KR101723012B1

KR101723012B1 - 셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 미세조류 응집제 및 이를 이용한 미세조류 회수 및 지질 함량 증대 방법

Info

Publication number: KR101723012B1
Application number: KR1020160053066A
Authority: KR
Inventors: 신화성; 유순일
Original assignee: 인하대학교 산학협력단
Priority date: 2016-04-29
Filing date: 2016-04-29
Publication date: 2017-04-04

Abstract

본 발명은 셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 미세조류 응집제 및 이를 이용한 미세조류 회수방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 셀룰로오스 나노섬유는 양이온 개질과 같은 표면 개질을 필요로 하지 않으며, 셀룰로오스 나노섬유의 망 구조를 통해 미세조류를 효율적으로 응집한다. 또한 응집된 미세조류 내 지질 및 탄화수소 함량을 증가시켜 경제적으로 회수 비용을 감소시킬 수 있으므로 미세조류의 회수에 유용하게 사용될 수 있으며 회수된 미세조류를 이용하여 경제성 있는 오일 및 바이오디젤의 생산이 가능하다.

Description

셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 미세조류 응집제 및 이를 이용한 미세조류 회수 및 지질 함량 증대 방법{Flocculant composition of microalgae comprising cellulose nanofibrils and method for flocculating microorganisms and increasing intracellular lipids using the same}

본 발명은 셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 미세조류 응집제 및 이를 이용한 미세조류 회수 및 지질 함량 증대 방법에 관한 것이다.

현재 전세계 에너지 수요의 약 80%를 차지하고 있는 화석연료는 화석연료의 매장량이 한정되어 있어서 에너지 안보의 문제가 있고, 화석연료를 연소할 때에 발생하는 이산화탄소 등 온실가스의 배출로 인하여 지구온난화 등 기후 변화의 위협이라는 환경적인 문제를 포함한 다양한 문제를 유발시켜, 전세계적으로 화석연료의 사용량을 감축하기 위한 논의가 활발하게 이루어지고 있다.

우리나라는 석유 부존자원이 없으며 대부분 수입에 의존하고 있다. 국제유가, 기후변화, 정치 환경변화 등에 의한 수급 상황에 따라 경제가 크게 영향을 받고 있으며, 국내 기술 및 자본을 이용한 대체에너지 기술개발 및 자원 확보가 절실한 상황이다. 현재 고유가 및 기후변화협약에 대비하기 위하여 에너지효율화 기술 및 태양, 풍력 등 재생에너지 기술에 대한 투자가 확대되고 있으나, 수송용 부문에서 석유 대체가 어렵다는 한계가 있다. 수송부분에서 사용되는 에너지는 전체 에너지 소비량의 21% 수준이며, 이중 98%는 석유에 의하여 공급되고 있다.

이에 따라 화석연료를 대신하여 사용할 대체연료의 개발이 시급한 상황이며, 이러한 대체연료로 언급되는 것이 바이오디젤(bio-diesel)이다. 상기 바이오디젤은 바이오에탄올과 함께 가장 널리 사용되는 바이오연료로서, 콩기름 등의 식물성 기름을 원료로 해서 만든 바이오연료로 바이오에탄올과 함께 가장 널리 사용된다. 보통 메탄올을 이용해 3가의 지방산에 글리세롤이 결합한 트라이글리세리드로부터 글리세롤을 분리한 다음, 지방산에스터를 만들어 내는 에스테르 교환방법을 통하여 만든다. 이때 만든 바이오디젤이 바로 지방산 메틸에스테르(FAME)이다.

바이오디젤은 연료로써 뿐만 아니라 공해성 석유제품을 이미 상당수 대체하는 화학물질의 중간체로 사용하고 있고 응용성이 급격하게 확장되고 있는 산업이다. 바이오디젤은 친환경 제품인 생분해성 계면활성제, 합성 윤활유 그리고 저독성 용제의 제조 원료로 사용되고 있으므로 EU 등 선진국에서 법적/제도적으로 장려 정책을 강도 높게 시행하고 있어 성장성이 기대된다. 또한 바이오디젤 플랜트 산업은 결합형 지식산업이자 벤처기업형 산업, 차세대 전략산업 및 국제산업이라는 산업적 특징이 있으며, 기술적으로는 기술집약적 첨단사업이자 정부의 정책적 의지가 강하게 작용하는 유망 산업으로 평가받고 있다.

그러나 현재 바이오디젤은 주로 콩, 유채 등의 식용작물에서 추출한 식물성 기름을 이용해 생산하고 있으며(1세대 바이오연료 기술), 이는 곡물가격 상승을 유발해 아프리카와 같은 빈곤 국가와 저소득층의 식량난을 가중시킨다는 비판을 받고 있다. 또한 늘어나는 바이오디젤의 수요에 맞추어 팜유와 같은 원료 생산을 위해 광범위한 열대우림 또는 산림이 개발되고 있으며, 이는 오히려 지구온난화를 부추긴다는 지적도 있다. 더욱이 우리나라는 바이오디젤의 원료(대두유) 대부분을 해외에서 수입하고 있으므로 수급 및 가격이 석유자원과 유사하게 대외적인 상황 변화에 크게 의존할 가능성이 높다.

