KR101446392B1 - 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포배양용액으로부터 손상 없는 세포와 지용성물질을 저비용 고효율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은, 지용성물질을 함유하는 세포를 배양하는 세포배양과정; 상기 세포의 배양환경을 변화시켜서, 상기 세포의 상기 지용성물질이 용해되는 지용성물질추출용매가 상기 세포 속으로 더 용이하게 투과되고 상기 세포가 상기 지용성물질의 함량을 증가하도록, 상기 세포를 변화시키는 세포숙성과정; 상기 지용성물질추출용매와 숙성된 상기 세포의 세포배양용액을 혼합한 혼합용액에서, 상기 세포가 상기 지용성물질추출용매에 접촉되게 함으로써, 상기 세포의 상기 지용성물질을 상기 지용성물질추출용매에 용해시키는 지용성물질 용해과정; 상기 지용성물질이 용해된 상기 세포를 상기 혼합용액으로부터 분리하는 세포분리과정; 상기 세포가 분리된 잔여의 상기 혼합용액을, 상기 지용성물질추출용매에 상기 지용성물질이 용해된 지용성물질용액과 물로 분획하는 분획과정; 및 분리된 상기 세포와 분획된 상기 지용성물질용액을 각각 수득하는 수득과정; 을 포함한다.

Description

세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법{Method for Producing Cell and Fat Solubles Material by Culturing Cell}

본 발명은 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법에 한 것이며, 보다 상세하게는 세포배양용액으로부터 손상 없는 세포와 지용성물질을 저비용 고효율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

미세조류와 같은 각종 세포의 배양으로부터 얻어지는 각종 바이오매스는 건강기능성 식품 및 의약제품의 원료물질 등 다양하게 사용되고 있으며, 사료, 대체에너지의 원료물질의 생산, 생화학물질의 생산 등으로 그 이용성이 확대되고 있다.

각종 세포는 1차 대사산물인 지질, 단백질, 탄소화물 뿐만 아니라, 2차 대사산물인 생리활성물질도 매우 다양하게 함유하고 있다. 세포로부터 획득할 수 있는 가장 풍부한 물질은 단백질이지만, 단백질은 주로 세포자체를 이용한다는 측면이 있고, 세포가 생산하는 물질을 이용한다는 측면에서 본다면, 지질, 탄소화물, 색소, 비타민, 미네랄 및 특수 성분을 획득할 수 있다. 또한 탄수화물, 단백질, 핵산, 그리고 지질 등의 합성과 분해 과정에서 나타나는 중간대사물질과 대사의 조절 과정에 관여하는 물질들도 세포의 필수 화합물이라 할 수 있으므로, 이들 화합물도 세포로부터 획득할 수 있다.

세포 바이오매스는 열화학적·생화학적 기술들이 적용된 가공공정(Biorefinery)을 적용함으로써 바이오 에너지로 전환될 수 있고, 이러한 바이오 에너지는 공정에 따라 바이오에탄올, 바이오부탄올, 바이오디젤 등의 액체연료와, 수소, 메탄 등의 기체연료 등으로 생산될 수 있으며, 경유를 대체할 수 있는 바이오디젤과 휘발유를 대체하는 바이오에탄올이 대표적이라 할 수 있다.

식물체에는 생존에 필수적이 아닌 화합물(주로 이차대사산물)도 다수 존재하며, 지금까지 10만 종 이상이 알려졌는바, 이런 화합물은 한 가지의 화합물이 몇 종 또는 몇 과의 식물에만 분포하는 경우가 많다. 이차대사산물은 구조와 합성 과정에 따라 크게 알칼로이드(alkaloid), 페놀성 화합물(phenolic compound), 테르펜(terpene), 기타 화합물 등으로 나눌 수 있다.

세포 바이오매스로부터 여러 유용물질을 얻는 전통적인 추출법은, 세포의 생장에 저해를 주는 과정인 원심분리, 여과 및 건조공정을 통해 최대한 수분을 제거한 다음 세포파쇄 공정을 걸쳐 유용물질을 분리 및 정제하는 것이다.

그러나 이러한 종래의 추출법은 탈수과정 및 추출과정에서 세포가 파괴되어 다른 유용한 물질들이 유출 및 소실됨으로, 재배양을 하거나 세포를 재사용하는데 어려움이 있으며, 대규모 배양시 복잡한 공정단계로 높은 운전비용 등의 문제점을 가지고 있다.

미세조류와 같은 각종 세포의 배양은 독립영양, 종속영양 및 혼합영양 배양이 있으며, 독립영양인 경우는 에너지원으로 빛에너지를 사용하고 탄소원으로 이산화탄소를 사용하여 그 생산성이 낮으며, 종속영양은 에너지원 및 탄소원으로 유기성탄소원을 사용하여 생산성이 높으나 고비용 구조이며, 혼합영양은 에너지원으로 빛에너지와 유기성탄소원, 탄소원으로 이산화탄소와 유기성탄소원을 사용하여 생산성이 높으나, 고비용 구조이다. 유용물질을 대량생산하기 위해서 세포 배양의 경제성을 확보해야 하며 저비용구조로 높은 생산성을 유지하는 세포배양 기술 개발이 필요하다.

유기성폐기물을 발효하면 바이오가스와 유기성폐수가 생산되고, 만약 유기성폐수로 미세조류를 배양하면 미세조류가 유기물을 함유한 유기성폐수로부터 유기물질, 질소 및 인 성분을 흡수하여 성장할 수 있기 때문에, 미세조류가 유기물질, 질소 및 인 성분을 제거함과 동시에 바이오에너지 및 바이오화학제품 원료인 바이오매스, 생리활성물질 및 어류의 먹이 등과 같은 유용한 생물자원(biomass)을 생산할 수 있을 것으로 예측되며, 또한 이렇게 생산되는 미세조류는 세포내 우량 단백질의 함량이 높아 고단백 가축사료로도 이용할 수 있을 것으로 기대된다. 따라서 유기성폐기물 발효시스템과 미세조류 배양 시스템을 통합 운영한다면, 유기성폐수를 정화하는 것은 물론 부가적으로 바이오가스 및 바이오매스를 대량 생산할 수 있을 것으로 기대된다.

세포 혹은 미생물은 배양기 내에서 지용성물질의 우수한 생산자이나, 초고밀도 배양(특히 상업 규모에서 약 100 g/L 생물량 초과)은 세포에서 분비하는 성장 저해물질로 바이오매스 생산성이 저하시킬 수 있으며 지용성물질 함량을 감소시키고, 따라서 지용성물질 생산성을 저하시킬 수 있다.

세포 혹은 미생물은 종 및 균주에 따라 세포의 지용성물질이 용해되는 지용성물질추출용매가 세포 속으로 투과되는 정도가 다양하여 지용성물질추출용매를 사용하여 세포손상이 없이 지용성물질을 추출하는 효율이 종 및 균주에 따라 상이할 수 있다.

본 발명의 목적은, 지용성물질을 함유한 세포를 배양한 세포배양용액으로부터 손상 없는 세포와 지용성물질을 저비용의 높은 수율로 생산하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 목적은, 지용성물질을 함유한 세포를 배양한 세포배양용액으로부터 세포와 지용성물질을 생산함에 있어서, 배양세포를 숙성시킴으로써, 즉 세포의 배양환경을 변화시켜서, 지용성 물질추출용매가 세포 속으로 용이하게 투과하여 세포내 지용성물질이 용이하게 용해되게 하고 배양세포의 지용성물질함량이 증가되도록, 세포를 변화시킴으로써, 손상이 없는 세포와 지용성물질의 생산 효율을 더욱 향상시킬 수 있는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 목적은, 지용성물질을 함유한 세포를 배양하여 세포배양용액으로부터 세포와 지용성물질을 생산함에 있어서, 배양 세포를 숙성 및 농축함으로써, 세포와 지용성물질의 생산 효율을 더욱 더 향상시킬 수 있는 방법 및 장치를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명에 따라 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법이 제공된다.

본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법은, 지용성물질을 함유하는 세포를 배양하는 세포배양과정; 상기 세포의 배양환경을 변화시켜서, 상기 세포의 상기 지용성물질이 용해되는 지용성물질추출용매가 상기 세포 속으로 더 용이하게 투과되고 상기 세포가 상기 지용성물질의 함량을 증가하도록, 상기 세포를 변화시키는 세포숙성과정; 상기 지용성물질추출용매와 숙성된 상기 세포의 세포배양용액을 혼합한 혼합용액에서, 상기 세포가 상기 지용성물질추출용매에 접촉되게 함으로써, 상기 세포의 상기 지용성물질을 상기 지용성물질추출용매에 용해시키는 지용성물질 용해과정; 상기 지용성물질이 용해된 상기 세포를 상기 혼합용액으로부터 분리하는 세포분리과정; 상기 세포가 분리된 잔여의 상기 혼합용액을, 상기 지용성물질추출용매에 상기 지용성물질이 용해된 지용성물질용액과 물로 분획하는 분획과정; 및 분리된 상기 세포와 분획된 상기 지용성물질용액을 각각 수득하는 수득과정; 을 포함한다.

본 발명의 방법은, 상기 세포배양과정에서 상기 세포를 농축하는 세포농축과정을 더 포함할 수 있다.

상기 세포숙성과정에서는, 상기 세포배양용액의 pH를 1 내지 6.5의 범위로 유지함으로써, 상기 세포를 숙성할 수 있다.

상기 세포숙성과정에서는, 상기 세포배양용액에 제한영양소원의 부재 또는 과도한 부족 상태로 탄소원을 첨가함으로써(영양소제한조건을 가하여), 상기 세포를 숙성할 수 있다.

바람직하게, 상기 제한영양소원은 질소원, 탄소원, 인산염원, 비타민원, 미량 금속원, 다량 금속원, 실리카원 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 영양소원이다.

상기 세포숙성과정에서는, 상기 세포배양용액의 용존산소를 저하시킴으로써, 상기 세포를 숙성할 수 있다.

본 발명의 방법은, 상기 지용성물질용해과정을 실행한 후에, 상층에 층분리된 상기 지용성물질용액을 하층에 층분리된 상기 세포배양용액에 분사 또는 교반 등의 방법으로 혼합함으로써, 상기 세포의 상기 지용성물질을 상기 지용성물질추출용매에 더 용해시키는 지용성물질 재용해과정을 1회 이상 실행할 수 있다.

본 발명의 방법은, 상기 분리과정에서 분리한 상기 세포에 대해 상기 세포배양과정과 상기 세포숙성과정을 다시 실행하고, 재숙성된 상기 세포배양용액을 상기 지용성물질추출용매 또는 분획된 상기 지용성물질용액과 혼합 및 접촉시켜 상기 세포의 상기 지용성물질을 상기 지용성물질추출용매에 더 용해시키는 과정과 그 이후 과정을 반복하되, 상기 세포의 재배양, 상기 세포의 재숙성, 상기 지용성물질의 재용해, 상기 세포의 재분리, 및 상기 지용성물질용액의 재분획을 1회 이상 다수회 행함으로써, 최종적으로 목적하는 고밀도의 상기 세포와, 목적하는 농축된 상기 지용성물질이 포함된 상기 지용성물용액을 수득할 수 있다.

본 발명의 방법은, 유기성폐기물을 발효시켜 유기성폐수와 바이오가스를 생산하고, 저분자유기산을 포함하는 상기 유기성폐수를, 상기 세포배양과정에서의 상기 세포의 영양물질로 사용하여 상기 세포를 배양할 수 있다.

상기 유기성폐수를 TCOD가 100 내지 10,000 ㎎/ℓ이고, 질소 농도가 100 내지 800 ㎎/ℓ가 되게 희석하여, 상기 세포를 배양할 수 있다.

상기 세포숙성과정에서는, 상기 유기성폐수의 질소 농도를 100 ㎎/ℓ 이하가 되게 질소원을 제거함으로써, 상기 세포를 숙성할 수 있다.

상기 지용성추출용매로는 탄화수소 용매를 사용할 수 있다.

본 발명의 방법은, 상기 세포배양과정에서 생성되어 상기 세포배양용액으로 분비되는 상기 세포의 생장을 저해하는 요소(물질 또는 병원균)를 상기 세포배양용액으로부터 제거하는 저해요소제거과정을 더 포함할 수 있다.

상기 세포분리과정에서는, 상기 혼합용액에 중력침강 또는 초음파공명장을 적용하여, 상기 혼합용액으로부터 상기 지용성물질이 용해된 상기 세포를 분리할 수 있다.

본 발명의 방법은, 숙성된 상기 세포배양용액과 상기 지용성물질추출용매를 혼합할 때, 상기 혼합용액을 진동 분쇄하는 과정 및 상기 혼합용액을 교반하는 과정 중 적어도 하나의 과정을 실행하여, 상기 세포배양용액과 상기 지용성물질추출용매의 접촉을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 방법은, 숙성된 상기 세포배양용액과 상기 지용성물질추출용매 또는 상기 지용성물질용액를 혼합하기에 앞서, 상기 지용성물질추출용매 또는 지용성물질용액를 진동 분쇄하면서 다수의 구멍을 이용하여 분사하는 과정, 및 상기 혼합용액을 교반하는 과정 중 적어도 하나의 과정을 실행하여, 상기 세포배양용액과 상기 지용성물질추출용매의 접촉을 증가시킬 수 있다.

상기 세포농축과정에서는, 상기 세포배양용액에 초음파공명장 또는 중력침강을 인가함으로써, 상기 세포를 농축할 수 있다.

1. 유기성폐기물(음식물폐기물)의 발효

본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법에서는, 바람직한 구체예로서 상기 세포배양과정에서의 세포배양의 영양물질로 유기성폐기물을 발효하여 얻은 유기성폐수를 사용할 수 있다.

유기성폐기물(예, 음식물폐기물)은 발효장치에서 반혐기성 혹은 혐기성 가수분해/산생성 발효시킴으로써 유기성폐수와 바이오가스를 생산한 후, 생산된 유기성폐수를 본 발명에서의 상기 세포배양과정이 진행되는 세포배양장치에 공급하여 세포(미세조류, 미생물)를 배양할 수 있다. 이때 부수적으로 생산되는 바이오가스는 이를 포획하여 에너지원 등으로 활용할 수 있다.

상기 유기성폐기물의 발효온도는, 예를 들어 45℃로 유지할 수 있고, 배양의 대상이 되는 세포는, 음식물에 많이 존재하는 탄수화물, 단백질, 지방 등 복잡한 유기물을 분해할 수 있는 균주이며, 그 예는 아래의 표1과 같다.

