KR101471243B1

KR101471243B1 - 나노클레이를 이용한 오일함유 미생물 수확방법

Info

Publication number: KR101471243B1
Application number: KR1020120028525A
Authority: KR
Inventors: 오유관; 박지연; 김보화; 신현재; 이영철
Original assignee: 한국에너지기술연구원
Priority date: 2012-03-20
Filing date: 2012-03-20
Publication date: 2014-12-10
Also published as: KR20130106744A

Abstract

본 발명에서는 미세조류의 효율적인 응집제를 개발하기위해 Chlorella sp. KR-1(KCTC0426BP) 균주를 질산염 농도 3 mM의 N8 배지를 사용하여 배양하고, 배양된 미세조류를 화학응집제로 Al₂(SO₄)₃ㆍ18H₂O (Aldrich, 227617)과 Nanoclay로서 Al-APTES, Ca-APTES, Mg-APTES, Mg-N3 등 총 4종류를 사용하여 배양된 미세조류를 응집 침전시키기 위한 나노클레이의 농도별 침전 효율을 조사하여 였다. 배양된 미세조류를 효율적으로 응집 침전시키기 위한 농도와 투여조건을 명확히 함으로서 미세조류 배양뿐만 아니라 수확에서도 많은 비용이 소용되는, 미세조류 바이오디젤 생산기술의 경제성 측면에서 생산단가가 낮아져 오일 함유 미생물로부터 오일을 추출하기 위하여 필요로 하는 공정비용 상승 문제를 개선함으로서 경제성 있는 오일 및 바이오디젤의 생산이 가능하여 바이오디젤의 대중화를 빨리 이룰 수 있다는 장점을 가진다.

Description

나노클레이를 이용한 오일함유 미생물 수확방법 {Harvesting oleaginous microorganisms using nanoclay}

본 발명은 미세조류의 효율적인 응집제를 개발하기 위한 기술로서 화학응집제는 일반적으로 Al₂(SO₄)₃, FeCl₃, ZnSO₄, ZnCl₂, CaSO₄, CaCl₂ 등의 다양한 무기 화합물이 많이 활용되고 있다 (A. Papazi, P. Makridis, P. Divanach, J. Appl. Phycol. (2010) 22:349-355). 본 발명에서는 효율적인 응집제를 개발하기 위해 미세조류를 배양하고 배양된 미세조류에 화학응집제로서 Al₂(SO₄)₃ㆍ18H₂O (Aldrich, 227617) 및 나노클레이(Nanoclay)로서 Al-APTES, Ca-APTES, Mg-APTES, Mg-N3 를 사용하여 배양된 미세조류에 대한 응집, 침전효율과 적정 사용량 및 농도조건을 실험에 의해 규명하였다.

우리나라는 석유 부존자원이 없으며 대부분 수입에 의존하고 있다. 국제유가, 기후변화, 정치 환경변화 등에 의한 수급 상황에 따라 경제가 크게 영향을 받고 있으며, 국내 기술 및 자본을 이용한 대체에너지 기술개발 및 자원 확보가 절실한 상황이다. 현재 고유가 및 기후변화협약에 대비하기 위하여 에너지효율화 기술 및 태양, 풍력 등 재생에너지 기술에 대한 투자가 확대되고 있으나, 수송용 부문에서 석유 대체가 어렵다는 한계가 있다. 수송부분에서 사용되는 에너지는 전체 에너지 소비량의 21% 수준이며, 이중 98%는 석유에 의하여 공급되고 있다(2006년 기준). 따라서 석유 대체 연료로 바이오디젤이 각광을 받고 있다.

바이오디젤은 식물성 기름 또는 동물성 유지로부터 생산된 지방산의 메틸 또는 에틸 에스테르 화합물로 정의된다. 바이오디젤은 기존 경유에 비해 일산화탄소, 미세먼지, 탄화수소, 독성물질 등 대기 오염물질 배출을 크게 줄일 수 있어 친환경 자동차 연료로 적합하다. 또한 바이오디젤의 연소에서 나오는 이산화탄소는 다시 식물의 광합성 기작에 의해 흡수, 고정되므로 이산화탄소의 순 배출이 거의 없어, 전 세계적으로 이산화탄소 중립 연료(CO₂-neutral fuel)로 큰 주목을 받고 있다.

국내에서도 바이오디젤의 보급 확대가 국제사회에서 도입하려는 이산화탄소 배출 규제에 대한 가장 현실적 대응 방안이라는 판단 하에 2002년부터 2006년까지 수도권과 전라북도 등에서 바이오디젤 시범 보급 사업을 시행한 후 2006년 7월부터 바이오디젤 보급을 전국으로 확대하였다. 또한 정유사가 구입하는 바이오디젤의 물량을 매년 높여 바이오디젤이 널리 보급되도록 하였다. 2010년부터 바이오디젤 2%를 경유에 혼합한 BD5 (바이오디젤 5% 이하 혼합 경유)가 연간 40만kL 규모로 기존 인프라와 주유소를 통해 보급되고 있다. 이러한 국내 바이오디젤 시장규모를 금액으로 평가하면 2010년 현재 6,000억원 규모이고, 2012년에는 약 8,000억원 시장으로 성장할 것으로 전망된다.

바이오디젤은 연료로서 뿐만 아니라 공해성 석유제품을 이미 상당수 대체하는 화학물질의 중간체로 사용하고 있고 응용성이 급격하게 확장되고 있는 산업이다. 바이오디젤은 친환경 제품인 생분해성 계면활성제, 합성 윤활유 그리고 저독성 용제의 제조 원료로 사용되고 있으므로 EU 등 선진국에서 법적/제도적으로 장려 정책을 강도 높게 시행하고 있어 성장성이 기대된다. 또한 바이오디젤 플랜트 산업은 결합형 지식산업이자 벤처기업형 산업, 차세대 전략산업 및 국제산업이라는 산업적 특징이 있으며, 기술적으로는 기술집약적 첨단사업이자 정부의 정책적 의지가 강하게 작용하는 유망 산업으로 평가받고 있다.