이와 같은 문제점을 해결하기 위해 기존 식용유 또는 팜유 대신에 미세조류(Microalgae)를 원료로 활용하는 기술이 '차세대 바이오디젤 기술'로 많은 관심을 받고 있다. 미세조류는 물, 이산화탄소와 햇빛을 이용하여 성장이 가능하며, 황무지, 해안가, 바다 등 어디서든 배양할 수 있어 기존 육상작물과 토지나 공간 측면에서 상호 경쟁하지 않는다. 또한 미세조류는 배양조건에 따라 생체 내에 많은 양의 지질(최대 70%)을 축적하며, 단위 면적당 오일(지질) 생산량이 콩과 같은 기존 식용작물에 비해 50-100배 이상 높아 대체 생물원유로서의 가능성이 매우 높다. 이로부터 단위 면적당 오일 생산량이 육상식물에 비해 매우 우수한 미세조류에 기반한 바이오디젤 생산기술에 대한 관심이 높아지고 있다.

미세조류는 단일세포의 광합성 생물로 3~30㎛의 크기에 담수나 해수에서 서식한다. 미세조류는 이산화탄소를 흡수하고 산소를 배출하며, 오일 및 유용물질을 함유하고 있다. 미세조류는 육상식물에 비해 성장률이 매우 빠르고, 대량으로 고농도 배양이 가능하며, 극한 환경에서도 성장이 가능하다는 장점을 가진다. 미세조류는 사용 가능한 오일 성분이 바이오매스의 30~70%에 달하므로, 기존 작물에 비해 높은 연료 생산성을 나타낸다. 미세조류는 다른 작물과 토지나 공간 측면에서 상호 경쟁하지 않으므로, 현재 식량 자원의 가격 상승 및 산림 파괴 등 2차적인 환경 문제를 일으키지 않는다. 따라서 미세조류 이용 바이오디젤 생산기술은 단위 면적 당 높은 생산성을 나타내어 자원 확보가 용이하고 식량 자원과의 경쟁이 없으므로 국내 실정에 적합하다고 할 수 있다.

미세조류 회수 기술로 원심분리(centrifugation), 여과(filtration), 응집(flocculation), 부유 기술 등이 활발히 연구되고 있다. 원심분리 기술은 미세조류 회수기술로 많이 활용되고 있으나 대용량을 처리하기에는 시간이 많이 소요되며 에너지 비용이 높고, 기기가 비싼 단점이 있다. 여과기술의 경우 크기가 마이크로미터(μm)단위로 매우 작은 미세조류에 의해 쉽게 막혀 연속적인 운전이 매우 어려우며 대용량에 적용하기가 쉽지 않다. 부유법의 경우는 응집제 첨가 혹은 기포를 발생시켜 미세조류 표면에 달라붙게 함으로써 밀도를 감소시켜 배양액 표면으로 떠오르게 하여 회수하는 방법이다. 하지만 상용화하기 위해서는 비용이 많이 들어간다. 반면에 응집제를 이용한 미세조류의 응집은 위 세가지 방법에 비하여 종 특이성이 적으며 규모를 키우기가 쉽다는 장점을 지닌다

이에 본 발명자들은 미세조류 회수 기술로 응집 기술을 연구하던 중, 셀룰로오스 나노섬유를 이용할 경우 미세조류를 효율적으로 하며, 응집된 미세섬유 내 지질 함량을 증가시킴을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

국내출원번호 10-2014-0058423 국내출원번호 10-2011-0126752 국내출원번호 10-2012-0149894 국내출원번호 10-2007-0014773 국내출원번호 10-2014-0003404 국내출원번호 10-2013-0053326 국내출원번호 10-2013-0032688

Growth promotion of microalgae Dunaliella bardawil and disruption of microcrystalline cellulose structure by the interactions between cellulose hydrogen bonds and algae exudates: Microcrystalline cellulose in the algae culture medium, International Biodeterioration & Biodegradation, Volume 77, February 2013, Pages 72-77

본 발명은 셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 미세조류 응집제를 제공함을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 응집제를 이용한 미세조류 회수 및 지질 함량 증대 방법을 제공함을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 미세조류 응집제를 제공한다.

또한, 본 발명은

a) 미세조류를 배양액에서 배양하는 단계;

b) 상기 미세조류의 배양액에 셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 미세조류 응집제를 혼합하는 단계; 및

c) 침전된 미세조류를 회수하는 단계로 이루어진, 셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 미세조류 응집제를 이용한 미세조류 회수방법을 제공한다.

