KR101251191B1 - 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법 및 장치 - Google Patents
세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법 및 장치 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법 및 장치에 관한 것이다. 본 발명의 방법은, 지용성물질을 함유하는 세포를 배양하는 과정; 상기 지용성물질이 용해되는 지용성물질추출용매와 상기 세포의 배양액을 혼합하여 상기 지용성물질추출용매를 상기 세포배양액에 접촉시킴으로써 상기 세포의 상기 지용성물질을 상기 지용성물질추출용매에 용해시키는 과정; 상기 혼합액에 초음파공명장 또는 중력침강을 적용함으로써, 상기 혼합액으로부터 세포를 응집, 정체 및 분리하는 과정; 상기 세포가 분리된 나머지 용액을, 상기 지용성물질추출용매에 상기 지용성물질이 용해된 지용성물질-용매와 물로 분획하는 과정; 및 분리된 상기 세포와 상기 지용성물질-용매를 각각 수득하는 과정; 을 포함한다.
Description
본 발명은 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법 및 장치에 관한 것이며, 보다 상세하게는 세포배양액으로부터 손상 없는 세포와 지용성물질을 저비용 고효율로 생산하는 방법 및 장치에 관한 것이다.
배양된 세포로부터 얻어지는 각종 바이오매스는 건강기능성 식품 및 의약제품의 원료물질 등 다양하게 사용되고 있으며, 사료, 대체에너지의 원료물질의 생산, 생화학물질의 생산 등으로 그 이용성이 확대되고 있다.
바이오매스 대량 생산의 경제성은 세포배양의 대형화에 의해 확보된다. 예를 들어 전통적인 회분발효(bach fermentation)의 경우는 교반탱크(stirred tank) 혹은 에어리프트 발효기(airlift fermenters)의 크기에 따라 그 경제성이 결정된다.
연속관류배양(continuous perfusion)은 세포가 발효기에 남아 있는 상태에서 생산물은 포함하되 세포가 없는 용액을 연속적으로 수확하는 방식이며, 발효기에 연속적으로 새로운 배지를 공급하는 상태로 수주 혹은 수개월 동안 세포를 배양할 수 있는 기술로서, 고농도의 세포 배양이 가능하고, 기질을 생산물로 전환하는 비율이 높으며, 발효기 사용시간이 효율적이기 때문에, 소형 발효기를 사용하여 소기의 목적을 달성할 수 있다.
연속관류배양은 세포가 생산물이 포함된 배지와 분리되면서, 세포는 발효기로 이동하고 나머지는 수확되는 공정으로 구성된다. 이때 세포의 분리는 세포가 물리적인 충격에 민감하므로 매우 정교해야 하고, 멸균상태에서 작동하여야 하며, 공정상의 문제가 없어야 한다. 또한, 디자인이 단순하고, 견고하며 경제적 규모 확장이 가능하고 위생적이며 위험한 유기체를 배양할 수 있도록 밀폐되어야 한다.
연속관류배양에서 바이오리액터나 발효기에서 배양된 세포의 정체 및 분리는 초음파공명장장치(Ultrasound resonance field), 중력침강장치(Gravitational settling devices), 스핀필터장치, 여과막 및 원심분리기 등을 이용한다.
초음파공명장이나 중력침강을 이용한 세포분리장치는, 간단한 장치만으로 매우 적은 전력을 소모하면서 거의 영구적으로 세포분리기능을 수행할 수 있는 장치이며, 가장 큰 장점은 다른 기계적인 장치의 부가 없이도 세포를 손상 없이 유지하면서 분리할 수 있다는 것이다.
세포의 분리에 초음파공명장이나 중력침강의 적용으로 기존의 여과막을 사용할 때 야기되었던 문제점들을 극복할 수 있다. 예를 들어, 종래 여과막 방식은 장기간 사용할 때 막의 막힘 현상으로 막을 교체해야하는 번거로움이 있으나, 초음파공명장이나 중력침강을 이용한 장치는 이런 불편을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 막의 오염을 방지할 수 있어 장기간 사용에 대해 안정성을 갖고 있다.