그러나 현재 바이오디젤은 주로 콩, 유채 등의 식용작물에서 추출한 식물성 기름을 이용해 생산하고 있으며(1세대 바이오연료 기술), 이는 곡물가격 상승을 유발해 아프리카와 같은 빈곤 국가와 저소득층의 식량난을 가중시킨다는 비판을 받고 있다. 또한 늘어나는 바이오디젤의 수요에 맞추어 팜유와 같은 원료 생산을 위해 광범위한 열대우림 또는 산림이 개발되고 있으며, 이는 오히려 지구온난화를 부추긴다는 지적도 있다. 더욱이 우리나라는 바이오디젤의 원료(대두유) 대부분을 해외에서 수입하고 있으므로 수급 및 가격이 석유자원과 유사하게 대외적인 상황 변화에 크게 의존할 가능성이 높다.

이와 같은 문제점을 해결하기 위해 기존 식용유 또는 팜유 대신에 미세조류(Microalgae)를 원료로 활용하는 기술이 '차세대 바이오디젤 기술'로 많은 관심을 받고 있다. 미세조류는 물, 이산화탄소와 햇빛을 이용하여 성장이 가능하며, 황무지, 해안가, 바다 등 어디서든 배양할 수 있어 기존 육상작물과 토지나 공간 측면에서 상호 경쟁하지 않는다. 또한 미세조류는 배양조건에 따라 생체 내에 많은 양의 지질(최대 70%)을 축적하며, 단위 면적당 오일(지질) 생산량이 콩과 같은 기존 식용작물에 비해 50-100배 이상 높아 대체 생물원유로서의 가능성이 매우 높다. 이로부터 단위 면적당 오일 생산량이 육상식물에 비해 매우 우수한 미세조류에 기반한 바이오디젤 생산기술에 대한 관심이 높아지고 있다 (표 1).

미세조류 및 기존 에너지 작물의 오일 생산량

에너지 작물	오일 생산량 (L/ha)
옥수수	172
대두	446
카놀라	1,190
자트로파	1,892
코코넛	2,689
팜	5,950
미세조류	58,700

미세조류는 단일세포의 광합성 생물로 3~30㎛의 크기에 담수나 해수에서 서식한다. 이산화탄소를 흡수하고 산소를 배출하며, 오일 및 유용물질을 함유하고 있다. 미세조류는 육상식물에 비해 성장률이 매우 빠르고, 대량으로 고농도 배양이 가능하며, 극한 환경에서도 성장이 가능하다는 장점을 가진다. 미세조류는 사용 가능한 오일 성분이 바이오매스의 30~70%에 달하므로, 기존 작물에 비해 높은 연료 생산성을 나타낸다. 미세조류는 다른 작물과 토지나 공간 측면에서 상호 경쟁하지 않으므로, 현재 식량 자원의 가격 상승 및 산림 파괴 등 2차적인 환경 문제를 일으키지 않는다. 따라서 미세조류 이용 바이오디젤 생산기술은 단위 면적 당 높은 생산성을 나타내어 자원 확보가 용이하고 식량 자원과의 경쟁이 없으므로 국내 실정에 적합하다고 할 수 있다.

미세조류 바이오디젤 생산기술은 이산화탄소 저감, 친환경 연료 개발, 새로운 녹색산업 창출 등 여러 장점을 지니고 있지만 기존 1세대 바이오연료 기술보다 아직 상대적으로 경제성이 떨어진다. 대두유, 유채유, 팜유 등을 이용한 바이오디젤의 생산비용은 리터당 0.5-1.0 달러 수준인 반면 미세조류 바이오디젤의 생산단가는 최소 리터당 2달러 이상으로 추정되고 있다. 따라서 미세조류 바이오디젤의 경제성을 향상시킬 수 있는 기술개발이 필요하다.

미세조류 바이오디젤 생산기술은 크게 1) 미세조류 배양, 2) 수확, 3) 오일 추출, 4) 바이오디젤 전환 등 4개 공정으로 구성된다. 미국 아리조나 주립대 연구팀(2009)은 바이오디젤의 생산단가 중 각 공정이 차지하는 비용이 각각 42%, 22%, 20%, 16%로 발표한 바 있다. 이는 미세조류 배양뿐만 아니라 수확에도 많은 비용이 소용되며, 경제적인 수확기술의 개발이 미세조류 바이오디젤 생산기술의 경제성 측면에서 매우 중요하다는 것을 나타낸다.

미세조류 수확 기술로 원심분리(centrifugation), 여과(filtration), 응집(flocculation) 기술 등이 활발히 연구되고 있다. 원심분리 기술은 미세조류 수확기술로 많이 활용되고 있으나 대용량을 처리하기에는 시간이 많이 소요되며 에너지 비용이 높고, 기기가 비싼 단점이 있다. 여과기술의 경우 크기가 마이크로미터(μm) 단위로 매우 작은 미세조류에 의해 쉽게 막혀 연속적인 운전이 매우 어려우며 대용량에 적용하기가 쉽지 않다. 반면 양이온성 화학물질 첨가에 따른 응집 및 침전을 이용한 미세조류 수확기술은 반응속도가 매우 빠르며 대용량의 미세조류 배양액에 쉽게 적용할 수 있다. 또한 간단한 교반장치만 필요하여 여과 및 원심분리 기술에 비해 설치비 및 운전비가 저렴하다.

