상이다. 즉, 본 발명은 일반적으로 잘 알려진 미세조류 뿐만 아니라 박테리아, 효모, 진균 등의 미생물도 오일을 함유하고 있기 때문에 이들 미생물로부터 바이오오일을 추출할 수 있다. 오일을 함유하는 대표적인 미생물과 각각의 오일 함량을 표 2에 나타내었다.

	미생물	오일 함량 (wt%, dry)
Microalgae (미세조류)	Botryococcus braunii Cylindrotheca sp. Nitzschia sp. Schizochytrium sp.	25-72 16-37 45-47 50-77
Bacterium (박테리아)	Arthrobacter sp. Acinetobacter calcoaceticus Rhodococcus opacus Bacillus alcalophilus	>40 27-38 24-25 18-24
Yeast (효모)	Candida curvata Cryptococcus albidus Lipomyces starkeyi Rhodotorula glutinis	58 65 64 72
Fungi (진균)	Aspergillus oryzae Mortierella isabellina Humicola lanuginosa Mortierella vinacea	57 86 75 66

오일 함유 미생물의 오일 함량(출처: Xin Meng et al., Renewable Energy 34 (2009) 1 ~ 5)

상기 표 2에 나타낸 오일 함유 미생물 이외에도 미세조류로서 아나시스티스 니둘란스(Anacystis nidulans), 안키스트로데스무스(Ankistrodesmus sp.), 비둘리파아 우리타(Biddulpha aurita), 체토세로스(Chaetoceros sp.), 치라미도모나스 애플라나타(Chlamydomonas applanata), 치라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii), 클로렐라(Chlorella sp.), 클로렐라 엘립소디아(Chlorella ellipsoidea), 클로렐라 에멀소니(Chlorella emersonii), 클로렐라 프로토더코이데스(Chlorella protothecoides), 클로렐라 프레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana), 클로렐라 뷸가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 미누티시마(Chlorella minutissima), 클로로코쿠 리토레일(Chlorococcu littorale), 시클로텔라 크립티카(Cyclotella cryptica), 두날리엘라 바르다윌(Dunaliella bardawil), 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina), 두날리엘라 테르티오렉타(Dunaliella tertiolecta), 두날리엘라 프리모렉타(Dunaliella primolecta), 짐노디움(Gymnodinum sp.), 헤머노모나스 카테라에(Hymenomonas carterae), 이소크리시스 갈베나(Isochrysis galbana), 이소크리시스(Isochrysis sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 마이크로모나스 푸실라(Micromonas pusilla), 모노두스 서브테라네우스(Monodus subterraneous), 나노클로리스(Nannochloris sp.), 나노클로롭시스(Nannochloropsis sp.), 나노클로롭시스 아토무스(Nannochloropsis atomus), 나노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina), 나비쿨라 필리쿨로사(Navicula pelliculosa), 니츠시아(Nitzschia sp.), 니츠시아 클로스테리움(Nitzscia closterium), 니츠시아 팔레아(Nitzscia palea), 오시스티스 폴리모피아(Oocystis polymorpha), 아우로코커스(Ourococcus sp.), 오실라토리아 루베스켄스(Oscillatoria rubescens), 파브로바 루테리(Pavlova lutheri), 패오닥트리움 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum), 피크노코커스 프로바솔리(Pycnococcus provasolii), 피라미노나스 코르다타(Pyramimonas cordata), 스피눌라 플라텐시스(Spirulina platensis), 스테파노디스커스 미누투루스(Stephanodiscus minutulus), 스티코커스(Stichococcus sp.), 시네드라우르나(Synedra ulna), 스케네데스무스 오브리쿼스(Scenedesmus obliquus), 스켈레나스트럼 그라시레(Selenastrum gracile), 스켈레토노마 코스타럼(Skeletonoma costalum), 테트라셀미스 출리(Tetraselmis chui), 테트라셀미스 마쿠라타(Tetraselmis maculata), 테트라셀미스(Tetraselmis sp.), 테트라셀미스 수에시카(Tetraselmis suecica), 탈라시오스트라 프세우도모나(Thalassiostra pseudomona), 아나배나(Anabaena sp.), 칼로드릭스(Calothrix sp.), 카마에시폰(Chaemisiphon sp.), 코로코시디옵시스(Chroococcidiopsis sp.), 차노데세(Cyanothece sp.), 실린더로스페멈(Cylindrospermum sp.), 데모카펠라(Dermocarpella sp.), 피셔렐라(Fischerella sp.), 글로에오캅사(Gloeocapsa sp.), 믹소사시나(Myxosarcina sp.), 노스톡(Nostoc sp.), 오스실라토리아(Oscillatoria sp.), 포르미디움 코리움(Phormidium corium), 플레우로캅사(Pleurocapsa sp.), 프로콜로코코스(Prochlorococcus sp.), 페세우다나바에나(Pseudanabaena sp.), 시네코코스(Synechococcus sp.), 시네코시스티스(Synechocystis sp.), 톨리포트릭스(Tolypothrix sp.), 제노코코스(Xenococcus sp.) 등의 미세조류로부터 오일을 추출할 수 있다. 특히 Aurantiochytrium sp.는 지방산 중에서도 오메가-3 지방산을 고함량으로 포함하고 있으며, Haematococcus pluvialis는 상업적으로 아스타잔틴을 추출할 때 이용된다.

