JP2022519874A

JP2022519874A - 微生物脂質を生産するための方法

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Publication number: JP2022519874A
Application number: JP2021546273A
Authority: JP
Inventors: マームトマスリ，; トーマスブリュック，
Original assignee: テクニッシュウニヴェルジテートミュンヘン
Priority date: 2019-02-18
Filing date: 2020-02-18
Publication date: 2022-03-25
Also published as: CA3129128A1; BR112021013812A2; US20240052384A1; CN113423838A; EP3894575A1; EP3696273A1; WO2020169586A1

Abstract

本発明は、微生物脂質を生産するための方法に関する。第１の態様において、本発明は、微生物脂質を生産するための方法に関し、前記方法は、以下のステップ、すなわち、ａ）油脂微生物を提供するステップ；ｂ）前記油脂微生物を炭素源および有機酸を含む培地中で増殖させ、それによって、前記油脂微生物に微生物脂質を産生させるステップ；ｃ）いかなる溶媒による抽出または化学薬品による解乳化も行わない、前記増殖させた油脂微生物の純粋に酵素的な処理を実施し、前記産生された微生物脂質を、その後の回収に適合させるステップ；ｄ）前記産生された微生物脂質を、密度に基づく分離法によって回収するステップを含む。

Description

本発明は、微生物脂質を生産するための方法に関する。

植物によるトリグリセリド油の生産における、土地を使いすぎること、単一栽培であること、および生物学的に多様な生息環境を排除して単一種を優先することによる潜在的な悪影響に鑑みて、微生物による油の生産は、可能性がある魅力的な代替手段とみなされてきた。しかしながら、経済的に、原材料の入手性およびコスト、トリグリセリド油の生産性、ならびに油の回収までに必要な処理ステップ数が、工業スケールでの生産を妨げている主要な課題である。Ｋｏｕｔｉｎａｓら、２０１４，Ｆｕｅｌ，Ｖｏｌｕｍｅ１１６，ｐｐ．５６６－５７７によれば、微生物により産生された油には５．５米ドル／ｋｇ（ＵＳＤ５，５／ｋｇ）かかると見積もられるのに対し、大豆油とパーム油には、それぞれ、およそ０．７９米ドル／ｋｇおよび０．６６米ドル／ｋｇしかかからない。したがって、この著しい価格差を低減させるために、微生物油プロセスは、プロセス廃棄物の利用に加えて、生産性を最大化し、かつプロセスのステップ数が最小になるように設計することが必要とされる。１つの問題は、微生物による油の製造に使用することができる、持続可能で安価な原材料を識別することである。考慮すべきさらなる側面は、脂質を回収するための下流プロセスの最適化であり、それはプロセスの全体的な経済性に与える影響は大きいと考えられるためである。従来の脂質抽出の手順は、典型的には、細胞壁の破壊と、それに続く有機溶媒を用いた脂質抽出を含み、この有機溶媒は、多くの場合、毒性である（例えば、クロロホルムまたはヘキサンなど）。さらに、細胞壁が強固である場合、典型的には、例えば温度ショック、化学的処理、または高圧ホモジナイズなどの過酷な処理がさらに行われ、それによって全体的なプロセスのコストが上昇する。有機溶媒を使用し、脂質を抽出することで、最終製品の品質が悪影響を受け、そのような脂質を食品および／または医薬用途に使用する可能性が制限される。

よって、本発明は、実施が容易かつ簡単であり、その結果、油脂微生物の培養を使用して微生物脂質を生産するために必要な全体的な労力を減少させる方法を提供することを目的とする。

Ｋｏｕｔｉｎａｓら、２０１４，Ｆｕｅｌ，Ｖｏｌｕｍｅ１１６，ｐｐ．５６６－５７７

第１の態様において、本発明は、微生物脂質を生産するための方法に関し、前記方法は、以下のステップ、すなわち、
ａ）油脂微生物を提供するステップ；
ｂ）前記油脂微生物を炭素源および有機酸を含む培地中で増殖させ、それによって、前記油脂微生物に微生物脂質を産生させるステップ；
ｃ）いかなる溶媒による抽出または化学薬品による解乳化も行わない、前記増殖させた油脂微生物の純粋に酵素的な処理を実施し、前記産生された微生物脂質を、その後の回収に適合させるステップ；
ｄ）前記産生された微生物脂質を、密度に基づく分離法によって回収するステップ
を含む。

１つの実施形態において、前記油脂微生物は、酵母、菌類、細菌、および微細藻類から選択され、ここで、好ましくは、前記油脂微生物は、油脂酵母であり、より好ましくは、前記油脂酵母は、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属、Ａｐｉｏｔｒｉｃｈｕｍ属、およびＣｕｔａｎｅｏｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属から選択される。

前記油脂微生物が菌類（すなわち油脂菌類）である場合、好ましくは、前記油脂菌類は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属、およびＨｕｍｉｃｏｌａ属から選択される。

前記油脂微生物が細菌（すなわち油脂細菌）である場合、好ましくは、前記油脂細菌は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、およびＢａｃｉｌｌｕｓ属から選択される。

前記油脂微生物が微細藻類（すなわち油脂微細藻類）である場合、好ましくは、前記微細藻類は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ属、Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ属、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ属、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ属、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ属、Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ属、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ属、Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ属、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐａｖｌｏｖａ属、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ属、Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ属、およびＮｉｔｚｓｃｈｉａ属から選択される。

油脂酵母の好ましい種は、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｃａｐｉｔａｔｕ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎａｓａｈｉｉ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓｓｔａｒｋｅｙｉ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓ、Ｃｕｔａｎｅｏｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ、Ａｐｉｏｔｒｉｃｈｕｍｃｕｒｖａｒｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｃｕｒｖａｔｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｓｐ．（Ｃａｎｄｉｄａｓｐ）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｒａｃｉｌｉｓである。油脂酵母の特に好ましい種は、Ｃｕｔａｎｅｏｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓである。

油脂微細藻類の好ましい種は、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍｓｐ．、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓｓｐ．（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓｓｐ）、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓｓｐ．、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓｓｐ．（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓｓｐ）、Ｔｒｉｂｏｎｅｍａｍｉｎｕｓ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａｓｐ．、Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓｓｐ．、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓｂｒａｕｎｉｉ、Ｐａｖｌｏｖａｓｐ．、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓｓｐ．、Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａｓｐ．、Ｎｉｔｚｓｃｈｉａｓｐ．である。

油脂細菌の好ましい種は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｏｐａｃｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓである。

油脂菌類の好ましい種は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａｓｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐ．、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａｓｐ．、およびＨｕｍｉｃｏｌａｓｐ．である。

１つの実施形態において、前記炭素源は、炭水化物；アミノ酸；脂肪酸；好ましくは単糖類、好ましくはペントースまたはヘキソース、より好ましくはグルコース、キシロース、および／またはマンニトール；オリゴ糖；動物組織の加水分解物、植物組織の加水分解物、または微生物の加水分解物；および前記のいずれかの組み合わせを含む群から選択され、ここで、より好ましくは、前記炭素源は、グルコースである。

１つの実施形態において、前記有機酸は、酢酸、マロン酸、シュウ酸、クエン酸、プロピオン酸、吉草酸、アクリル酸、クロトン酸、酪酸、イソ酪酸、イソ吉草酸、３－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシプロピオン酸、２－ヒドロキシ酪酸、乳酸、およびこれらの酸のそれぞれの塩（単数または複数）、ならびに前記有機酸の任意のものの組み合わせを含む群から選択される。好ましくは、前記有機酸は、酢酸またはアセテートである。１つの実施形態において、前記有機酸は、酢酸またはアセテート単独であり；別の実施形態において、前記有機酸は、酢酸またはアセテートと、上述のその他の有機酸との組み合わせである。

用語「有機酸」は、本明細書で使用される場合、各有機酸のプロトン化度に関わらず、それぞれの有機酸を包含することが意図されていること、すなわち、（例えば、前記有機酸が、それぞれのｐＫａ値に応じて、それぞれプロトン化または脱プロトン化されるｐＨの水溶液における場合の）プロトン化状態（単数または複数）の前記酸ならびに脱プロトン化状態（単数または複数）の前記酸を包含することが意図されていることに留意すべきである。用語「有機酸」は、本明細書で使用される場合、前記有機酸の塩（単数または複数）、例えば、そのような有機酸のそれぞれの金属塩を包含することも意図されている。そのような金属塩の例は、それぞれの有機酸のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩である。前記塩は、それらの解離形態または非解離形態であり得る。用語「有機酸混合物」は、本明細書で使用される場合、それぞれが酸形態の有機酸の（すなわち、他の有機酸との）混合物、酸形態の有機酸と、塩形態の他の有機酸との有機酸混合物、および有機酸の塩と、他の有機酸の塩との混合物を包含することを意図している。

用語「有機酸」は、本明細書で使用される場合、脂肪酸またはアミノ酸を包含しないことに留意すべきである。

語句「炭素源および有機酸」は、本明細書で使用される場合、「炭素源」が、「有機酸」とは異なるということを含意する。よって、前記２つのものは、化学的に異なっている。

１つの実施形態において、ステップｂ）の間の前記炭素源の濃度は、１５０～４００ｍＭ、好ましくは２００～３００ｍＭの範囲内である。１つの実施形態において、ステップｂ）の間の前記有機酸の濃度は、３０～１００ｍＭ、好ましくは５０～７０ｍＭの範囲内である。１つの実施形態において、ステップｂ）の間の前記炭素源の濃度は、１５０ｍＭ～４００ｍＭ、好ましくは２００～３００ｍＭの範囲内であり、ステップｂ）の間の前記有機酸の濃度は、３０ｍＭ～１００ｍＭ、好ましくは５０～７０ｍＭの範囲内である。

１つの実施形態において、ステップｂ）の間の培地中の炭素と窒素の重量比（Ｃ：Ｎ）は、特に窒素制限培地である場合、（１００～２００）：１である。別の実施形態において、ステップｂ）の間の培地中の炭素と窒素の重量比（Ｃ：Ｎ）は、特に窒素制限培地ではない場合、（１０～１００）：１、好ましくは（１０～５０）：１である。１つの実施形態において、ステップｂ）において使用される培地は、富窒素培地である。

前記の重量比、および以下にさらに記載される重量比は、開始培地における重量比、すなわちステップｂ）が始まるときの重量比である。本明細書で使用される場合、用語「富窒素培地」は、窒素制限培地ではない培地を指す。１つの実施形態において、「富窒素培地」は、炭素と窒素の重量比（Ｃ：Ｎ）が１００未満、好ましくは８０またはそれ未満である培地である。

１つの実施形態において、前記増殖させた油脂微生物の前記純粋に酵素的な処理は、前記微生物の、加水分解酵素単独による処理、プロテアーゼと組み合わせた加水分解酵素による処理、または加水分解酵素による処理の後にプロテアーゼによる処理が続く処理である。

本明細書で使用される場合、用語「いかなる前処理、溶媒による抽出、または化学薬品による解乳化も行わない、前記増殖させた油脂微生物の純粋に酵素的な処理」は、ａ）１つまたはいくつかの溶媒を用いた抽出を行わない、ｂ）１つまたはいくつかの（適切な）化学試薬を用いた解乳化を行わない、またはｃ）ａ）とｂ）のいずれも行わない、前記油脂微生物の酵素的な処理を指すことが意図されている。好ましくは、この用語は、抽出溶媒に対するいかなる曝露もなく、かつ解乳化化学試薬に対するいかなる曝露もない、酵素的な処理を指すことが意図されている。この用語は、また、前記増殖させた油脂微生物に対する、その他のいかなる前処理の実施も排除することが意図されている。

本発明の実施形態において、「純粋に酵素的な処理」は、前記増殖させた油脂微生物のいかなる前処理の実施も排除していることに留意すべきであり、この前処理は、化学的前処理（前記増殖させた油脂微生物が曝露されることになる１つまたはいくつかの化学試薬を用いるもの）、または物理的前処理（例えば、温度、圧力、超音波、光、電磁放射線による照射などの物理的条件の変化など）であり得る。