국내 공개특허공보 제10-2011-0035324호에는 플루오르세인 이소티오시아네이트가 표지된 마그네슘 유기클레이 및 이의 제조 방법에 관한 것으로 플루오르세인 이소티오시아네이트와 3-아미노프로필트리에톡시실란 (3-aminopropyltriethoxy silane)을 콘쥬게이션 시키고, MgCl2를 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 하는 이소티오시아네이트-표지된 마그네슘 유기클레이의 제조 방법이 개시되어있다. 또한, 국내 공개특허공보 제10-2011-0096377호에는 미세조류로부터 오일 추출 및 바이오디젤 전환 방법에 관한 것으로, 미세조류로부터 오일을 추출하여 바이오디젤을 생산시, 추출된 오일에 존재하여 바이오디젤 전환 반응을 저해하는 현상을 가지는 엽록소를 바이오디젤 전환 반응 전에 미리 제거함으로써 바이오디젤 전환율을 증가시키는 방법을 개시하고 있다. 상세하게는 미세조류로부터 오일을 추출하는 단계; b) 추출된 오일을 흡착제와 접촉시켜 오일에 포함된 엽록소를 제거하는 단계; 및 c) 엽록소가 제거된 오일을 바이오디젤로 전환하는 단계;를 포함하여 구성된 미세조류로부터 오일 추출 및 바이오디젤 전환 방법을 제공한다. 그러나 상기 발명들은 본 발명의 기술적 특징으로 하고 있는 오일 함유 미생물을 효율적으로 수확하기 위하여 Chlorella sp. KR-1(KCTC0426BP) 균주를 질산염 농도 3 mM의 N8 배지를 사용하여 배양하고, 배양된 미세조류를 화학응집제로 Al2(SO4)3ㆍ18H2O (Aldrich, 227617)(이하 Alum으로 명칭)과 Nanoclay로서 Al-APTES, Ca-APTES, Mg-APTES, Mg-N3 등 총 4종류를 사용하여 배양된 미세조류를 응집 침전시키기 위한 나노클레이의 농도별 침전 효율을 제공하는 본 발명과는 다른 구성을 갖는다.

본 발명에서는 미세조류의 효율적인 응집제를 개발하기위해 화학응집제로 Al₂(SO₄)₃ㆍ18H₂O (Aldrich, 227617) 및 Nanoclay로서 Al-APTES, Ca-APTES, Mg-APTES, Mg-N3 등 총 4종류를 사용하여 배양된 미세조류에 대한 응집, 침전효율과 적정 사용량 및 농도조건을 실험에 의해 규명하고자한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여

Chlorella sp. KR-1(KCTC0426BP) 균주를 질산염 농도 3 mM의 N8 배지를 사용하여 배양하고, 배양된 미세조류를 화학응집제로 Al₂(SO₄)₃ㆍ18H₂O (Aldrich, 227617)(이하 Alum으로 명칭)과 Nanoclay로서 Al-APTES, Ca-APTES, Mg-APTES, Mg-N3 등 총 4종류를 사용하여 배양된 미세조류를 응집 침전시키기 위한 나노클레이의 농도별 침전 효율을 조사하였다.

화학응집제로 Alum과 Nanoclay로서 Al-APTES, Ca-APTES, Mg-APTES, Mg-N3 등 총 4종류를 사용하여 배양된 미세조류를 효율적으로 응집 침전시키기 위한 농도와 투여조건을 명확히 함으로서 미세조류 배양뿐만 아니라 수확에서도 많은 비용이 소용되는, 미세조류 바이오디젤 생산기술의 경제성 측면에서 생산단가가 낮아져 오일 함유 미생물로부터 오일을 추출하기 위하여 필요로 하는 공정비용 상승 문제를 개선함으로서 경제성 있는 오일 및 바이오디젤의 생산이 가능하여 바이오디젤의 대중화를 빨리 이룰 수 있다는 장점을 가진다.

도 1은 라이브러리에 있는 유기나노클레이의 합성 모식도를 나타낸다.
도 2는 Ca-APTES, Mg-APTES, Al-APTES clay 합성에서 사용한 APTES의 구조식(N1)을 나타내며, Mg-N3합성에서 사용한 N3의 구조식을 나타낸다.
도 3은 Alum 농도에 따른 반응 30분 경과 후 사진을 나타내며, 맨 왼쪽은 Alum을 첨가하지 않은 control, 맨 오른쪽은 1.9 g/L Alum 첨가한 경우를 나타낸다.
도 4는 Alum 농도에 따른 침전효율의 변화를 나타낸다.
도 5는 Al-APTES 농도에 따른 반응 30분 경과 후 사진을 나타내며, 맨 왼쪽은 Al-APTES을 첨가하지 않은 control, 맨 오른쪽은 1 g/L Al-APTES 첨가한 경우를 나타낸다.
도 6은 Al-APTES 농도에 따른 침전효율의 변화를 나타낸다.
도 7은 Ca-APTES 농도에 따른 반응 30분 경과 후 사진으로, 맨 왼쪽은 Ca-APTES을 첨가하지 않은 control, 맨 오른쪽은 1 g/L Ca-APTES 첨가한 경우를 나타낸다.
도 8은 Ca-APTES 농도에 따른 침전효율의 변화를 나타낸다.
도 9는 Mg-N3 농도에 따른 반응 30분 경과 후 사진을 나타내며, 맨 왼쪽은 Mg-N3을 첨가하지 않은 control, 맨 오른쪽은 1 g/L Mg-N3 첨가한 경우를 나타낸다.
도 10은 Mg-N3 농도에 따른 침전효율의 변화를 나타낸다.
도 11은 Mg-APTES 농도에 따른 반응 30분 경과 후 사진으로, 맨 왼쪽은 Mg-APTES을 첨가하지 않은 control, 맨 오른쪽은 1 g/L Mg-APTES 첨가한 경우를 나타낸다.
도 12는 Mg-APTES 농도에 따른 침전효율의 변화를 나타낸다.
도 13은 반응 30분 경과 후 응집제별 농도에 따른 침전효율을 나타낸다.
도 14는 응집제별 침전물의 개수(A) 및 부피(B) 분포를 나타낸다.
도 15는 Al-APTES 농도별 침전물의 개수(A) 및 부피(B) 분포를 나타낸다.
도 16은 응집제별 침전세포의 모습 (×1000)으로 위) control, Alum, Al-APTES, 아래) Ca-APTES, Mg-APTES, Mg-N3 응집제는 1.0 g/L로 첨가한 경우를 나타낸다.
도 17은 응집제 농도에 따른 pH 변화를 나타낸다.
도 18은 Al-APTES 0.2 g/L에서의 pH 변화시 반응 30분 경과 후 사진을 나타낸다.
도 19는 Al-APTES 0.2 g/L에서 pH 변화에 따른 침전효율을 나타내며, Control 1은 Al-APTES 및 NaOH 첨가 안한 상태, control 2는 Al-APTES 0.2 g/L에 NaOH 첨가 안한 상태를 나타낸다.