공정	균 주	분해능력
반혐기성 가수분해/산생성 발효	Cellulomonas cellulans	cellulose, chitin, pectin
	Flavobacterium breve	cellulose
	Bacillus amyloliquefaciens	탄수화물
	Bacillus licheniformis	단백질
	Bacillus subtilis	탄수화물, 단백질
	Bacillus alcalophilus	지방질
혐기성 산 발효	Clostridium acetobutyricum	당, 아미노산, 긴 사슬 지방산
	Clostridium butyricum
혐기성 메탄 발효	Metanogenic mibrobes	아세테이트, 포메이트

유기성폐수의 원료가 되는 음식물폐기물은, 물과 1:1의 비율로 혼합한 후 미생물들에 의해 분해가 잘 되도록 파쇄기로 잘게 분쇄하여 사용할 수 있다. 반혐기성 조건에서 2일간의 체류시간을 거친 후 생성된 발효액인 유기성폐수는 하측으로 배출시키고 펌프를 이용해서 상기 세포배양과정에 사용하기에 앞서서, 예를 들어 유기성폐수수용장치(탱크)에 일시 저장할 수 있다. 이때 유기성폐수는 유기성폐수수용장치의 아래로부터 유입하여 체류하도록 할 수 있다. 유기성폐수수용장치의 내부에서 COD(화학적 산소 요구량), 질소 및 인을 측정하여 미세조류(세포)의 성장에 적합하도록 조정할 수 있다.

음식물폐기물을 반혐기성 가수분해/산생성 발효시켜 생산된 유기성폐수를 사용하여 바로 상기 세포배양과정을 실행할 수도 있고, 2차적으로 혐기성 가수분해/산생성 발효를 더 실행하여 수소 및 유기성폐수를 얻고, 3차적으로 메탄 생성균에 의한 메탄발효를 추가로 실행하여 얻은 유기성폐수로 상기 세포배양과정을 실행할 수도 있다.

유기성폐기물의 발효과정에서 생성된 수소와 메탄과 같은 바이오가스는, 적당한 바이오가스수용장치로 포획하여 필요한 용도에 사용할 수 있다.

2. 세포의 배양

본 발명에서의 상기 세포배양과정에서 배양할 수 있는 세포는, 세포를 구성하는 성분 중에 지질과 같은 지용성물질을 함유하고 있는 세포로서, 식물세포, 곰팡이, 규조류, 와편모조강, 착편모조류, 남조강, 홍조강, 녹조강, 원핵생물 등을 포함하며, 대표적으로 단세포 미세조류인 클로렐라와 같은 단세포 미세조류이다.

예를 들어, 본 발명에는, 미세조류의 일종인 Chlorella protothecoides를 상기 배양세포로 이용할 수 있다. C. protothecoides는 대부분의 미세조류보다 10배 이상의 세포 밀도로 배양이 가능하여 바이오매스 확보 차원에 매우 적절하다. C. protothecoides는 종속영양상태인 이상적인 조건에서 최대 35 gfw/L의 수율로 바이오매스를 수확할 수 있으며, 바이오매스의 대략 55%를 지용성물질로 저장할 수 있는 것으로 알려져 있다.

세포에 의한 지용성물질의 비교적 일정한 생산 속도를 가정하면, 생물량 밀도를 높이면 부피당 생산되는 지용성물질의 총량을 보다 많게 할 것임은 당연하다.

세포를 배양 및 성장시키는 종래의 통상적인 배양방법은, 약 50 내지 약 80 g/L 또는 그 미만의 생물량 밀도를 달성할 뿐이다.

그러나 본 발명에 따른 방법에서의 세포배양과정에서는 세포의 생물량 밀도를 적어도 약 100 g/L 이상, 최대 200 g/L 이상을 달성할 수 있다.

따라서, 그러한 높은 세포의 생물량 밀도에서, 세포의 지용성물질 생산 속도는 다소 감소할 수 있더라도, 부피당 전체 지용성물질의 생산 속도는 종래의 공정보다 유의하게 더 높일 수 있다.

C. protothecoides는 글루코오스 또는 옥수수 감미료 가수분해물(CSH)에 종속영양 혹은 혼합영양으로 배양할 수 있다. 종속영양성장은 지용성물질 함량을 증가시키고, 태양 에너지에 대한 직접적 의존성을 감소시킬 수 있다. C. protothecoides로부터 생산된 지용성물질로부터 바이오디젤을 생산할 경우에 바이오디젤의 에너지 밀도는 석유 기반 디젤과 실질적으로 동등하다.

Chlorella는 분자생물적인 방법으로 엔지니어링하기 용이하고 강화된 CO₂로 대규모 포토바이오렉터에서 배양이 가능하다.

3. 유기성폐수를 영양물질로 한 세포의 배양

일반적인 폐수는 질소원에 비해 탄소원의 상대적 비율이 낮아 기존의 미생물을 사용한 폐수 처리방법은 질소제거 효율이 낮으며, 활성슬러지 방법은 폐수에서 BOD(생물학적 산소 요구량: Biochemical Oxygen Demand)를 90% 이상 제거할 수 있으나 질소는 20 내지 50% 정도만을 제거할 수 있다. 현재까지 에탄올이나 포도당과 같은 별도의 유기탄소원을 공급하여 인위적으로 C/N의 비율을 높임으로써 질소를 제거해 왔는데, 이러한 처리방법은 폐수에 포함된 질소가 충분히 제거되지 않는 상태에서 하천에 방출되면 적조 현상을 유발하여 생태계를 교란시킬 뿐만 아니라 경제적인 피해를 줄 수 있다.

미세조류(세포)를 종속영양 혹은 혼합영양으로 배양하는 경우, 유기성 탄소원, 이산화탄소, 물 및 질소가 필요하다. 유기성폐수(즉, 유기성폐기물의 발효액, 특히, 음식물쓰레기의 발효액)를 영양물질로 하여 본 발명에서의 세포배양과정을 실행할 경우에, 유기성폐수에 충분한 유기성 탄소원 및 질소를 공급받게 되므로 종속영양 혹은 혼합영양에 의해 미세조류의 성장이 활발하게 일어나고 이에 비례하여 유기성폐수(축산폐수 혹은 음식물폐기물의 발효액)에 포함된 유기성 탄소원, 질소 및 인을 제거할 수 있다.

본 발명에서는 유기성탄소원이 충분히 포함된 음식물폐기물 발효액이나 축산폐수 발효액 등과 같은 유기성폐수에 대해 인위적으로 유기물질 및 질소성분의 농도를 조절한 후에, 이런 유기성폐수를 세포배양의 영양물질로 사용할 수 있다.

미세조류를 종속영양 혹은 혼합영양으로 배양하는 경우, 상기 유기성폐수는 pH를 5.0-5.5로 유지하면서, TCOD(총 화학적 산소 요구량)를 100 내지 10,000 ㎎/ℓ 이하, 질소 농도를 100 내지 800 ㎎/ℓ 이하가 되게 희석한 후 상기 미세조류를 배양할 수 있다.

미세조류의 성장을 증진시키기 위하여 무기질을 추가로 첨가할 수 있다. 무기질은 Mg²⁺, Ca²⁺, 인으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 무기물을 첨가한다. 유기성폐수에 Mg²⁺ 또는 Ca²⁺을 첨가하고 질소와 인의 비율을 조절함으로써, 미세조류의 성장을 증진시켜 유기성폐수의 처리 효율을 증가시킬 수 있다.

유기성 폐수에 첨가하는 Mg²⁺의 농도는 100 내지 1,000 ㎎/ℓ이고, 300 내지 500 ㎎/ℓ인 것이 바람직하다.

유기성폐수에 첨가하는 Ca²⁺의 농도는 10 내지 300 ㎎/ℓ이고, 100 내지 150 ㎎/ℓ인 것이 바람직하다.

유기성폐수에 첨가하는 인은, 유기성폐수에 함유되는 질소와 인 비율이 20:1 내지 3:1이 되게 첨가하고, 12:1 내지 10:1이 되게 첨가하는 것이 바람직하다.

미세조류(세포)의 생장에 필수적인 인과 철, 아연, 망간, 구리 및 알루미늄 등의 금속이온은 따로 첨가해 줄 필요가 없으나 이들 이온을 인위적으로 소량 첨가함으로써 미세조류를 고밀도로 배양할 수도 있다.

4. 세포배양용액의 세포의 농축

상기 세포배양과정에 의해 배양된 세포는 영양배양방법에 따라 세포배양용액에서의 농도가 0.03%~5.0% 내외로서 지용성물질을 수득하기에는 낮다. 이런 이유로, 본 발명에서는 상기 세포분리과정에서도 세포가 농축되지만, 배양된 세포를 숙성시키기에 앞서 추가적으로 세포를 농축할 수 있다.

상기 세포농축과정에서는 이후에 설명하는 상기 세포분리과정에 적용된 방법과 유사하게 정밀여과막(MF막), 한외여과막(UF막), 역침투막(RO막) 등 여과막을 교체 장착할 수 있는 여과장치를 적용하여 세포를 여과함으로써 세포를 농축시킬 수 있다.

미세조류를 포함한 각종 세포를 배양한 경우 일반적으로 미세조류의 밀도는 독립영양배양의 경우는 0.03~0.1%(w/v)이고, 종속 또는 혼합영양배양의 경우는 3~5%(w/v)이다. 상기와 같이 배양한 세포배양용액을 바로 숙성하기보다는 농축하여 세포배양용액의 부피를 축소시킨 후, 세포숙성과정 및 지용성물질 용해과정을 수행하는 것이 경제적이다.

5. 세포의 숙성

배양세포만을 사용하여 지용성물질추출용매로 세포 손상 없는 세포와 지용성물질을 생산하는 경우, 배양 세포(또는 미생물)의 종 및 균주 그리고 환경조건에 따라 지용성물질의 함량변화 및 지용성물질추출용매에 대한 세포투과성의 다양성으로 세포에서 목적하는 정도의 지용성물질을 수확하기 어려운 점이 있는바, 본 발명에서는 세포를 숙성시켜 지용성물질을 생산함으로써 이런 문제점을 완화 및 극복한다.

본 발명에 있어서 세포배양과정에서 실행하는 세포숙성과정이란, 세포의 배양환경을 변화시킴으로써 세포를 변화시키는 과정으로서, 지용성물질추출용매(세포의 지용성물질이 용해되는 용액)가 세포 속으로 보다 더 용이하게 투과되도록 하고 세포가 지용성물질의 함량을 증가하도록, 세포배양환경의 변화를 통해 세포를 변화시키는 과정이며, 이런 세포숙성은 세포배양용액의 영양소, 온도, pH 등을 변화시켜 세포를 변화시키는 것에 의해 달성할 수 있다.

일반적으로 세포의 투과성은 세포막을 구성하는 주성분인 인지질의 용해도에 의해 결정되며, 인지질의 용해도는 pH의 영향을 받는 것으로 알려져 있고, 지용성금속복합체의 세포 투과성은 세포배양용액의 pH에 따라 변화가 있음이 보고되었다(Australian Journal of Chemistry 57(10). 931-936. 2004). 따라서 지용성추출용매에 대한 세포의 투과성과 세포배양용액의 pH 관계를 알면 세포의 지용성추출용매에 대한 높은 투과성을 나타내도록 세포배양용액의 pH 범위를 결정할 수 있다.

미세조류인 Chlorella protothecoides을 독립영양으로 배양한 경우 지질함량이 약 14.57%이나, 외부에서 유기성 탄소원을 공급하여 배양한 경우, 약 55.20%로 증가함이 알려져 있다(J Biotechnol 126: 499-507. 2006). 또한, 미세조류의 세포배양에서 지질함량을 증가시키는 염, 온도, 빛 및 영양원 등을 이용한 스트레스 방법을 적용 한 후에 세포를 수확 및 건조하고, 유기용매추출방법에 의해 지질을 추출하는 방법이 제안되어 있다(Curr Opin Biotech 19: 430-436. 2008).

본 발명의 세포배양과정에 사용하는 "제한영양소원"은 세포배양용액으로부터 제한영양소가 실질적으로 고갈될 때 그 고갈이 세포가 더욱 성장하거나 또는 복제하는 것을 실질적으로 제한하는 점에서 세포의 성장에 필수적인 영양소원(영양소 자체를 포함)을 의미한다.

그러나, 특정 제한영양소원이 결핍되어도, 나머지 다른 영양소가 여전히 풍부하므로, 세포는 계속해서 상황에 맞게 세포내 및 세포외 산출물을 만들어 축적한다. 이때 특정한 제한영양소을 선택하여 그 공급을 제어하면, 축적되는 산출물의 종류 및 세포의 성질을 조절할 수 있다고 알려져 있다. 즉, 제한영양소원을 특정 속도로 제공하면 세포의 성장 속도와 원하는 산출물(예를 들어, 지질)의 생산 또는 축적을 조절할 수 있다.

세포를 배양함에 있어서, 생물량 밀도의 증가기를 유도할 수 있다. 생물량 밀도 증가기의 1차 목적은 목적하는 생물량 밀도를 얻기 위해 배양배지 내의 생물량 밀도를 증가시키는 것이다.

본 발명에서 세포배양과정에서의 탄소원 첨가 속도는 세포의 생존력에 유의한 유해 효과를 일으키지 않는 범위로 유지한다. 세포의 배양 동안 특정 세포에 필요한 탄소원의 양의 적절한 범위는 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.

본 발명의 세포배양과정에 적용되는 탄소원은 비알코올 탄소원, 즉, 알코올을 함유하지 않는 탄소원이다.

본 발명에서 사용하는 "알코올"은 바람직하게 1개의 히드록시기를 갖는 4개 이하의 탄소 원자를 갖는 화합물, 예를 들어, 메탄올, 에탄올 및 이소프로판올이다. 히드록시 유기산, 예를 들어 락트산 및 유사 화합물도 세포배양과정에서 공급하는 비알코올 탄소원에 포함할 수 있다. 또한 탄소원으로서 프룩토스, 글루코스, 수크로스, 몰라세스 및 전분을 포함할 수 있으며, 다른 탄수화물도 적용할 수 있다. 또한, 옥수수 시럽을 1차 탄소원으로서 사용할 수 있다. 히드록시 지방산, 트리글리세라이드, 및 디- 및 모노글리세라이드 형태의 지방산이 또한 탄소원으로서 적용할 수 있다.

세포배양의 질소원으로는 요소, 질산염, 아질산염, 콩 단백질, 아미노산, 단백질, 옥수수 침액 (steep liquor), 효모 추출물, 동물 부산물, 무기 암모늄염, 황산염, 수산화물의 암모늄염, 또는 수산화암모늄을 포함할 수 있다.

세포배양에서의 다른 제한영양소원으로는 탄소원, 인산염원, 비타민원(예를 들어 비타민 B12원, 판토텐산염원, 티아민원) 및 미량 금속원 (예를 들어 아연원, 구리원, 코발트원, 니켈원, 철원, 망간원, 몰리브덴원)과 다량 금속원(예를 들어 마그네슘원, 칼슘원, 나트륨원, 칼륨원 및 실리카원 등)을 포함한다. 미량 금속원과 다량 금속원은 이들 금속의 황산염 및 염화물염 (비제한적인 예로서 MgSO₄·7H₂O; MnCl₂·4H₂O; ZnSO₄·7H₂O; CoCl₂·6H₂O; Na₂MoO₄·2H₂O; CuSO₄·5H₂O; NiSO₄·6H₂O; FeSO₄·7H₂O; CaCl₂; K₂SO₄; KCl; 및 Na₂SO₄)을 포함할 수 있다.