１つの実施形態において、前記加水分解酵素は、菌類から、好ましくは糸状菌から、より好ましくはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｌｉｕｍ属、およびＦｕｓａｒｉｕｍ属の菌類から得られたものである。

１つの実施形態において、前記密度に基づく分離法は、自然の重力に基づく分離、重力を利用した相分離、および遠心分離から選択され、ここで、前記自然の重力に基づく分離、重力を利用した相分離、および遠心分離は、それぞれ単独で実施されるか、またはデカンテーション、吸引、またはその他の機械的回収法と組み合わせて実施される。

１つの実施形態において、ステップｂ）とｃ）は、同じ反応槽の中で実施される。

１つの実施形態において、ステップｃ）および／またはｄ）は、脂質相、および前記油脂微生物の加水分解物をもたらす。いくつかの例において、ステップｃ）および／またはｄ）は、加えて、前記油脂微生物の残存バイオマス（この残存バイオマスは、前記脂質相および前記加水分解物とは異なる）ももたらし得る。１つの実施形態において、前記方法は、ステップｂ）～ｄ）を繰り返し実施することを含み、ここで、ステップｃ）および／またはｄ）から得られる前記油脂微生物の前記加水分解物は、ステップｂ）を実施するために再利用／リサイクルされる。

１つの実施形態において、ステップｂ）～ｄ）は、２～ｎ回実施され、ここで、ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０から選択される整数である。

１つの実施形態において、前記加水分解酵素は、前記油脂微生物の細胞壁を溶解させる加水分解酵素調製物を得るために、誘導システム存在下で培養された菌類から取得し、ここで、好ましくは、前記誘導システムは、前記油脂微生物の構成成分、より好ましくは、微生物脂質を生産するために用いられる前記油脂微生物の１つまたはいくつかの細胞壁構成成分である。１つの実施形態において、前記誘導システムは、ステップｃ）および／またはｄ）の間に産生された前記油脂微生物の前記残存バイオマスであるか、または前記残存バイオマスの一部もしくは構成成分である。

１つの実施形態において、ステップｂ）で使用される前記培地は、富窒素培地である。

１つの実施形態において、ステップｂ）で使用される前記培地は、窒素源を、好ましくはタンパク質加水分解物の形態で、例えば、ペプトン、トリプトン、またはその他のペプチド性加水分解物などの形態でさらに含み、ここで、好ましくは、前記ペプチド性加水分解物は、動物組織、植物組織、および／または前記油脂微生物の構成成分を含む。

１つの実施形態において、前記プロテアーゼは、存在する場合、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．、またはＢａｃｉｌｌｕｓｓｐ．によって産生されたプロテアーゼから選択される。

１つの実施形態において、前記菌類から得た前記加水分解酵素は、（本発明のステップｂ）～ｃ）を実施することによって）別々に調製され、前記菌類を培養することによって直接得られる液体調製物として、またはステップｃ）で使用する溶液中で後に再構成される凍結乾燥調製物として、ステップｃ）に用いられる。

１つの実施形態において、前記加水分解酵素は、１つまたはいくつかの活性、例えば、それらに限定されないが、セルラーゼ、キシログルカナーゼ、β－グルコシダーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、およびラミナリナーゼ酵素活性から選択される酵素活性を有する。

１つの実施形態において、前記方法は、流加モード、半連続モード、または連続モードで実施され、ここで、好ましくは、前記方法は、上で定義したような、有機酸の反復的な添加を含み、ここで、好ましくは、前記方法は、有機酸、例えば酢酸またはアセテートの反復的な添加を含む。

ステップｂ）で産生される前記微生物脂質の組成は、このステップｂ）で用いられた条件による影響を受け得ることに留意すべきである。ステップｂ）の典型的な条件は、以下のとおりである。

１つの実施形態において、ステップｂ）の間の増殖温度は、５℃～３２℃の範囲内である。ステップｂ）の１つの実施形態において、ｐＨは、５～８の範囲内である。ステップｂ）の好ましい実施形態において、ステップｂ）の間の増殖温度は、１０℃～２８℃の範囲内である。ステップｂ）のさらに好ましい実施形態において、ｐＨは、５．５～７．５の範囲内である。さらにいっそう好ましい実施形態において、ステップｂ）の間の増殖温度は、５℃～３２℃の範囲内であり、ｐＨは、５～８の範囲内である。特に好ましい実施形態において、ステップｂ）の間の増殖温度は、１０℃～２８℃の範囲内であり、ｐＨは、５．５～７．５の範囲内である。

１つの実施形態において、本方法は、全脂肪酸含量に対する不飽和脂肪酸含量が＞６０％であり、および／または流動点が＜１０℃の範囲内、例えば９℃～５℃、例えばおよそ５℃などである脂質を生産するために特に有用である。このことは、ステップｂ）のために、以下のパラメーター、すなわち
前記油脂微生物を、炭素源および有機酸を含む培地中で、炭素源＝グルコース；有機酸＝酢酸＋クロトン酸添加；温度１０～１５℃；溶存酸素含量１０～３０％、およびクロトン酸添加（全有機酸の４～１０％）という条件で増殖させ、それにより、前記油脂微生物に、「流動点」が＜１０℃の範囲内、例えば９℃～５℃、例えばおよそ５℃などであり、および／または全脂肪酸含量に対する不飽和脂肪酸含量が＞６０％であることを特徴とする微生物脂質を産生させる、というパラメーターを採用した場合に、特にあてはまる。
「流動点」は、本明細書で使用される場合、典型的には、以下の規格、すなわちＤＩＮ５１５９７、ＤＩＮＥＮ２３０１５：１９９４－０５、ＤＩＮＩＳＯ３０１５：１９８２－１０、ＤＩＮＩＳＯ３０１６：１９８２－１０、ＡＳＴＭＤ９７、ＡＳＴＭＤ５９８５のいずれかに従って、好ましくはＤＩＮＩＳＯ３０１６を用いて決定される。

油脂微生物は、当業者に知られている。本発明の１つの実施形態によれば、本発明による方法で用いられる油脂微生物は、油脂酵母である。１つの実施形態において、前記油脂酵母は、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属、Ａｐｉｏｔｒｉｃｈｕｍ属、およびＣｕｔａｎｅｏｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属を含む属の群から選択される。好ましい実施形態において、前記油脂微生物／酵母は、Ｃｕｔａｎｅｏｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｍ（Ｃ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｍ）である。

微生物油の生産のために微生物を培養している間、微生物油の生産のための脂質生産性またはバイオマス生産性のいずれかにおける代償が存在する。従来、脂質の産生は、非制限条件下でバイオマスを生産するための第１のステップと、それに続く栄養制限フェーズ（このフェーズの間、バイオマスの増殖は停止し、脂質のみが蓄積される）を含む２フェーズ系で行われている。このような条件下においては、脂質生産性は７０％（ｗ／ｗ）を超えない。驚くべきことに、本発明は、バイオマス増殖と脂質蓄積を同時に達成し得る、脂質生産のための全く新しい経路を開示する。

これにより、バイオマスが２００ｇ／Ｌを超え、そのバイオマスが８５％（ｗ／ｗ）を超える脂質を含有する、バイオマスおよび脂質収率のための選択肢が提供される。１つの実施形態において、前記油脂微生物は、さらに上で定義したような、炭素源および有機酸を含む培地中で増殖させる。前記培地のｐＨに依存して、前記有機酸は解離／脱プロトン化され、この場合において、前記有機酸は、塩／カルボキシレートアニオン形態^－の有機酸として存在し、または前記有機酸は解離せず、この場合において、前記有機酸は、プロトン化形態の有機酸として存在する。前記油脂微生物を増殖させる培地は、このようなカルボン酸／カルボキシレートと共に、炭素源を含む。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、有機酸、例えば酢酸／アセテートの存在が脂質生産性を向上させる一方、炭素源の存在が全バイオマスを増加させるものと考えている。「炭素源」および有機酸は、上で定義したように、互いに異なる２つの別々のものである。１つの実施形態において、炭素源は、脂肪酸、アミノ酸、炭水化物、好ましくは単糖類、好ましくはペントースまたはヘキソース、より好ましくはグルコース、キシロース、マンニトール；オリゴ糖；動物組織の加水分解物、植物組織の加水分解物、または微生物の加水分解物；ならびに前記のいずれかの組み合わせを含む群から選択され、ここで、より好ましくは、前記炭素源は、グルコースである。前記グルコースは、単独で使用してもよく、または、例えば、適切な加水分解物、例えばペプトン、トリプトンなどと組み合わせて使用してもよい。

１つの実施形態において、前記加水分解物は、藻類加水分解物、リグノセルロース加水分解物、野菜加水分解物、海生バイオマス加水分解物、例えば海生の大型藻類および微細藻類の加水分解物など、トウモロコシ加水分解物、小麦加水分解物、またはその他の加水分解物である。本発明による方法の、リサイクリングステップを含むいくつかの実施形態において、前記加水分解物は、前記油脂微生物（例えば酵母自体）の加水分解に由来する微生物加水分解物（例えば酵母加水分解物）であってもよく、脂質の産生に使用された後の加水分解物であるのが好ましい。

上で定義した炭素源および有機酸を含む適切な培地中で前記油脂微生物を増殖させると、前記油脂微生物は、微生物脂質を産生する。しかしながら、典型的には、これらの微生物脂質は、まだ前記油脂微生物の細胞内に含まれており、したがって、その後の回収のために利用しやすくする必要がある。したがって、本発明の実施形態は、産生された微生物脂質を、その後の培養槽からの回収に適合させる、または、その後の培養槽からの回収に利用しやすくする、前記増殖させた油脂微生物の酵素的な処理を規定する。本発明による方法は、いかなる前処理ステップ（例えば化学的前処理ステップ）にも、またはそれに続く、もしくはそれと同時の、溶媒を用いた前記脂質の抽出にも頼る必要がない、前記増殖させた油脂微生物の純粋に酵素的な処理を含むことに留意すべきである。このような化学的前処理ステップ、またはそれに続く、またはそれと同時の抽出ステップは、溶媒による抽出または化学薬品による解乳化である。しかしながら、このような排除された前処理ステップは、物理的ステップ、例えば、温度変化、圧力変化、遠心分離、音波処理、照射などでもあり得る。

用語「化学薬品による解乳化」は、本明細書で使用される場合、（形成されている可能性がある）任意の乳濁液の解乳化を可能にするために、増殖させたバイオマスを解乳化剤に曝露することを指す。

本発明の実施形態によれば、前記方法は、溶媒による抽出、化学薬品による解乳化、または、例えば温度ショック、化学的処理、または高圧ホモジナイズもしくは超音波ホモジナイズなどのその他の処理を含まない。これらの処理は、潜在的に、前記方法のコストまたは危険な特性を増加させるであろうことから、本発明では回避される。本発明者らは、驚くべきことに、このような過酷な処理ステップが、厳密には必要ではないことを見いだした。

本発明による実施形態において、続いて、前記産生された微生物脂質は、密度に基づく分離法を用いて回収される。最も簡単な形態において、このような密度に基づく分離法は、前記油脂微生物の培養物を、ある期間、単に放置するプロセスであってもよく、その結果、脂質相は、密度および／または水に対する溶解性の違いによって、水相から分離する。この分離法は、その後のデカンテーション、吸引、またはその他の培養物からの脂質相の機械的分離と組み合わせてもよい。他の実施形態において、重力を利用した相分離によって、遠心分離によって、分離が起こり得、これらは単独であってもよく、その後の脂質相の機械的分離（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｒｅｍｏｖａｌｏｒｔｈｅｌｉｐｉｄ－ｐｈａｓｅ）、例えばデカンテーションまたは吸引と組み合わせてもよい。