또한 박테리아 종으로는 상기 표 2에 나타낸 것 이외에도 대장균(E. coli), 로도시스타센테나리아(Rhodocista centenaria), 로도스피라 트루페리(Rhodospira trueperi), 로도스피리럼 프루붐(Rhodospirillum fulvum), 로도스피리럼 모리스키라넘(Rhodospirillum molischianum), 로도스피리럼 포토메트리쿰(Rhodospirillum photometricum), 로도스피리럼 러브럼(Rhodospirillum rubrum), 로도스피리럼 살렉시젠(Rhodospirillum salexigens), 로도스피리럼 살리나루튼(Rhodospirillum salinarutn), 로도스피리럼 소도멘세(Rhodospirillum sodomense), 로도스피리럼 메디오살리넘(Rhodospirillum mediosalinum), 로돕세우도모나스(Rhodopseudomonas sp.), 로돕세우도모나스 아시도피라(Rhodopseudomonas acidophila), 로돕세우도모나스 캅술라투스(Rhodopseudomonas capsulatus), 로돕세우도모나스 파루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 로돕세우도모나스 스페로이데스(Rhodopseudomonas sphaeroides), 로도박터 캅술라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도박터 세페로이데스(Rhodobacter sphaeroides) 등의 종으로부터 오일을 추출할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 산 촉매로는 황산, 염산, 질산 중에서 선택되는 하나 이상의 강산을 사용할 수 있다. 이러한 산 촉매는 미생물의 세포벽을 약화시켜 용매추출 시 용매가 세포 내로 침투하여 오일을 추출하는 기능을 향상시키게 된다.

또한 본 발명에서 사용되는 술폰산기와 벤젠기를 갖는 바람직한 음이온 계면활성제는 도데실벤젠술폰산나트륨(SDBS, Sodium Dodecyl Benzene Sulfonate)이다.

그리고 데실벤젠술폰산나트륨(Sodium Decyl Benzene Sulfonate), 트리데실벤젠술폰산나트륨(Sodium Tridecyl Benzene Sulfonate), 운데실벤젠술폰산나트륨(Sodium Undecyl Benzene Sulfonate) 등도 술폰산기와 벤젠기를 가지고 있다.

이 외에 Triton X-100, IGEPAL CO-520, IGEPAL CA-630 등의 비이온성 계면활성제가 벤젠기를 가지고 있으며, Glycolic acid ethoxylate 4-tert-butylphenyl ether, Glycolic acid ethoxylate 4-nonylphenyl ether 등도 벤젠기를 포함하고 있다.

친수성기와 소수성기를 동시에 가지고 있는 계면활성제는 친수성 부분의 성질에 따라 음이온, 양이온, 양성, 비이온성 계면활성제로 나뉘며 계면의 경계를 완화시켜 계면 에너지를 감소시키고 표면장력을 약화시키는 역할을 함으로써 다양한 분야에서 활용되고 있다.

계면활성제의 응용범위는 매우 다양하여, 가정용으로는 세제, 세척제 등이 있으며, 공업용으로는 섬유, 석유화학, 건축 및 토목, 화장품, 제지, 식품 및 의약품, 안료 및 페인트 등 각종 산업분야에 이용되고 있다.