본 발명에 따른 셀룰로오스 나노섬유는 양이온 개질과 같은 표면 개질을 필요로 하지 않으며, 셀룰로오스 나노섬유의 망 구조를 통해 미세조류를 효율적으로 응집한다. 또한 응집된 미세조류 내 지질 및 탄화수소 함량을 증가시켜 경제적으로 회수 비용을 감소시킬 수 있으므로 미세조류의 회수에 유용하게 사용될 수 있으며 회수된 미세조류를 이용하여 경제성 있는 오일 및 바이오디젤의 생산이 가능하다.

도 1a는 셀룰로오스 나노결정 및 셀룰로오스 나노섬유의 형태를 TEM 이미지를 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 1b는 셀룰로오스 나노결정 및 셀룰로오스 나노섬유의 두께를 Image J를 통해 정량한 결과를 나타낸 도이다.
도 1c는 셀룰로오스 나노결정 및 셀룰로오스 나노섬유의 크기 분포를 ELS를 통해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a는 미세조류를 셀룰로오스 나노결정 및 셀룰로오스 나노섬유와 각각 함께 배양한 후 응집 여부를 현미경을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 미세조류를 셀룰로오스 나노섬유와 함께 배양한 후 시간의 흐름에 따른 응집 여부를 광학 밀도 측정을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 2c는 미세조류를 셀룰로오스 나노섬유와 함께 배양한 후 처리 농도에 따른 응집 여부를 광학 밀도 측정을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 3a는 TAP 성장 배지 및 증류수에서 셀룰로오스 나노섬유로 인한 미세조류 응집을 광학 밀도 측정을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 3b는 황산 처리 후 황이 제거되지 않은 셀룰로오스 나노섬유 및 황이 제거된 셀룰로오스 나노섬유로 인한 미세조류 응집을 광학 밀도 측정을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 3c는 셀룰로오스 나노섬유 형태에 따른 미세조류 응집을 현미경을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 3d는 교반되지 않은 셀룰로오스 나노섬유 및 교반 후의 셀룰로오스 나노섬유로 인한 미세조류 응집을 현미경을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 4a는 셀룰로오스 나노섬유와 함께 배양된 미세조류의 세포 내 지질 함량을 나일레드 염색 및 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다
도 4b는 셀룰로오스 나노섬유와 함께 배양된 미세조류의 세포 내 지질 함량을 분광형광계를 통해 정량화한 결과를 나타낸 도이다.
도 4c는 셀룰로오스 나노섬유와 함께 배양된 미세조류의 지질 내부 탄화수소 함량의 변화를 GC-MS를 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 셀룰로오스 나노섬유와 함께 배양된 미세조류의 지질 생성 관련 mRNA 발현량을 qRT-PCR을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다
도 6a는 셀룰로오스 나노섬유와 함께 배양된 미세조류의 세포생존율을 광학 밀도 측정을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 6b는 셀룰로오스 나노섬유와 함께 배양된 미세조류의 세포 수를 혈구계수기를 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 6c는 셀룰로오스 나노섬유와 함께 배양된 미세조류의 세포 크기를 쿨터카운터를 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 셀룰로오스 나노섬유와 함께 배양된 미세조류의 칼슘 유입 여부를 공초점 현미경을 통해 관찰한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 미세조류 응집제를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 유효성분인 셀룰로오스는 포도당으로 된 단순 다당류로서 고등식물이나 조류의 세포벽을 구성한다.

본 발명의 셀룰로오스 나노섬유는 셀룰로오스를 황산 처리하여 수득할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 멍게 껍질을 황산 처리하여 수득하였다.

본 발명의 셀룰로오스 나노섬유는 크기 및 두께로 셀룰로오스 나노결정과 구별될 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 20 μm의 직경을 가질 수 있다.