１つの実施形態において、ステップｃ）の間、前記「いかなる溶媒による抽出も行わない、前記増殖させた油脂微生物の純粋に酵素的な処理」とは、前記微生物の、加水分解酵素による処理である。好ましくは、このような加水分解酵素は、別の微生物から、好ましくは菌類から、より好ましくは糸状菌から得る。１つの実施形態において、前記菌類は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｌｌｉｕｍ属、およびＦｕｓａｒｉｕｍ属から選択される。より好ましい実施形態において、前記糸状菌は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉであり、その理由は、この糸状菌は、前記油脂微生物の細胞壁を溶解させる、特に効果的な加水分解酵素を産生することが確認されているからである。１つの実施形態において、前記加水分解酵素は、誘導システムの存在下で培養された菌類、好ましくは糸状菌から取得し、ここで、好ましくは、前記誘導システムは、前記油脂微生物の細胞壁を溶解させる加水分解酵素調製物が得られるように、微生物脂質を生産するために用いられる前記油脂微生物の構成成分、好ましくは前記油脂微生物の１つまたはいくつかの細胞壁構成成分である。１つの実施形態において、前記誘導システムは、ステップｃ）およびｄ）の間に産生され得る前記残存バイオマス、またはその構成成分である。好ましくは、このような加水分解酵素は、前記油脂微生物の細胞壁のフラグメントの存在下で、前記糸状菌を培養することによって産生される。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、前記糸状菌、例えばＴ．ｒｅｅｓｅｉを、前記油脂微生物のこのような細胞壁構成成分の存在に曝露することによって、前記のような糸状菌に、前記油脂微生物の細胞壁の溶解を完了させるための、まさに適切な酵素を産生させると考えている。特に好ましい実施形態において、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属由来の糸状菌、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉが用いられ、特に好ましい実施形態において、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉのミュータント、例えば、ＡＴＣＣ寄託番号５６７６５および１３６３１を有するミュータントが用いられる。糸状菌が培養されたら、得られた培養物をさらに処理、例えば濃縮してもよく、そして前記菌類自体のバイオマスを除去し、得られた上清をその形態で使用してもよく、またはその上清を、保存およびその後の適切な水溶液中での再構成のために、凍結乾燥して保管してもよい。再び、いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、このようにして産生された加水分解酵素は、種々の酵素活性の組み合わせ、例えば、セルラーゼ、キシログルカナーゼ、β－グルコシダーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、およびラミナリナーゼ、ならびに、場合により、その他の酵素活性の組み合わせを示し得ると考えている。

本発明による１つの実施形態において、ステップｂ）およびｃ）は、同じ反応槽の中で実施される。これは、本明細書において、「ワンポット法」または「ワンポットプロセス」とも呼ばれることがある。この実施形態において、本発明による方法は、微生物脂質の製造のためのワンポットプロセスとみなされる。典型的には、ステップｃ）および／またはステップｄ）は、脂質相と前記油脂微生物の加水分解物相をもたらし、そして本方法は、好ましくは、ステップｂ）～ｄ）を繰り返し実施することを含む。このような実施形態において、ステップｃ）および／またはｄ）から得られる前記加水分解物は、ステップｂ）を実施するために再利用／リサイクルされる。このような実施形態において、ステップｃ）および／またはｄ）から得られる前記微生物加水分解物は、ステップｂ）において使用される培地中に再供給され、炭素源としての、または追加の炭素源（選択された、最初に存在する炭素源に対する、追加の炭素源）としての役割を果たし得る。ここで、ステップｂ）～ｄ）における副生成物が再利用／リサイクルされる実施形態、例えば、ステップｃ）および／またはｄ）から得られる生成物がステップｂ）において再利用／リサイクルされる実施形態は、廃棄物の発生を防止する。したがって、このような実施形態は、本明細書において、「廃棄物の出ないプロセス」または「廃棄物の出ない方法」とも呼ばれることがある。

１つの実施形態において、特に前記油脂微生物の前記加水分解物がステップｂ）を実施するために再利用／リサイクルされる場合、本発明による方法は、ステップｂ）～ｄ）が、繰り返し、好ましくは２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、または、場合により１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または、更には５０回５０実施される方法である。１つの実施形態において、ステップｂ）～ｄ）は、２～３回実施される。繰り返しリサイクルを行うことによって、このプロセスから生じる生成物、例えば前記油脂微生物の加水分解物が、その油脂微生物を増殖させるための開始培地として再利用されるため、含まれる種々の培地の効率的な利用が可能になり、過剰な廃棄物の生成が回避される。

１つの実施形態において、ステップｂ）において使用される培地は、窒素源を、好ましくはタンパク質加水分解物の形態で、例えば、ペプトン、トリプトン、またはその他のペプチド性加水分解物などの形態でさらに含む。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、このような追加の窒素源が存在することによって、全体として、脂質とバイオマスの生産を向上させると考えている。

１つの実施形態において、ステップｂ）において使用される培地は、富窒素培地である。用語「富窒素培地」は、本明細書で使用される場合、炭素と窒素の重量比（Ｃ：Ｎ）が、＜１００、好ましくは≦８０、より好ましくは２５～８０である培地を指す。

本発明による１つの実施形態において、ステップｃ）において実施される「純粋に酵素的な処理」は、前記微生物の、プロテアーゼによる処理をさらに含む（しかしながら、依然として、前処理、または溶媒による抽出もしくは化学薬品による解乳化は排除される）。このようなプロテアーゼは、もし使用されるときは、前述の加水分解酵素を用いた処理に続いて使用されるか、または前述の加水分解酵素を用いた処理と組み合わせて使用されることに留意すべきである。再び、いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、プロテアーゼを含む前記処理によって、産生された脂質に付随するあらゆるタンパク質から前記産生された脂質を分離することが可能となり、その結果、脂質の遊離が促進されると考えている。１つの実施形態において、前記プロテアーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．、またはＢａｃｉｌｌｕｓｓｐ．によって産生されたプロテアーゼの群から選択される。

１つの実施形態において、本発明による方法は、流加様式または連続モード様式で実施され、流加モードが好ましい。好ましくは、本発明による方法が流加様式で実施される場合、ステップｂ）の実施のために、上で定義したような、所定量の前記炭素源、および所定量の前記有機酸を、繰り返して、好ましくはステップｂ）が実施される回数だけ添加する。好ましい実施形態において、ステップｂ）の間の前記有機酸の濃度は、発酵時間にわたって、３０～１００ｍＭの範囲、好ましくは５０～７０ｍＭの範囲の濃度に維持すべきである。

さらに、図面について以下のように言及する。

図１は、本方法の実施によって得られる生成物、特に油脂微生物の加水分解によって得られる生成物のいくつかのリサイクルを含む、本発明による実施形態に含まれるバイオマスの流れを示す。

図２は、異なるフィードを用いた、すなわち（ａ）酢酸単独を用いた；（ｂ）グルコース単独を用いた、発酵時間にわたるバイオマス増殖およびフィード消費量を示す。

図３は、異なるフィードを用いた、発酵時間にわたるバイオマス増殖フィード消費量、および脂質蓄積、すなわち（ａ）窒素制限培地において酢酸とグルコースの両方による共発酵を用いた、発酵時間に対するバイオマス増殖および基質燃焼；（ｂ）窒素制限培地において酢酸とグルコースの両方による共発酵を用いた、発酵時間にわたる、発酵時間に対する脂質蓄積；（ａ）富窒素培地において酢酸とグルコースの両方による共発酵を用いた、発酵時間に対するバイオマス増殖および基質燃焼；ならびに（ｄ）富窒素培地において酢酸とグルコースによる共発酵を用いた、発酵時間に対する脂質蓄積を示す。

図４は、異なるフィードを用いた、発酵時間にわたるバイオマス増殖、脂質蓄積、およびフィード消費、すなわち（ａ）酢酸とグルコースによる共発酵をＬａｍｉｎａｒｉａｄｉｇｉｔａｔａ加水分解物と共に用いた、発酵時間に対するバイオマス増殖および基質燃焼；（ｂ）単位ｇ／Ｌ（明るい灰色の縦棒）および単位％（ｗ／ｄｗバイオマス）（重量パーセント／バイオマス乾燥重量あたり）（暗い灰色の縦棒）の両方で表した、（ａ）の培養物の脂質の蓄積および生産性；（ｃ）半連続モードを用い、富窒素培地において酢酸とグルコースによる共発酵を用いた、発酵時間に対するバイオマス増殖および基質燃焼（すなわち、酢酸のバッチを繰り返し（例えば２回）加え、そしてバイオマスもまた繰り返し（例えば２回）回収する）；および（ｄ）富窒素培地において酢酸とグルコースによる共発酵を用いた（ここでも、３ａ）と同様に半連続モードを用いる）、発酵時間に対する脂質の蓄積および生産性を示す。

図５は、連続発酵モードを用い、富窒素培地において酢酸とグルコースによる共発酵を用いた、発酵時間に対するバイオマス増殖および脂質蓄積を示す；（ａ）発酵時間に対する、ＯＤ６００ｎｍによって測定したバイオマス増殖；（ｂ）発酵時間に対する、細胞数によって測定したバイオマス増殖；（ｃ）発酵時間に対する、重量分析法によって測定したバイオマス増殖；および（ｄ）発酵時間に対する、重量分析法によって測定した脂質の蓄積および生産性。

図６は、（ａ）Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ（ＡＴＣＣ１３６３１）を用いた、酵素的加水分解時間に対するバイオマス重量の相対的減少；（ｂ）Ｔ．ｒｅｅｓｅｉＲＵＴＣ－３０（ＡＴＣＣ５６７６５）を用いた、酵素的加水分解時間に対するバイオマス重量の相対的減少；（ｃ）酵素系（すなわちミックス１（市販の混合物）、ミックス２（市販の混合物）、前記Ｔ．ｒｅｅｓｅｉＡＴＣＣ１３６３１、および前記Ｔ．ｒｅｅｓｅｉＲＵＴＣ－３０（ＡＴＣＣ５６７６５））と共に１２時間および１８時間インキュベートした後の相対残存バイオマス重量；ならびに２つの対照、すなわち対照１＝未処理のバイオマス；対照２＝加水分解酵素処理を行わないことを除き、同じ条件下でインキュベートしたバイオマス；（ｄ）従来の溶媒抽出（クロロホルム：ＭｅＯＨ（２：１（ｖ／ｖ）を溶媒として用いる）を用いて遊離された脂質、および加水分解酵素処理を行わないことを除き、同じ条件下でインキュベートした対照と比較した、酵素系（すなわちミックス１（市販の混合物）、ミックス２（市販の混合物）、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉＡＴＣＣ１３６３１、およびＴ．ｒｅｅｓｅｉＲＵＴＣ－３０（ＡＴＣＣ５６７６５））と共に１２時間および１８時間インキュベートした後の、遊離された脂質の相対重量を示す。ミックス１：マンナナーゼ（Ｃｌａｒｉａｎｔ、スイス）、ＣｅｌｌｉｃＣｔｅｃ２（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、デンマーク）、ＣｅｌｌｉｃＨｔｅｃ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、デンマーク）、およびβ－グルコシダーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、デンマーク）の混合物。ミックス２：Ｌｉｑｕｅｂｅｅｔ（Ｃｌａｒｉａｎｔ、スイス）、ＣＬＡ（Ｃｌａｒｉａｎｔ、スイス）、マンナナーゼ（Ｃｌａｒｉａｎｔ、スイス）１，３－β－グルカナーゼ（１．３－β－ｇｌｕｃａｎａｓｅ）（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、フランス）、およびβ－グルコシダーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、デンマーク）の混合物。

図７は、（ａ）酵素的加水分解時間に対する、Ｃ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ細胞密度（ｄｅｌｌｄｅｎｓｉｔｙ）の細胞密度プロット図を示す。この細胞密度プロットは、前方散乱（ＦＳＣ）（ｘ軸）および側方散乱（ＳＳＣ）（ｙ軸）の強度；（ｂ）酵素的加水分解時間に対する、糖濃度の上昇；（ｃ）酵素的加水分解時間に対する、Ｃ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓの細胞数の減少を示す。