그리고 기존의 세포 회수방법의 하나인 원심분리는 발효기를 온라인 시스템(on-line system)에 적용하기 어려운 반면에 초음파공명장이나 중력침강은 온라인 시스템에 적용 가능하며, 또한 초음파공명장이나 중력침강을 세포의 분리장치로 적용하면 발효기의 온라인정화(on-line clarification)와 관류배양(perfusion culture)이 가능하게 된다. 따라서 초음파공명장장치나 중력침강장치를 세포나 세포외 산물의 회수에 적용하면 종래의 초여과와 마이크로여과를 이용하는 공정을 대체할 수 있을 것으로 기대된다.
초음파공명장이나 중력침강을 이용한 세포나 미생물의 분리는, 매우 적은 전력을 사용하기 때문에 미생물이나 세포의 생사에 거의 영향을 주지 않는 것으로 알려져 있고, 식물세포, 곤충세포, 동물세포 등의 고농도 배양을 위한 관류배양에서 세포를 사멸 없이 유지하기 위한 장치로 사용되고 있으며, 단클론항체의 생산을 위한 연속적인 관류배양에도 사용되고 있다.
각종 세포는 1차 대사산물인 지질, 단백질, 탄소화물 뿐만 아니라, 2차 대사산물인 생리활성물질도 매우 다양하게 함유하고 있다. 세포로부터 획득할 수 있는 가장 풍부한 물질은 단백질이나, 단백질은 주로 세포자체를 이용한다는 측면에서 고려되어야 할 성분이고, 세포가 생산하는 물질을 이용한다는 측면에서 본다면, 지질, 탄소화물, 색소, 비타민, 미네랄 및 특수 성분을 획득할 수 있다. 또한 탄수화물, 단백질, 핵산, 그리고 지질 등의 합성과 분해 과정에서 나타나는 중간대사물질과 대사의 조절 과정에 관여하는 물질들도 세포의 필수 화합물이라 할 수 있으므로, 이들 화합물도 세포로부터 획득할 수 있다.
식물체에는 생존에 필수적이 아닌 화합물(주로 이차대사산물)도 다수 존재하며, 지금까지 10만 종 이상이 알려졌는바, 이런 화합물은 한 가지의 화합물이 몇 종 또는 몇 과의 식물에만 분포하는 경우가 많다. 이차대사산물은 구조와 합성 과정에 따라 크게 알칼로이드(alkaloid), 페놀성 화합물(phenolic compound), 테르펜(terpene), 기타 화합물 등으로 나눌 수 있다.
세포 바이오매스로부터 여러 유용물질을 얻는 종래의 추출법은, 세포의 생장에 저해를 주는 과정인 원심분리, 여과 및 건조공정을 통해 최대한 수분을 제거한 다음 세포파쇄 공정을 걸쳐 유용물질을 분리·정제하는 것이다.
그러나 이러한 종래의 추출법은 탈수과정 및 추출과정에서 세포가 파괴되어 다른 유용한 물질들이 유출 및 소실되어 재배양을 하거나 세포를 재사용하는데 어려움이 있으며, 대규모 배양시 복잡한 공정단계로 높은 운전비용 등의 문제점을 가지고 있다.
본 발명자는 세포(미세조류)로부터 유용물질을 추출하는 종래 방법의 문제점을 해소하고자, 대한민국 특허출원 제10-2010-0043955호(2010. 05. 11 출원)의 '미세조류 배양에 의한 바이오연료 추출 방법 및 장치' 및 대한민국 특허출원 제10-2010-0059100호(2010. 06. 22 출원)의 '미세조류 배양을 통한 고밀도 미세조류 및 농축된 지용성물질 생산 방법 및 장치'를 제안한바 있다.