이하 본 발명의 실시 예인 구성과 그 작용을 첨부도면에 연계시켜 상세히 설명하면 다음과 같다. 또한 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다.

가. 미세조류배양 및 응집제 제조

1) 미세조류 및 배양조건

본 실험에는 Chlorella sp. KR-1(KCTC0426BP) 균주를 사용하였으며, 질산염 농도 3 mM의 N8 배지를 사용하였다. N8 배지의 조성은 KNO₃(0.3033g/L), KH₂PO₄(0.7400g/L), Na₂HPO₄(0.2598g/L), MgSO₄·7H₂O (0.0500g/L), CaCl₂(0.0132g/L), FeNaEDTA (0.0100g/L), ZnSO₄·7H₂O (0.0032g/L), MnCl₂·4H₂O (0.0130g/L), CuSO₄(0.0117g/L), Al₂(SO₄)₃·18H₂O (0.0070g/L)이었다.

KR-1 균주를 형광등이 설치된 항온실에서 고체배지, 250mL 플라스크, 1L 원통형 유리 광생물반응기를 이용하여 순차적으로 예비 배양한 후 7L 원통형 유리 광생물반응기(본 배양)의 10% 수준으로 접종하여 진행하였다. 1L와 7L 원통형 유리 광생물반응기에서 배양시 공급가스의 CO₂농도는 10%(v/v)이었으며, 가스 공급속도는 각각 0.3L/min 및 0.75L/min이었다. 실내 항온 배양실의 온도는 27~32℃, 빛의 세기는 135∼197 μmol/m²/s였다. 약 170시간 동안 배양하여 실험에 사용하였고, 이 때 균체농도는 1.5∼1.7 g/L였다.

2) 응집제 및 나노클레이 제조

화학응집제로 Al₂(SO₄)₃ㆍ18H₂O (Aldrich, 227617)를 사용하였다(이하 Alum으로 명칭). Nanoclay는 조선대학교에서 제공받은 것으로 Al-APTES, Ca-APTES, Mg-APTES, Mg-N3 등 총 4종류를 사용하였다. 나노클레이의 합성방법으로는 국내 공개특허공보 제10-2011-0035324호에 Mg-유기클레이의 합성 방법이 공지되어있다.

또한, 유기클레이 합성은 다음과 같은 방법으로 합성가능하다. 도 1에는 라이브러리에 있는 유기나노클레이의 합성 모식도를 나타낸다.

유기용매 (BTEX, DMF, pyridine, DMSO, hexane, 메탄올 등 대표적으로 독성이 덜한 에탄올) 40 mL에 메탈 하이드레이트 형태(1.68g)을 녹인다. 완전히 혼합을 통해 녹인 후, 2.6 mL가량의 silane를 전구체를 넣는다 (이때 메탈 양이온 몰비 > silane 몰비). Aminoclay의 경우는 촉매를 따로 넣지 않으며 6시간 이상이 되면 평형상태에 도달을 하게 된다. 클레이 라이브러리에서 다른 칼럼의 silane 전구체를 사용할 시에는 염기성 촉매인 NaOH을 넣어주어야 sol-gel 반응이 진행이 된다.

따라서 Aminosilane 칼럼을 제외한 유기나노클레이의 경우에는 수용액에서도 합성이 용이하다. Aminosilane을 수용액 base에서 합성할 경우, 입자가 만들어지자마자 물에 녹아버리는 특성을 보이므로 입자회수가 용이하지 않은 점이 있다. 유기나노점토의 대량 생산시에는 반응 미디어인 에탄올과 메탈 양이온 silane 전구체를 비례적으로 늘려서 반응을 시키면 간단히 얻을 수 있으며 50도의 오븐에서 하루정도 건조시킨 후 막자사발로 가루로 만들어 사용하면 된다.

본 발명에서 사용된 나노클레이 중 이하 Mg-APTES의 합성방법에 대해 설명하면 다음과 같다. 3-아미노프로필트리에톡시실란 (APTES, 99%)을 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)로부터 구입하였다. 99.9% 이상 순도인 에탄올은 Merck KGaA (Darmstadt, Germany)로 부터 구입하였다. 마그네슘 클로라이드 헥사하이드레이트 (Magnesium chloride hexahydrate, 98.0%)를 Junsei Chemical Co., Ltd.로부터 구입하였다.