질소원으로서 암모늄이 사용되는 경우, 세포배양환경은 염기 첨가 또는 완충제에 의해 조절하지 않는 경우 산성으로 된다. 1차 질소원으로서 수산화암모늄이 사용되는 경우, 이는 pH 조절을 위해 사용할 수 있다. 세포는 넓은 pH 범위에 걸쳐, 예를 들어, 약 pH 5 내지 약 pH 11에 걸쳐 성장하며, 특정 미생물의 발효를 위해 적절한 pH 범위는 당업계의 알려져 있다.

상기 세포배양과정에서는, 상기 세포숙성과정이 진행되도록 숙성기를 포함할 수 있다. 숙성기에서 미생물에 의한 기질의 1차적 사용은 생물량 밀도를 증가시키는 것이 아니라 지질을 생산하기 위해 기질을 사용하는 것이다.

지질은 생물량 밀도 증가기 동안에도 세포에 의해 생산되지만, 상기한 바와 같이, 생물량 밀도 증가기에서 1차적 목표는 생물량 밀도를 증가시키기 위한 것이다.

세포배양 중에 제한영양소원의 첨가를 감소하거나 중단하여, 세포의 숙성을 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다.

또한, 세포배양 중에 용존 산소를 감소시키면 세포의 지질 생산 속도가 증가되는 것이 알려져 있다.

생물량 밀도 증가기 동안 일반적인 세포배양용액 내의 용존 산소 수준은 포화의 적어도 약 8%, 바람직하게는 포화의 적어도 약 4%인 반면, 본 발명에 따라 세포배양용액 내의 용존 산소를 포화의 약 3% 이하, 포화의 약 1% 이하, 또는 포화의 0%까지 감소시킴으로써, 세포의 숙성을 유도할 수 있다. 이때 배양의 초기에는 용존 산소를 포화 또는 그 부근으로 하고, 세포가 성장함에 따라 용존 산소를 상기 낮은 범위로 저하시킬 수 있다.

구체적으로, 본 발명에서 세포배양용액 내의 용존 산소는 세포배양과정 동안 변화시킬 수 있으며, 예를 들어 약 90시간 내지 약 100시간의 총 배양 시간을 갖는 배양 과정에 있어서, 배양배지 내의 용존 산소 수준은 처음 24시간 동안 약 8%로, 약 24시간째 내지 약 40시간째에는 약 4%로, 약 40시간째 내지 배양과정의 종료까지 약 0.5% 이하로 유지할 수 있다.

세포배양용액 내에 존재하는 용존 산소의 양은 배양기 내의 산소의 양을 조절함으로써, 또는 바람직하게는 세포배양용액의 교반 속도를 조절함으로써 조절할 수 있다. 예를 들어, 높은 교반 속도에서는 낮은 교반 속도에서보다 세포배양용액 내의 용존 산소의 양이 비교적 높다. 세포배양용액 내의 용존 산소의 특정 양을 달성하기 위해 필요한 교반 속도의 특정 범위는 당업계의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

본 발명에 적용되는 세포 배양의 바람직한 온도는 약 20℃ 이상, 더 바람직하게는 적어도 약 25℃ 이상, 가장 바람직하게는 적어도 약 30℃ 이상이다. 냉수가 온수보다 더 많은 양의 용존 산소를 보유할 수 있으므로, 보다 높은 세포배양용액 온도는 용존 산소의 양을 감소시키는 부가적인 이점이 있다.

추가하여, 상기 유기성폐수는 공지된 물리화학적 혹은 생물학적 처리방법 등으로 질소농도가 100㎎/ℓ 이하가 되게 질소원을 제거함으로써, 세포배양과정에서 세포숙성을 유도할 수 있다.

상기 세포숙성과정은, 상기 세포배양과정 중에 적용할 수도 있고, 상기 지용성물질 용해과정에 적용할 수도 있으며, 상기 세포배양과정과 상기 지용성물질 용해과정 모두에 적용할 수도 있다.

6. 세포에서 지용성물질의 용해

세포를 이용한 바이오매스 및 유용물질 생산에 관련된 주요 비용은 큰 부피의 세포배양용액으로부터 세포를 수확하는 과정에서 발생한다. 세포배양용액으로부터 세포를 수확하고 건조한 후 파괴하여 지용성물질을 추출하는 과정을 포함하는 종래의 지용성물질 생산 방법에서, 이런 과정에 소요되는 비용이 전체 비용의 40-60%를 차지한다.

종래의 방법은 지용성물질을 추출하는 과정에서 세포가 파괴되어 지용성물질을 제외한 다른 생체분자를 수확하기 어려우나, 본 발명은 저비용의 비파괴적인 재순환(재) 배양에 의해 이런 종래의 문제점을 완화 및 극복한다.

본 발명에 사용하는 지용성물질추출용매는, 지용성물질에 대해 선택성이 높고, 생물학적으로 적합하여 세포 활성에 커다란 손실 없이 세포와 접촉할 수 있는 용매로서, 일반적으로 옥탄올 개수[log Poct(octanol/water partition coefficient), 옥탄올 물 분할 계수의 로그]가 5이상이다(Dodecanone은 이 규칙에서 예외이다). 옥탄올 개수 4-5인 용매 중에 헥산(hexane), 헵탄(heptane)은 세포에 유독하고, 데칸올(decanol), 다이펜틸 에테르(dipentyl ether)는 세포에 무해하다.

본 발명에 적용할 수 있는 예시적인 지용성물질추출용매로서는, 1,12-도데칸 디오익 산 디에틸 에테르(1,12-dodecanedioic acid diethyl ether), n-헥산(n - hexane), n-헵탄(n-heptane), n-옥탄(n-octane), n-도데칸(n-dodecane), 초산 도데실(dodecyl acetate), 데칸(decane), 다이헥실 에테르(dihexyl ether), 이소파(isopar), 1-도데칸올(1-dodecanol), 1-옥탄올(1-octanol), butyoxyethoxyehteane, 3-옥타논(3-octanone), 고리형 파라핀(cyclic paraffins), 바솔(varsol), 이소파라핀(isoparaffins), 분지형의 알칸(branched alkane), 올레일 알코올(oleyl alcohol), dihecylether, 2-도데칸(2-dodecane) 등이 포함된다.

본 발명에 사용되는 지용성물질추출용매는, C4-C16 탄화수소 1개 이상을 포함할 수 있고, C10, C11, C12, C13, C14, C15 또는 C16 개의 탄화수소를 포함할 수 있다.

진동분쇄에 의한 세포 손상 없는 미생물에의 초음파조사는, 저주파에서 양-의존적(dose-dependent)이다. 주파수가 증가하면, 긴 조사시간에도 미생물이 생존한다. 세포 활성에 영향이 없고 지용성물질의 용해를 최적화할 수 있는 주파수 법위(20 kHz - 1 MHz)에서 적절하게 세분된 주파수범위 및 다른 노출시간에 따른 강도를 결정하는 연구를 수행하여 다양한 다른 주파수, 강도와 노출되는 시간 등이 지용성물질 추출(용해) 효율에 영향을 준다.

적정주파수 범위(20 kHz - 60 kHz)에서 다른 노출시간에 따른 이상적인 강도로 세포에 손상 없이 지용성물질의 용해를 최적화하기 위해 이용될 수 있다. 즉, 주파수, 강도와 노출시간 등이 지용성물질 추출효율에 영향을 미친다. 세포 크기, 세포 형상, 세포벽 조성물 그리고 생리학적 상태가 세포와 초음파의 상호작용에 복합적으로 영향을 주기 때문에 이상적인 지용성물질의 용해를 위해 20 kHz와 1 MHz, 20-100 kHz, 20-60 kHz, 30-50 kHz, 또는 40 kHz 등의 다양한 주파수 중 이상적인주파수를 결정하여 사용할 수 있다. 지용성물질추출용매와 진동분쇄의 적절한 조합으로, 거의 100%까지 지용성물질(세포 총 지방산의 10%)의 추출(용해) 효율을 달성할 수 있다.

진동분쇄 대신에 세포배양용액과 지용성물질추출용액 혼합용액을 교반할 경우에도 세포배양용액과 지용성물질추출용매의 접촉을 증가(개선)시킴으로써, 진동분쇄와 같이 지용성물질의 추출(용해)효율을 향상시킬 수 있다. 물론 진동분쇄와 교반을 함께 실행하는 것도 가능하다.

7. 세포 손상이 없는 세포의 분리

종래의 방법은 지용성물질추출용매를 사용하여 세포손상이 없는 세포와 지용성물질을 생산하는 경우는 세포에서 지용성물질을 용해시킨 후 분리 단계가 없거나 중력에 의한 세포의 자연낙하를 사용하였는데, 대용량 지용성물질을 생산하는 경우는 세포의 자연낙하로 세포를 수확하는 경우에 소요되는 시간 등의 문제로 세포를 수확하기 어려운 점이 있다.

예를 들어 세포분리를 위해 초음파공명장 발생장치를 적용할 경우, 지용성물질추출용매와 초음파공명장의 초음파 진동수, 초음파 진동자와 반사막 간의 거리 등의 적절한 조합으로, 거의 100%까지 지용성물질(세포 총 지방산의 10%)의 추출효율을 달성할 수 있다.

또한 지용성물질추출용매와 세포배양용액의 혼합, 접촉 및 세포의 분리 과정에서, 세포배양용액에 존재하는 병원균 및 세포에서 분비된 지용성 세포생장저해물질을 세포배양용액에서 제거하여 효율적으로 세포를 고밀도 배양이 가능하게 할 수 있다. Chlorella vulgaris의 경우는 지용성 세포생장저해물질인 클로렐린(chlorellin)를 분비한다(Pratt et al., (1944) Science. 28;99(2574):351-2.).

보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii)의 경우처럼 생산되어 분비되는 탄화수소가 균주 외벽에 강하게 부착되어 있어 교반만으로는 세포배양용액과 지용성물질추출용매의 충분한 접촉이 가능하지 않기 때문에 높은 탄화수소의 회수율을 얻을 수가 없으나, 지용성물질추출용매와 세포배양용액의 혼합, 접촉 및 세포의 분리 과정에서 기존 기술 보다 지용성물질추출용매와 세포배양용액과의 접촉을 더욱 향상시키면 지용성물질의 추출능력을 개선시킬 수도 있다.

8. 바이오디젤 생산

바이오디젤의 생산 방법은 크게 직접이용법, 초임계유체법, 전이에스테르화법으로 나뉜다. 직접이용법은 경유와 동식물성 기름을 직접 혼합한 것으로 시간이 지날수록 디젤의 점도가 높아져 운행에 방해가 된다. 초임계유체법은 반응속도가 빠르며 지방산, 글리세린 등은 모두 열분해 되어 부생물이 발생하지 않는다.

현재까지 보편적으로 사용되고 있는 방법인 전이에스테르화법은 촉매 존재하에 트리글리세리드(triglyceride)와 알코올을 혼합하여 기름을 지방산에스테르와 글리세린으로 분해하는 방법으로서, 이때 분리된 지방산에스테르가 바이오디젤이 된다. 전이에스테르화법은 화학 촉매를 사용하는 화학법과 생촉매를 사용하는 효소법으로 나뉜다.

화학법은 촉매 비용이 싸고 단시간에 높은 전환율을 얻기 때문에 대부분의 공정에서 사용되어지고 있다. 일반적으로 산촉매(HCl, H₂SO₄ 등) 또는 염기촉매(NaOH, KOH 등)를 사용하며, 산촉매는 유리지방산이 높은 폐유에 적합하나 공정의 부식, 고온·고압에 따른 에너지 소모가 크다는 단점을 가지고 있다. 염기촉매는 산촉매보다 반응속도가 빨라 많은 상용 공정에서 사용되고 있다. 효소법은 리파아제를 촉매로 사용하여 에스테르화를 하는 방법으로, 화학법에 비해 알코올 사용량이 적고 글리세린의 분리정제과정은 생략이 가능하다. 또한 기름에 포함된 지방산이 모두 에스테르화가 가능하며 생성물의 순도도 높은 편이다. 이러한 효소법의 단점을 보완하기 위해 다공성 중공사막에 방사선그라프트중합법을 이용하여 그라프트 체인을 형성하고 친수기의 음이온 교환기를 도입하여 효소의 활성도를 유지한다.

디젤생산장치에 적용되는 디젤반응기의 종류로는 공정에 따라 배치, 연속식 등이 있으며 형태에 따라 일반 촉매반응기, 환상반응기, 관상반응기 등이 있다.

식물지질을 이용한 비아오디젤 제조에서는 식물지질의 산도, 점도, 및 불포화지방산 함유량에 따른 공정의 최적화 및 통합화도 앞으로 연구 수행을 통해 개발의 필요성이 있다.

바람직하게, 본 발명의 구체예에서는 분획된 지질에서부터 화학적인 전이에스테르화법으로 바이오디젤을 추출한다.

9. 에탄올의 생산

일반적으로, 에탄올의 원료는 당질계(사탕수수, 사탕무 등), 전분질계(옥수수, 감자, 고구마 등), 목질계(나무, 볏짚, 폐지 등)가 있으며, 당질계의 경우 원료를 비교적 간단한 전처리 과정 후 이어지는 발효 공정을 통해 곧바로 에탄올로 전환이 가능하지만, 전분질계와 목질계의 경우에는 적절한 전처리 과정과 당화 공정을 거친 당화액을 이용한 발효 공정을 통해 에탄올을 제조할 수 있다.

본 발명에서는 혐기성 셀룰로오스 분해 세균인 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스(Clostridium phytofermentans) 세포(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 700394^T)를 이용하여 분획장치(50)에서 분획된 세포를 직접 발효시켜(시료전처리, 당화과정 및 에탄올발효과정이 없이) 에탄올과 수소를 생산할 수 있다.

혐기성 셀룰로오스 분해 세균은 다양한 서식지(예, 토양, 침전물, 습지, 포유류의 장 등)에서 분리된다(Madden, et al., (1982) Int J Syst Bacteriol 32, 87-91; Murray et al., (1986) Syst Appl Microbiol 8, 181-184; He et al., (1991) Int J Syst Bacteriol 41, 306-309; Monserrate et al., (2001) Int J Syst Evol Microbiol 51, 123-132.).

대표적인 혐기성 셀룰로오스 분해세균인 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스(Clostridium phytofermentans) 세포(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 700394^T)는 메사추세츠주(USA)에 있는 콰빈 저수지 근처 수목 지구의 간헐하천 바닥의 젖은 침니(slit)로부터 분리된 것이다.

일반적으로, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포는 둥근 말단포자(직경이 0.9-1.5㎛)를 형성하는 길고, 얇고, 곧은 운동성 막대세포이다. 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포의 부가적인 특징은 Warnick et al., Int. J. Systematic and Evol. Microbiology, 52, 1155-1160 (2002)에 기재되어 있다.