상기 미세조류는 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii), 아나시스티스 니둘란스(Anacystis nidulans), 안키스트로데스무스(Ankistrodesmus sp.), 비둘파 아우리타(Biddulpha aurita), 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii), 키토세라스(Chaetoceros sp.), 클라미도모나스 아플란타(Chlamydomonas applanata), 클로렐라(Chlorella sp.), 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea), 클로렐라 에멀소니(Chlorella emersonii), 클로렐라 프로토세코이드(Chlorella protothecoides), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 미누티시마(Chlorella minutissima), 클로로코쿠 리토레일(Chlorococcu littorale), 시클로텔라 크립티카(Cyclotella cryptica), 두날리엘라 바르다윌(Dunaliella bardawil), 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina), 두날리엘라 테르티오렉타(Dunaliella tertiolecta), 두날리엘라 프리모렉타(Dunaliella primolecta), 짐노디움(Gymnodinum sp.), 헤머노모나스 카테라에(Hymenomonas carterae), 이소크리시스 갈베나(Isochrysis galbana), 이소크리시스(Isochrysis sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 마이크로모나스 푸실라(Micromonas pusilla), 모노두스 서브테라네우스(Monodus subterraneous), 나노클로리스(Nannochloris sp.), 나노클로롭시스(Nannochloropsis sp.), 나노클로롭시스 아토무스(Nannochloropsis atomus), 나노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina), 나비쿨라 필리쿨로사(Navicula pelliculosa), 니츠시아(Nitzschia sp.), 니츠시아 클로스테리움(Nitzscia closterium), 니츠시아 팔레아(Nitzscia palea), 오시스티스 폴리모피아(Oocystis polymorpha), 아우로코커스(Ourococcus sp.), 오실라토리아 루베스켄스(Oscillatoria rubescens), 파브로바 루테리(Pavlova lutheri), 패오닥트리움 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum), 피크노코커스 프로바솔리(Pycnococcus provasolii), 피라미노나스 코르다타(Pyramimonas cordata), 스피눌라 플라텐시스(Spirulina platensis), 스테파노디스커스 미누투루스(Stephanodiscus minutulus), 스티코커스(Stichococcus sp.), 시네드라우르나(Synedra ulna), 스케네데스무스 오브리쿼스(Scenedesmus obliquus), 스켈레나스트럼 그라시레(Selenastrum gracile), 스켈레토노마 코스타럼(Skeletonoma costalum), 테트라셀미스 출리(Tetraselmis chui), 테트라셀미스 마쿠라타(Tetraselmis maculata), 테트라셀미스(Tetraselmis sp.), 테트라셀미스 수에시카(Tetraselmis suecica), 탈라시오스트라 프세우도모나(Thalassiostra pseudomona), 아나배나(Anabaena sp.), 칼로드릭스(Calothrix sp.), 카마에시폰(Chaemisiphon sp.), 코로코시디옵시스(Chroococcidiopsis sp.), 차노데세(Cyanothece sp.),실린더로스페멈(Cylindrospermum sp.), 데모카펠라(Dermocarpella sp.), 피셔렐라(Fischerella sp.), 글로에오캅사(Gloeocapsa sp.), 믹소사시나(Myxosarcina sp.), 노스톡(Nostoc sp.), 오스실라토리아(Oscillatoria sp.), 포르미디움 코리움(Phormidium corium), 플레우로캅사(Pleurocapsa sp.), 프로콜로코코스(Prochlorococcus sp.), 페세우다나바에나(Pseudanabaena sp.), 시네코코스(Synechococcus), 시네코시스티스(Synechocystis sp.), 톨리포트릭스(Tolypothrix sp.) 및 제노코코스(Xenococcus sp.)일 수 있으며, 바람직하게는 클로렐라(Chlorella sp.)일 수 있으나 이에 제한하지 않으며, 바람직하게는 클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii)일 수 있다.

상기 미세조류는 바다, 하천, 또는 호수 등에서 포집된 것을 배양하지 않고 포집된 그대로 회수할 수도 있으며, 광생물 배양기 등을 이용하여 배양된 미세조류일 수 있다.

본 발명의 셀룰로오스 나노섬유는 양이온 개질과 같은 표면 개질을 필요로 하지 않으며, 셀룰로오스 나노섬유의 크기와 관련하여 이의 망 구조를 통해 미세조류 응집제로서의 역할을 수행한다. 또한, 상기 셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 응집제를 바이오디젤 공정에 이용하는 경우, 가장 비싼 공정 중 하나인 지질 및 탄화수소 생성을 증가시키면서 회수 비용을 감소시킬 수 있으므로 미세조류의 회수에 유용하게 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 응집제를 이용하여 경제성 있는 오일 및 바이오디젤의 생산이 가능하다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 미세조류 응집제를 이용한 미세조류 회수방법을 제공한다.

a) 미세조류를 배양액에서 배양하는 단계;

c) 침전된 미세조류를 회수하는 단계.

본 발명의 미세조류 회수방법을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.

상기 a) 단계는 미세조류를 배양하는 단계로, 미세조류의 종류에 따라 최적 배양조건은 달라질 수 있으나 셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 응집제의 성능에는 유의미한 영향을 미치지 않는다.

상기 b) 단계는 상기와 같이 배양된 미세조류와 셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 미세조류 응집제를 혼합하는 단계로, 응집제를 증류수에 녹인 후, 여기에 미세조류 배양액을 혼합 및 교반한다.

상기 c) 단계는 침전된 미세조류를 회수하는 단계로, 셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 미세조류 응집제와 미세조류를 혼합한 후, 일정시간 경과 후에 회수한다. 일정시간은 3분 이상인 것이 바람직하며, 응집제의 양이 증가함에 따라, 또는 배양액을 교반함으로써 침전은 가속화된다.