음이온 계면활성제로는 지방산나트륨(RCOO^-Na⁺), 모노알킬황산염(ROSO₃ ^-M⁺), 알킬폴리옥시에틸렌황산염(RO(CH₂CH₂O)_mSO₃ ^-M⁺),알킬벤젠술폰산염(RR'CH₂CHC₆H₄SO₃ ^-M⁺), 모노알킬인산염(ROPO(OH)O^-M⁺) 등이 있으며,

양이온 계면활성제로는 모노알킬트리메틸암모늄염(RN⁺(CH₃)₃X^-), 디알킬디메틸암모늄염(RR'N⁺(CH₃)₂X^-), 알킬벤질메틸암모늄염(RN⁺(CH₂Ph)(CH₃)₂X^-) 등이 있다.

양성 계면활성제로는 알킬설포베타인(RR'R"N⁺(CH₂)_nSO₃), 알킬카르복시베타인(R(CH₃)₂N⁺CH₂COO^-) 등이 있으며,

비이온성 계면활성제로는 폴리옥시에틸렌알킬에테르(RO(CH₂CH₂O)_mH), 지방산솔비탄에스테르, 지방산디에탄올아민(RCON(CH₂CH₂OH)₂), 알킬모노글리세릴에테르(ROCH₂CH(OH)CH₂OH) 등이 있으며, Triton X, Pluronic, Tween, Brij, Span 등이 상품명으로 판매되고 있다.

많이 이용되는 계면활성제 중, 음이온 계면활성제로는 SDS(sodium dodecyl sulfate), SDBS(sodium dodecyl benzene sulfonate), Sarkosyl(sodium lauroyl sarcosinate), SC(sodium cholate), SLES(sodium laureth sulfate) 등이 있으며, 양이온 계면활성제로는 CTAB(cetyl trimethylammonium bromide), DTAB(dodecyl trimethylammonium bromide) 등이 있고, 비이온성 계면활성제로는 Span 20, Triton X-100, IGEPAL CA-630, Brij 30, 35, Tween 20, 60, 80 등이 있다.

미생물로부터 산 촉매를 이용한 바이오오일 추출 공정 중에 산 촉매와 같이 음이온 계면활성제인 도데실벤젠술폰산나트륨을 첨가하고 가열하면, 산 촉매에 의해 높은 수율로 바이오오일이 얻어지면서, 동시에 바이오오일이 계면활성제에 의해 분해되어 높은 수율의 유리지방산이 바이오디젤 전환 공정에 앞서 오일 추출 단계에서 생성된다.

도데실벤젠술폰산나트륨의 벤젠기와 술폰산기가 트리글리세리드의 카르복실기 부분을 공격하여 유리지방산 형태로 분리되도록 하는 역할을 한다.

본 발명에서 사용되는 상기 배양액 중 오일 함유 미생물의 농도는 20 ~ 300g/L이고, 상기 혼합물 중 산 촉매의 농도는 0.5 ~ 10% (w/w)이며, 상기 혼합물 중 계면활성제의 농도는 0.1 ~ 5% (w/w)이다.

구체적으로 배양액 1L 기준, 이에 포함된 미생물의 양은 20 ~ 300g의 범위가 바람직하다. 만약 미생물의 농도가 20g/L 미만일 경우 미생물 양 대비 수분 함량이 매우 높아, 산 촉매와 계면활성제가 희석되어 오일 추출율이 낮으며, 미생물 농도가 300g/L를 넘을 경우 성상이 유동성이 적은 필터 케이크 형태로 되어 산 촉매와 계면활성제와의 균질한 반응이 어렵고 오일 추출율이 낮다.

또한 산 촉매는 혼합물 기준 100g당 0.5 ~ 10g의 범위로 사용하는 것이 바람직하다. 만약 농도가 0.5% (w/w) 미만일 경우 낮은 산 촉매 농도로 인하여 오일 추출율이 낮으며, 산 촉매가 10% (w/w) 보다 높을 경우 반응기의 부식을 초래할 수 있다.