클로스트리듐 파이토퍼멘탄스는 고효율로 넓은 스펙트럼의 물질을 연료로 발효시킬 수 있다. 유용하게, 폐기물, 예를 들면, 락토스, 폐휴지, 잎, 목초 베어낸 것, 및/또는 톱밥을 이용하여 연료를 제조할 수 있다(대한민국 공개특허 10-2008-0091257).

클로스트리듐 파이토퍼멘탄스는 단독으로 또는 효모 또는 진균(fungi)(예, 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 트리코데르마 종(Trichoderma species), 아스페르질러스 종(Aspergillus species)) 또는 기타 박테리아(예, 자이모모모나스 모빌리스(Zymommonas moblis), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 베이제린크키이(Clostridium beijerinckii), 클로스트리듐 파피로솔벤스(Clostridium papyrosolvens), 클로스트리듐 셀룰로라이티쿰(Clostridium cellulolyticum), 클로스트리듐 조수이(Clostridium josui), 클로스트리듐 테르미티디스(Clostridium termitidis), 클로스트리듐 셀룰로시(Clostridium cellulosi), 클로스트리듐 셀레레크레센스(Clostridium celerecrescens), 클로스트리듐 포풀레티(Clostridium populeti), 클로스트리듐 셀룰로보란스(Clostridium cellulovorans) 등의 하나 이상의 다른 미생물과 조합하여 사용할 수 있다.

예를 들면, 셀룰로오스 분해 클로스트리듐(균주 C7)은 성장 기질로서 셀룰로오스를 함유하는 배지 중에서 자이모모나스 모빌리스와 공배양하여 성장시켰을 때, 에탄올 수율이 상기 클로스트리듐 단독 배양보다 2.5배 높다(Leschine and Canale-Parola, Current Microbiology, 11:129-136, 1984).

미생물 혼합물은 고체 혼합물(에, 동결건조 혼합물)로 또는 미생물의 액체 분산액으로 제공할 수 있으며, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스와 공배양하여 성장시키거나, 또는 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 첨가 전 또는 후에 또 다른 미생물을첨가함으로써, 미생물들을 배양 배지에 순차적으로 첨가할 수도 있다.

10. 부탄올의 생산

셀룰로스성 바이오매스의 생물학적 전처리 및 당화는 산 또는 염기처리 등의 화학적 처리 또는 고압/고온의 물리적 처리 없이, 순수한 생물학적 처리에 의해 셀룰로스성 바이오매스를 당화시킴으로써 높은 공정효율 및 수율로 바이오 부탄올을 생산할 수 있다.

바이오부탄올 생산 공정은, (당화)전처리공정, 당화공정, 발효공정 및 정제공정으로 분류할 수 있다.

부탄올 발효는 당화공정 및 발효공정을 발효장치에서 동시에 수행하고 각 공정을 최적화함으로써 당화공정을 통해 얻어지는 글루코스 등의 당산물의 수율을 향상시킬 수 있다. 셀룰로스성 바이오매스는 미세조류 같은 섬유소 작물에서 유래한 비 목질계 바이오매스이다.

통상적으로 당화공정은 산당화 공정과 생물학적인 당화 공정으로 나눌 수 있는바, 산당화의 경우에는 묽은 산 또는 농축된 산을 이용하여 셀룰로스와 헤미셀룰로스 구조를 파괴시켜 당의 형태로 전환시킬 수 있다.

생물학적인 당화 중 가장 보편적으로 사용하는 효소당화는 셀룰라제가 상기 셀룰로오스의 반응표면에 흡착하여 이를 분해함으로써 셀로바이오스(cellobiose)를 생성한다. 셀로바이오스는 환원성 이당류의 하나로, 화학식 C₁₂H₂₂O₁₁인 무색 결정이며, 베타-글루코시다제(β-glucosidase)에 의해 가수분해되어 글루코스 2분자를 생성한다.

효소당화는 담체에 고정한 베타-글루코시다제를 분획 및 이송된 미세조류 세포배양용액에 적용함으로써 세포배양용액의 바이오매스를 분해하여 글루코스를 생성되도록 할 수 있다.

당화과정은 생물학적인 효소방법이 아닌 Clostridium thermocellum을 사용하여 미세조류의 헤미셀룰로오스 및 셀룰로오스를 당화시키는 방법을 적용할 수 있다(Biotechnology Letters Vol 7 No 7 509-514 (1985)).

부탄올 발효는 혐기성 미생물인 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum), 또는 클로스트리듐 베이제른키(Clostridium beijernckii)로 실행할 수 있다.

부탄올발효는 Clostridium acetobutylicum을 사용하여 부탄올 발효할 수 있는 바, 이에 제한되는 것은 아니다.

생산된 부탄올을 세포배양용액으로부터 분리하는 기술로서는, 투과증발(pervaporation), 추출(extraction), 증류(distillation), 탈기(gas stripping) 또는 흡착(adsorption) 등의 방법이 있다. 부탄올의 분리는 소수성 이온성 액체를 이용하여 분리할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

11. 유기산(젖산)의 생산

젖산(2-hydroxypropanoic acid)은 미생물을 이용한 발효나 화학적인 합성에 의해서 생산된다. 젖산 발효균은 Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus 및 Weissella 등을 있는바, 단일균주(Lactobacillus brevis subsp. brevis)를 사용하여 혐기발효로 할 수 있다.

젖산은 식료품 첨가제나 다른 산업적 적용분야가 넓어서 연간 50,000 톤 가량 사용되고 있다. 젖산은 생분해성 고분자, 환경친화적인 용매, 식물생장조절제, 특수 화학물질의 중간체로써 사용가능성이 무한하다. 석유로부터 생산되는 합성 젖산은 생산단가가 낮지만, D(-)와 L(+)형이 함께 존재하기 때문에 PLA(polylactate)와 같은 생분해성 고분자를 만들기에는 부적합하다. PLA는 석유화학공업에 의해 유도되는 난분해성 플라스틱인 polyethylene, polystyrene, polypropylene의 대체물질로써 환경친화적인 생분해성 플라스틱일 뿐만 아니라 생체적합성을 지니고 있어 그 수요가 증가할 것으로 예상된다.

PLA와 같은 생분해성 고분자를 생산하기 위해서는 석유 화학적 합성공정에 의한 DL-젖산의 생산보다는 생물 공학적 발효에 의해 특이적으로 L(+)형 젖산만을 생합성할 수 있는 공정이 더 유효하다. 그러나, 발효공정으로 생산된 젖산은 발효액 내의 여러 가지 불순물들과 함께 존재하기 때문에 이들을 제거하기 위한 회수공정이 필요하게 된다. 또한, 젖산 생산공정 중 분리정제과정이 전체 생산비용의 50%이상 차지하기 때문에 발효액으로부터 효율적인 회수공정이 젖산의 경제적 생산에 필수적이다. 분리 및 정제 방법으로는, 용매추출, 전기투석, 이온교환수지, 나노여과, 역삼투법 등이 있다.

유기산 발효과정을 통하여 생성된 젖산염과 단백질 등의 불순물을 포함한 발효액에서 원심분리에 의해 미생물을 제거한 후, 침전장치에서 석회(Ca(OH)₂)를 첨가하여 발효액에서 젖산을 칼슘염(Ca(LA)2) 형태로 침전시킨 후 회수하는 방법을 적용할 수 있다.

본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법에 의하면, 지용성물질을 함유한 세포를 배양한 세포배양용액으로부터 손상 없는 세포와 지용성물질을 저비용의 높은 수율로 생산할 수 있고, 특히 세포숙성과정을 통해, 배양한 세포의 지용성물질의 함량이 증가하고 지용성물질추출용매가 세포 속으로 보다 용이하게 투과하여 세포내 지용성물질이 보다 용이하게 용해되며, 선택적으로 배양된 세포를 농축시킴으로써, 대량생산이 가능할 정도로 손상이 없는 세포와 지용성물질의 생산 효율을 더욱 향상시킬 수 있다.

도1은 본 발명의 방법을 시행할 수 있는 예시적인 시스템의 개략도,
도2는 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 예시적인 분리장치인 초음파공명장 발생장치의 개략도,
도3은 본 발명의 방법에 적용할 수 있는 예시적인 분리장치인 중력침강장치의 개략도,
도4는 본 발명의 방법에 적용할 수 있는 다른 예시적인 시스템의 개략도,
도5는 본 발명의 방법에 적용할 수 있는 또 다른 예시적인 시스템의 개략도,
도6은 본 발명의 방법에 적용할 수 있는 예시적인 통합분리장치의 개략도,
도7은 지용성물질추출용매가 세포의 생존에 미치는 영향을 보여주는 그래프,
도8은 세포에서의 지용성물질의 추출에 미치는 지용성물질추출용매(알칸)와 진동분쇄의 효과를 보여주는 그래프,
도9는 본 발명의 방법에 의해 생산한 바이오디젤에 대한 GC-TOF-MS 분석 결과 그래프.

이하, 첨부도면과 실시예를 참조하여, 본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법을 상세히 설명한다. 이하의 구체예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 아니한다.

도1은 본 발명에 따른 방법을 적용한 예시적인 시스템(1)의 개략도로서, 본 시스템(1)은, 배양장치(10), 용매장치(20), 혼합장치(30), 분리장치(40), 분획장치(50), 세포수용장치(60) 및 지용성물질용매수용장치(70)를 포함한다.

상기 배양장치(10)는 예를 들어 미세조류와 같은 지용성물질을 함유한 세포를 배양하고 배양된 세포배양용액을 다음 공정으로 공급하는 본 발명에서의 세포배양과정을 실행하는 장치이다.

배양장치(10)는 세포를 배양하기에 적당한 시스템을 폭넓게 사용할 수 있다. 배양장치(10)에는, 연못, 인공적인 노지 배양시설물, 바이오리액터(bioreactors), 플라스틱 백(plastic bags), 튜브(tubes), 발효조(fermentors), 쉐이크 플라스크(shake flasks), 에어리프트 칼럼(airlift columns) 등이 포함되며, 세포를 배양할 수 있는 것이라면 그 형식에 제한이 없다.

배양방법은 독립영양배양 혹은 종속영양배양 또는 혼합영양배양을 단독으로 하거나, 독립영양배양 후에 종속영양배양 또는 종속영양배양 후에 독립영양배양을 할 수 있다.

상기 용매장치(20)는 본 발명에서의 상기 지용성물질 용해과정을 실행하기 위해 세포배양용액의 세포에 함유된 지용성물질을 추출하기 위한 지용성물질추출용매를 저장하고 공급하는 장치이다.

상기 혼합장치(30)는, 본 발명에서의 상기 지용성물질 용해과정을 실행하기 위해, 배양장치(10)로부터 공급된 세포배양용액과 용매장치(20)로부터 공급된 지용성물질추출용매를 균일하게 혼합하여 양자가 접촉되도록 함으로써 세포배양용액의 세포에 함유된 지용성물질이 지용성물질추출용매에 용해된 지용성물질용액이 생성되도록 하는 장치이다. 바람직하게, 혼합장치(30)에서는 세포배양용액과 지용성물질추출용매를 대략 5:1비율로 혼합한다.

바람직하게, 혼합장치(30)에는 진동분쇄장치(31)를 장착하여 세포배양용액을 진동 분쇄할 수 있다. 바람직한 진동분쇄장치(31)는 초음파로 세포배양용액을 처리하는 것이다. 진동분쇄는 분자 집합체를 분리하거나 투과시키기 위해 분자집합체를 분쇄한다. 진동분쇄는 세포배양용액을 작은 입자로 만들어 세포가 더 많은 지용성물질추출용매에 노출(접촉)되도록 하여 지용성물질의 추출효율을 향상시킨다.

진동분쇄장치(31)와 함께 또는 진동분쇄장치(31)를 대신하여 세포배양용액과 지용성물질추출용매의 혼합용액을 교반하여 주는 교반장치(32)를 설치할 수 있으며, 교반장치(32)도 세포배양용액과 지용성물질추출용매의 접촉을 증가시켜 지용성물질의 추출효율을 향상시킨다.

바람직하게, 배양장치(10)의 세포배양용액과 용매장치(20)의 지용성물질추출용매는 제1 연동펌프(2)를 통해 정해진 유량으로 혼합장치(30)로 이송한다.

이를 위해, 배양장치(10)로부터의 라인(11)과 용매장치(20)로부터의 라인(21)은 각각 제1 연동펌프(2)에 각각 연결하고, 제1 연동펌프(2)로부터의 라인(33)은 혼합장치(30)에 연결한다.

상기 분리장치(40)는, 본 발명에서의 상기 세포분리과정을 실행하는 장치로서, 라인(34)을 통해 혼합장치(30)로부터 이송된 혼합용액에, 바람직하게 초음파공명장 또는 중력침강 등을 적용한 연속관류배양을 실행하여 지용성물질이 용해된 세포배양용액의 세포들이 서로 응집되도록 함으로써 혼합용액으로부터 세포들이 응집, 정체, 농축 및 분리되도록 하는 장치이다.

분리장치(40)로서 여과방식을 적용할 경우, 세포(미세조류)의 크기가 커지거나 작아질 경우, 미세조류의 유실을 방지할 수 있도록 정밀여과막(MF막), 한외여과막(UF막), 역침투막(RO막) 등 여과막을 교체 장착할 수 있는 여과(막)장치를 적용하여 세포를 분리할 수 있다.

바람직하게, 분리장치(40)로서는 초음파공명장에 의해 세포를 분리하는 초음파공명장 발생장치(41: 도2 참조) 및/또는 중력침강에 의해 세포를 분리하는 중력침강장치(46: 도3 참조)를 적용할 수 있다.

상기 초음파공명장 발생장치(41)로서는 도2에 예시된 바와 같은 어쿠스틱세포필터(41)(Acoustic Cell Filter)(Nature Biotechnology 12, 281 - 284 (1994)를 적용할 수 있다. 초음파공명장 발생장치(41)는 혼합용액에 초음파공명장(Ultrasonic Resonance Field)을 가하여 세포가 응집 및 분리되도록 한다. 이런 초음파공명장 발생장치(41)는, 예를 들어 미국특허 5711888(1998. 01. 27 등록)의 'Mutilayered plezoelectric resonator for the separation of suspended particles'를 참조할 수 있다.

도2에 도시된 바와 같이, 어쿠스틱세포필터(41)는, 어쿠스틱챔버(Acoustic chamber; 42), 초음파 발진기(Generator; 43), 초음파 진동자(Transducer; 44) 그리고 반사막(Reflector; 45)을 포함하며, 혼합용액의 세포들에 대해 초음파공명장을 가하여 세포들이 초음파공명장 내에서 응집되어 응집체(aggregates)를 형성하도록 한다.