본 발명의 목적은, 지용성물질을 함유한 세포배양액을 지용성물질추출용매와 혼합하여 세포의 지용성물질이 지용성물질추출용매에 용해되도록 하고, 혼합액을 세포분리장치에 적용하여 세포를 응집, 정체 및 분리한 다음, 세포가 제거된 나머지 용액을 물과 지용성물질-용매(지용성물질이 지용성물질추출용매에 용해된 용액)로 분획한 후에, 바람직하게 분리된 세포를 재배양함과 아울러 재배양된 세포를 지용성물질추출용매 또는 분획된 지용성물질-용매와 재접촉하는 과정을 필요한 만큼 반복하는 과정을 통해, 최종적으로 목적하는 정도의 밀도를 가진 세포와 함께 목적하는 정도로 농축된 지용성물질이 포함된 지용성물질-용매를 획득하여, 전자의 세포는 바이오화합물, 의약품, 건강기능성 식품, 바이오연료 및 단백질가수분해산물 등의 생산에 사용할 수 있도록 하고, 후자의 지용성물질-용매로부터 추출된 지용성물질은 의약품, 건강기능성 식품, 바이오디젤 등의 생산에 사용할 수 있도록 하는, 세포배양을 통해 저비용으로 세포손상이 없는 세포와 지용성물질을 높은 수율로 생산하는 방법과 장치를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명에 따라, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법 및 장치가 제공된다.
본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법은, 지용성물질을 함유하는 세포를 배양하는 과정; 상기 지용성물질이 용해되는 지용성물질추출용매와 상기 세포의 배양액을 혼합하여 상기 지용성물질추출용매를 상기 세포배양액에 접촉시킴으로써 상기 세포의 상기 지용성물질을 상기 지용성물질추출용매에 용해시키는 과정; 상기 혼합액으로부터 세포를 응집, 정체 및 분리하는 과정; 상기 세포가 분리된 나머지 용액을, 상기 지용성물질추출용매에 상기 지용성물질이 용해된 지용성물질-용매와 물로 분획하는 과정; 및 분리된 상기 세포와 상기 지용성물질-용매를 각각 수득하는 과정; 을 포함한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법은, 상기 혼합액에 초음파공명장을 적용함으로써 상기 혼합액에서 상기 세포를 분리하거나, 상기 혼합액에 중력침강을 적용함으로써 상기 혼합액에서 상기 세포를 분리한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법은, 상기 분리된 상기 세포를 재배양하고, 재배양된 상기 세포 배양액을 상기 지용성물질추출용매 또는 분획된 상기 지용성물질-용매와 혼합 및 접촉시켜 상기 세포의 상기 지용성물질을 상기 지용성물질추출용매에 더 용해시키는 과정, 및 그 이후 과정을 반복하되, 상기 세포의 재배양, 상기 지용성물질의 재용해, 상기 세포의 재분리, 및 상기 지용성물질-용매의 재분획을 1회 이상 다수회 함으로써, 최종적으로 목적하는 고밀도의 상기 세포와, 목적하는 농축된 상기 지용성물질이 포함된 상기 지용성물질-용매를 수득한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법은, 상기 세포 배양액과 상기 지용성물질 추출용매를 혼합할 때, 상기 세포 배양액을 진동 분쇄하는 과정 및 혼합액을 교반하는 과정 중 적어도 하나의 과정을 실행하여, 상기 세포 배양액과 상기 지용성물질 추출용매의 접촉을 증가시킨다.
본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 장치는, 지용성물질을 함유하는 세포를 배양하는 배양조; 상기 지용성물질이 용해되는 지용성물질추출용매를 저장하는 용매조; 상기 배양조로부터의 상기 세포의 배양액과 상기 용매조로부터의 상기 지용성물질추출용매를 혼합하는 혼합조; 세포분리장치를 구비하고, 상기 혼합조로부터의 혼합액으로부터 상기 세포를 응집, 정체 및 분리하는 분리조; 상기 세포가 분리된(제거된) 상기 분리조로부터의 용액을, 상기 지용성물질추출용매에 상기 세포배양액의 상기 지용성물질이 용해된 지용성물질-용매와 물로 분획하는 분획조; 상기 분리조로부터 분리된 상기 세포를 수용 또는 처리하는 세포-수용장치; 및 상기 분획조로부터 분획한 상기 지용성물질-용매를 수용 또는 처리하는 지용성물질-수용장치; 를 포함한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 장치에서, 상기 세포분리장치는, 상기 혼합액에 초음파공명장을 적용하여 상기 혼합액에서 상기 세포를 분리하는 초음파공명장 발생장치, 및 상기 혼합액에 중력침강을 적용하여 상기 혼합액에서 상기 세포를 분리하는 중력침강장치 중에 적어도 하나의 장치이다.