아미노프로필 마그네슘 필로실리케이트 점토 (aminopropyl functionalized magnesium phyllosilicate clay, Mg-APTES)는 졸-겔 합성법에 의하여 제조되었다. 에탄올 40mL에 교반을 통하여 염화마그네슘 6수하물 (magnesium chloride hexahydrate) 1.68g을 완전히 녹인다. 에탄올-염화마그네슘 용액에 2.6mL의 3-아미노프로필트리에톡시실란 (3-aminopropyltriethoxysilane, APTES)을 첨가하고, 12시간 동안 상온에서 교반한 뒤 침전물을 원심분리로 분리한다. 50mL 에탄올로 세정한 후, 40℃에서 건조시키고 막사사발을 이용하여 가루로 만든다.

도 2에는 본 발명의 Ca-APTES, Mg-APTES, Al-APTES clay 합성에서 사용한 APTES의 구조식(N1)을 나타내며, Mg-N3합성에서 사용한 N3의 구조식을 나타낸다.

3) 침전효율 측정

50 mL test tube에 무게를 측정한 응집제를 넣고 2 mL의 증류수에 녹인 후, 28 mL의 KR-1 배양액을 넣어 총 부피 30 mL로 실험하였다. 마그네틱 바를 이용하여 800 rpm에서 1분 동안 교반하였다. 이후 실온에 방치한 뒤 일정한 시간 간격으로 샘플을 200 μL씩 채취하여 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 샘플은 반응액의 높이 2/3지점인 20 mL 부근에서 채취하였다. 침전효율은 다음 식으로 계산하였다.

3) 세포 변화 관찰

응집제를 이용한 침전반응 후 침전물의 상태를 알아보기 위해 광학현미경으로 1000배율 하에서 관찰하였다. 또한 Coulter counter(model multisizer 4, Beckman Coulter, USA)를 이용하여 세포의 크기상태의 변화를 조사하였다. Coulter counter는 aperture tube 20 μm를 사용하였고, 전해질 20 mL에 초기 배양액 50 μL를 넣어 기포가 생기지 않게 섞어준 후 측정하였다. 침전물의 경우 농도가 매우 높아 샘플의 양 1∼5 μL을 넣어 측정하였다.

나. 응집제에 따른 침전효율

1) 응집제별 침전효율

출원인의 앞선 실험에서 KR-1을 대상으로 다양한 화학응집제(Al₂(SO₄)₃, FeCl₃, ZnSO₄, ZnCl₂, CaSO₄, CaCl₂)의 성능을 조사하였고, Al₂(SO₄)₃이 침전효율이 가장 우수하였다(한국에너지기술연구원, 조류 이용 바이오연료 생산 요소기술 개발(II), KIER-B02408, 2010.12).

본 발명에서는 Al₂(SO₄)₃ㆍ18H₂O(이하 Alum 명칭) 대비 나노클레이의 침전효율을 조사하였다. Alum 응집실험은 응집제를 첨가하지 않은 Control부터 응집제를 약 200 mg씩 증가시켜 1.9 g/L까지 총 11단계의 농도로 진행하였다. 도 3은 Alum 농도에 따른 반응 30분 경과 후 사진을 나타내며, 맨 왼쪽은 Alum을 첨가하지 않은 control, 맨 오른쪽은 1.9 g/L Alum 첨가한 경우를 나타낸다.

본 발명의 실험은 반응 후 초기 5분 내에 급격한 침전정도의 차이를 나타내었고, 반응 30분 이후부터 2시간까지 침전효율 변화는 크지 않았다. Al₂(SO₄)₃ㆍ18H₂O 농도 1.0 g/L의 경우가 64.1%로 가장 높았고, 다음으로 1.2 g/L가 58.2%로 높게 나타났다. 1.4 g/L의 경우 23.4%로 1.0, 1.2 g/L의 침전효율의 절반수준이었다. 나머지 0.2∼0.8, 1.6∼1.9 g/L는 침전효율이 약 3%로 control의 침전효율 변화와 별다른 차이를 나타내지 않았다. 도 4는 Alum 농도에 따른 침전효율의 변화를 나타낸다.

나노클레이(Nanoclay) 실험은 Alum의 가장 높은 침전효율 농도인 1.0 g/L를 최대 농도범위로 하여 응집제를 첨가하지 않은 Control부터 응집제를 증가시켜 조사하였다. 도 5는 Al-APTES 농도에 따른 응집반응 30분 경과 후 모습을 나타낸다. 도 5의 왼쪽은 Al-APTES을 첨가하지 않은 control, 오른쪽은 1 g/L Al-APTES 첨가한 경우를 나타낸다. Al-APTES 농도가 높을수록 침전효율이 높아지고, 0.5 g/L부터는 상등액이 투명하여 침전효율이 매우 높음을 알 수 있다. 도 6은 Al-APTES 농도에 따른 침전효율의 변화를 나타낸다. 반응 30분 후의 침전효율은 0.2 g/L가 44.4%, 0.3 g/L가 80.6%, 0.4 g/L가 94.1%이었고, 농도 0.5 g/L 이상은 99%이상의 침전효율을 나타내었다[도 6].

도 7은 Ca-APTES 농도에 따른 반응 30분 경과 후 모습으로, 맨 왼쪽은 Ca-APTES을 첨가하지 않은 control, 맨 오른쪽은 1 g/L Ca-APTES 첨가한 경우를 나타낸다. Ca-APTES의 경우 또한 농도가 증가할수록 침전효율이 증가하는 경향을 나타내었다.

도 8은 Ca-APTES 농도에 따른 침전효율의 변화를 나타낸다. 농도 0.1∼1.0 g/L의 범위에서 농도가 0.1 g/L 높아질수록 침전효율의 증가량은 평균 7% 정도로 Al-APTES에 비해 차이가 크지 않았다. 반응 30분 후의 가장 높은 효율은 64.4%(1.0 g/L)이었다[도 8].