図８は、（ａ）酵素的加水分解を１０時間行った後の、酵母細胞についての蛍光顕微鏡イメージを示す。脂質は、ナイルレッドで染色した；（ｂ）酵素的加水分解後の培養物（この培養物は、ワークベンチ上に終夜放置されていたものである）；（ｃ）遠心分離（９０００ｇ、２０分間）後の培養物；（ｄ）さらなる精製を何も行わずにデカンテーションした後の浮遊脂質。

図９は、酢酸とグルコースによる共発酵を用いた、発酵時間に対する、重量分析法によって測定したバイオマス増殖を示す。サイクル１において、使用した培地は、グルコースと酢酸の両方を使用して、さらにペプチド加水分解物を含む、富窒素培地であった。サイクル２および３において、使用した培地は、その前のサイクルにおいて産生された加水分解物を含んでいた。

図１０は、酢酸のみを使用した、発酵時間に対する（発酵は、２リットルフラスコ中で、温度２８℃、ｐＨ６．５、およびｐＯ_２≧５０％で行った）、ｇ／Ｌで測定した脂質含量（明るい灰色の縦棒）の増加、および単位％（ｗ／ｄｗバイオマス）（重量パーセント／バイオマス乾燥重量あたり）での生産性の向上（暗い灰色の縦棒）を示す。

図１１は、最小窒素培地におけるグルコースによる発酵（左図）および富窒素培地における共発酵（右図）についての、細胞容積および脂質含量の著しい増加を示す蛍光顕微鏡イメージを示す。

図１２は、富窒素培地における、発酵時間に対する、酢酸とグルコースによる共発酵の前方散乱［ＦＳＣ］強度（ｘ軸）および側方散乱［ＳＳＣ］強度（ｙ軸）の上昇を示す。発酵は、２１リットルのバッチで、温度２８℃、ｐＨ６．５、およびｐＯ_２≧５０％で行った。

図１３は、富窒素培地における、発酵時間に対する、酢酸とグルコースによる共発酵の脂肪酸プロファイル（全脂肪酸重量あたりの重量％で表される）において観察された変化を示す。発酵は、２１リットルのバッチで、温度２８℃、ｐＨ６．５、およびｐＯ_２≧５０％で行った。

図１４は、グルコースと酢酸の両方を使用した共発酵における発酵後、および１５，０００ｇで３０分間の遠心分離後の油性の酵母培養物を示す。

図１５は、２４００ｂａｒの圧力を３回加えた、高圧ホモジナイザーによる処理後の、Ｃ．ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ細胞についての電子顕微鏡イメージを示す。

図１６は、異なる運転条件下で産生された脂質のサンプルを示す。

図１７は、１００％酢酸を使用した培地中でＣ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓを培養した後に得られた酵母油の脂肪酸プロファイルを示す。

図１８は、９０％酢酸と１０％イソ酪酸の混合物を使用した培地中でＣ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓを培養した後に得られた酵母油の脂肪酸プロファイルを示す。

図１９は、９０％酢酸と１０％イソ吉草酸の混合物を使用した培地中でＣ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓを培養した後に得られた酵母油の脂肪酸プロファイルを示す。

図２０は、９０％と１０％クロトン酸の混合物を使用した培地中でＣ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓを培養した後に得られた酵母油の脂肪酸プロファイルを示す。

さらに、以下の実施例に言及するが、これらは、本発明を限定するためではなく、例証するために示されている。

１．１．脂質生産性の最大化
実施例１（比較のための、酢酸単独の発酵、グルコース単独の発酵）

窒素制限培地条件および富窒素培地条件を用いた、種々の発酵設定（酢酸単独、グルコース単独、酢酸とグルコースの共発酵）が検討された。単独基質発酵に関して、グルコース単独の発酵（培地Ａ）（図２ｂ）は、酢酸単独の発酵（培地Ｂ）（図２ａ）に対して、より高いバイオマス生産性を示す。しかしながら、酢酸単独の発酵は、グルコース単独の発酵の設定に対して、わずかに高い脂質生産性を示し（図１０）、それぞれ、酢酸単独の発酵は、０．１３ｇ／Ｌ／ｈ［バイオマス２２ｇ／Ｌ、脂質７２％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）］、およびグルコース単独の発酵は、０．０９ｇ／Ｌ／ｈ［バイオマス３４ｇ／Ｌ、脂質４５％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）］をもたらした。

さらに、油脂生物を用いた従来の脂質生産は２段階のプロセスであり、第１のステップは、非制限条件下（対数増殖期）においてバイオマス形成をもたらし、第２の脂質誘導ステップ（栄養制限フェーズ）は、細胞数増加が止まった状態において、高い細胞内脂質の蓄積をもたらす。本発明者らのデータは、糖と有機酸（例えば酢酸）の共発酵が、代謝ストレス因子（例えば窒素制限など）を必要とせずに、バイオマスと脂質の同時形成を実現しうることを初めて実証した。本発酵手段は、これまでに発表されたあらゆるデータを凌駕するバイオマスおよび脂質生産速度（バイオマス２４０ｇ／Ｌ、脂質８７％（ｗ／ｗ））を達成した。

株：Ｃｕｔａｎｅｏｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ（ＡＴＣＣ２０５０９）を、抗生物質（１０ｍｇ／Ｌアンピシリン、１０ｍｇ／Ｌカナマイシン、および１２ｍｇ／Ｌテトラサイクリン）を含有する、ＹＰＤ培地ブロス（１０ｇ／Ｌ酵母抽出物、２０ｇ／Ｌペプトン、および２０ｇ／Ｌグルコース）が入ったエルレンマイヤーフラスコ内で培養した。そのフラスコを、ロータリーシェーカー内で、１００ｒｐｍ、温度２８℃で２日間インキュベートし、次いで、それを接種材料として使用した。

培地Ａ：グルコース３０ｇ／Ｌ、酵母抽出物０．５ｇ／Ｌ、ＮＨ_４Ｃｌ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４２．４ｇ／Ｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ０．９ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ１．５ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ０．０８ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０１ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ０．１ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ、ＣＯ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ。

培地Ｂ：酵母抽出物０．５ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム４．１ｇ／Ｌ、ＮＨ_４Ｃｌ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４２．４ｇ／Ｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ０．９ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ１．５ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ０．０８ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０１ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ０．１ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ、ＣＯ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ。

２Ｌバイオリアクター：Ｔ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓの流加培養を、２Ｌバイオリアクター（ＩＮＦＯＲＳＨＴシステム、スイス）内で、対応する培地の仕込み容量１Ｌで実施した。温度は２８℃で一定に保たれ、バイオリアクターのｐＨは、１ＭＮａＯＨまたは１ＭＨＣｌ（グルコース発酵の場合）および５０％酢酸（ＡＡ発酵の場合）によって、ｐＨ６．５±０．２に調節された。撹拌（３５０～１０００ｒｐｍ）およびエアレーション（１．０～２．０ＮＬ／Ｖの空気）は、５０％を上回る溶存酸素を維持するように自動的に制御された。０．０１％（Ｖ／Ｖ）の消泡剤（Ａｎｔｉｆｏａｍ２０４、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を加えることによって泡を予防した。
実施例２（窒素制限培地における酢酸とグルコースの共発酵）

比べて、窒素制限培地（培地Ｃ）におけるグルコースと酢酸の共発酵（図３ａ）は、初めの２４時間で、バイオマスが２０ｇ／Ｌ、脂質含量が２０％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}））］に達した（図３ｂ）。これに対して、同じ時点で、個別のグルコースおよび酢酸発酵は、それぞれ、バイオマスが１０ｇ／Ｌ、脂質含量が１２％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）、ならびにバイオマスが５ｇ／Ｌ、脂質が３０％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）に達したにすぎなかった。これは、第１日からの脂質生産性が０．２ｇ／Ｌ／ｈであり、これに対して、個別のグルコースおよび酢酸バッチ発酵に関しては０．０７５ｇ／Ｌ／ｈであったことと符合する。

窒素制限条件下における脂質生産性は、その後、発酵第５日までに、０．１８ｇ／Ｌ／ｈ［バイオマス４３ｇ／Ｌ、脂質７３．５％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）］まで低下した。算出された炭素：炭素利用率は、０．２２ｇ／ｇ脂質／全炭素であった。この低下は、制限された窒素資源が原因であり得る。

培地Ｃ：グルコース３０ｇ／Ｌ、酵母抽出物０．５ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム４．１ｇ／Ｌ、ＮＨ_４Ｃｌ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４２．４ｇ／Ｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ０．９ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ１．５ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ０．０８ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０１ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ０．１ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ、ＣＯ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ。

２Ｌバイオリアクター：Ｔ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓの流加培養を、２Ｌバイオリアクター（ＩＮＦＯＲＳＨＴシステム、スイス）内で、対応する培地の仕込み容量１Ｌで実施した。温度は２８℃で一定に保たれ、バイオリアクターのｐＨは、１ＭＮａＯＨまたは１ＭＨＣｌ（グルコース発酵の場合）および５０％酢酸（ＡＡ発酵の場合）によって、ｐＨ６．５±０．２に調節された。撹拌（３５０～１０００ｒｐｍ）およびエアレーション（１．０～２．０ＮＬ／Ｖの空気）は、５０％を上回る溶存酸素を維持するように自動的に制御された。０．０１％（Ｖ／Ｖ）の消泡剤（Ａｎｔｉｆｏａｍ２０４、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を加えることによって泡を予防した。
実施例３（窒素に富む培地における酢酸とグルコースの共発酵）

興味深いことに、富窒素培地（培地Ｄ）をベースとした発酵によって、第１日までに、脂質生産性が０．６７ｇ／Ｌ／ｈまで向上した（図３ｃおよび３ｄ）。注目すべきことに、富窒素培地による共発酵は、発酵を開始した直後に、バイオマスと細胞内脂質の両方の同時形成を示す。これらの条件下で、７０％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）を超える脂質含量が、発酵第２日までに達成された。その後、この脂質収率はさらに上昇し、１２０時間後に８５％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）に達した。これは、油脂酵母でこれまでに観察された、最も高い細胞内脂質収率である。このような実験条件下で、バイオマス収率もまた、水平化して定常期に入ることなく、直線的に上昇を続けた（図３ｃ）。ここで適用した酢酸と糖の共発酵プロトコルによって、脂質生産性は、０．５３ｇ／Ｌ／ｈ［バイオマス８４ｇ／Ｌ、８４．９％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）］まで改善された。しかしながら、炭素：炭素利用率は、０．２４ｇ／ｇ脂質／全炭素であった。確証的に、蛍光顕微鏡イメージングによって、細胞容積と脂質含量の著しい増加が示された（図１１）。

推定では、そしていかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、酢酸は、培地から同化され、そして直接アセチル－ＣｏＡ（細胞増殖、脂質生合成、およびエネルギー代謝に関係する、普遍的な基盤となる代謝産物である）に変換され得る。この変換は酢酸ＣｏＡリガーゼによって触媒され、このことは以前にＣ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓのトランスクリプトーム分析において報告されている。よって、酢酸ＣｏＡリガーゼは、糖ベースの発酵について報告されているような相対的なＣ：Ｎ比とは無関係に、脂質生合成経路への近道に関連する、高脂質含量をもたらす基本的な酵素活性であり得る。

具体的には、酢酸ＣｏＡは、細胞の恒常性および増殖と結びついている、中心的なＴＣＡ中間体である。しかしながら、酢酸のみを使用して（すなわち、独立した炭素源なしで）得た本発明者らのデータは、アセテートは脂肪酸生合成に優先的に向けられ、細胞増殖を確実にするものではないこと示している。この点に関し、バイオマスの生産が、脂質生合成と同時に誘導され得るか否かを明らかにすることが重要である。バイオマスと脂質の同時形成は、プロセスの経済的実現可能性のための鍵となる因子である。この点に関し、炭素源と有機酸の共発酵、例えば糖と酢酸の共発酵が、迅速なバイオマス増殖と脂質蓄積の両方を引き起こすための最も有効な手順であると思われる。

培地Ｄ：グルコース３０ｇ／Ｌ、酵母抽出物０．５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム４．１ｇ／Ｌ、ＮＨ_４Ｃｌ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４２．４ｇ／Ｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ０．９ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ１．５ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ０．０８ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０１ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ０．１ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ、ＣＯ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ。