바람직하게, 본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 장치는, 상기 분리조로부터의 분리된 상기 세포를 상기 배양조로 순환하는 세포-순환라인; 및 상기 분획조로부터의 분획된 상기 지용성물질-용매를 상기 용매조로 순환하는 용매-순환라인; 을 더 포함한다. 여기에서 상기 세포-수용장치는, 상기 세포-순환라인을 통해 상기 배양조에서 1회 또는 2회 이상 재배양한 후에 상기 분리조로부터 최종 분획한 고밀도의 상기 세포를 수용 또는 처리하고; 상기 지용성물질-수용장치는, 상기 용매-순환라인을 통해 상기 분획조에서 1회 또는 2회 이상 재분획한 후에 상기 분획조로부터 최종 분획한 농축된 상기 지용성물질-용매를 수용 또는 처리한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 장치는, 상기 배양조의 상기 세포배양액과 상기 용매조의 지용성물질추출용매를 상기 혼합조로 일정량 공급하는 제1 연동펌프; 상기 분리조에서 분리된 상기 세포를 그 밀도에 따라 선택적으로 상기 세포-순환라인을 통해 상기 배양조로 이송하거나 상기 세포-수용장치로 이송하는 제2 연동펌프; 및 상기 분획조에서 분획된 상기 지용성물질-용매를 그 농축도에 따라 상기 용매조로 이송하거나 상기 지용성물질-수용장치로 이송하는 제3 연동펌프; 를 포함한다.
바람직하게, 본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 장치는, 상기 혼합조에, 상기 세포 배양액과 상기 지용성물질 추출용매의 접촉을 증가시키도록, 상기 세포 배양액을 진동 분쇄하는 진동분쇄장치 및 상기 혼합액을 교반하는 교반장치 중 적어도 하나의 장치를 더 포함한다.
본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법 및 장치에 있어서, 바람직하게, 상기 지용성물질추출용매는 탄화수소 용매이다.
본 발명에서의 '지용성물질'은 기름에 녹는 물질로 인지질, 유리지방산, 지방산의 에스테르, 트리아실글리세롤, 스테롤 및 스테롤 에스테르, 카로테노이드, 크산토필(예를 들어, 옥시카로테노이드), 탄화수소, 알칼로이드, 페놀성 화합물, 테르펜, 이소프레노이드-유도 화합물 및 기타 기름에 녹는 여러 가지 물질을 포함하는 것이다.
본 발명에 있어서 상기 세포는 동물세포, 식물세포, 곰팡이, 규조류, 와편모조강, 착편모조류, 남조강, 홍조강, 녹조강, 원핵생물 등을 포함한다.
본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법 및 장치는, 지용성물질을 함유한 세포의 배양액을 지용성물질추출용매와 혼합하여 세포의 지용성물질이 지용성물질추출용매에 용해되도록 하고, 혼합액을 세포분리장치에 적용하여 세포를 분리시키고, 세포가 제거되고 남은 용액을 지용성물질-용매와 물로 분획하는 과정을 통해, 세포손상 없는 세포와 함께 지용성물질이 포함된 지용성물질-용매를, 별도의 분리 전처리가 필요 없이 고밀도와 고농도로 획득하는 방법 및 장치로서, 저렴한 운전비용으로 높은 생산 수율로 세포손상이 없는 세포와 지용성물질을 획득할 수 있는 효과가 있으며, 이로써 바이오화합물, 의약품, 건강기능성 식품, 바이오연료 및 단백질가수분해산물 등의 생산에 사용할 수 있는 세포(바이오매스)와, 의약품, 건강기능성 식품, 바이오디젤 등의 생산에 사용할 수 있는 지용성물질의 생산성을 극대화할 수 있다.