도 9는 Mg-N3 농도에 따른 반응 30분 경과 후 모습을 나타내며, 맨 왼쪽은 Mg-N3을 첨가하지 않은 control, 맨 오른쪽은 1 g/L Mg-N3 첨가한 경우를 나타내고 도 10은 Mg-N3 농도에 따른 침전효율의 변화를 나타낸다. Mg-N₃는 control 및 0.1, 0.5, 1.0 g/L의 4가지의 농도만으로 실험을 진행하였다. 침전반응 30분 후의 결과는 control < 0.1 g/L < 0.5 g/L < 1.0 g/L의 순서로 침전효율은 증가하였다. 침전효율이 가장 높은 1.0 g/L의 경우 반응 30분 후의 침전효율은 45.1%이었다[도 10].

도 11은 Mg-APTES 농도에 따른 반응 30분 경과 후 모습으로, 맨 왼쪽은 Mg-APTES을 첨가하지 않은 control, 맨 오른쪽은 1 g/L Mg-APTES 첨가한 경우를 나타낸다. Mg-APTES는 30분 후의 침전효율이 0.5 g/L에서 효율이 37.8%였으며, 0.6 g/L에서 96%로 증가하였다. 그러나 0.6 g/L 농도 이상에서는 0.1 g/L씩 농도가 높아질수록 오히려 2∼4%정도 침전효율이 감소하는 경향이 관찰되었다[도 12].

도 13은 반응 30분 후 각 응집제의 농도별 침전효율을 나타내고 있다. Al-APTES는 0.4 g/L에서 90% 이상의 우수한 응집효율을 나타내었다. 1 g의 미세조류를 침전시키기 위해서는 약 250 mg/g cell이 필요함을 알 수 있다. Mg-APTES의 경우 0.6 g/L에서 96%의 높은 효율을 나타내었으나 이후 농도증가에 따라 오히려 감소하는 경향이 관찰되었다. Alum의 경우 0∼0.8 g/L 까지 침전을 나타내지 않았다. 본 결과는 KR-1의 응집반응을 이용한 수확에는 Al-APTES가 가장 효과적임을 나타낸다.

2) 응집제 종류에 따른 침전물 크기 분포 및 사진

Coulter counter를 이용하여 각 응집제 1.0 g/L 일 때의 응집반응 침전물의 크기를 측정한 결과를 도 14에 나타내었다. Coulter counter 사용시 침전세포의 농도가 매우 높아, 샘플의 양으로 1∼10 μL의 소량을 사용하였고, 크기별 분포도를 조사하였다. KR-1의 세포크기 대부분 2∼4 μm 범위였다.

Alum을 첨가한 경우 control의 크기분포와 큰 차이가 없었다. Ca-APTES와 Mg-N₃, Mg-APTES를 첨가한 경우 control의 세포크기 분포에 비해 4∼10 μm 범위 분포정도가 약간 높게 나타났다. 반면 Al-APTES의 경우 4∼10 μm의 크기가 분포가 매우 크게 측정되었다. 4∼10 μm 개수의 퍼센트보다 부피의 퍼센트가 높은 것으로 보아 세포가 서로 붙은 상태로 크기가 측정된 것으로 보인다. 이는 coulter counter 측정시 전해질에 넣은 침전세포가 잘 풀어지지 않는 이유로 사료되어, Al-APTES를 이용한 응집력이 매우 강하기 때문이라 추측된다.

Al-APTES의 농도 변화(0.2∼1.0 g/L)에 따른 개수 및 부피의 분포도를 조사하였다[도 15]. 0.2 - 0.5 g/L의 범위에서는 첨가량이 증가할수록 4∼10 μm 구간의 분포범위가 점점 높아지는 경향이 관찰되었으나, 0.5 g/L와 1.0 g/L는 큰 차이를 나타내지 않았다.

도 16은 응집제별 침전세포의 모습 (×1000)으로 위) control, Alum, Al-APTES, 아래) Ca-APTES, Mg-APTES, Mg-N3 응집제는 1.0 g/L로 첨가한 경우를 나타낸다. 현미경 관찰 결과 Alum 및 nanoclay를 넣은 세포는 control에 비하여 서로 응집된 상태를 보였다[도 16].

3) 응집제 이용시 pH의 변화

도 17는 각각 응집제의 농도별 pH 변화를 나타내고 있다. Alum의 경우 1.0 g/L까지 농도가 증가할수록 pH가 감소하였다. 반대로 Mg-N₃는 농도가 증가할수록 pH가 증가하였고, 농도 1.0 g/L는 pH가 8.6이었다. Al-APTES와 Ca-APTES, Mg-APTES의 경우 pH는 농도에 따른 변화 없이 6∼7을 유지하였다. 대량배양시 배지 재사용 문제를 고려한다면 pH 변화가 없는 Al-APTES 및 Ca-APTES, Mg-APTES가 적합하다고 판단된다.

4) Al-APTES에 대한 pH 변화 효과

미세조류 배양액의 pH는 질소원의 종류 및 완충용액의 세기에 따라 달라 질 수 있다. 예를 들면 고농도의 질산염을 질소원으로 쓰고 완충용액의 세기가 충분하지 않을 pH는 최대 9.5까지 증가할 수도 있다.