２Ｌバイオリアクター：Ｔ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓの流加培養を、２Ｌバイオリアクター（ＩＮＦＯＲＳＨＴシステム、スイス）内で、対応する培地の仕込み容量１Ｌで実施した。温度は２８℃で一定に保たれ、バイオリアクターのｐＨは、１ＭＮａＯＨまたは１ＭＨＣｌ（グルコース発酵の場合）および５０％酢酸（ＡＡ発酵の場合）によって、ｐＨ６．５±０．２に調節された。撹拌（３５０～１０００ｒｐｍ）およびエアレーション（１．０～２．０ＮＬ／Ｖの空気）は、５０％を上回る溶存酸素を維持するように自動的に制御された。０．０１％（Ｖ／Ｖ）の消泡剤（Ａｎｔｉｆｏａｍ２０４、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を加えることによって泡を予防した。
実施例４（酢酸と褐藻類加水分解物培地の共発酵）

先の発酵操作において、純粋なグルコースを含む合成培地を適用した。しかしながら、共発酵による土地利用変化の影響を回避するために、海生褐藻類バイオマスであるＬ．ｄｉｇｉｔａｔａを糖源として供給した。以前に報告されているＬ．ｄｉｇｉｔａｔａ加水分解物（参考文献：Ｍａｓｒｉら、ＪｏｕｒｎａｌＡｐｐｌ．Ｅｎｅｒｇ．，２０１８，ｖｏｌ．２２４，１－１２）（この加水分解物は、炭素源として、特にグルコースとマンニトールを含有している）を、酢酸と共に、共発酵モードで用いた。Ｌ．ｄｉｇｉｔａｔａ加水分解物と酢酸の共発酵によって、栄養制限なしで、バイオマスと脂質が同時に形成された。加えて、バイオマス収率は細胞内脂質形成を上回り、また、このより高いバイオマス収率によって、全脂質生産性は、０．５９ｇ／Ｌ／ｈ［バイオマス１１４ｇ／Ｌ、脂質６４％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）］と向上した。この実験の設定において、炭素利用率は、０．２４ｇ／ｇ脂質／全炭素量であった（図４ａおよび４ｂ）。

転作した土地からのバイオ燃料およびオレオケミカルの生産は、これらのバイオ燃料がもたらすであろう年間の温室効果ガス（ＧＨＧ）削減量よりも１７～４２０倍多くのＣＯ_２を放出することから、固有の炭素負債を生じさせる。例えば、アブラヤシ由来のバイオディーゼル（アブラヤシは転作した泥炭雨林に植えられた）によって生じた炭素負債を償還するためには、約４２３年を要する。対照的に、廃棄物バイオマス（例えば森林廃棄物など）または耕作放棄地で作られたバイオ燃料およびオレオケミカルは、生じさせる炭素負債がわずかであるか、または炭素負債を生じさせない。他方、このような廃棄物バイオマスまたは耕作放棄地の植栽は、食品産業に対する高い圧力を生じさせ、土地の制約による価格の上昇を引き起こすであろう。

この点に関し、本発明者らは、褐藻類であるＬ．ｄｉｇｉｔａｔａ（本発明者らは、以前に、Ｌ．ｄｉｇｉｔａｔａが、Ｃ．ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓのための優れた発酵基材であることを実証している（Ｍａｓｒｉら、ＪｏｕｒｎａｌＡｐｐｌ．Ｅｎｅｒｇ．，２０１８，ｖｏｌ．２２４，１－１２））の酵素的加水分解物を用いることにした。さらに、ライフサイクルの影響およびプロセスの持続可能性に関し、Ｌ．ｄｉｇｉｔａｔａ由来の褐藻類加水分解物などの海生バイオマスは、あらゆる陸生バイオマス残渣よりも優れており、その理由は、海生バイオマスは、農業活動と競合せず、陸生の同等物よりも著しく早く成長し、かつ、陸生リグノセルロース（ｌｉｎｇｏ－ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ）バイオマスが必要とするエネルギー集約的な物理化学的前処理によらずに、容易に加水分解され得るからである。

Ｌ．ｄｉｇｉｔａｔａ加水分解物：Ｌａｍｉｎａｒｉａｄｉｇｉｔａｔａ（Ｌ．ｄｉｇｉｔａｔａ）の褐藻類サンプルの酵素的加水分解を、２０リットルの酢酸バッファー溶液（５０．０ｍＭ、ｐＨ５．０）および６０．０ｇのバイオマスが入った５リットルガラス瓶（Ｓｃｈｏｔｔ）を用いて行った。この反応は、酵素溶液を加え、電磁攪拌器を用いて４００ｒｐｍで撹拌しながら、５０℃で７２時間インキュベートすることによって引き起こした。それから、反応混合物を８０００ｇで３０分間遠心し、次いでクロスフロー濾過した（再生セルロースから作られた１０ｋＤａ膜を、以下のパラメーターで使用した：入口圧（Ｐ１）２ｂａｒ、リペンタント圧（ｒｅｐｅｎｔａｎｔ－ｐｒｅｓｓｕｒｅ）（Ｐ２）０．３～０．５ｂａｒ、および透過物は大気圧に開放されていた。リペンタント（ｒｅｐｅｎｔａｎｔ）と透過物の流速は、それぞれ、およそ２Ｌ／分とおよそ０．１Ｌ／分であった。得られた加水分解物を滅菌するために、出口に０．２μｍフィルターカプセルを取り付けた。）。

２Ｌバイオリアクター：Ｔ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓの流加培養を、２Ｌバイオリアクター（ＩＮＦＯＲＳＨＴシステム、スイス）内で、対応する培地の仕込み容量１Ｌで実施した。温度は２８℃で一定に保たれ、バイオリアクターのｐＨは、１ＭＮａＯＨまたは１ＭＨＣｌ（グルコース発酵の場合）および５０％酢酸（ＡＡ発酵の場合）によって、ｐＨ６．５±０．２に調節された。撹拌（３５０～１０００ｒｐｍ）およびエアレーション（１．０～２．０ＮＬ／Ｖの空気）は、５０％を上回る溶存酸素を維持するように自動的に制御された。０．０１％（Ｖ／Ｖ）の消泡剤（Ａｎｔｉｆｏａｍ２０４、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を加えることによって泡を予防した。
実施例５（窒素に富む培地における酢酸とグルコースの共発酵－半連続運転モード）

経済効率に関し、各種の運転モードを試験した。そのために、半連続運転モードおよび連続運転モードを、長時間の運転時間で試験した。

２つの回収点を含む半連続運転モードを、約１２日間行った。この２つの部分的回収点は、１６２時間と２３４時間の時点で行い、培養物の４０～５０％（Ｖ／Ｖ）をバイオリアクターから取り出し、その分を新鮮な培地Ｅで置き換えた。長時間にわたるＮ富化培地（培地Ｄ）と酢酸の初めの共発酵を図４ｃおよび４ｄに示す。以前に観察されたように、バイオマスと脂質の形成は同時的で、１６２時間後に、脂質生産性は０．５７ｇ／Ｌ／ｈ［バイオマス１０６ｇ／Ｌ、脂質８７％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）］に達していた。このとき、第１の回収点で、４０％（Ｖ／Ｖ）回収され、それによってバイオマス濃度は６９ｇ／Ｌに低下した。

これに続く４２時間の運転において、バイオマス濃度は急速に増加し、２３５ｇ／Ｌに達した。さらに、脂質含量は、驚くべきことに、８０％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）超に維持することができ、脂質生産性は０．９０ｇ／Ｌ／ｈであった。これは、この点のプロセス最適化において観察された、最も高い脂質生産性である。

２３４時間の時点において、第２の回収ステップを実施し、培養量の５０％（Ｖ／Ｖ）を取り出した（図４ｃ）。このため、バイオマス濃度は、１５８ｇ／Ｌに低下した。興味深いことに、バイオマス濃度は、続く３２時間の発酵の間に、２４０ｇ／Ｌまで回復し、脂質含量は８７．５％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）であった。

運転の終わりには、全脂質生産性は、０．８ｇ／Ｌ／ｈ［バイオマス２４０ｇ／Ｌ、脂質８７．６％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）］であった。しかしながら、脂質形成に関する炭素利用率は、０．３９ｇ／ｇであった。しかしながら、この生産性の数値は、回収された培養物量を考慮しておらず、この回収された培養物量は、元の培養物の体積の８０％（Ｖ／Ｖ）を超えていた。極めて高い細胞密度および脂質含量は、細胞を水にさらした時に、極めて高い粘度および細胞の疎水性によって視覚的に明らかにすることができた。

培地Ｄ：グルコース３０ｇ／Ｌ、酵母抽出物０．５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム４．１ｇ／Ｌ、ＮＨ_４Ｃｌ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４２．４ｇ／Ｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ０．９ｇ／ＬＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ１．５ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ０．０８ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０１ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ０．１ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ、ＣＯ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ。

培地Ｅ：酵母抽出物１．０ｇ／Ｌ、ペプトン１．０ｇ／Ｌ、ＮＨ_４Ｃｌ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４２．４ｇ／Ｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ０．９ｇ／ＬＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ１．５ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ０．０８ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０１ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ０．１ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ、ＣＯ（ＮＯ_３）２・６Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ。

２Ｌバイオリアクター：Ｔ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓの流加培養を、２Ｌバイオリアクター（ＩＮＦＯＲＳＨＴシステム、スイス）内で、対応する培地の仕込み容量１Ｌで実施した。温度は２８℃で一定に保たれ、バイオリアクターのｐＨは、１ＭＮａＯＨまたは１ＭＨＣｌ（グルコース発酵の場合）および５０％酢酸（ＡＡ発酵の場合）によって、ｐＨ６．５±０．２に調節された。撹拌（３５０～１０００ｒｐｍ）およびエアレーション（１．０～２．０ＮＬ／Ｖの空気）は、５０％を上回る溶存酸素を維持するように自動的に制御された。０．０１％（Ｖ／Ｖ）の消泡剤（Ａｎｔｉｆｏａｍ２０４、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を加えることによって泡を予防した。
実施例６（窒素に富む培地における酢酸とグルコースの共発酵－連続運転モード－スケールアップ）

技術的に妥当なスケールにおける、発明者らのデータを検証するために、２５Ｌスケールで、Ｎ富化培地において共発酵を行った。発酵は、連続希釈として５０％（ｗ／ｗ）の酢酸を用いて、連続モードで運転した。酵素は、この実験操作の開始後約４８時間で著しい酢酸代謝を引き起こしたために、５０％（ｗ／ｗ）の濃度で酢酸の供給を行ったので、反応槽の希釈度は増大した。この点に関し、実験期間にわたって酢酸代謝が増大するにつれて、希釈係数が連続的に増加したことに留意しなければならない。

最初の２４時間以内は、酢酸供給は、１日あたり２ｋｇ／日であり、その後、９６時間において６ｋｇまで指数関数的に増加させた。この供給速度において、培養物の体積は、９６時間にわたって４．５Ｌ増加し［１８％（Ｖ／Ｖ）の体積増加］、これは７．５ｍＬ／Ｌ／ｈの希釈に相当する。この体積増加は、これと等しい体積の培養物を毎日回収（４．５Ｌ／日）することによって相殺した。９６時間後、一定のＯＤおよび細胞数（フローサイトメトリーによって）を検出することができ、これは反応における、増殖速度と、適用した希釈係数との間のバランスによるものであった（図５ａおよび５ｂ）。しかしながら、細胞数が一定であった一方で、バイオマス形成の連続的な増加が測定され、これは、細胞内脂質の定常的増加によるものであり得る（図５ｃおよび５ｄ）。よって、このバイオマスの増加は、細胞容積の拡大のみに起因しており、これは、フローサイトメトリーによって検出されたような細胞内脂質ベシクルの体積増加と相関している（図１２）。図１３は、発酵時間にわたる脂肪酸プロファイルの変化を示す。