본 발명의 셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 미세조류 응집제를 이용한 미세조류 회수방법은 양이온 개질과 같은 표면 개질을 필요로 하지 않으며, 셀룰로오스 나노섬유의 크기와 관련하여 이의 망 구조를 통해 미세조류를 효율적으로 응집한다. 또한 응집된 미세조류 내 지질 및 탄화수소 함량을 증가시켜 경제적으로 회수 비용을 감소시킬 수 있으므로 미세조류의 회수에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 설명을 위한 것일 뿐 하기 실시예에 의하여 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 멍게 셀룰로오스 나노결정 및 셀룰로오스 나노섬유의 제조

멍게의 껍질을 분리하여 오븐에서 건조하였다. 그 후 껍질을 80℃의 5% 수산화칼륨(Daejung Chemistry, Republic of Korea) 수용액에 3일 동안 침지시켰다. 다음으로, 0.17% 아세트산(Daejung Chemistry, Republic of Korea) 수용액 및 0.34% 하이포아염소산 나트륨(Daejung Chemistry, Republic of Korea, 4% < chlorine)을 60℃에서 껍질에 첨가하였으며 멍게의 색소가 제거될 때까지 한시간마다 상기 용액을 갈아주고, 색소가 제거된 후 증류수로 세척하였다. 그 후 시료를 50 mesh 크기의 분말로 분쇄하고, 분쇄된 껍질을 60% (w/v) 황산 수용액으로 처리하였으며 20분간 60℃에서 교반하였다. 반응 후, 가수분해 반응을 멈추기 위해 온도를 0℃로 낮추고, 진공 하에서 Whatman GF/F 유리 마이크로섬유 필터를 이용하여 여과하여 셀룰로오스 나노결정 및 셀룰로오스 나노섬유를 수득하였다.

잔류 황산은 pH 5-6까지 계속해서 증류수로 증화시키고, 시료를 30분 동안 초음파처리하였다. 그 후, 셀룰로오스 나노결정 및 셀룰로오스 나노섬유를 탈황시키기 위하여 셀룰로오스 나노결정과 같은 부피로 2N NaOH 용액을 첨가하였다. 그 후 시료를 60℃에서 6시간 동안 반응시키고 이어서 NaOH 및 남아있는 금속 이온을 제거하기 위하여 7일 동안 투석하였다. 황산 성분은 원소 분석기(Tecan)를 사용하여 측정하였다.

실시예 2. 미세조류 배양

미세조류로서 녹조류(Chlamydomonas reinhardtii) 균주 cc-124를 12시간의 명암주기로 23℃의 진탕배양기(80 rpm)에서 배양하였다. 미세조류 배양에 있어서, TAP 배지(Gibco)를 기본 배지로서 사용하였다.

실험예 1. 셀룰로오스 나노결정 및 셀룰로오스 나노섬유의 특성

셀룰로오스 나노결정 및 셀룰로오스 나노섬유의 형태 및 크기를 투과전자 현미경(CN200, Philips, Netherland)으로 관찰하였다. 먼저, 셀룰로오스 나노결정 또는 셀룰로오스 나노섬유를 1 ml 현탁액으로부터 수거하고, 암실에서 5분 동안 우라닐 아세테이트로 염색하였다. 이를 증류수로 3회 세척하고, TEM 이미지를 관찰하였으며, 그 결과를 도 1a에 나타내었다.

도 1a에 나타낸 바와 같이, 셀룰로오스 나노결정은 막대 형태를 나타내고 셀룰로오스 나노섬유는 유연한 형태를 나타내었으며, 유연한 형태의 나노섬유가 얽혀 형성된 망 형태를 나타내었다.

상기 TEM 이미지상의 셀룰로오스 나노결정 또는 셀룰로오스 나노섬유의 크기 및 폭을 계산하기 위하여 Image J를 사용하였으며, 그 결과를 도 1b에 나타내었다.

도 1b에 나타낸 바와 같이, 셀룰로오스 나노결정 및 셀룰로오스 나노섬유는 두께 차이가 발생하며, 셀룰로오스 나노섬유가 셀룰로오스 나노결정에 비해 좀 더 두꺼운 두께를 가진다는 것을 확인하였다.

또한 셀룰로오스 나노결정 및 셀룰로오스 나노섬유의 크기 분포를 ELS를 이용하여 동적 광산란법에 의해 측정하였으며, 그 결과를 도 1c에 나타내었다.

도 1c에 나타낸 바와 같이, 셀룰로오스 나노결정의 피크는 100 및 120 nm 부근에서 확인되었으나 셀룰로오스 나노섬유 피크는 대부분 10 μm 부근에서 확인되었다. 상기 결과는 셀룰로오스 나노결정 및 셀룰로오스 나노섬유가 크기에 따라 분리될 수 있음을 나타낸다.

실험예 2. 미세조류의 응집 분석

셀룰로오스 나노결정 또는 셀룰로오스 나노섬유에 의한 미세조류 응집을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1의 셀룰로오스 나노결정 또는 셀룰로오스 나노섬유를 실시예 2의 미세조류 배지에 첨가하여 함께 배양하였다. 상기 배지를 1시간 간격으로 현미경을 통해 침강 테스트를 수행하였으며, 그 결과를 도 2a에 나타내었다.