분리장치(40)에 어쿠스틱세포필터와 같은 초음파공명장 발생장치(41)를 설치함에 따라, 초음파 발진기(43)의 작용으로 초음파 진동자(44)에 의해 제1 진행파를 발생시키고, 초음파 진동자(44)로부터 반사막(45)에 가해진 제1 진행파는 반사막(45)에서 역방향으로 반사하여 제2 진행파를 발생시키며, 결국 초음파 진동자(44)에서 발생한 제1 진행파와 반사막(45)에서 반사되어 반대방향으로 진행하는 제2 진행파가 어쿠스틱챔버(42)에서 충돌하여, 초음파 진동자(44)와 반사막(45) 사이에 정재파(standing wave)를 발생시킨다. 정재파는 서로 반대방향에서 나오는 두 개의 독립적인 진행파(traveling wave)가 합쳐져 형성한다.

이와 같은 초음파의 정재파는, 일정 거리 이격하여 서로 마주보게 설치된 초음파 진동자(예, 압전 트랜스듀서: piezoelectric transducer)와 반사막(45)의 구조나, 일정 거리 이격하여 서로 마주보게 설치된 두 개의 독립적인 초음파 진동자로부터 발생시킬 수 있다.

초음파의 정재파는 마디(node: 절)와 배(antinode) 부분을 가지게 되는데 이러한 초음파의 정재파의 압력진폭(pressure amplitude)은 배 부분에서 가장 크며 마디에서 최소값을 갖고 하나의 파장에 두 번씩 나타난다. 이렇게 형성된 초음파공명장 내에서 입자, 세포 또는 방울(droplet)의 불연속성(discontinuity) 때문에 초음파공명장에는 위치 의존성 음향에너지(position-dependent acoustic potential energy)를 형성한다. 이러한 현상에 의해 세포는 음향에너지(acoustic potential energy)가 가장 낮은 곳으로 이동하여 초음파의 정재파에 포집(entrapment)된다.

이로써 세포는 파장의 절반의 위치마다 존재하는 압력절점(pressure node)에 포집된다. 이렇게 포집된 입자들은 정상파 내부에서 응집되어 응집체(aggregates)를 형성한다.

분리장치(40)로서의 상기 중력침강장치(46)는, 세포와 배지의 침강속도(sedimentation velocity)의 차이, 장치내 용액이 흐르는 관의 기울기 및 전자기 진동자(Electromagnetic vibrator) 등을 이용하여 세포를 응집시켜 정체 및 분리시킨다. 이런 중력침강장치(46)로서는 예를 들어 Cell settler(Biotechnology Solutions 사, USA)를 사용할 수 있다.

도3에 예시한 중력침강장치(46)는 내부에 일정 간격을 두고 일정한 경사를 이루는 다수 층의 경사판(46a)을 복수개 설치한 구성으로서, 도시된 구체예에서 경사판(46a)은 상부와 하부의 2단으로 구성되어 있다. 경사판(46a)들은 상하 일정 간격의 상부, 중간 및 하부 거치프레임(46b)에 의해 지지된다. 상부의 경사판(46a)과 하부의 경사판(46a)은 서로 엇갈리게 설치되며, 이는 유하되는 유속을 감소시켜 세포의 침전효율을 향상시키기 위함이다.

혼합장치(30)로부터의 세포배양용액과 지용성물질추출용매의 혼합용액은, 라인(34)에 연결된 유입구(46c)를 통해 중력침강장치(46)로 유입되어 침강과정을 거치게 된다. 경사판(46a)의 후단에는 침강된 세포를 수집 후 배출시키기 위한 세포수집부(46d)가 설치되어 있고, 세포수집부(46d)에 수집된 세포는 세포수집부(46d)에 설치된 세포배출구(46e)를 통해 외부로 배출된다. 침강 완료된 세포가 제거된 용액은 상측의 유출웨이(46f)를 넘어 용액배출구(46g)를 통해 흘러나가 다음 처리단계로 넘어가게 된다.

바람직하게, 중력침강장치(46)에는 진동발생부(46h)가 설치되어 경사판(46a)을 좌우로 유동시킴으로써 경사판 내측에 응집 및 정체된 세포를 효과적으로 분리하도록 할 수 있다.

도1에 도시된 시스템(1)에 있어서, 혼합장치(30)와 분리장치(40)를 별도의 분리된 구성으로 구축한 예를 도시하였지만, 이점쇄선으로 표시된 바와 같이 혼합장치(30)와 분리장치(40)를 그 기능이 통합된 하나의 반응장치(100)로 통합 구성하는 것도 가능하다.

상기 분획장치(50)는, 본 발명에서의 상기 분획과정을 실행하는 장치로서, 분리장치(40)로부터의 라인(51)을 통해 분리장치(40)로부터 이송된 세포가 제거된 용액을, 지용성물질용액(층)(세포배양용액의 지용성물질이 지용성물질추출용매에 용해된 용액)과 물로 분획하기 위한 장치이다. 즉, 분획장치(50)에서는 분리장치(40)로부터의 혼합용액이 상층의 지용성물질용액(층)과 하층의 물(층)로 분획된다.

이후에 설명하는 바와 같이, 분리장치(40)에서 분리된 세포는 세포수용장치(60)로 수득되어 이후의 목적하는 용도에 사용되고, 분획장치(50)에서 분획된 상층의 지용성물질용액은 지용성물질용액수용장치(70)로 수득되어 이후의 목적하는 용도에 사용된다.

선택적으로 부가할 수 있는 상기 세포순환라인(80)은, 분리장치(40)의 하층에 분리된 세포를 선택적으로 다시 배양장치(10)로 순환하는 라인이다. 즉, 바람직한 실시예에서, 분리장치(40)의 세포는 세포수용장치(60)로 이송되거나 세포순환라인(80)을 통해 배양장치(10)로 재공급된다.

선택적으로 부가할 수 있는 상기 용매순환라인(90)은, 분획장치(50)에서 상층에 분획된 지용성물질용액을 선택적으로 다시 용매장치(20)로 순환하는 라인이다. 즉, 바람직한 실시예에서, 분획장치(50)의 지용성물질용액은 지용성물질용액수용장치(70)로 이송되거나 용매순환라인(90)을 통해 용매장치(20)로 재공급된다.

순환된 세포는 배양장치(10)에서 재배양되고, 재배양된 세포와 용매장치(20)의 지용성물질추출용매 또는 순환된 지용성물질용액이 다시 혼합장치(30)에 공급 및 혼합되어 세포로부터의 지용성물질의 용해가 더욱 진행된 후에, 그 혼합용액이 다시 분리장치(40) 및 분획장치(50)에 공급됨으로써 앞서와 같이 세포의 분리 및 지용성물질용액의 분획이 반복적으로 실행된다.

바람직하게, 이런 세포의 재배양, 재분리 및 지용성물질용액의 재분획은, 세포가 목적하는 정도의 밀도로 고밀도화되고 지용성물질용액의 지용성물질이 목적하는 정도로 농축될 때까지 1회 또는 그 이상 다수회 반복할 수 있다.

상기 세포수용장치(60)는 분리장치(40)에서 1번 분리된 세포를 바로 이송받거나 또는 세포순환라인(80)을 순환하면서 1회 이상 재배양된 세포가 목적하는 정도의 밀도로 고밀도화되었을 때 해당 고밀도 세포를 분리장치(40)로부터 이송 받아, 이후의 목적하는 처리를 위해 일시 수용하거나 목적하는 처리를 하는 장치이다.

예를 들어, 세포수용장치(60)에서는 고밀도 세포를 에탄올발효, 부탄올발효, 유기산발효 등 각종 처리를 하여 세포로부터 바이오화합물, 의약품, 건강기능성 식품, 바이오연료 및 단백질가수분해산물 등 각종 유용물질을 생산하거나, 이런 유용물질을 생산하기 위한 처리장치에 보내기에 앞서 일시 수용한다.

예를 들어, 세포수용장치(60)에서 에탄올발효와 같은 각종 발효를 실행하는 경우라면 세포수용장치(60)는 발효장치가 되고, 세포수용장치(60)가 별도의 발효장치로 보내기 전에 일시적으로 고밀도 세포를 저장하는 경우라면 세포수용장치(60)는 임시저장장치가 된다.

상기 지용성물질용액수용장치(70)는 분획장치(50)에서 1번 분획된 지용성물질용액을 바로 이송 받거나, 용매순환라인(90)을 순환하면서 분획장치(50)에서 1회 이상 재분획하여 지용성물질용액의 지용성물질이 목적하는 정도의 농도로 농축되었을 때 지용성물질용액을 분획장치(50)로부터 이송 받아서, 이후의 목적하는 처리를 위해 일시 수용하거나 목적하는 처리를 하는 장치이다.

예를 들어 지용성물질용액수용장치(70)는, 지용성물질용액으로부터 지용성물질을 추출하고 추출된 지용성물질로부터 의약품, 건강기능성 식품, 바이오디젤 등의 각종 유용물질을 생산하거나 이런 유용물질을 생산하기 위한 처리장치에 보내기에 앞서 일시 수용한다.

예를 들어, 지용성물질용액수용장치(70)에서 지용성물질용액으로부터 지용성물질을 추출하고 추출된 지용성물질로부터 바이오디젤을 생산하는 경우라면 지용성물질용액수용장치(70)는 증류-바이오디젤 생산장치가 되고, 별도의 증류-바이오디젤 생산장치로 지용성물질용액을 보내기 전에 일시 저장하는 경우라면, 지용성물질용액수용장치(70)는 임시저장장치가 된다.

바람직하게, 분리장치(40)에서 분리된 세포를 그 밀도에 따라 선택적으로 세포순환라인(80)을 통해 배양장치(10)로 이송하거나 세포수용장치(60)로 이송하는 제2 연동펌프(3)를 포함한다. 이를 위해, 분리장치(40)와 배양장치(10) 사이의 세포순환라인(80)에는 제2 연동펌프(3)가 설치되고, 제2 연동펌프(3)로부터 추가의 라인(61)은 세포수용장치(60)에 연결된다.

바람직한 구체예에서, 이와 같은 제2 연동펌프(3)의 작용으로 분리장치(40)의 세포의 밀도가 목적하는 밀도에 이르지 못하면 세포는 반복적으로 배양장치(10)로 순환되어 1회 이상 반복적으로 재배양, 세포의 지용성물질 용해, 세포의 분리가 진행되고, 목적하는 밀도에 이르면 세포수용장치(60)로 이송된다.

바람직하게, 본 발명이 적용된 시스템(1)은, 분획장치(50)에서 분획된 지용성물질용액을 그 농축도에 따라 용매장치(20)로 이송하거나 지용성물질용액수용장치(70)로 이송하는 제3 연동펌프(4)를 포함한다. 이를 위해, 분획장치(50)와 용매장치(20) 사이의 용매순환라인(90)에 제3 연동펌프(4)가 설치되고, 제3 연동펌프(4)로부터 추가의 라인(71)이 지용성물질용액수용장치(70)에 연결된다.

바람직한 구체예에서, 이와 같은 제3 연동펌프(4)의 작용으로 분획장치(50)의 지용성물질용액의 지용성물질의 농도가 목적하는 농도에 이르지 못하면 지용성물질용액은 다시 용매장치(20)로 순환되어 1회 이상 재분획에 사용되고, 목적하는 농도에 이르면 지용성물질용액수용장치(70)로 이송된다.

도4를 참조하면, 본 발명이 적용된 시스템(1)은 발효장치(210), 바이오가스수용장치(220) 및 유기성폐수수용장치(230)를 더 포함하며, 유기성폐수수용장치(230)의 유기성폐수는 배양장치(10)에 공급하여 세포의 세포배양용액으로 활용한다.

상기 발효장치(210)는 음식물폐기물 등과 같이 탄수화물, 단백질, 지방 등 복잡한 유기성 화합물을 함유하는 유기성폐기물을 발효로 분해하여 유기성폐수와 바이오가스를 생산하는 장치이다.

이때 발효장치(210)에서 발생하는 이산화탄소를 포획하여 배양장치(10)에서의 세포(미세조류)의 배양에 필요한 이산화탄소를 공급할 수도 있다.

상기 바이오가스수용장치(220)는, 발효장치(210)에서 생산된 수소와 메탄 등의 바이오가스를 포획 및 저장하고, 필요에 따라 목적하는 용도로 처리하는 장치이다.

상기 유기성폐수수용장치(230)는, 발효장치(210)에서의 발효의 결과로 생산된 유기성폐수(즉, 발효액)를 저장하는 장치이다.

도4의 경우에, 발효장치(210), 바이오가스수용장치(220) 및 유기성폐수수용장치(230)가 배양장치(10)와 하나의 연속된 플랜트로 구성된 예를 도시하고 있지만, 유기성폐수수용장치(230) 등을 원격에 설치하여 원격에서 유기성폐수를 생산하여 배양장치(10)로 이송하여 공급하는 시스템도 본 발명의 방법이 적용된 것으로 이해되어야 한다.

분획장치(50)와 발효장치(210) 사이에는 물순환라인(240)을 형성하고, 분획장치(50)에서 분획된 물을 발효장치(210)로 순환하여 발효에 재사용 할 수 있다.

물론 분획장치(50)에 의해 분획된 물은 물수용장치(250)로 이송 및 저장하여 필요한 용도로 재활용할 수 있다. 이때 물순환라인(240)에는 제4 연동펌프(5)를 설치하여 분획장치(50)로부터의 물을 물수용장치(250) 또는 발효장치(210)로 선택적으로 공급할 수 있다.

도5에 도시된 바와 같이, 본 발명의 방법이 적용된 시스템(1)에는, 세포를 숙성시키는 세포숙성장치(400)를 포함하며, 바람직하게 세포배양용액의 세포를 농축하는 세포농축장치(300)를 추가할 수 있다.

도5의 도시된 구체예는 세포농축장치(300)와 세포숙성장치(400)가 배양장치(10)와 혼합장치(30) 사이에 별도로 추가된 것으로 되어 있으나, 세포의 농축과 세포의 숙성은 배양장치(10)에서의 세포배양과정에서 함께 실행할 수도 있다.

세포농축장치(300)는, 예를 들어 도1을 참조하여 설명한 분리장치(40)에 적용된 여과막, 초음파공명장 또는 중력침강 등을 적용하여, 배양장치(10)에서 배양된 세포를 농축함으로써, 세포배양용액을 농축된 세포와 수용액으로 분리한다.

세포숙성장치(400)에서는 배양된 또는 배양 후 농축된 세포배양용액의 세포를 숙성시킨다.

세포숙성장치(400)에서는, 세포배양용액의 pH를 1 내지 6.5의 범위, 바람직하게 5.0-5.5로 유지함으로써, 세포를 숙성할 수 있다.

또한, 세포숙성장치(400)에서는, 예를 들어 세포배양의 영양물질로서, 제한영양소원이 포함되지 않거나 과도하게 부족하면서 탄소원이 함유된 영양물질을 가하는 방식으로 세포를 숙성시켜, 세포의 지용성물질함량을 증가시키고, 지용성물질추출용매가 용이하게 세포 속으로 투과하여 지용성물질을 용이하게 용해할 수 있도록 세포를 변화시킬 수 있다.

또한 세포숙성장치(400)에서는, 세포배양용액의 용존산소를 저하시킴으로써, 세포를 숙성할 수도 있다.