２５Ｌスケールにおけるその時点のデータに基づくと、５０％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）の酢酸の供給は、培養密度にいかなる影響も与えることなく、発酵体積の２０％（Ｖ／Ｖ）を毎日または連続的に回収することを可能にする。しかしながら、このプロセスを１０，０００Ｌ発酵槽にスケールアップすると、１日に回収される体積は、１０８ｋｇの油を含有する、１８００リットルになるであろう。この量が、下流プロセスに連続的に移送される可能性がある。

本発明による新たなプロセスの実施形態で、本発明者らは、種々の油脂酵母および培養条件について報告された最高の脂質生産性を更新した。この点に関し、９０ｇ／Ｌのセロビオースとキシロースの共発酵におけるＬｉｐｏｍｙｃｅｓｓｔａｒｋｅｙの脂質生産性は、０．１２ｇ／Ｌ／ｈ［バイオマス３１．５ｇ／Ｌ、脂質５５％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）］であった（Ｚ．Ｇｏｎｇ、Ｑ．Ｗａｎｇ、Ｈ．Ｓｈｅｎ、Ｃ．Ｈｕ、Ｇ．Ｊｉｎ、およびＺ．Ｋ．Ｚｈａｏ、ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌ．，２０１２，１１７，２０－２４）。複雑な培地の場合（例えば、トウモロコシの茎や葉の加水分解物の利用）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｒａｍｉｎｉｓがもたらす脂質生産性は、０．２３ｇ／Ｌ／ｈ［バイオマス４８ｇ／Ｌ、脂質３４％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）］である（Ｓ．Ｇａｌａｆａｓｓｉ、Ｄ．Ｃｕｃｃｈｅｔｔｉ、Ｆ．Ｐｉｚｚａ、Ｇ．Ｆｒａｎｚｏｓｉ、Ｄ．Ｂｉａｎｃｈｉ、およびＣ．Ｃｏｍｐａｇｎｏ、ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌ．，２０１２，１１１，３９８－４０３）。同様に、１５Ｌ撹拌槽型発酵槽中で、グルコースで培養されたＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓＹ４がもたらす脂質生産性は、０．５４ｇ／Ｌ／ｈ［バイオマス１０６．５ｇ／Ｌ、脂質６７．５％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）］であった（Ｙ．Ｌｉ、Ｚ．Ｋ．Ｚｈａｏ、およびＦ．Ｂａｉ、ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌ．，２００７，４１，３１２－３１７）。

報告されているＣ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓの能力に関し、酢酸によるｐＨ一定の発酵が達成した生産性は、０．６６ｇ／Ｌ／ｈ［バイオマス１６８ｇ／Ｌ、脂質７５％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）］であった（Ｚ．Ｃｈｉ、Ｙ．Ｚｈｅｎｇ、Ｊ．Ｍａ、およびＳ．Ｃｈｅｎ、Ｉｎｔ．Ｊ．ＨｙｄｒｏｇｅｎＥｎｅｒｇ．，２０１１，３６，９５４２－９５５０）。さらに、Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａの遺伝的に最適化された系統であるＮＳ４３２が達成した生産性は、流加グルコース発酵において、０．７３ｇ／Ｌ／ｈ［バイオマス１１０ｇ／Ｌ、脂質７７％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）］であった（Ｊ．Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ、Ｖ．Ｔｓａｋｒａｋｌｉｄｅｓ、Ａ．Ｋａｍｉｎｅｎｉ、Ｅ．Ｈ．Ｇｒｅｅｎｈａｇｅｎ、Ａ．Ｌ．Ｃｏｎｓｉｇｌｉｏ、Ｋ．ＭａｃＥｗｅｎ、Ｄ．Ｖ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ、Ｊ．Ａｆｓｈａｒ、Ｒ．Ｌ．Ｎｕｇｅｎｔ、およびＭ．Ａ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｆｕｅｌｓ，２０１６，９，７７）。しかしながら、最も良好な文献データは、富酸素バッチ培養におけるＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓが達成した０．８７ｇ／Ｌ／ｈ［バイオマス１８５ｇ／Ｌ、脂質４０％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）］という生産性であった（Ｊ．Ｇ．Ｐａｎ、Ｍ．Ｙ．Ｋｗａｋ、およびＪ．Ｓ．Ｒｈｅｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１９８６，８，７１５－７１８）。Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓに関し、トリグリセリドを加えたこの油脂酵母は、著しい量のβ－カロチン（テルペンに基づく脂質）を生産し、これによってこの報告における全脂質収率が説明され得ることに留意しなければならない。本発明者らの現在のデータおよび積み重ねられた文献による報告に基づけば、種々のパラメーター、例えば、酢酸濃度、全培地組成、ｐＨ、発酵時間、エアレーション、および発酵システム自体が、脂質生産性を変化させ得る。

最適化手順のこの点において、本発明者らは、２５Ｌスケールまでのスケールで、流加、半連続、または連続プロセスモードにおいて、Ｃ．ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓの共発酵に、規定の糖ベースの培地および有機酸、例えば酢酸を適用することに成功した。このスケールにおいて、合成Ｎ富化培地（培地Ｄ）および酢酸を利用して、半連続発酵モードで、１．２ｇ／Ｌ／ｈという最も良好な脂質生産性を達成した。この数字は、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓについて報告されている最も良好な脂質生産性に対して、脂質形成における１３８％の改善を示す。それにもかかわらず、本研究において、酵母細胞加水分解物を炭素源として使用した場合に、脂質の収率および生産性のさらなる向上が達成された。

５０Ｌバイオリアクター：Ｔ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓのＦｅ流加培養を、５０Ｌバイオリアクター（Ｂｉｏ－Ｅｎｇｉｎｅｅｒ、ＵＳＡ）内で、対応する培地の仕込み容量５０Ｌで実施した。温度は２８℃で一定に保たれ、バイオリアクターのｐＨは、１ＭＮａＯＨまたは１ＭＨＣｌ（菌類の発酵の場合）および５０％酢酸（ＡＡ発酵の場合）によって、ｐＨ６．５±０．２に調節された。撹拌（３５０～８００ｒｐｍ）、エアレーション（１．０～２．０ＮＬ／Ｖの空気）、および圧力（０．２～１ｂａｒ）は、６０％を上回る溶存酸素濃度を維持するように自動的に制御された。０．０１％（Ｖ／Ｖ）の消泡剤（Ａｎｔｉｆｏａｍ２０４、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を加えることによって泡を予防した。
１．２．下流プロセスおよび脂質回収
実施例７（加水分解酵素の生産）

Ｔ．ｒｅｅｓｅｉの２つの変異体ＲＵＴＣ－３０（ＡＴＣＣ５６７６５）および（ＡＴＣＣ１３６３１）を、個別に、５０リットルスケールの発酵槽内で、開始炭素源としてグルコースを用いて培養した。発酵２日目までに、培地中のグルコース含量は、ほぼ枯渇した。その後、部分精製したＣ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓバイオマスを１０ｇ／Ｌの濃度で発酵培地に加えた（培地Ｆ）。視覚的観察と、それに続く糖分析を用いて、経時的なＣ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ細胞の減衰を追跡した［データ記載せず］。これによって、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉが、Ｃ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ細胞を加水分解することができ、炭素源として利用することができることが示された。培養３日目までに、Ｃ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ細胞デブリは、完全に分解された。この発酵は、この菌類にストレスをかけ、加水分解酵素の分泌を最大にするために、あと１日継続した。その後、加水分解酵素を濃縮、富化、および精製するために、遠心分離、１０ｋＤａクロスフロー濾過による培地濾過、およびバッファー交換を行った。最終的な酵素溶液は、ＲＵＴＣ－３０（ＡＴＣＣ５６７６５）と（ＡＴＣＣ１３６３１）由来の各酵素溶液について、それぞれタンパク質濃度が３．２％と３．５％（ｗ_{タンパク質}／ｖ_溶液）である、約１Ｌの酵素溶液であった。

続いて、４つのステップにより、酵素活性を評価した：ステップ１－純粋な多糖類によるインキュベーション、ステップ２－精製した酵母バイオマスによるインキュベーション、ステップ３－実際の培養物によるインキュベーション。その後、ステップ４－スケールを２５リットルにして酵素活性を確認。

菌類：ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉＲＵＴＣ－３０（ＡＴＣＣ５６７６５）および（ＡＴＣＣ１３６３１）をＬＢ培地（５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌトリプトン）中で活性化した。そして、これを発酵のための接種材料として使用した。

培地Ｆ：ＴＯ細胞壁１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４１．４ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ０．４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．３ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．００５ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ０．００３７ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ０．００１６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．００１４ｇ／Ｌ。部分精製細胞壁は、以下のようにして調製した：脂質抽出後、残ったＣ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓバイオマスをｄｄ水で３回洗浄し、凍結乾燥によって２日間乾燥させ、粉砕し、それをＴ．ｒｅｅｓｅｉのための栄養源として使用した。

５０Ｌバイオリアクター：Ｔ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓのＦｅ流加培養を、５０Ｌバイオリアクター（Ｂｉｏ－Ｅｎｇｉｎｅｅｒ、ＵＳＡ）内で、対応する培地の仕込み容量５０Ｌで実施した。温度は２８℃で一定に保たれ、バイオリアクターのｐＨは、１ＭＮａＯＨまたは１ＭＨＣｌ（菌類の発酵の場合）および５０％酢酸（ＡＡ発酵の場合）によって、ｐＨ６．５±０．２に調節された。撹拌（３５０～８００ｒｐｍ）、エアレーション（１．０～２．０ＮＬ／Ｖの空気）、および圧力（０．２～１ｂａｒ）は、６０％を上回る溶存酸素濃度を維持するように自動的に制御された。０．０１％（Ｖ／Ｖ）の消泡剤（Ａｎｔｉｆｏａｍ２０４、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を加えることによって泡を予防した。
実施例８（純粋な多糖類で産生された酵素の評価－活性アッセイステップ１、および純粋な酵母バイオマスで産生された酵素の評価－活性アッセイステップ２）

純粋な多量体糖基質による酵素溶液の（０．３５％（ｗ_酵素／^ｄｗ_基質）での）インキュベーションの間、本発明者らは、両方の調製物において、セルラーゼ、キシログルカナーゼ、β－グルコシダーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、およびラミナリナーゼ酵素活性を検出することができた［データは記載せず］。次いで、得られた酵素系を、Ｃ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓの精製細胞壁調製物で試験した。図６ａおよび６ｂは、インキュベーション時間にわたる残存バイオマス重量の減少を示し、ＡＴＣＣ１３６３１とＡＴＣＣ５６７６５の酵素溶液による２８時間のインキュベーションの後、残存するバイオマスは、それぞれわずか１６％（ｗ／ｗ）未満と２０％（ｗ／ｗ）未満であった。

酵素活性アッセイ：セルラーゼ、キシログルカナーゼ、β－グルコシダーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、およびラミナリナーゼ酵素活性を試験するために、５０．０ｍｇのセルロース、キシログルカン、セロビオース、マンナン、キシラン、およびラミナリンを、１ｍｌのバッファー（酢酸ナトリウム５０ｍＭ、ｐＨ５．０）、および０．３５％（ｗ／ｗ_{バイオマス}）の酵素溶液とインキュベートした。Ｃ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓバイオマスの酵素活性を試験するために、５０．０ｍｇの部分精製細胞壁を１ｍｌのバッファー（酢酸Ｎａ５０ｍＭ、ｐＨ５．０）および０．３５％（ｗ／ｗ_{バイオマス}）の酵素溶液とインキュベートした。全ての試験は、５０℃で２８時間インキュベートした。加水分解を追跡するために、重量分析的／糖分析（ＨＰＬＣ）を使用した。
実施例９（新鮮な培養物で産生された酵素の評価－活性アッセイステップ３）