도 2a에 나타낸 바와 같이, 셀룰로오스 나노섬유는 미세조류를 응집하였으나, 셀룰로오스 나노결정은 미세조류의 응집에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

또한 상기 녹조류 배양 후 분광광도계(T₀)를 이용하여 매시간마다 680 nm에서 광학 밀도를 측정하고, 응집의 차이는 시간당 응집 비율(T/T₀*100)에 기반하여 비교함으로써 응집을 정량적으로 확인하였으며, 그 결과를 도 2b 및 2c에 나타내었다.

도 2b에 나타낸 바와 같이, 모든 셀룰로오스 나노섬유 농도에서 상등액의 광학 밀도는 시간이 흐름에 따라 감소하여, 시간이 흐름에 따라 응집이 서서히 진행됨을 확인하였다.

또한, 도 2c에 나타낸 바와 같이, 셀룰로오스 나노섬유 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 미세조류 응집 또한 증가함을 확인하였다. 일정 농도 지점 이후부터는 응집에 큰 차이를 보이지는 않았다.

실험예 3. 셀룰로오스 나노섬유의 응집 현상 메커니즘

응집이 배양 배지의 이온 강도에 의존적인지 여부를 확인하기 위하여, TAP 성장 배지 및 증류수에서의 셀룰로오스 나노섬유로 인한 미세조류 응집을 광학 밀도 측정을 통해 비교하였으며, 그 결과를 도 3a에 나타내었다.

도 3a에 나타낸 바와 같이, 응집 비율은 모든 셀룰로오스 나노섬유 농도에 대하여 TAP 배지에 비하여 증류수에서 더욱 빠르게 나타났으나, 120분 후 양 배지에서 이온성 분자의 유의미한 응집 차이는 발견되지 않았다.

황이 응집에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위하여, 셀룰로오스 나노섬유의 표면에 포함된 황을 제거한 후 미세조류 응집을 광학 밀도 측정을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 3b에 나타내었다.

도 3b에 나타낸 바와 같이, 비개질된 셀룰로오스 나노섬유 및 황을 제거한 셀룰로오스 나노섬유의 미세조류 상층액은 유사한 광학 밀도를 나타내어 황이 미세조류 응집에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

또한, 미세조류 응집에 미치는 셀룰로오스 나노섬유의 구조적 효과를 확인하기 위하여, 셀룰로오스 나노섬유 형태에 따른 미세조류 응집 현상을 관찰하였으며, 그 결과를 도 3c에 나타내었다.

도 3c에 나타낸 바와 같이, 배양액에 투입할 때, 처음부터 얽혀있는 촘촘한 셀룰로오스 나노섬유 망보다 고정 용액 내 자유롭게 움직이는 셀룰로오스 나노섬유가 더욱 미세조류를 응집시킴을 확인하였다.

또한 교반이 응집 현상에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 교반되지 않은 셀룰로오스 나노섬유와 교반 후 셀룰로오스 나노섬유를 각각 미세조류 배양액에 첨가한 후 미세조류 응집 현상을 관찰하였으며, 그 결과를 도 3d에 나타내었다.

도 3d에 나타낸 바와 같이, 교반된 셀룰로오스 나노섬유가 교반되지 않은 셀룰로오스 나노섬유에 비해 더욱 미세조류를 응집시킴을 확인하였다.

실험예 4. 세포 내 지질 함량의 분석

미세조류의 세포 내 지질 함량을 확인하기 위하여 나일레드(nile red) 염색을 수행하였다. 먼저, 셀룰로오스 나노결정 또는 셀룰로오스 나노섬유와 함께 배양된 미세조류를 PBS 내 2.5% 글루타르알데히드로 고정하였다. 원심분리(12,000 g, 1분)를 이용하여 시료의 배지 용액을 폐기한 후, 세포 펠릿을 PBS와 함께 재현탁하였으며, 나일레드 염료(Sigma Aldrich, 아세톤 내 2 μg/ml)를 1:3 부피비(염료:시료)로 혼합한 후 40℃에서 10분동안 배양하였다. 그 후 공초점 현미경(Carl Zeiss, LSM510 meta)을 이용하여 세포 내 지질 이미지를 관찰하였으며, 그 결과를 도 4a에 나타내었다.

도 4a에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 셀룰로오스 나노섬유와 함께 배양된 미세조류에서 눈에 띄는 지질의 형태를 확인하였다.

또한, 상기 나일레드 염색된 시료의 세포 내 지질 함량을 정량화하기 위하여 분광형광계(Hitachi F-4500, Japan)를 이용하였으며, 그 결과를 도 4b에 나타내었다.

도 4b에 나타낸 바와 같이, 셀룰로오스 나노섬유와 함께 배양된 미세조류에서 전체 지질 함량이 크게 증가한 것을 확인하였다.

또한, 미세조류 지질내부의 개별 탄화수소 함량의 변화를 GC-MS를 통해 관찰하였으며, 그 결과를 도 4c에 나타내었다.