세포숙성장치(400)에서 숙성된 세포배양용액은 혼합장치(30)로 이송되고, 이와 함께 용매장치(20)의 지용성물질추출용매도 숙성된 세포배양용액의 세포에 함유된 지용성물질을 추출하기 위한 혼합장치(30)로 이송된다.

배양장치(10)와 세포농축장치(300) 사이에는 제5 연동펌프(6)를 설치하여 정해진 유량의 세포배양용액이 세포농축장치(300)로 이송되도록 할 수 있다.

마찬가지로, 세포농축장치(300)와 세포숙성장치(400) 사이에 제6 연동펌프(7)를 설치하여 정해진 유량의 농축된 세포배양용액이 세포숙성장치(400)로 이송되게 할 수 있다.

세포농축장치(300)와 물수용장치(250) 사이에 물순환라인(310)을 연결하여 세포농축장치(300)에서 수집된 물을 물수용장치(250)로 이송함으로써 이후에 재활용하도록 할 수 있고, 물순환라인(310)에 제7 연동펌프(8)를 설치할 수 있다.

세포순환라인(80)은, 분리장치(40)에 의해 분리된 세포를 세포수용장치(60)로 이송하거나 선택적으로 배양장치(10) 또는 세포숙성장치(400)로 이송할 수 있다. 세포순환라인(80)에는 제8 연동펌프(9)를 추가로 설치하여 분리장치(40)에서 분리된 세포의 배양장치(10) 또는 세포숙성장치(400)로의 이송을 조절할 수 있다.

도5의 실선으로 표시된 바와 같이, 세포숙성장치(400)와 혼합장치(30) 및 분리장치(40)는 물리적으로 별도의 장치로 형성할 수 있지만, 도5의 이점쇄선으로 표시된 바와 같이, 세포숙성장치(400)와 혼합장치(30)와 분리장치(40)는 하나의 장치인 통합분리장치(500)로 통합할 수도 있다.

즉, 통합분리장치(500)는 세포농축장치(300)로부터의 농축된 세포를 물리적으로 하나의 장치에서, 세포를 숙성시키고, 숙성된 세포배양용액과 용매장치(20)로부터의 지용성물질추출용매를 혼합하고, 혼합용액으로부터 세포를 분리하는 과정을 단일 공정으로 실행한다.

도6은 통합분리장치(500)의 예로서, 농축된 세포배양용액에 세포숙성조건(즉, 제안영양소, 용존산소, pH 등)을 적용하여 숙성시킨 후, 숙성된 세포배양용액에 지용성물질추출용매를 공급하여, 세포배양용액과 지용성물질추출용매를 혼합시킴으로써, 숙성된 세포의 지용성물질이 지용성물질추출용매에 용해되도록 함과 아울러, 혼합용액을 하층의 세포와 상층의 물 및 지용성물질용액을 층분리한다.

보다 구체적으로, 통합분리장치(500)는, 유입관(510), 분출관(520), 회수관(530), 연동펌프(540) 및 교반장치(550)를 포함하도록 구성할 수 있다. 유입관(510)은 지용성물질추출용매를 용매장치(20)로부터 통합분리장치(500)에 공급한다. 분출관(520)은 유입관(510)의 말단에 연결되어 지용성물질추출용매를 세포배양용액의 하층으로부터 분출한다. 회수관(530)은 통합분리장치(500)의 지용성물질추출용매와 여기에 지용성물질이 용해된 지용성물질용액을 다시 용매장치(20)로 회수한다. 연동펌프(540)는 유입관(510)과 회수관(530)에 걸쳐 설치되어 지용성물질추출용매와 지용성물질용액의 이송압을 제공한다. 교반장치(550)는 통합분리장치(500)에서 세포배양용액과 지용성물질추출용매를 혼합한다.

이와 같은 통합분리장치(500)에 의하면, 지용성물질추출용매 및 지용성물질용액이 통합분리장치(500)와 용매장치(20) 사이를 순환하면서 숙성된 세포의 지용성물질을 반복적으로 용해시키게 되고, 지용성물질의 농도가 소정의 목적하는 정도에 도달했을 때 용매의 순환을 중지하고 방치하면, 통합분리장치(500)에서 하층의 세포와 상층의 물 및 지용성물질용액으로 층분리가 일어나게 된다.

층분리된 하층의 세포는 앞서 도1을 참조하여 설명한 것과 마찬가지로, 세포수용장치(60)로 회수하거나 배양장치(10)로 재순환하고, 상층의 물 및 지용성물질영액은 분획장치(50)로 이송하여 도1을 참조하여 설명한 것과 마찬가지로 분획 처리된다.

실시예 1. 유기성폐기물(음식물폐기물)의 가수분해/산생성 발효

이하, 실시예를 통해 본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법을 설명한다.

먼저, 유기성폐기물로서의 음식물폐기물로부터 미생물이 분해하기 어려운 물질(닭뼈, 생선뼈, 나무토막 등)을 제거하였다. 음식물폐기물과 미생물과의 접촉이 용이하고 각 공정으로의 수송이 편리하도록 파쇄기로 죽 상태로 잘게 분쇄하여 이후의 공정에 사용하였다. 죽 상태의 음식물폐기물이 충분히 교반되고 산소가 원활히 전달될 수 있도록, 음식물폐기물과 물을 1：1의 비율로 혼합하여 발효장치(210)에 주입하였다.

반혐기적인 조건에서 가수분해 및 산생성 발효가 이루어지도록 하기 위하여 컴프레서(compressor)를 이용하여 발효장치(210)의 하단과 중앙에서 공기를 주입하고, 발효기의 상단에 교반기를 설치하여 음식물폐기물, 균체 및 산소가 원활히 접촉할 수 있도록 교반하였다.

발효공정에 사용된 발효장치(210)는 5L 발효기(Bioflo 3000)였고, 균주는 고온균(표1 참조)이다. 음식물폐기물과 물을 1:1로 혼합한 뒤 이 3L 혼합용액을 발효장치(210)에 주입하여 50℃에서 24시간 동안 유지하여 다른 부패균을 사멸시켰다.

발효기 내의 온도를 45℃ 로 낮춰 배양된 50 mL 공시균주를 접종하여 2-5일간의 체류시간을 거친 뒤 유출수(즉, 발효액: 유기성폐수)를 유기성폐수수용장치(230)로 이송하였으며, 이때 TCOD가 약 45,000 mg/L이고 SCOD는 약 31,000mg/L 이었다. 총 질소는 3,600∼4,800 mg/L로 평균 4,200 mg/L이었다. 한편 총 인은 약 6.1 mg/L이었다. 반혐기성 가수분해/산생성 발효공정에서 생성된 유기산의 약 75%정도가 아세트산이었다.

실시예 2. 세포의 배양

Chlorella protothecoides를 프로테오스 사면한천(proteose agar slant)에 유지하면서 본 발명에 사용하였다. 기본배지의 성분은 1 리터당 KH₂P0₄(0.7g), K₂HPO₄(0.3g), MgSO₄·7H₂O(0.3g), FeSO₄·7H₂O(3mg). 우레아(1g), Arnon's A Solution(1 ml), thiamine hvdrochloride(10 ㎍), pH 6.3.이었다. 배양은 5 % CO₂, 20도, 15,000 lux 형광등에서 실행하였다. Arnon's A5 용액의 조성은 리터당 H₃BOS3(2.9g), MnCl₂·4H₂O(1.8g), ZnSO₄·7H₂O(0.22g), CuSO₄· 5H₂O(0.08g), MoO₃(0.018g) 이었다. Chlorella protothecoides의 종속영양 배양은 기본배지에서 0.1% 우레아 대신에 0.01% 우레아를 및 4.0% 포도당을 첨가하여 수행했다.

Chlorella protothecoides의 혼합영양배양은 기본배지에서 0.1% 우레아 대신에 0.01% 우레아를 및 4.0% 포도당을 첨가하여 5 % CO₂, 20도, 15,000 lux 형광등에서 수행하였다.

실시예 3. 세포에 미치는 유기성폐수의 영향

상기 유기성폐수의 질소 농도를 150 ㎎/ℓ가 되게 희석한 후, C. protothecoides 세포배양용액을 접종하여 3일간 배양하였으며 배양된 C. protothecoides 용액 1 ml을 1/100,000배 희석하여 1.5% 아가 플레이트에 도말하여 형성된 콜로니를 계수하여 음식물폐기물의 발효액인 유기성폐수가 C. protothecoides의 생존에 미치는 영향을 평가하였다. 음식물폐기물의 발효액(유기성폐수)으로 미세조류를 배양한 결과, 기본배지로 미세조류를 배양한 경우와 대비할 때 성장 정도에 의미 있는 차이가 없었다.

유기성폐수의 TCOD를 1,607 ㎎/ℓ 및 질소 농도를 150 ㎎/ℓ가 되게 희석한 후 미세조류, 상기 유기성폐수에 첨가하는 Mg2+의 농도는 500 ㎎/ℓ, Ca^{2 +}의 농도는 150 ㎎/ℓ이며, 상기 유기성폐수에 첨가하는 인은, 상기 유기성폐수의 질소와 인의 비율이 10:1이 되게 첨가한 후에 배양하였다.

실시예 4. 세포의 배양에 의한 질소 제거 효과

5L의 배양장치(10)에서 교반속도 150 rpm에서 C. protothecoides를 로그구간까지 상기 유기성폐수(음식물폐기물 발효액)를 이용하여 배양하였다. 상기 희석된 유기성폐수에 첨가하는 미세조류는 대략 1X10⁶ 개체수/㎖ 내외로 첨가하였고, 5X10⁵ 내지 1X 10⁷ 개체수/㎖ 정도 첨가하면 바람직하다.

유기성폐수의 미세조류 배양을 통해 TCOD 및 질소가 얼마나 제거되는지를 확인하였다. 구체적으로, 음식물폐기물의 발효액(유기성폐수: 총질소 농도 4,200 ㎎/ℓ)을 질소 농도를 기준으로 100, 150, 300 또는 500 ㎎/ℓ로 희석한 뒤 5L의 배양장치에 각 질소 농도별로 3000 ㎖씩 넣어 주었다. 이와 같이 희석했을 때 유기성폐수(TCOD는 45,000 ㎎/ℓ)의 TCOD는 1,071, 1,607, 3,214 또는 5,357 ㎎/ℓ이었다.

여기에 C. protothecoides을 각각 첨가하고, 유기성폐수 중 질소농도의 변화를 분석하였다. 각각의 질소 농도에서 C. protothecoides에 의한 질소제거율을 조사하였다. 그 결과, 유기성폐수의 질소 농도를 100, 150, 300, 500 ㎎/ℓ로 희석하였을 때, C. protothecoides에 의한 각각의 질소농도에 대한 4일 후의 제거율은 38, 50, 33 그리고 21%로 측정되었다. 질소농도가 150 ㎎/ℓ일 때 가장 높은 질소 제거율을 보여주고 있고, 이 때 잔류하는 질소농도는 75.6 ㎎/ℓ로 측정되었다.

실시예 5. 세포에 미치는 지용성물질추출용매의 효과

C. protothecoides 세포배양용액에 C10 내지 C16 알칸(alkanes)의 지용성물질추출용매를 5:1비율로 5분간 처리한 후, 분획된 C. protothecoides 용액 1 ml을 1/100,000배 희석하여 1.5% 아가 플레이트에 도말하여 형성된 콜로니를 계수하여 지용성물질추출용매가 C. protothecoides의 생존에 미치는 영향을 평가하였으며, 그 결과는 도7과 같으며, 지용성물질추출용매가 세포의 생존에 아무런 영향이 없었음을 알 수 있다.

실시예 6. 세포의 농축 및 숙성

5L의 배양장치(10)에서 교반속도, 150 rpm, 조도 15,000 lux 하에서 혹은 암반응하에서 C. protothecoides를 로그구간까지 배양한 후, 여과방식으로 500 g/ℓ로 농축하였다. 농축된 C. protothecoides를 실시예2의 기본배지에서 제한영양소원이 포함되지 않으면서 포도당이 5%가 되는 배지(세포 숙성을 위한 배지인 세포숙성용액)로 변환하여 24시간동안 배양(숙성)하였으며, 다양한 세포숙성조건에서 지질의 생산량을 측정한 결과는 표2과 같았다.

제한영양소		숙 성(g/ℓ)
		pH 7	pH 6	pH 5	pH 4	pH 3
질소원	0.01% 우레아	165	183	201	186	152
	0	190	195	250	210	193
용존산소	4∼8%	165	183	201	186	152
	1∼3%	180	200	230	206	186
Thiamine hydrochloride	10 ㎍/ℓ	165	183	201	186	152
	0	170	197	225	192	175

더하여, 상기 전술한 유기성폐수를 공지된 생물학적 처리방법으로 질소농도를 50㎎/ℓ 가 되게 세포숙성용액을 제조하여 상기 500 g/ℓ로 농축된 C. protothecoides을 세포를 24시간동안 숙성하여 지질의 생산량을 측정한 결과 약 245g/ℓ이였다. 질소원이 제거된 pH 5 ~ 5.5 인 유기성폐수는 지용성물질의 함량이 증가되게 하고, 지용성물질을 용해하는 지용성물질추출용매가 숙성된 세포 속으로 용이하게 투과하여 지용성물질을 용이하게 용해할 수 있도록, 세포를 변화(숙성)시킴으로써 높은 지질생산성이 보이는 것으로 판단되었다.

실시예 7. 세포의 지용성물질의 용해에 미치는 지용성물질추출용매 및 초음파진동분쇄의 효과

C. protothecoides의 생장율이 로그구간에 있는 세포배양용액과 헥산(hexane)과 데칸(decane) 용매(지용성물질추출용매)를 5:1비율로 5분간 처리한 후, 수조에서 2초간 40 kHz로 진동 분쇄하였다.

지용성물질추출용매로 추출된 지용성물질은 비누화되었으며 유리 지방산을 C17을 표준으로 하여 LC-MS 분석하여 측정하였다. 그 결과는 도8과 도9와 같으며, 지방산이 5분간의 지용성물질추출용매 혼합과 추가적인 2초간의 진동 분쇄로 추출되었다. 데칸(decane) 용매 사용시 짧은 진동 분쇄가 지용성물질 추출 정도를 75% 정도 증가시켰다.

실시예 8. 세포의 지용성물질의 용해에 미치는 지용성물질추출용매 및 초음파공명장의 효과

C. protothecoides의 생장율이 로그구간에 있는 세포배양용액과 헥산(hexane) 혹은 데칸(decane) 용매(지용성물질추출용매)를 5:1비율로 5분간 처리한 후, 어쿠스틱세포필터(41)가 작동하는 분리장치(40)로 이송하여 세포를 분리하고, 연속적으로 분획장치(50)로 이송하여 지용성물질용액을 분획하였다.