본 발명에서는 미세조류 배양액의 pH 증가에 따른 Al-APTES의 침전효율을 조사하였다. 도 18은 Al-APTES 0.2 g/L에서의 pH 변화시 반응 30분 경과 후 사진을 나타낸다. Al-APTES는 0.2 g/L로 첨가하였다. pH 조절은 2N NaOH 60∼700 μL를 사용하였다. 도 18은 응집반응 30분후 pH에 따른 침전효율의 변화 사진을 나타내고 있다. pH 6.2 - 8.0의 경우 Al-APTES를 첨가하였을 때 약 40%의 침전효율을 나타내었으나, 이후 pH 증가에 따라 침전율은 감소하는 경향을 나타내었다. 이들 결과는 Al-APTES를 이용할 경우 적절한 pH 조절이 필요함을 나타낸다. 도 19는 Al-APTES 0.2 g/L에서 pH 변화에 따른 침전효율을 나타내며, Control 1은 Al-APTES 및 NaOH 첨가 안한 상태, control 2는 Al-APTES 0.2 g/L에 NaOH 첨가 안한 상태를 나타낸다.

5) 오일함유 미생물의 종류에 따른 나노클레이에 대한 응집효과

본 발명에서는 화학응집제로 Al₂(SO₄)₃ㆍ18H₂O (Aldrich, 227617)를 사용하였다(이하 Alum으로 명칭). Nanoclay로서 Al-APTES, Ca-APTES, Mg-APTES, Mg-N3 등 총 4종류를 사용하여, Chlorella 종을 대상으로 응집 침전실험을 하였으나 오일 함유 미생물로는 미세조류 외에도 박테리아, 효모, 진균 등의 미생물도 오일을 함유하고 있으므로, 이들의 다양한 종에도 적용이 가능하다. 본 발명의 나노클레이를 이용한 미생물 응집, 침전이 가능한 오일을 함유하는 대표적인 미생물과 각각의 오일 함량을 표 2에 나타내었다.

오일 함유 미생물의 오일 함량

	미생물	오일 함량 (wt%, dry)
Microalgae (미세조류)	Botryococcus braunii Cylindrotheca sp. Nitzschia sp. Schizochytrium sp. Chlorella sp.	25-72 16-37 45-47 50-77 30-50
Bacterium (박테리아)	Arthrobacter sp. Acinetobacter calcoaceticus Rhodococcus opacus Bacillus alcalophilus	>40 27-38 24-25 18-24
Yeast (효모)	Candida curvata Cryptococcus albidus Lipomyces starkeyi Rhodotorula glutinis	58 65 64 72
Fungi (진균)	Aspergillus oryzae Mortierella isabellina Humicola lanuginosa Mortierella vinacea	57 86 75 66

상기 표 2에 나타낸 오일 함유 미생물 이외에도 미세조류로서 아나시스티스 니둘란스(Anacystis nidulans), 안키스트로데스무스(Ankistrodesmus sp.), 비둘리파아 우리타(Biddulpha aurita), 체토세로스(Chaetoceros sp.), 치라미도모나스 애플라나타(Chlamydomonas applanata), 치라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii), 크로렐라(Chlorella sp.), 크로렐라 엘립소디아(Chlorella ellipsoidea), 크로렐라 에멀소니(Chlorella emersonii), 크로렐라 프로토더코이데스(Chlorella protothecoides), 크로렐라 프레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 크로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana), 크로렐라 뷸가리스(Chlorella vulgaris), 크로렐라 미누티시마(Chlorella minutissima), 클로로코쿠 리토레일(Chlorococcu littorale), 클로텔라 크립티카(Cyclotella cryptica), 두날리엘라 바르다윌(Dunaliella bardawil), 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina), 두날리엘라 테르티오렉타(Dunaliella tertiolecta), 두날리엘라 프리모렉타(Dunaliella primolecta), 짐노디움(Gymnodinum sp.), 헤머노모나스 카테라에(Hymenomonas carterae), 이소크리시스 갈베나(Isochrysis galbana), 이소크리시스(Isochrysis sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 마이크로모나스 푸실라(Micromonas pusilla), 모노두스 서브테라네우스(Monodus subterraneous), 나노클로리스(Nannochloris sp.), 나노클로롭시스(Nannochloropsis sp.), 나노클로롭시스 아토무스(Nannochloropsis atomus), 나노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina), 나비쿨라 필리쿨로사(Navicula pelliculosa), 니츠시아(Nitzschia sp.), 니츠시아 클로스테리움(Nitzscia closterium), 니츠시아 팔레아(Nitzscia palea), 오시스티스 폴리모피아(Oocystis polymorpha), 아우로코커스(Ourococcus sp.), 오실라토리아 루베스켄스(Oscillatoria rubescens), 파브로바 루테리(Pavlova lutheri), 패오닥트리움 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum), 피크노코커스 프로바솔리(Pycnococcus provasolii), 피라미노나스 코르다타(Pyramimonas cordata), 스피눌라 플라텐시스(Spirulina platensis), 스테파노디스커스 미누투루스(Stephanodiscus minutulus), 스티코커스(Stichococcus sp.), 시네드라우르나(Synedra ulna), 스케네데스무스 오브리쿼스(Scenedesmus obliquus), 스켈레나스트럼 그라시레(Selenastrum gracile), 스켈레토노마 코스타럼(Skeletonoma costalum), 테트라셀미스 출리(Tetraselmis chui), 테트라셀미스 마쿠라타(Tetraselmis maculata), 테트라셀미스(Tetraselmis sp.), 테트라셀미스 수에시카(Tetraselmis suecica), 탈라시오스트라 프세우도모나(Thalassiostra pseudomona), 아나배나(Anabaena sp.), 칼로드릭스(Calothrix sp.), 카마에시폰(Chaemisiphon sp.), 코로코시디옵시스(Chroococcidiopsis sp.), 차노데세(Cyanothece sp.),실린더로스페멈(Cylindrospermum sp.), 데모카펠라(Dermocarpella sp.), 피셔렐라(Fischerella sp.), 글로에오캅사(Gloeocapsa sp.), 믹소사시나(Myxosarcina sp.), 노스톡(Nostoc sp.), 오스실라토리아(Oscillatoria sp.), 포르미디움 코리움(Phormidium corium), 플레우로캅사(Pleurocapsa sp.), 프로콜로코코스(Prochlorococcus sp.), 페세우다나바에나(Pseudanabaena sp.), 시네코코스(Synechococcus), 시네코시스티스(Synechocystis sp.), 톨리포트릭스(Tolypothrix sp.), 제노코코스(Xenococcus sp.) 등의 미세조류 종을 대량 배양하여 유기나노클레이를 첨가하는 본 발명의 과정을 통하여 오일함유 미생물을 수확할 수있다.