その後、酵素溶液を、新鮮なＣ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ培養物で試験した。比較のために、市販の酵素系の２種類の混合物を調製した。これら２種類の混合物（ミックス１およびミックス２と称する）は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ由来の酵素系と同じ酵素活性を有していた。両方の混合物における最終的なタンパク質濃度は、それぞれ１４．２％と１４．５％（ｗ_{タンパク質}／ｖ_溶液）であった。個別に、４種類の各酵素系の１００μｌを、５．０ｍｌの酢酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ５．０）中で、１．０ｇのバイオマスと１８時間インキュベートした。同じ体積の酵素調製物を用いると、異なる酵素／バイオマス比（ｗ／ｗ）となる。この点に関し、酵素：バイオマス比は、それぞれ、市販の混合物においては約１．４％（ｗ_酵素／^ｄｗ_{バイオマス}）であり、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉが産生した酵素系についてはおよそ０．３５％（ｗ_酵素／^ｄｗ_{バイオマス}）であった。市販の混合物の場合、４０～４８％（ｗ／ｗ）のバイオマスが溶解し、これに対してＴ．ｒｅｅｓｅｉが産生した酵素調製物では５７～６３％（ｗ／ｗ）が溶解した（図６ｃ）。しかしながら、全ての調製物において、遊離した脂質は約４０％（ｗ／ｗ）であった（図６ｄ）。

酵素活性アッセイ－２：部分精製細胞壁は、以下のようにして調製した：脂質抽出後、残ったＣ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓバイオマスをｄｄ水で３回洗浄し、凍結乾燥によって２日間乾燥させ、粉砕し、それをＴ．ｒｅｅｓｅｉのための栄養源として使用した。市販の酵素混合物は次の通りである。ミックス１：マンナナーゼ（Ｃｌａｒｉａｎｔ、スイス）、ＣｅｌｌｉｃＣｔｅｃ２（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、デンマーク）、ＣｅｌｌｉｃＨｔｅｃ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、デンマーク）、およびβ－グルコシダーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、デンマーク）。ミックス２：Ｌｉｑｕｅｂｅｅｔ（Ｃｌａｒｉａｎｔ、スイス）、ＣＬＡ（Ｃｌａｒｉａｎｔ、スイス）、マンナナーゼ（Ｃｌａｒｉａｎｔ、スイス）、１，３－β－グルカナーゼ（１．３－β－ｇｌｕｃａｎａｓｅ）（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、フランス）、およびβ－グルコシダーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、デンマーク）。
実施例１０（２５Ｌスケールで産生された酵素の評価－活性アッセイステップ４）

実験室ベースの実験に続き、本発明者らは、２５Ｌスケールの発酵で、酵素によるＣ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓの溶解手順の妥当性を確認した。最初のＣ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓの発酵は、前記の通りに実施し、Ｃ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓの増殖は、エアレーションを止めることによって停止させた。この時点では、バイオマスの回収は行わなかった。代わりに、発酵槽の温度を４５℃に上昇させ、ｐＨを４．５に調節し、撹拌速度を８００ｒｐｍに上げることによって、その後のＴ．ｒｅｅｓｅｉ加水分解酵素による高脂質含有Ｃ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ細胞の溶解を可能にした。細胞溶解は、各Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ酵素調製物を０．４％（ｗ_酵素／^ｄｗ_{バイオマス}）加えることによって開始させた［全濃度は、０．８％（ｗ_酵素／^ｄｗ_{バイオマス}）であった］。処理の２０時間後、反応条件を変更し、ｐＨを７．０、温度を３７℃にした。その後、市販のプロテアーゼ調製物（Ｌａｖｅｒｇｙ（商標）、ＢＡＳＦ）を０．５％（ｗ_酵素／^ｄｗ_{バイオマス}）加えることによって、細胞のタンパク質を分解し、反応物を解乳化させた（これは、脂質の遊離を助ける）。

時間分解した細胞溶解および脂質遊離の分析を、フローサイトメトリーによる細胞数分析およびＨＰＬＣによる糖遊離分析によって行った。図７ａは、インタクトな細胞領域に位置する１つの集団としての細胞密度プロットを示す（Ｒ３）。加水分解時間にわたり、領域Ｒ３内の細胞密度は減少しているが、より小さい領域（Ｒ４）内に新たな集団が生じている。この新たな集団は、細胞デブリを表す。細胞数（図７ｃ）は、細胞数が酵素的加水分解前の９８３×１０^６細胞／ｍｌから１３９×１０^６細胞／ｍｌに低下していることから、前記密度プロットの変化を裏付けている。糖分析（図７ｂ）は、加水分解時間にわたる糖含量の増加を示す。

これらのデータは、蛍光顕微鏡によってさらに補強され、この蛍光顕微鏡によって、溶解プロセスの視覚的な洞察が可能となった（図８ａ）。その後、バイオマスを遠心分離にかけ、そこで、その上層画分は、遊離した脂質を驚くほど純粋な形態で含有していた。この点に関し、図８ｂ、８ｃ、および８ｄは、遠心分離前後の、酵素的な処理後の遊離脂質を示す。積み重ねられたデータによって、Ｃ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ酵母細胞の８５％（ｗ／ｗ）が加水分解され、全細胞内脂質の約９０％（ｗ／ｗ）を遊離させることに成功したことが実証された。

５０Ｌバイオリアクター：Ｔ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓのＦｅ流加培養を、５０Ｌバイオリアクター（Ｂｉｏ－Ｅｎｇｉｎｅｅｒ、ＵＳＡ）内で、対応する培地の仕込み容量５０Ｌで実施した。温度は２８℃で一定に保たれ、バイオリアクターのｐＨは、１ＭＮａＯＨまたは１ＭＨＣｌ（菌類の発酵の場合）および５０％酢酸（ＡＡ発酵の場合）によって、ｐＨ６．５±０．２に調節された。撹拌（３５０～８００ｒｐｍ）、エアレーション（１．０～２．０ＮＬ／Ｖの空気）、および圧力（０．２～１ｂａｒ）は、６０％を上回る溶存酸素濃度を維持するように自動的に制御された。０．０１％（Ｖ／Ｖ）の消泡剤（Ａｎｔｉｆｏａｍ２０４、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を加えることによって泡を予防した。

下流プロセス、特に脂質抽出は、経済的および環境的の両方のプロセス効率、ならびに保証を必要とする市場部門（例えば食品産業など）に関係する製品の品質に対して重大な影響力を有する。脂質生産の下流プロセスの処理は、従来、以下の５ステップであった；密度に基づくバイオマス濃縮（例えば、ディスク型セパレーターなど）、細胞破壊（例えば、高圧ホモジナイザーのようなもの）、溶媒抽出（例えば、ヘキサン、またはクロロホルム）、そして最終的に溶媒分離および回収（例えば、固液型分離装置と、それに続いて単一効用エバポレーター）。高コストに加えて、多くの技術的障害が、これらのプロセスを、微生物油の商業的生産のために、工業的に応用する上で妨げになるであろう。まず、高脂質含量（５０％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）超）の細胞は、高Ｇ遠心分離（約５０，０００ｇ）において、上清中に懸濁したままであるか、または固まっていない層として最上部に浮かんだままとなるであろうことから（図１４）、細胞が高脂質含量であることによって、効率的な分離が妨げられ、それにより回収ステップが非効率的になる。次のステップにおいて、酵母細胞が強固であるため、高圧ホモジナイズは、複数ステップを行っても有効ではない。図１５は、２，４００ｂａｒで高圧ホモジナイズを３回行った後の（すなわち、本発明にしたがった処理を受けていない）酵母細胞についての電子散乱顕微鏡像を示す。最後に、ホモジナイズされた細胞は、有機溶媒によって抽出する必要がある。そのため、有機溶媒で抽出された脂質は、高価値な食品および飼料用途のために保証することが困難である。製品の品質以外にも、有機溶媒はプロセス水中および細胞残渣流中にも蓄積し、それがこれらのプロセス流の価格安定化およびリサイクルにおける重大な環境問題を引き起こすであろう。

この研究において、本発明者らは、前処理または有機溶媒を利用した脂質回収ステップを行う必要のない、定量的な細胞溶解と脂質回収／精製を可能にする、新たなｉｎｓｉｔｕの酵素的な処理プロセスを開発した。しかしながら、炭水化物とタンパク質加水分解産物（単量体の糖とアミノ酸）は、いかなる溶媒の痕跡による汚染もないため、潜在能力的には、その後の発酵において再利用することが可能である。
１．３．バイオマスと加水分解物画分のリサイクル
実施例１１（発酵培地としての酵母加水分解物の試験－リサイクル実験）

最初に、５００ｍＬの培地Ｇを、最初のＣ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ培養サイクルに使用した。図９は、発酵時間にわたる最初のＣ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ増殖速度を示す。これらの実験セットについて、４５時間後の脂質生産性は、１．２３ｇ／Ｌ／ｈ［バイオマス７２ｇ／Ｌ、脂質７７％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）］であった。発酵の終わり（１３８時間）には、脂質生産性は、０．７１ｇ／Ｌ／ｈ［バイオマス１１５．６ｇ／Ｌ、脂質８５％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）］であった。

続いて、上記のように、その後のグルコヒドロラーゼ処理およびプロテアーゼ処理によって、Ｃ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓバイオマスの溶解および脂質の遊離がもたらされた。糖、アミノ酸、および微量栄養素を含有する、得られた液体加水分解物を、滅菌および残存する酵素残留物の除去のために、１０ｋＤａクロスフローフィルターによって濾過した。その後、加水分解物を６０ｇ／Ｌグルコースに調節し、さらなる培養サイクルにおける発酵培地として使用した。

興味深いことに、発酵培地を含有するこの加水分解物によって、４５時間後のバイオマス生産性は、１４７ｇ／Ｌまで著しく向上した。同時に、脂質生産性は、２．４／Ｌ／ｈ［バイオマス１４７ｇ／Ｌ、脂質７３％（ｗ_脂質／^ｄｗ_{バイオマス}）］を記録した。これらの結果は、続く３番目の培養操作においても正確に再現することができた（図９）。バイオマスと脂質の生産性、ならびにそれぞれの全収率は、以前の結果のどれよりも優れている。結果として、このデータは、バイオマス生産性と脂質生産性について、最良の文献値を著しく上回っており、それぞれ１．５倍と２．９倍であった。^４５。
さらに、本発明者らのこの時点のデータは、実験の初めの４５時間以内に、より優れたバイオマス生産性および脂質生産性が得られることを示している。よって、本発明者らは、コストおよび大量の効率的培養のためには、最大の収率を得るには４５～７２時間という短い培養時間で十分であることを示唆する。

培地Ｇ：グルコース５０～６０ｇ／Ｌ、酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４１．４ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ０．４ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．３ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．００５ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ０．００３７ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ０．００１６ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．００１４ｇ／Ｌ。

１Ｌバイオリアクター：対応する培地１Ｌの４倍の仕込み容量のＤＡＳＧＩＰ（登録商標）パラレルバイオリアクターシステム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ）。温度は、２８～３０℃で変動し、バイオリアクターのｐＨは、１ＭＮａＯＨまたは７０～１００％酢酸でｐＨ７．０～６．５±０．２に調節された。撹拌（３５０～８００ｒｐｍ）、酸素比（２１～１００％）、およびエアレーション（１．０～２．０ＮＬ／Ｖの空気）は、ｐＯ_２≧５０％を上回る溶存酸素濃度を維持するように自動的に制御された。０．０１％（Ｖ／Ｖ）の消泡剤（Ａｎｔｉｆｏａｍ２０４、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を加えることによって泡を予防した。

本発明者らは、炭素源と有機酸（例えば、糖と酢酸）の両方の同時的な同化を可能にし、栄養限定を必要とすることなく、高いバイオマス収率と脂質収率を同時にもたらす、Ｃ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ共発酵システムを提示してきた。脂質は、本プロセスについての主要な収益源であると考えられるが、脂質抽出後の残存バイオマスは、従来、低価値な副産物とみなされている。溶媒を利用した脂質抽出／精製に頼った標準的なプロセスにおいて、このバイオマスの副流は、溶媒残留物で汚染されており、かつ、本質的にプロセスコストを増大させる厳しい規制上の要求に基づいて廃棄しなければならない、環境的に有害な廃棄物流として取り扱わなければならない。