어쿠스틱세포필터(41)는, 도2에 도시된 바와 같은, 어쿠스틱챔버(42), 3MHz 초음파 발진기(43), 초음파 진동자(44) 그리고 반사막(45)으로 구성된 것을 사용하였다. 어쿠스틱챔버(42)는 아크릴관을 이용하여 제작하였고, 반사막(45)으로는 유리를 사용하였다. 어쿠스틱챔버(42)에서 초음파공명장에 의한 세포 응집(농축)이 일어나는 것을 확인할 수 있었다.

지용성물질추출용매로 추출된 지용성물질은 비누화되었으며 유리 지방산을 C17을 표준으로 하여 LC-MS 분석하여 측정하였다. 그 결과는 도9와 같으며, 지방산이 5분간의 지용성물질추출용매 혼합과 어쿠스틱세포필터의 처리로 추출되었다.

실시예 9. 세포의 분리 및 지용성물질용액의 분획

5L의 배양장치(10)에서 교반속도, 150 rpm, 조도 15,000 lux 하 혹은 암반응하에서 C. protothecoides를 로그구간까지 배양하였다.

배양장치(10)의 세포배양용액과 용매장치(20)의 데칸(decane) 용매(지용성물질추출용매)를 혼합장치(30)로 이송하되 5:1비율로 이송하여 이들을 혼합시켰다.

결과의 혼합용액을 초음파공명장 발생장치(41)로서의 어쿠스틱세포필터 혹은 중력침강장치(46)로서의 CS 10 Cell settler(Biotechnology Solutions 사, USA)가 작동하는 분리장치(40)로 이송하였으며, 이때 세포는 응집(농축)되어 세포응집체를 형성하면서 아래로 침강하였다. 침강하여 정체 및 분리된 세포를 제외한 나머지 용액을 연속적으로 분획장치(50)로 이송하여 분획하였으며, 이로써 지용성물질용액(층)과 물(층)이 상하로 분획되었다.

이후 분리장치(40)의 세포는 세포순환라인(80)을 통해 배양장치(10)로 이송하고 세포배양용액을 첨가하여 재배양하였고, 분획장치(50)의 지용성물질용액(층)은 용매순환라인(90)을 통해 용매장치(20)로 이송하였다.

실시예 10. 세포의 재배양

실시예6과 실시예9로부터 획득한, 지용성물질을 용해한 후에 분리된 세포에 대해 재배양을 실행하여 분석한 결과, 즉 지용성물질의 용해로 지용성물질추출용매에 의해 저해를 받은 세포배양용액을 배양장치(10)로 이송하여 재배양한 결과, 성장 속도가 0.028 g/h로 나타났다. 일반적으로 클로렐라를 배양하는 경우, 고밀도에서 세포의 생장을 저해하는 클로렐린(chlorellin)이 분비되어 거의 일정한 밀도가 유지되는 정지기가 된다. 본 실시예에서 지용성물질추출용매로 지용성물질을 제거하는 과정에서 생장저해물질인 클로렐린이 함께 제거되어 고밀도 배양이 가능한 것으로 사료된다. 일반적인 발효장치 배양의 경우 성장 속도가 약 0.033 g/h 인 것과 비교하면 동시 추출 후 균주의 재배양하는 것에는 문제가 없다는 결과를 얻었다.

배양, 혼합, 분리 및 분획 과정을 1일 1회 실시하거나, 일일 1회식 2-20회 반복하여 세포를 50-200 gfw/L의 밀도로 배양하고 농축된 지용성물질이 포함된 지용성물질용액을 확보하였다. 이와 같은 분리, 분획 및 배양 과정을 반복함에 따라 세포의 밀도 및 지용성물질이 매 단계마다 2-3 배 증가하여 포화됨을 확인하였다.

실시예 11. 세포의 재숙성이 생산성에 미치는 영향

숙성한 후 지용성물질이 제거된 C. protothecoides 세포를 재배양하고 재숙성하는 경우 및 재배양이 없이 직접 재숙성하는 경우에서 재숙성시간, 전공정을 수행한 횟수 등이 바이오매스 및 지용성물질의 생산성에 미치는 영향을 분석하였다.

상기 분리장치(40)에서 분리된 지용성물질이 제거된 C. protothecoides 세포는 세포순환라인(80)을 통해 배양장치(10)로 이송하고 세포배양용액을 첨가하여 24시간동안 재배양한 후, 500 g/L로 농축하여 24시간, 48시간 및 72시간동안 실시예2와 마찬가지로 재숙성하였다.

또한 분리장치(40)에서 분리된 지용성물질이 제거된 C. protothecoides 세포는 세포순환라인(80)을 통해 재배양이 없이 직접 세포숙성장치(400: 도5 참조)로 이송하여 제한 영양소원이 포함되지 않으면서 포도당만 5%가 되게 첨가한 배양배지(세포숙성용액)에서 24시간, 48시간 및 72시간동안 재숙성하였다.

세포숙성장치(400)로부터의 숙성된 세포배양용액과 용매장치(20)의 데칸(지용성물질추출용매)을 혼합장치(30)로 1:1 비율로 이송하여 이들을 혼합시켰다.

결과의 혼합용액을 초음파공명장 발생장치(41)로서의 어쿠스틱세포필터 혹은 중력침강장치(46)로서의 CS 10 Cell settler(Biotechnology Solutions 사, USA)가 작동하는 분리장치(40)로 이송하였으며, 이때 세포는 침강하였으며 분리된 세포를 제외한 나머지 용액을 연속적으로 분획장치(50)로 이송하여 분획하였으며, 이로써 지용성물질용액(층)와 물(층)이 상하로 분획되었다. 상기에서 침강하여 분리된 C. protothecoides 세포의 생체량을 측정하였다.

상기 실시예에서, 지용성물질이 제거된 C. protothecoides를 100 g/L로 접종하고 재배양 및 재농축한 세포를, 전술한 세포숙성용액에서, 500 g/L가 되도록 24시간, 48시간 또는 72시간동안 재숙성한 후에 세포를 재분리하고 재분획하였으며, 다양한 재숙성 시간에 따른 생체량, 지방산 및 카로티노이드의 생산성은 표3과 같다.

표3은 지용성물질이 제거된 Chlorella protothecoides 세포를 재배양, 재농축, 재숙성, 재분리 및 재분획하는 등의 모든 공정을 연속적으로 1회 수행한 경우에서 세포숙성시간이 생체량 및 지용성물질의 생산성에 미치는 영향에 대한 결과이다.

지용성물질이 제거된 C. protothecoides를 100 g/L로 접종하여 재배양하고 재숙성이 없이 전공정을 수행한 경우보다 지용성물질이 제거된 C. protothecoides를 100 g/L로 접종하여 재배양하고 재숙성공정을 포함한 전공정을 수행한 경우가 생체량, 지방산 등을 포함한 지용성물질 함량이 월등히 높았다.

상기 실험에서 지용성물질이 제거된 C. protothecoides를 100 g/L로 접종하여 24시간동안 재배양하고 재농축하여 세포를 500 g/L가 되도록 세포숙성용액을 첨가하여 24시간동안 재숙성하여 세포를 재분리하고 재분획한 후, 생산한 세포를 100 g/L으로 재접종하여 전공정을 실시하여 분석하였으며, 전공정을 수행한 횟수에 따른 생체량, 지방산 및 카로티노이드의 생산성은 아래의 표4와 같다. 전공정을 처음 수행한 경우가 2회, 3회 수행한 경우보다 생산성이 높았다.

표4는 지용성물질이 제거된 Chlorella protothecoides세포를 재배양, 재농축, 재숙성, 재분리 및 재분획하는 등의 모든 공정을 연속적으로 수행한 횟수가 생체량 및 지용성물질의 생산성에 미치는 영향에 대한 결과이다.

상기 실험에서 지용성물질이 제거된 C. protothecoides를 재배양 없이 직접 500 g/L로 숙성용액을 첨가하여 24시간, 48시간 또는 72시간동안 재숙성한 후 세포를 재분리하고 재분획하였으며 재숙성 시간에 따른 생체량, 지방산 및 베타-카로틴의 생산성은 표5와 같다.

표5는 지용성물질이 제거된 Chlorella protothecoides세포를 재배양이 없이 재숙성, 재분리 및 재분획하는 등의 전공정을 연속적으로 1회 수행한 경우에서 세포숙성시간이 생체량 및 지용성물질의 생산성에 미치는 영향에 대한 결과이다.

지용성물질이 제거된 C. protothecoides를 500 g/L로 재배양이 없이 직접 재숙성, 재분리 및 재분획 공정 등을 수행한 후 재숙성 시간에 따라 생체량 및 지방산을 포함한 지용성물질 생산량이 증가하였다.

상기 실험에서 지용성물질이 제거된 C. protothecoides를 500 g/L로 재배양이 없이 직접 24시간동안 재숙성하고 재분리하여 재분획을 수행하였으며, 이와 같이 생산된 세포로 다시 전공정을 수행한 횟수에 따른 생체량, 지방산 및 카로티노이드의 생산성은 표6와 같았다.

표6은 지용성물질이 제거된 Chlorella protothecoides세포를 재배양이 없이 재숙성, 재분리 및 재분획하는 등의 전공정을 연속적으로 수행한 횟수가 생체량 및 지용성물질의 생산성에 미치는 영향에 대한 결과이다.

지용성물질이 제거된 C. protothecoides를 500 g/L로 재배양이 없이 직접 재접종하여 전공정을 수행한 횟수에 따른 생산되는 생체량 및 지방산을 포함하는 지용성물질의 생산량의 큰 변화가 없었다.

실시예 12. 분사법에 의한 지용성물질의 추출

실시예2 및 실시예3에 따라 배양하고 500 g/L로 농축하고 24시간 숙성한. C. protothecoides 숙성된 세포배양용액에 데칸(decane)(지용성물질추출용매)을 상층에 5:1(부피:부피)비율로 위치하도록 한 후, 숙성된 세포숙성용액에 지용성물질추출용매를 직접 분사하여 숙성세포와 접촉하도록 하였다. 지용성물질추출용매를 4시간동안 순환시킨 후 지용성물질용액이 있는 층을 수확하여, LC-MS 분석하여 측정하였다. 상기 C. protothecoides를 배양, 농축 및 숙성하여 지용성물질추출용매로 지용성물질을 순환식으로 추출한 결과는 지용성물질의 생산량은 305 g/L이고 카로티노이드 생산량은 0.31g/L이었다.

실시예 13. 분획된 지용성물질용액에서 지용성물질의 추출

지용성물질인 지방산의 추출은 지용성물질용매수용장치(70)의 예에 해당하는 둥근 바닥형 플라스크가 부착된 Buchi 210/215 회전식 증발기(rotovapor; 스위스, Buchi사)를 사용하였다. 분획된 지용성물질용액을 증발기로 이송하여 둥근 바닥형 플라스크 안에 위치하게 하였다. 차가운 원수는 응축 장치로 유입되고 증류 플라스크의 오일 배스는 174℃에 세팅하였다.

증류가 시작했을 때, 가스 데칸(decane)이 기구를 통과하여 콘덴서에 유입되고 액체 상태로 수용 플라스크에 모였다. 증류가 종결될 때, 수용 플라스크에 회수된 데칸(decane)의 부피 및 증류 플라스크 내에 남겨진 세포 기원 지용성물질의 부피를 측정하고 C17을 표준으로 하여 LC-MS 분석하여 측정하였다. 회수된 데칸용매는 용매장치(20)로 이송하여 재사용하였다.

실시예 14. 세포 지방산에서 바이오디젤 추출

메탄올과 가성소다를 교반하여 메톡시드(methoxide)를 제조하고, 제조된 메톡시드를 교반기에 투입하고 교반하여, 추출된 세포의 지용성물질과 메톡시드를 반응시켜 바이오디젤과 글리세린 및 비누 고형성분을 형성하였다. 이들 생성물들을 원심분리기에 공급하여 원심 분리시키고, 각각의 비중 차이에 의해 상부에는 바이오디젤이 위치되고 하부에는 비중이 무거운 글리세린 및 비누 성분이 위치되게 상하 분리시켰다.

이와 같이 분리되어 하부에 위치된 글리세린과 비누 성분은 별도의 글리세린 저장탱크로 배출하였고, 상부에 위치된 바이오디젤과 바이오디젤 량의 2배 정도의 물을 교반기에 투입하여 교반시킴으로써, 바이오디젤 안에 포함되어 있는 글리세린과 비누성분 및 메탄올 성분이 물에 용해시키고, 이와 같이 교반된 용액을 다시 원심분리기에 투입하여 분리시킴으로써 물에 용해된 글리세린 등의 잡성분이 분리하였고, 이들 잡성분을 포함한 폐수용액은 별도의 배출라인을 통하여 글리세린 저장탱크로 배출하였으며, 최종적으로 히터장치인 증류기를 작동시켜 바이오디젤 속에잔류하는 1-2% 정도의 물을 증발시켜 날려 보내는 증류공정을 실시하여 최종적으로 바이오디젤을 수확하였다.

수확한 바이오디젤에 대한 GC-TOF-MS(Gas Chromatography/Time of flight/Mass spectrometry; GC-6890N,. Agilent Technologies, USA) 분석을 한 결과는 도9와 같다.

실시예 15. 분획된 지용성물질용액에서의 베타-카로틴의 분석

분획된 지용성물질용액에 있는 베타-카로틴의 함량을 워터스 스페리소브(Waters Spherisorb) S5 ODS2 카트리지 칼럼(4.6x250 mm)이 장착된 HPLC(Hewlett Packard Series model 1100)를 사용하여 측정하였다.

색소를 분리하기 위해 용매를 1.0ml/분의 속도로 흘려주면서 0 내지 1분 사이에는 아세토니트릴 90%, 증류수 9.99% 및 트리에틸아민이 0.01%, 2 내지 14분에는 아세토니트릴 86%, 증류수 8.99%, 트리에틸아민 0.01% 및 에틸아세테이트5%로 하였으며, 15 내지 21분 동안은 100% 에틸아세테이트를 사용하였다. 포스트런(post-run)은 처음 시작한 용매로 9분간 하였다. 레퍼런스(Jin et al., 2001. Biochim Biophys Acta 1506:244-2597)를 550nm로 한 경우 베타-카로틴 색소는 445nm에서 검출되었고, 베타-카로틴(DHI water and environment사, Denmark)을 정량한 표준곡선을 기초로 베타-카로틴의 양을 측정한 그 결과 8.72x10-10μM이었다.

실시예 16. 분획된 세포의 에탄올 발효

지용성물질용매수용장치(70)의 예인 발효기는 미생물발효기(INNO 200603, 이노바이오사, 한국)를 이용하여 구성하였다.

분획된 세포를 각각 제시된 양을 함유하는 GS-2 배지를 포함하는 배양관에서, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스를 증식시켰다.

GS-2 배지는 효모 추출물 6.0, 우레아 2.1, K₂HPO₄ 2.9, KH₂PO₄ 1.5, MOPS 10.0, 트리소디움 시트레이트 디하이드레이트 3.0, 시스테인 하이드로클로라이드 2.0(각각 g/L로 표시됨)을 포함한 것이었다. 배지의 초기 pH는 7.5 이고, 초기 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 농도는 0.8-1.1×10⁷ 세포/mL이고, 30℃의 N₂ 가스를 주입하면서 배양하였다.