본 발명에 따른 장치와 방법은, 세포분리장치를 통해 분리된 세포를 재배양하여 재배양된 세포에 대해 세포를 분리하고 지용성물질을 추출하는 이후의 과정을 필요한 만큼 반복적으로 실행함으로써, 세포와 지용성물질이 포함된 지용성물질-용매를, 고밀도와 고농도로 획득할 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 장치는, 탈수과정이 필요한 종래 기술의 배양, 수확 및 추출법과는 달리, 연동 펌프들을 이용한 반복적인 재배양, 재분리 및 재분획 과정을 통해, 고밀도 세포와 농축된 지용성물질을 저렴하게 생산할 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 장치는, 세포를 파괴시키지 않는 상태로 지용성물질을 추출하므로, 세포내 다른 유용 성분들의 유실을 방지할 수 있어 지용성물질이 추출된 세포의 유용성이 향상되며, 순환 반복 배양으로 세포의 생산성을 극대화시킬 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 장치는, 세포 배양액과 지용성물질추출용매의 효과적인 접촉을 통해, 지용성물질과 세포의 생산 수율을 더욱 향상시킬 수 있다.
도1은 본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법이 적용되는 예시적인 장치의 개략도,
도2는 본 발명에 적용되는 예시적인 세포분리장치(중력침강장치)의 개략도,
도3은 지용성물질추출용매가 세포의 생존에 미치는 영향을 보여주는 그래프,
도4는 세포로부터 지용성물질 추출에 미치는 지용성물질추출용매(알칸)와 진동분쇄의 효과를 보여주는 그래프,
도5는 세포로부터 지용성물질 추출에 미치는 지용성물질추출용매(알칸)와 초음파공명장의 효과를 보여주는 그래프,
도6은 본 발명에 의해 세포에서 추출한 바이오디젤에 대한 GC-TOF-MS 분석 결과 그래프.
도2는 본 발명에 적용되는 예시적인 세포분리장치(중력침강장치)의 개략도,
도3은 지용성물질추출용매가 세포의 생존에 미치는 영향을 보여주는 그래프,
도4는 세포로부터 지용성물질 추출에 미치는 지용성물질추출용매(알칸)와 진동분쇄의 효과를 보여주는 그래프,
도5는 세포로부터 지용성물질 추출에 미치는 지용성물질추출용매(알칸)와 초음파공명장의 효과를 보여주는 그래프,
도6은 본 발명에 의해 세포에서 추출한 바이오디젤에 대한 GC-TOF-MS 분석 결과 그래프.
이하, 본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법 및 장치를 보다 상세히 설명한다. 이하의 구체예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 아니한다.
먼저, 도1을 참조하여 본 발명에 따른 세포 배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 장치(1)를 설명한다.
도1에 예시된 바와 같이, 본 발명에 따른 장치(1)는, 기본적으로 배양조(10), 용매조(20), 혼합조(30), 분리조(40), 분획조(50), 세포-수용장치(80) 및 지용성물질-수용장치(90)를 포함하며, 바람직하게 세포-순환라인(60) 및 용매-순환라인(70)을 더 포함한다.
상기 배양조(10)는 세포를 배양하고 배양된 세포배양액을 다음 공정으로 공급하는 장치이다. 배양조(10)는 세포를 배양하기에 적당한 시스템을 폭넓게 사용할 수 있다. 배양조(10)에는, 연못, 인공적인 노지 배양시설물, 바이오리액터(bioreactors), 플라스틱 백(plastic bags), 튜브(tubes), 발효조(fermentors), 쉐이크 플라스크(shake flasks), 공기압 리프트 칼럼(air lift columns) 등이 포함되며, 세포를 배양할 수 있는 것이라면 그 형식에 제한이 없다. 배양방법은 독립영양배양 혹은 종속영양배양을 단독으로 하거나, 독립영양배양 후에 종속영양배양 또는 종속영양배양 후에 독립영양배양을 할 수 있다.