또한 계면활성제는 혼합물 기준 100g당 0.1 ~ 5g 범위로 사용하는 것이 바람직하다. 만약 농도가 0.1% (w/w) 미만의 경우 유리지방산으로 전환되는 비율이 매우 낮으며, 농도가 5% (w/w) 초과일 경우 친수성과 소수성을 동시가 가진 계면활성제가 혼합물에 다량 함유되어 오일 추출을 저해하여 오일 추출율이 점점 감소하는 경향을 보이기 때문이다.

본 발명에서 사용되는 유기용매는 헥산, 메탄올, 클로로포름 중에서 선택되는 하나 이상이다. 미생물의 세포벽 내에 존재하는 오일을 용매추출법을 이용하여 추출하기 위해서는, 미생물의 세포벽을 일부 붕괴하고 용매가 안으로 침투할 필요가 있는데 산 촉매에 의해 세포벽이 약화되거나 붕괴되므로 유기용매를 이용한 오일 추출이 매우 용이해진다.

추출된 오일은 계면활성제에 의해 유리지방산 형태로 전환된다.

유기용매는 극성과 비극성 유기용매로 나뉘는데, 메탄올은 극성 유기용매이며 헥산과 클로로포름은 비극성 유기용매이다. 단독의 용매를 사용하거나, 용매를 혼합하여 사용하는 것이 가능하다. 용매의 밀도 및 물과의 친화도의 차이에 의해 헥산층은 상층에 존재하며, 클로로포름 층은 하층에 존재한다. 메탄올은 물과 혼합되어 상분리가 일어나지 않으므로, 헥산-메탄올 또는 클로로포름-메탄올의 혼합 용매가 바람직하다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 이에 대비되는 비교예이다.

[실시예 1] 산 촉매와 계면활성제 SDBS를 이용한 유리지방산 추출법

배양된 Chlorella vulgaris를 원심분리를 통하여 수분을 일부 제거한 후, 20g/L의 습식 미세조류 용액을 준비하였다. 100mL 열수 반응기에 미세조류 용액을 50mL 채우고, 황산 농도는 0.5, 1, 2% (w/w)로 하였으며, 음이온 계면활성제 SDBS(sodium dodecyl benzene sulfonate)의 농도는 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1% (w/w)로 하였다. 황산열수 반응을 위하여 120℃에서 1시간 반응시켰다. 반응물을 식힌 후 헥산-메탄올 (7:3(v/v)) 용매를 20mL 넣고 2시간 동안 교반하였다. 용매 층을 분리하고 증발(evaporation)을 수행한 후, 회수된 오일의 양을 정량하였다.

오일 추출율(%)은 초기 미세조류의 오일 함량 대비 추출된 오일량의 백분율로 나타내었다. 오일 중의 유리지방산 함량은 KOH 적정에 의한 산가 분석을 통하여 측정하였다.

산가(acid value, AV)는 오일 1g 중에 포함된 유리 산을 중화하는데 필요한 KOH의 mg수로 정의된다. 산가 및 유리지방산(free fatty acid, FFA) 함량은 다음과 같이 계산되었다.

(1)

V = 사용한 KOH 용액의 부피 (mL)

c = KOH 용액의 몰 농도

m = 시료의 질량 (g)

(2)

C. vulgaris의 초기 오일 함량은 건조 중량 대비 29.6% (w/w)이며, 오일 추출율은 산 촉매인 황산의 농도에 영향을 받지 않았지만, 계면활성제인 SDBS의 농도에 영향을 받았다. 황산열수 처리에 의하여 계면활성제를 넣지 않은 경우에도 높은 오일 추출율을 나타냈으며, 계면활성제의 농도가 0.2%인 경우에서 오일 추출율은 더 증가하였다. 이후로는 계면활성제의 양이 증가할수록 오일 추출율이 조금씩 낮아지는 경향을 보이긴 하지만 전체적으로 황산열수 처리에 기인하여 높은 오일 추출율을 보이고 있다 (도면 2참조).