또한 박테리아 종으로는 상기 표 2에 나타낸 것 이외에도 대장균(E. coli), 로도시스타센테나리아(Rhodocista centenaria), 로도스피라 트루페리(Rhodospira trueperi), 로도스피리럼 프루붐(Rhodospirillum fulvum), 로도스피리럼 모리스키라넘(Rhodospirillum molischianum), 로도스피리럼 포토메트리쿰(Rhodospirillum photometricum), 로도스피리럼 러브럼(Rhodospirillum rubrum), 로도스피리럼 살렉시젠(Rhodospirillum salexigens), 로도스피리럼 살리나루튼(Rhodospirillum salinarutn), 로도스피리럼 소도멘세(Rhodospirillum sodomense), 로도스피리럼 메디오살리넘(Rhodospirillum mediosalinum), 로돕세우도모나스(Rhodopseudomonas sp.), 로돕세우도모나스 아시도피라(Rhodopseudomonas acidophila), 로돕세우도모나스 캅술라투스(Rhodopseudomonas capsulatus), 로돕세우도모나스 파루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 로돕세우도모나스 스페로이데스(Rhodopseudomonas sphaeroides), 로도박터 캅술라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도박터 세페로이데스(Rhodobacter sphaeroides) 등의 종으로 부터도 본 발명의 과정을 통하여 오일함유 미생물을 수확할 수있다.

또한, 효모로는 칸디다 쿠루바타(Candida curvata), 크립토코커스 알비더스(Cryptococcus albidus), 리포미세스 스타케이(Lipomyces starkeyi), 로도토루라 글루티니스(Rhodotorula glutinis) 등이 있고, 진균으로는 아스페질러스 오르자에(Aspergillus oryzae), 모르티에레라 이사벨리나(Mortierella isabellina), 후미콜라 라누지노사(Humicola lanuginosa), 모르티에레라 비나세아(Mortierella vinacea) 등의 종에서도 나노클레이를 이용한 미생물 응집, 침전시켜 미세조류의 수확이 가능하다.

화학응집제로 Alum과 Nanoclay로서 Al-APTES, Ca-APTES, Mg-APTES, Mg-N3 등 총 4종류를 사용하여 배양된 미세조류를 효율적으로 응집 침전시키기 위한 농도와 투여조건을 명확히 함으로서 미세조류 배양뿐만 아니라 수확에서도 많은 비용이 소용되는, 미세조류 바이오디젤 생산기술의 경제성 측면에서 생산단가가 낮아져 오일 함유 미생물로부터 오일을 추출하기 위하여 필요로 하는 공정비용 상승 문제를 개선함으로서 경제성 있는 오일 및 바이오디젤의 생산이 가능하여 바이오디젤의 대중화를 빨리 이룰 수 있다는 장점을 가진 유용한 발명으로 산업상 그 이용이 크게 기대된다.

Claims

a) 미세조류를 배양액에서 배양하는 단계;
b) 배양된 오일 함유 미세조류 배양액에 아미노프로필 알루미늄 필로실리케이트 (aminopropyl functionalized aluminum phyllosilicate clay, Al-APTES) 나노클레이를 혼합농도 0.2-1.0 g/L의 농도로 혼합하고 배양액의 pH를 6.2 - 8.0으로 조절하는 단계;
c) 30분 이상 경과한 후 응집 침전된 미생물을 수확하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 나노클레이를 이용한 오일 함유 미생물 수확방법
a) 미세조류를 배양액에서 배양하는 단계;
b) 배양된 오일 함유 미세조류 배양액에 아미노프로필 칼슘 필로실리케이트 (aminopropyl functionalized calcium phyllosilicate clay, Ca-APTES) 나노클레이를 혼합농도 0.8-1.0 g/L의 농도로 혼합하는 단계;
c) 30분 이상 경과 후, 응집 침전된 미생물을 수확하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 나노클레이를 이용한 오일 함유 미생물 수확방법
a) 미세조류를 배양액에서 배양하는 단계;
b) 배양된 오일 함유 미세조류 배양액에 아미노프로필 마그네슘 필로실리케이트 (aminopropyl functionalized magnesium phyllosilicate clay, Mg-APTES) 나노클레이를 혼합농도 0.6-1.0 g/L의 농도로 혼합하는 단계;
c) 30분 이상 경과 후, 응집 침전된 미생물을 수확하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 나노클레이를 이용한 오일 함유 미생물 수확방법
a) 미세조류를 배양액에서 배양하는 단계;
b) 배양된 오일 함유 미세조류 배양액에 Mg-N3 나노클레이를 혼합농도 0.6-1.0 g/L의 농도로 혼합하며, 상기 N3는 3 - [2 - (2 - 아미노 에틸 아미노) 에틸 아미노] 프로필트리메톡시실란으로, (CH₃O)₃Si(CH₂)₃NHCH₂CH₂NHCH₂CH₂NH₂ 화학식을 가지며;
c) 30분 이상 경과 후, 응집 침전된 미생물을 수확하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 나노클레이를 이용한 오일 함유 미생물 수확방법
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