도 4c에 나타낸 바와 같이, 미세조류 지질내부의 개별 탄화수소 함량의 변화가 발생하였으며, 구체적으로 C22의 긴-사슬 탄화수소의 비율이 증가함을 확인하였다. 이는 응집에 의해 탄소 개수가 많은 탄화수소쪽으로 지질 함량이 변한 것을 나타낸다.

이는 과한 황산처리 및 추가 처리가 필요없다는 점에서 셀룰로오스 나노섬유의 미세조류 응집제로서의 유용성을 나타낸다.

실시예 5. qRT - PCR 을 이용한 mRNA 의 분석

미세조류의 지질 생성 관련 mRNA를 트리졸 시약(Takara, RNAiso-easy)을 이용하여 수득하였다. 총 mRNA의 보존은 safe shine green(Biosesang)을 이용하여 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하였고, QuantiTect 역전사 키트(QIAGEN)를 이용하여 cDNA를 합성한 후, qRT-PCR을 수행하여 mRNA 발현량을 관찰하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, LPAAT ACCase DGAT 모두 셀룰로오스 나노섬유와 함께 배양된 미세조류에서 mRNA 발현량이 증가하는 것을 확인하였다.

실험예 6. 세포생존율, 세포 수 및 크기의 측정

5일 동안 12시간마다 세포생존율 및 세포 수를 통해 세포 응집을 판단하였다. 세포생존율은 Mackinney 등에 따라 엽록소의 양을 측정하였다. 다양한 농도의 셀룰로오스 나노결정 및 셀룰로오스 나노섬유를 미세조류 배양시 첨가하였으며, 각각의 시료를 회수하고 PBS 내에서 2.5% 글루타르알데히드(Samchun, Korea)를 처리한 후, TAP 배지 및 글루타르알데히드를 제거하기 위하여 원심분리에 의해 분리하고, 24시간 동안 클로로포름에서 재현탁하였다. 상기 미세조류 내부의 응집으로 인한 엽록소 함량 차이는 광학 밀도 측정을 통해 확인하였으며, 그 결과를 도 6a에 나타내었다.

도 6a에 나타낸 바와 같이, 셀룰로오스 나노섬유와 함께 배양된 미세조류의 경우 대조군에 비해 엽록소의 양이 약 30% 정도 감소한 것을 확인하였다.

또한, 세포 수는 혈구계수기(hemocytometer)(Marienfeld-Superior)를 이용하여 직접적으로 세었으며, 그 결과를 도 6b에 나타내었다.

도 6b에 나타낸 바와 같이, 셀룰로오스 나노섬유와 함께 배양된 미세조류의 경우 대조군에 비해 세포 수가 감소한 것을 확인하였다.

또한, 세포 크기는 쿨터 카운터(coulter counter)(Beckman)를 사용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 6c에 나타내었다.

도 6c에 나타낸 바와 같이, 셀룰로오스 나노섬유와 함께 양된 미세조류의 경우 대조군에 비해 세포 크기가 약 1 μm 정도 감소한 것을 확인하였다.

실시예 7. Fura -2에 의한 칼슘 유입의 측정

셀룰로오스 나노섬유와 함께 배양된 미세조류의 세포역학신호변환(mechanotransduction) 현상을 확인하기 위하여, Fura-2 염색을 이용하여 세포 내 칼슘 함량을 측정하였다.

셀룰로오스 나노섬유와 함께 배양된 미세조류 시료를 13,500 g로 1분 동안 원심분리하고, 배지를 NMG+/K+ 완충액(1 mM KCl, 200 μM K+ BAPTA, 1 mM 설핀피라졸을 이용하여 pH 5.6로 조정된 N-메틸-D-글루카민, 5 mM HEPES, 및 10 mM HCl) 및 DMSO에 용해된 3 μM Fura-2로 교체하였다. 그 후 시료를 6 웰 플레이트에서 재현탁하고, 23℃에서 24시간 동안 배양한 후 회수하였다. 380 nm의 여기 및 510 nm의 방출 파장에서 공초점 현미경(Carl Zeiss, LSM510meta)을 이용하여 미세조류의 칼슘 유입 이미지를 확인하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 셀룰로오스 나노섬유와 함께 배양된 미세조류 내부의 칼슘 유입의 차이를 확인하였다.

상기 실험 결과로부터 본 발명의 셀룰로오스 나노섬유가 양이온 개질과 같은 표면 개질을 필요로 하지 않고, 셀룰로오스 나노섬유의 망 구조를 통해 미세조류를 응집하며, 응집된 미세조류 내 지질 및 탄화수소 함량을 증가시켜 경제적인 회수 비용 절감뿐만 아니라, 효율적인 지질 증가 첨가제로서의 역할을 할 수 있음을 확인하였다.