이 때 추출된 오일의 유리지방산 함량을 분석해보면, 황산열수 처리시에는 유리지방산 함량이 25 ~ 40%였으며 황산 농도가 높을수록 높은 유리지방산 함량을 나타내어 산 촉매에 의해서도 일부 트리글리세리드가 유리지방산으로 분해되었음을 알 수 있다. 계면활성제의 농도가 증가할수록 높은 유리지방산 함량을 나타내며, 1% 황산 및 0.4% SDBS 조건에서 오

일이 거의 100% 유리지방산으로 전환되는 것을 알 수 있으며, 2% 황산 및 0.2% SDBS 조건에서도 오일이 거의 100% 유리지방산으로 전환되었다. 황산이 0.5%일 경우에는 1%의 계면활성제 농도에서도 오일이 전부 유리지방산으로 전환되지 않았으며 더 높은 농도의 계면활성제 첨가를 필요로 하였다 (도 3 참조).

이 결과로부터 황산열수 반응에 계면활성제 SDBS를 첨가함으로써 100% 유리지방산 전환이 가능함을 확인하였으며, 본 발명을 통한 고효율 유리지방산 추출이 가능함을 확인하였다.

[비교예 1] 산 촉매와 계면활성제 SDS를 이용한 유리지방산 추출법

배양된 Chlorella vulgaris를 원심분리를 통하여 수분을 일부 제거한 후, 20g/L의 습식 미세조류 용액을 준비하였다. 100mL 열수 반응기에 미세조류 용액을 50mL 채우고, 황산 농도는 1% (w/w)로 하였으며, 음이온 계면활성제 SDS(sodium dodecyl sulfate)의 농도는 0, 0.2, 0.6, 1% (w/w)로 하였다. 황산열수 반응을 위하여 120℃에서 1시간 반응시켰다. 반응물을 식힌 후 헥산-메탄올 (7:3(v/v)) 용매를 20mL 넣고 2시간 동안 교반하였다. 용매 층을 분리하고 evaporation을 수행한 후, 회수된 오일의 양을 정량하였다. 오일 추출율(%)은 초기 미세조류의 오일 함량 대비 추출된 오일량의 백분율로 나타내었다. 오일 중의 유리지방산 함량은 KOH 적정에 의한 산가 분석을 통하여 측정하였다.

계면활성제가 첨가되지 않은 황산열수 처리시 유리지방산 함량은 25%였으며, SDS가 첨가되었을 경우 계면활성제의 양에 관계없이 유리지방산 함량이 증가되는 현상이 나타나지 않고 초기 유리지방산 함량을 그대로 유지하였다.(도 4 참조)

따라서 미세조류 오일의 지방산 전환에 SDS는 효과가 없었으며, SDBS가 효율적인 것으로 나타났다.

[실시예 2] 산 촉매와 계면활성제 SDBS를 이용하여 추출된 유리지방산의 바이오디젤 전환

바이오디젤 촉매인 황산 0.1, 0.5, 1, 3% (w/w) 농도인 조건에서 과량의 메탄올을 첨가하여 유리지방산을 바이오디젤로 전환하였다. 반응조건은 100℃에서 1시간으로 하였다. 바이오디젤 전환율은 지방산메틸에스테르(fatty acid methyl ester, FAME) 표준분석법(EN 14103)에 따라 Agilent 6890 Gas Chromatography로 분석하였다. 컬럼은 HP-INNOWAX capillary column (30m ㅧ 0.32mm ㅧ 0.5μm)을 사용하였다. FAME의 정량화를 위하여 내부 표준시료로 methyl heptadecanoate (Fluka)를 이용하여 분석하였다. FAME 농도는 다음의 식으로부터 계산되었다.

(3)

∑A : C14:0에서 C24:1 사이에 존재하는 메틸에스테르의 총 피크 면적

A_EI : 내부 표준물질(methyl heptadecanoate)의 피크면적

C_EI : 사용된 내부 표준물질의 농도 (mg/mL)

V_EI : 사용된 내부 표준물질의 부피 (mL)

m : 시료의 질량 (mg)

초기 추출된 오일의 바이오디젤 전환 가능한 유리지방산 함량은 85%였다. 황산 농도를 3%에서 0.1%까지 줄여나감에 따라 FAME 함량은 그대로 유지되어 적은 황산 농도 (0.1%) 조건에서도 높은 바이오디젤 전환율을 얻을 수 있었다 (도 5 참조).