これらの従来のプロセスとは対照的に、本発明者らの酵素的加水分解は、有機溶媒のいかなる関与もなしに、酵母バイオマス残留物を発酵可能な糖に変換し、その全濃度は１８ｇ／Ｌであった。さらに、得られた酵母加水分解物は、価値のあるアミノ酸、可溶性リン脂質、ミネラル、および親水性２次代謝産物も含有しており、これらはＣ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓの増殖を促進させ得る。そのため、この加水分解物のリサイクルには、原料の節約および廃棄物流の除去などの多くの利点がある。次の実験において、本発明者らは、バッチ培養と脂質生産を繰り返すための発酵基材としての、Ｃ．ｏｌｅａｇｉｎｏｓｕｓ細胞可溶化物のリサイクルを検討した。
実施例１２（さまざまな運転条件の試験）

この実験セットにおいて、さまざまな運転条件を適用した。表１は、適用した運転設定を示す。

この実験結果は、発酵温度と溶存酸素が、それぞれ２８℃から１０℃および７０％から３０％に低下するにつれて、得られた脂質の２０℃における状態が、硬質／固体から液体に変化していることを示す（表１、図１６）。しかしながら、低温かつ低溶存酸素では、暗く赤みがかった油になる。低温かつ低溶存酸素と組み合わせて、酢酸にクロトン酸を加えることによって、脂質の色が改善され、非常に明るい黄色になる。

培地Ｄ：グルコース３０ｇ／Ｌ、酵母抽出物０．５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム４．１ｇ／Ｌ、ＮＨ_４Ｃｌ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４２．４ｇ／Ｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ０．９ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ１．５ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ０．０８ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０１ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ０．１ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ、ＣＯ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇＬ

１Ｌバイオリアクター：対応する培地１Ｌの４倍の仕込み容量のＤＡＳＧＩＰ（登録商標）パラレルバイオリアクターシステム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ）。温度は、２８～３０℃で変動し、バイオリアクターのｐＨは、１ＭＮａＯＨまたは７０～１００％酢酸でｐＨ７．０～６．５±０．２に調節された。撹拌（３５０～８００ｒｐｍ）、酸素比（２１～１００％）、およびエアレーション（１．０～２．０ＮＬ／Ｖの空気）は、ｐＯ_２≧５０％を上回る溶存酸素濃度を維持するように自動的に制御された。０．０１％（Ｖ／Ｖ）の消泡剤（Ａｎｔｉｆｏａｍ２０４、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を加えることによって泡を予防した。
実施例１３

この実験において、本発明者らは、他の有機酸を栄養源として適用し、油性酵母の増殖、脂質蓄積、および産生された油の脂肪酸プロファイルに対する効果を検討した。したがって、酢酸（ＡＡ）、イソ酪酸（ｉＢＡ）、イソ吉草酸（ｉＶＡ）、およびクロトン酸（ＣＡ）を、グルコースと共に、有機酸源として共発酵に適用した。共発酵システム内での酢酸の使用を、以前の実施例において検証した。よって、酢酸を、この実験の対照として使用した。

４バイオリアクター型のＤＡＳＧＩＰ（登録商標）パラレルバイオリアクターシステム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆから入手）を、この実験のために選択した。バイオリアクター１においては、有機酸源として１００％酢酸を適用したが、バイオリアクター２、３、および４においては、有機酸混合物として、それぞれ１０％イソ酪酸、イソ吉草酸、またはクロトン酸と、９０％酢酸を組み合わせた混合物を適用した。

培地Ｄ：グルコース３０ｇ／Ｌ、酵母抽出物０．５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酢酸ナトリウム４．１ｇ／Ｌ、ＮＨ_４Ｃｌ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４２．４ｇ／Ｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ０．９ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ１．５ｇ／Ｌ、ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ０．０８ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０１ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ０．１ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇ／Ｌ、ＣＯ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ０．１ｍｇＬ。

１Ｌバイオリアクター：対応する培地１Ｌの４倍の仕込み容量のＤＡＳＧＩＰ（登録商標）パラレルバイオリアクターシステム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ）。温度は、２８～３０℃で変動し、バイオリアクターのｐＨは、１ＭＮａＯＨまたは１００％酢酸もしくは酢酸と他の有機酸の混合物でｐＨ７．０～６．５±０．２に調節された。撹拌（３５０～８００ｒｐｍ）、酸素比（２１～１００％）、およびエアレーション（１．０～２．０ＮＬ／Ｖの空気）は、ｐＯ_２≧５０％を上回る溶存酸素濃度を維持するように自動的に制御された。０．０１％（Ｖ／Ｖ）の消泡剤（Ａｎｔｉｆｏａｍ２０４、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を加えることによって泡を予防した。

ＧＣ－ＦＩＤ：脂肪酸プロファイルは、メチル化後、水素炎イオン化検出器を用いたガスクロマトグラフィー（ＧＣ－ＦＩＤ）を用いて測定した。メチル化は、１ｍｇの油を１ｍｌのＮａＯＣＨ_３とインキュベートすることによって、短時間に行った（８０℃で２０分間）。そして、この混合物と１ｍｌのＨＣｌ（３７％、メタノール中）を、再度、８０℃で２０分間インキュベートした。これによって生じた脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥｓ（ｆａｔｔｙａｃｉｄｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒｓ））を、注入したＧＣ－ＦＩＤ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、日本）内で、ヘキサンによって抽出した。トリグリセロールＣ１９：０を、内部標準として使用した。

バイオマスおよび脂質蓄積は、全てのバイオリアクターにおいて類似していることがわかった。これにより、ｉＢＡ、ｉＶＡ、およびＣＡを栄養源として適用し得ることが裏付けられた。しかしながら、脂肪酸プロファイルについてのＧＣ－ＦＩＤ分析によって、適用した栄養源に応じて、ある程度までは異なる脂肪酸分布が示された。図１７、１８、１９、および２０は、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、およびＣ１８：２のピーク強度の変化を示し、これは、使用した酸に付随する脂肪酸濃度の変化が原因であり得る。さらに、新たな脂肪酸を示す新たなピークが観察された。例えば、図１７は、酢酸を栄養源として適用することで得られる、典型的な脂肪酸プロファイルを示す。しかしながら、１０％ｉＢＡを適用することによって、Ｃ１７：０およびＣ１７：１が形成される（図１８）。その上、１０％ｉＶＡを適用した場合に、さらに５つの不明なピークが集中的に形成された（図１９）。
結論

本発明者らは、酢酸および糖から持続可能な脂質への生物学的変換を、生産性を最大化し、かつ廃棄物生成およびエネルギー消費を最小化して行うための、統合された運転ユニットを実証する。そのため、植物に基づく脂質とのコスト的な隔たりが、大幅に縮小された。

Claims

ａ）油脂微生物を提供するステップ；
ｂ）前記油脂微生物を炭素源および有機酸を含む培地中で増殖させ、それによって、前記油脂微生物に微生物脂質を産生させるステップ；
ｃ）いかなる溶媒による抽出または化学薬品による解乳化も行わない、前記増殖させた油脂微生物の純粋に酵素的な処理を実施し、前記産生された微生物脂質を、その後の回収に適合させるステップ；
ｄ）前記産生された微生物脂質を、密度に基づく分離法によって回収するステップ
を含む、微生物脂質を生産するための方法。
前記油脂微生物が、酵母、菌類、細菌、および微細藻類から選択され、好ましくは、前記油脂微生物が、油脂酵母であり、より好ましくは、前記油脂酵母が、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属、Ａｐｉｏｔｒｉｃｈｕｍ属、およびＣｕｔａｎｅｏｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属から選択される、請求項１に記載の方法。
前記炭素源が、炭水化物；アミノ酸；脂肪酸；好ましくは単糖類、好ましくはペントースまたはヘキソース、より好ましくはグルコース、キシロース、マンニトール；オリゴ糖；動物組織の加水分解物、植物組織の加水分解物、または微生物の加水分解物；および前記のいずれかの組み合わせを含む群から選択され、より好ましくは、前記炭素源が、グルコースである、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
前記有機酸が、酢酸、マロン酸、シュウ酸、クエン酸、プロピオン酸、吉草酸、アクリル酸、クロトン酸、酪酸、イソ酪酸、イソ吉草酸、３－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシプロピオン酸、２－ヒドロキシ酪酸、乳酸、およびこれらの酸のそれぞれの塩（単数または複数）、ならびに前記有機酸の任意のものの組み合わせを含む群から選択され、好ましくは、前記有機酸が、酢酸またはアセテートである、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
前記増殖させた油脂微生物の前記純粋に酵素的な処理が、前記微生物の、加水分解酵素単独による処理、プロテアーゼと組み合わせた加水分解酵素による処理、または加水分解酵素による処理の後にプロテアーゼによる処理が続く処理である、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
前記加水分解酵素が、菌類から、好ましくは糸状菌から、より好ましくはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｌｌｉｕｍ属、およびＦｕｓａｒｉｕｍ属から選択される菌類から得られたものである、請求項５に記載の方法。
前記密度に基づく分離法が、自然の重力に基づく分離、重力を利用した相分離、および遠心分離から選択され、ここで、前記自然の重力に基づく分離、重力を利用した相分離、および遠心分離が、それぞれ単独で実施されるか、またはデカンテーション、吸引、またはその他の機械的回収法と組み合わせて実施される、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
ステップｂ）およびｃ）が、同じ反応槽の中で実施される、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
ステップｃ）および／またはｄ）が、脂質相、前記油脂微生物の残存バイオマス、および前記油脂微生物の加水分解物をもたらし、ここで、前記方法が、ステップｂ）～ｄ）を繰り返し実施することを含み、ここで、ステップｃ）および／またはｄ）から得られる前記油脂微生物の前記加水分解物が、ステップｂ）を実施するために再利用／リサイクルされる、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
ステップｂ）～ｄ）が、２～ｎ回実施され、ここで、ｎが、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、および５０から選択される整数である、前記の請求項のいずれかに記載の方法、特に請求項９に記載の方法。
前記加水分解酵素が、前記油脂微生物の細胞壁を溶解させる加水分解酵素調製物を得るために、誘導システム存在下で培養された菌類から取得され、ここで、好ましくは、前記誘導システムが、前記油脂微生物の構成成分であり、好ましくは微生物脂質を生産するために用いられる前記油脂微生物の１つまたはいくつかの細胞壁構成成分である、請求項５～６に記載の方法、または請求項５～６のいずれかに従属している場合の請求項７～１０に記載の方法。
ステップｂ）で使用される前記培地が、富窒素培地であり、ここで、好ましくは、前記富窒素培地が、炭素と窒素の重量比（Ｃ：Ｎ）が＜１００、より好ましくは≦８０、とりわけ好ましくは２５～８０の範囲内である培地である、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
ステップｂ）で使用される前記培地が、窒素源を、好ましくはタンパク質加水分解物の形態で、例えば、ペプトン、トリプトン、またはその他のペプチド性加水分解物の形態でさらに含み、ここで、好ましくは、前記ペプチド性加水分解物が、動物組織、植物組織、および／または前記油脂微生物の構成成分を含む、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
前記プロテアーゼが、存在する場合、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．、またはＢａｃｉｌｌｕｓｓｐ．によって産生されたプロテアーゼから選択される、請求項５～１３のいずれかに記載の方法。
記菌類から得た前記加水分解酵素が、別々に調製され、前記菌類を培養することによって直接得られる液体調製物として、またはステップｃ）で使用する溶液中で後に再構成される凍結乾燥調製物として、ステップｃ）に用いられる、請求項６～１４のいずれかに記載の方法。
前記加水分解酵素が、セルラーゼ、キシログルカナーゼ、β－グルコシダーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、およびラミナリナーゼ酵素活性から選択される１つまたはいくつかの活性を有する、請求項５～１５のいずれかに記載の方法。
前記方法が、流加様式、半連続モード様式、または連続モード様式で実施され、ここで、好ましくは、前記方法が、前記有機酸の反復的な添加、好ましくは酢酸またはアセテートの反復的な添加を含む、請求項９～１６のいずれかに記載の方法。