Claims

셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 미세조류 응집제.
제1항에 있어서, 상기 셀룰로오스 나노섬유는 셀룰로오스를 황산 처리하여 수득한 것을 특징으로 하는, 미세조류 응집제.
제2항에 있어서, 상기 셀룰로오스는 멍게 껍질 셀룰로오스인 것을 특징으로 하는, 미세조류 응집제.
제1항에 있어서, 상기 나노섬유는 5 내지 20 μm 직경인 것을 특징으로 하는, 미세조류 응집제.
제1항에 있어서, 상기 미세조류는 클라미도모나스 레인하티(chlamydomonas reinhardtii), 아나시스티스 니둘란스(Anacystis nidulans), 안키스트로데스무스(Ankistrodesmus sp.), 비둘파 아우리타(Biddulpha aurita), 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii), 키토세라스(Chaetoceros sp.), 클라미도모나스 아플란타(Chlamydomonas applanata), 클로렐라(Chlorella sp.), 클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea), 클로렐라 에멀소니(Chlorella emersonii), 클로렐라 프로토세코이드(Chlorella protothecoides), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 미누티시마(Chlorella minutissima), 클로로코쿠 리토레일(Chlorococcu littorale), 시클로텔라 크립티카(Cyclotella cryptica), 두날리엘라 바르다윌(Dunaliella bardawil), 두날리엘라 살리나(Dunaliella salina), 두날리엘라 테르티오렉타(Dunaliella tertiolecta), 두날리엘라 프리모렉타(Dunaliella primolecta), 짐노디움(Gymnodinum sp.), 헤머노모나스 카테라에(Hymenomonas carterae), 이소크리시스 갈베나(Isochrysis galbana), 이소크리시스(Isochrysis sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 마이크로모나스 푸실라(Micromonas pusilla), 모노두스 서브테라네우스(Monodus subterraneous), 나노클로리스(Nannochloris sp.), 나노클로롭시스(Nannochloropsis sp.), 나노클로롭시스 아토무스(Nannochloropsis atomus), 나노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina), 나비쿨라 필리쿨로사(Navicula pelliculosa), 니츠시아(Nitzschia sp.), 니츠시아 클로스테리움(Nitzscia closterium), 니츠시아 팔레아(Nitzscia palea), 오시스티스 폴리모피아(Oocystis polymorpha), 아우로코커스(Ourococcus sp.), 오실라토리아 루베스켄스(Oscillatoria rubescens), 파브로바 루테리(Pavlova lutheri), 패오닥트리움 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum), 피크노코커스 프로바솔리(Pycnococcus provasolii), 피라미노나스 코르다타(Pyramimonas cordata), 스피눌라 플라텐시스(Spirulina platensis), 스테파노디스커스 미누투루스(Stephanodiscus minutulus), 스티코커스(Stichococcus sp.), 시네드라우르나(Synedra ulna), 스케네데스무스 오브리쿼스(Scenedesmus obliquus), 스켈레나스트럼 그라시레(Selenastrum gracile), 스켈레토노마 코스타럼(Skeletonoma costalum), 테트라셀미스 출리(Tetraselmis chui), 테트라셀미스 마쿠라타(Tetraselmis maculata), 테트라셀미스(Tetraselmis sp.), 테트라셀미스 수에시카(Tetraselmis suecica), 탈라시오스트라 프세우도모나(Thalassiostra pseudomona), 아나배나(Anabaena sp.), 칼로드릭스(Calothrix sp.), 카마에시폰(Chaemisiphon sp.), 코로코시디옵시스(Chroococcidiopsis sp.), 차노데세(Cyanothece sp.),실린더로스페멈(Cylindrospermum sp.), 데모카펠라(Dermocarpella sp.), 피셔렐라(Fischerella sp.), 글로에오캅사(Gloeocapsa sp.), 믹소사시나(Myxosarcina sp.), 노스톡(Nostoc sp.), 오스실라토리아(Oscillatoria sp.), 포르미디움 코리움(Phormidium corium), 플레우로캅사(Pleurocapsa sp.), 프로콜로코코스(Prochlorococcus sp.), 페세우다나바에나(Pseudanabaena sp.), 시네코코스(Synechococcus), 시네코시스티스(Synechocystis sp.), 톨리포트릭스(Tolypothrix sp.) 및 제노코코스(Xenococcus sp.)로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 미세조류 응집제.
a) 미세조류를 배양액에서 배양하는 단계;
b) 상기 미세조류의 배양액에 셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 미세조류 응집제를 혼합하는 단계; 및
c) 침전된 미세조류를 회수하는 단계로 이루어진, 셀룰로오스 나노섬유를 포함하는 미세조류 응집제를 이용한 미세조류 회수방법.
제6항에 있어서, 상기 c)단계는 b) 단계 후 3분 이상 경과 후 수행되는 것을 특징으로 하는, 미세조류 회수방법.
제6항에 있어서, 상기 회수방법은 응집된 미세조류 내 지질 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 미세조류 회수방법.