따라서 본 발명을 통하여 미세조류로부터 산 촉매와 계면활성제 SDBS를 이용하여 추출된 유리지방산의 바이오디젤 전환이 매우 용이해졌음을 알 수 있다.

[실시예 3] 헥산-메탄올 유기용매를 이용하여 추출된 오일의 바이오디젤 전환

건조된 Chlorella vulgaris로부터 헥산-메탄올 (7:3 (v/v)) 용매를 이용하여 오일을 추출하였다. 1000rpm에서 6시간 동안 상온에서 교반하였으며, 용매 층을 분리하고 evaporation을 수행한 후, 오일을 회수하였다. 유기용매 추출 오일은 트리글리세리드와 유리지방산을 모두 포함한 오일이다.

바이오디젤 촉매인 황산 0.1, 0.5, 1, 3, 5, 10% (w/w) 농도인 조건에서 과량의 메탄올을 첨가하여 오일을 바이오디젤로 전환하였다. 반응조건은 100℃에서 1시간으로 하였다. 바이오디젤 전환율은 지방산메틸에스테르(fatty acid methl ester, FAME) 표준분석법(EN 14103)에 따라 Agilent 6890 Gas Chromatography로 분석하였다.

초기 추출된 오일의 바이오디젤 전환 가능한 유리지방산 함량은 85%였다. 황산 농도를 0.1%에서 10%까지 증가시킴에 따라 FAME 함량이 점점 증가하여 10%의 황산 농도에서 높은 FAME 함량을 나타내어, 트리글리세리드와 유리지방산을 포함하는 오일의 바이오디젤 전환을 위해서는 많은 양의 황산을 필요로 하는 것을 알 수 있다. (도 6 참조)

트리글리세리드와 유리지방산을 포함한 오일의 바이오디젤 전환을 위하여 10% (w/w)의 황산을 필요로 하는 반면, 유리지방산의 바이오디젤 전환을 위해서는 1/100 수준의 0.1% (w/w) 황산만을 필요로 한다는 것을 알 수 있다.

본 발명은 상술한 특정의 바람직한 실시 예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형실시가 가능한 것은 물론이고, 그와 같은 변경은 청구범위 기재의 범위 내에 있게 된다.

Claims (10)

1. a) 오일 함유 미생물을 포함한 배양액에 산 촉매 및 술폰산기와 벤젠기를 갖는 음이온 계면활성제를 첨가한 혼합물을 준비하는 단계;
   b) 상기 혼합물을 가열하여 유리지방산 형태의 오일을 추출하는 단계;를 포함하여 구성된 것을 특징으로 하는 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 b) 단계 후, c) 수득된 혼합물에 유기용매를 첨가하여 유리지방산이 포함된 유기용매층과 미생물 잔해가 포함된 층으로 상분리하는 단계; 를 더 포함하여 구성된 것을 특징으로 하는 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법.
   
3. 청구항 2에 있어서,
   상기 c)단계 후, d) 상기 미생물 잔해가 포함된 층으로부터 유리지방산이 포함된 층을 별도로 분리한 후 상기 유기용매를 제거하는 단계; 를 더 포함하여 구성된 것을 특징으로 하는 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법.
   
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 오일 함유 미생물은 미세조류, 박테리아, 효모, 진균 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법.
   
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 산 촉매는 황산, 염산, 질산 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법.
   
6. 청구항 1에 있어서,
   상기 계면활성제는 도데실벤젠술폰산나트륨 (SDBS, Sodium Dodecyl Benzene Sulfonate)인 것을 특징으로 하는 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법.
   
7. 청구항 1에 있어서,
   상기 배양액 중 오일 함유 미생물의 농도는 20 ~ 300g/L인 것을 특징으로 하는 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법.
   
8. 청구항 1에 있어서,
   상기 혼합물 중 산 촉매의 농도는 0.5 ~ 10% (w/w)인 것을 특징으로 하는 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법.
   
9. 청구항 1에 있어서,
   상기 혼합물 중 계면활성제의 농도는 0.1 ~ 5% (w/w)인 것을 특징으로 하는 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법.
   
10. 청구항 2에 있어서,
    상기 유기용매는 헥산, 메탄올, 클로로포름 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 미생물로부터 산 촉매와 계면활성제를 이용한 유리지방산 고효율 추출 방법.

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