분획된 세포의 발효 완료시 에탄올 농도를 결정하였다. 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스는 에탄올 발효와 동시에 수소를 발생시켰다. 에탄올 농도는 RI 검출기가 장착된 HPLC (Breeze HPLC system, Waters Co., USA)를 사용하여 분석하였으며, 칼럼은 Aminex HPX-87H(3007.8㎜, Bio-rad)를 사용하였다.

분획된 세포 밀도가 10 g/L일 때, 에탄올의 농도는 0.23-0.26%(v/v) 이었다. 분획된 세포 밀도가 20 g/L일 때, 에탄올의 농도는 0.42-0.54%(v/v)이었다.

분획된 세포 밀도가 40 g/L일 때, 에탄올의 농도는 0.92-1.20%(v/v)이었다. 에탄올 증류는 증류장치를 이용하여 수행하였다.

이런 결과는, 분획된 세포의 밀도가 증가함에 따라 에탄올의 농도가 증가하기 때문에, 더 높은 밀도의 분획된 세포 이 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스의 작용을 저해하지 않음을 나타낸다. 결국, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스가 분획된 세포 공급 원료의 화학적 전처리 및 셀룰라제 또는 다른 효소의 첨가 없이, 이들 셀룰로스 공급원료를 에탄올로 발효시킴을 알 수 있다.

실시예 17. 에탄올의 추출

에탄올 발효로 생성된 발효산물을 증류기로 이송하여 에탄올 증류하였다. 이 때 에탄올의 증발이 이루어지도록 오일배스를 작동시켜 에탄올의 증발온도 이상으로 가열시켰다. 가열시 물의 증발온도보다 높을 경우 수분이 증발되어 에탄올과 섞여 에탄올의 농도가 저하될 수 있으므로, 기화온도는 섭씨 78.3∼85℃ 사이에서 형성시켜 일정시간동안 가열하며, 고농도의 에탄올을 기화시킨 후 별도의 에탄올저장 탱크에서 응축하여 저장하였다.

실시예 18. 분획된 세포의 부탄올 발효

지용성물질용액수용장치(70)의 예인 발효기는 미생물발효기(INNO 200603, 이노바이오사, 한국)를 이용하여 구성하였다.

Clostridium thermocellum을 DSM 배지에서 온도 60℃, 혐기성조건, 150 rpm으로 교반하며 혐기배양하였다. 분획된 세포 을 5L의 발효장치로 이송하고 상기 C. thermocellum 세포배양용액(5%, v/v)을 접종한 후, 온도 60℃, 혐기성조건, 150 rpm으로 교반하며 3일간 배양하여 당화시켰다[Biotechnology Letters Vol 7 No 7 509∼514 (1985)]. 접종한 후에, 상기 세포배양용액에는 질소 기체를 주입하여 혐기성 조건을 유지하였다.

부탄올 발효를 위해 포자상태의 현탁액으로 있는 Clostridium acetobutylicum에 섭씨 80도에서 10분 동안 열을 가하였다. 그 후 배지 내에서 온도 37℃의 온도에서 혐기배양 하였다.

상기 발효기에 상기 C. acetobutylicum 세포배양용액(5%, v/v)을 접종한 후, 온도 37℃, 혐기성조건, 180 rpm 교반하면서 혐기성 부탄올 발효를 하였다. 발효 과정중에, 주기적으로 시료를 채취하여 미생물의 생장 및 부탄올 농도 분석을 수행하였다.

사용한 DSM 배지는 리터당 1.3g의 (NH4)2SO4, 2.6 g의 MgCl2·6H2O, 1.43 g의 KH₂PO₄, 7.2g의 K₂HPO₄·3H₂O, 0.13g의 CaCl₂·6H₂O, 1.1mg의 FeSO₄·7H₂O, 6.0g의 sodium β-glycerophosphate, 4.5g의 이스트 추출물(yeast extract), 10g의 탄소원(필터 페이퍼, 셀룰로스로 가공된 덩어리 또는 셀로바이오스), 0.25g의 환원된 글루타티온 및 1mg의 레사주린(resazurin)을 포함하였다. pH는 1M HCl 혹은 1 M NaOH으로 5.0에서 8.0까지 조정하였다.

C. acetobutylicum 배양 배지는 0.75g의 KH₂PO₄, 0.75g의 K₂HPO₄, 0.4g의 MgSO₄·H₂O, 0.01g의 MnSO₄·H₂O, 0.01g의 FeSO₄·7H₂O, 0.5g의 시스테인; 5g의 이스트 추출물, 2g의 아스파라긴·H₂O, 2g의 (NH₄)₂SO₄을 포함했다.

상기 연속 공정 후 미생물이 생산한 아세톤, 부탄올 및 에탄올은 FID(Flame Ionization Detector)가 장착된 가스크로마토그래피 (Agilent technology 6890N Network GC system)를 이용하여 정량하였으며, 컬럼은 HP-INNOWAX (30 cm x 250㎛ x 0.25㎛, Agilent technology)를 사용하였다. 시료 주입부 및 검출부의 온도는 250℃로, 오븐은 50℃에서 10℃/분의 속도로 170℃까지 상승하도록 설정하였다. 발효액에는 부탄올 13g/L, 아세톤 8g/L, 에탄올 0.5g/L 이 함유되었다.

실시예 19. 부탄올의 추출

이온성 액체인 BMIM-TFSI 이미드[1-부틸-3-메틸 이미다졸리움 비스(트리플루오로메틸설포닐)][1-butyl-3-methyl imidazolium bis(trifluoromethylsulfonyl) imide], 및 BMIM-PF6(1-부틸-3-메틸 이미다졸리움 헥사플루오로포스페이트)(1-butyl-3-methyl imidazolium hexafluorophosphate)를 이용하여 부탄올을 추출하였다. 상기 발효기에 있는 발효액에 BMIM-TFSI(시그마 알드리치, 미국) 동량으로 혼합한 혼합용액, 및 상기 발효액 동량으로 BMIM-PF6(시그마 알드리치, 미국)을 혼합한 혼합용액을 각각 볼텍싱하여 부탄올을 추출하였다. 이때 일반적인 이온성 액체 제조방법을 사용하여 제조한 것을 이용하는 것도 가능하다. 실험 결과 BMIM-TFSI를 사용한 경우에는 60±1%의 부탄올이 추출되었고, BMIM-PF6를 이용한 경우에는 64±1%의 부탄올이 추출되었음을 확인하였다.

실시예 20. 분획된 세포 에서 유기산 발효

지용성물질용매수용장치(70)의 예인 발효기는 미생물발효기(INNO 200603, 이노바이오사, 한국)를 이용하여 구성하였다.

젖산발효균주인 Lactobacillus brevis subsp. brevis)는 PYG 세포배양용액(배지조성은 1 리터당 펩톤 20.0g, 포도당 5.0g, 이스트파우터 10.0g, NaCl 0.08g, Cysteine hydrochloride 0.5g, Calcium chloride 0.008g, MgSO4 0.008g, K2HPO4 0.04g, KH2PO4 0.04g, Sodium bicarbonate 0.4g, pH 7.1-7.3) 을 포함하는 배양기에서 증식시킨 후, 원심분리방법으로 수확하여 0.085% 식염수로 세척하였다. 이를 이송된 세포 이 있는 발효장치에 접종하였다. 배지의 초기 pH는 7.2 이고, 초기 젖산발효균주 0.8 1.1×10⁸ 세포/mL이고, 30℃의 N2 가스를 주입하면서 배양하였다. 분획된 세포의 발효 완료시 유기산인 말산(malate), 젖산(lactate), 초산(acetate), 구산(citrate) 및 낙산(butyrate) 농도를 결정하였다.

유기산인 말산, 젖산, 초산 및 구산의 농도는 Platinum EPS C18 유기산 분석컬럼 (250mm X 4.6mm, 5μm)이 있는 HPLC (HP placard, Japan)로 측정하였으며 pH 2.4에서 0.05M KH2PO4로 하였다. 낙산은 CP 58 Wax (FFAP) (30cm X 0.25mm ID, 0.25 μm) 컬럼을 사용하여 가스 크로마토크래프 (HP placard, Japan)로 분석하였다.

그 결과는 말산, 젖산, 초산, 구산 및 낙산이 각각 870.30±13.15, 746.16±8.91, 4,233.23±76.06, 318.04±47.75 및 1.99±1.99 mM의 농도로 있었다.

이런 결과는, 젖산발효균주가 분획된 세포 공급 원료의 화학적 전처리 및 셀룰라제 또는 다른 효소의 첨가없이, 이들 셀룰로스 공급원료를 젖산으로 발효시킴을 알 수 있다.

실시예 21. 젖산의 추출

상기 발효액에 Ca(OH)₂를 첨가하여 pH 10로 조정한 후 가열함으로써, 젖산칼슘(Ca-lactate)의 용해도를 증가시키고, 젖산균을 사멸시키고, 단백질을 응고시켰다. 이를 고온에서 여과하여 젖산칼슘으로 회수하고 냉각하여 젖산칼슘을 침전시켰다. 고온에서 젖산칼슘을 용해시킨 후, 황산을 처리하여 CaSO₄가 침전되어 젖산을 회수하였다.

1: 본 발명의 방법이 적용된 예시적인 시스템
10: 배양장치
20: 용매장치
30: 혼합장치
40: 분리장치
50: 분획장치
60: 세포수용장치
70: 지용성물질용매수용장치
80: 세포순환라인
90: 용매순환라인
100: 반응장치
300: 세포농축장치
400: 세포숙성장치
500: 통합분리장치

Claims (18)

1. 지용성물질을 함유하는 세포를 배양하는 세포배양과정;
   상기 세포의 배양환경을 변화시켜서, 상기 세포의 상기 지용성물질이 용해되는 지용성물질추출용매가 상기 세포 속으로 더 용이하게 투과되고 상기 세포가 상기 지용성물질의 함량을 증가하도록, 상기 세포를 변화시키는 세포숙성과정;
   상기 지용성물질추출용매와 숙성된 상기 세포의 세포배양용액을 혼합한 혼합용액에서, 상기 세포가 상기 지용성물질추출용매에 접촉되게 함으로써, 상기 세포의 상기 지용성물질을 상기 지용성물질추출용매에 용해시키는 지용성물질 용해과정;
   상기 지용성물질이 용해된 상기 세포를 상기 혼합용액으로부터 분리하는 세포분리과정;
   상기 세포가 분리된 잔여의 상기 혼합용액을, 상기 지용성물질추출용매에 상기 지용성물질이 용해된 지용성물질용액과 물로 분획하는 분획과정; 및
   분리된 상기 세포와 분획된 상기 지용성물질용액을 각각 수득하는 수득과정;
   을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 세포배양과정에서 상기 세포를 농축하는 세포농축과정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 세포숙성과정은, 상기 세포배양용액의 pH를 1 내지 6.5의 범위로 유지함으로써, 상기 세포를 숙성시키는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 세포숙성과정은, 상기 세포배양용액에 제한영양소원의 부재 또는 과도한 부족 상태로 탄소원을 첨가함으로써, 상기 세포를 숙성시키는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법.
5. 제4항에 있어서,
   상기 제한영양소원이 질소원, 탄소원, 인산염원, 비타민원, 미량 금속원, 다량 금속원, 실리카원 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 영양소원을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 세포숙성과정은, 상기 세포배양용액의 용존산소를 저하시킴으로써, 상기 세포를 숙성시키는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 지용성물질 용해과정을 실행한 후에, 상층에 층분리된 상기 지용성물질용액을 하층에 층분리된 상기 세포배양용액에 분사 또는 교반의 방법으로 혼합함으로써, 상기 세포의 상기 지용성물질을 상기 지용성물질추출용매에 더 용해시키는 지용성물질 재용해과정을 1회 이상 실행하는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 분리과정에서 분리한 상기 세포에 대해 상기 세포배양과정과 상기 세포숙성과정을 다시 실행하고, 재숙성된 상기 세포배양용액을 상기 지용성물질추출용매 또는 분획된 상기 지용성물질용액과 혼합 및 접촉시켜 상기 세포의 상기 지용성물질을 상기 지용성물질추출용매에 더 용해시키는 과정과 그 이후 과정을 반복하되, 상기 세포의 재배양, 상기 세포의 재숙성, 상기 지용성물질의 재용해, 상기 세포의 재분리, 및 상기 지용성물질용액의 재분획을 1회 이상 다수회 행함으로써, 최종적으로 목적하는 고밀도의 상기 세포와, 목적하는 농축된 상기 지용성물질이 포함된 상기 지용성물용액을 수득하는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   유기성폐기물을 발효시켜 유기성폐수와 바이오가스를 생산하고, 저분자유기산을 포함하는 상기 유기성폐수를, 상기 세포배양과정에서의 상기 세포의 영양물질로 사용하여 상기 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법.
10. 제9항에 있어서,
    상기 유기성폐수를 TCOD가 100 내지 10,000 ㎎/ℓ이고, 질소 농도가 100 내지 800 ㎎/ℓ가 되게 희석하여, 상기 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법.
11. 제9항에 있어서,
    상기 세포숙성과정은, 상기 유기성폐수의 질소 농도를 100 ㎎/ℓ 이하가 되게 질소원을 제거함으로써, 상기 세포를 숙성시키는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법.
12. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 지용성추출용매는 탄화수소 용매인 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법.
13. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 세포배양과정에서 생성되어 상기 세포배양용액으로 분비되는 상기 세포의 생장을 저해하는 요소를 상기 세포배양용액으로부터 제거하는 저해요소제거과정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법.
14. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 세포분리과정은, 상기 혼합용액에 중력침강 또는 초음파공명장을 적용하여, 상기 혼합용액으로부터 상기 지용성물질이 용해된 상기 세포를 분리하는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법.
15. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    숙성된 상기 세포배양용액과 상기 지용성물질추출용매를 혼합할 때, 상기 혼합용액을 진동 분쇄하는 과정 및 상기 혼합용액을 교반하는 과정 중 적어도 하나의 과정을 실행하여, 상기 세포배양용액과 상기 지용성물질추출용매의 접촉을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법.
16. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    숙성된 상기 세포배양용액과 상기 지용성물질추출용매 또는 상기 지용성물질용액를 혼합하기에 앞서, 상기 지용성물질추출용매 또는 지용성물질용액를 진동 분쇄하면서 다수의 구멍을 이용하여 분사하는 과정, 및 상기 혼합용액을 교반하는 과정 중 적어도 하나의 과정을 실행하여, 상기 세포배양용액과 상기 지용성물질추출용매의 접촉을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법.
17. 제2항에 있어서,
    상기 세포농축과정은, 상기 세포배양용액에 초음파공명장 또는 중력침강을 인가함으로써, 상기 세포를 농축하는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법.
18. 삭제

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