상기 용매조(20)는 세포배양액의 세포에 함유된 지용성물질을 추출하기 위한 지용성물질추출용매를 저장 및 공급하는 장치이다.
상기 혼합조(30)는, 배양조(10)로부터의 세포배양액과 용매조(20)로부터의 지용성물질추출용매를 균일하게 혼합하여 양자가 접촉되도록 함으로써 세포배양액의 세포에 함유된 지용성물질이 지용성물질추출용매에 용해된 지용성물질-용매가 생성되도록 하는 장치이다. 바람직하게, 혼합조(30)는 세포배양액과 지용성물질추출용매를 대략 5:1비율로 혼합한다.
바람직하게, 혼합조(30)에는 진동분쇄장치(31)를 장착하여 세포 배양액을 진동분쇄할 수 있다. 바람직한 진동분쇄장치(31)는 초음파로 배양액을 처리하는 것이다. 진동분쇄는 분자 집합체를 분리하거나 투과시키기 위해 분자집합체를 분쇄한다. 진동분쇄는 세포 배양액을 작은 입자로 만들어 세포가 더 많은 지용성물질추출용매에 노출(접촉)되도록 하여 지용성물질의 추출효율을 향상시킨다.
진동분쇄장치(31)와 함께 또는 진동분쇄장치(31)를 대신하여 세포배양액과 지용성물질추출용매의 혼합액을 교반하여 주는 교반장치(32)를 설치할 수 있으며, 교반장치(32)도 세포 배양액과 지용성물질추출용매의 접촉을 증가시켜 지용성물질의 추출효율을 향상시킨다.
바람직하게, 배양조(10)의 세포배양액과 용매조(20)의 지용성물질추출용매는 제1 연동펌프(2)를 통해 정해진 유량으로 혼합조(30)로 이송된다.
이를 위해, 배양조(10)로부터의 라인(11)과 용매조(20)로부터의 라인(21)은 각각 제1 연동펌프(2)에 각각 연결되고, 제1 연동펌프(2)로부터의 라인(33)은 혼합조(30)에 연결된다.
상기 분리조(40)는 혼합조(30)로부터의 라인(34)을 통해 혼합조(30)로부터 이송된 혼합액에 예를 들어 초음파공명장 또는 중력침강 등을 적용한 연속관류배양을 실행하여 지용성물질이 추출된 세포배양액의 세포들이 서로 응집되도록 함으로써 혼합액으로부터 세포들이 응집, 정체 및 분리되도록 하는 장치이며, 이를 위해 분리조(40)에는 세포분리장치(40a)가 설치되어 있다.
분리조(40)에 설치되는 세포분리장치(40a)로서는 초음파공명장에 의해 세포를 분리하는 초음파공명장 발생장치(41) 또는 중력침강에 의해 세포를 분리하는 중력침강장치(46)를 적용할 수 있다.
상기 초음파공명장 발생장치(41)로서는 예를 들어 어쿠스틱세포필터(41)(Acoustic Cell Filter)(Nature Biotechnology 12, 281 - 284 (1994)를 적용할 수 있다. 초음파공명장 발생장치(41)는 혼합액에 초음파공명장(Ultrasonic Resonance Field)을 가하여 세포가 응집 및 분리되도록 한다. 이런 초음파공명장 발생장치(41)는, 예를 들어 미국특허 5711888(1998. 01. 27 등록)의 'Mutilayered plezoelectric resonator for the separation of suspended particles'를 참조할 수 있다.
도1에 예시된 어쿠스틱세포필터(41)는, 어쿠스틱챔버(Acoustic chamber; 42), 초음파 발진기(Generator; 43), 초음파 진동자(Transducer; 44) 그리고 반사막(Reflector; 45)을 포함하며, 혼합액의 세포들에 대해 초음파공명장을 가하여 세포들이 초음파공명장 내에서 응집되어 응집체(aggregates)를 형성하도록 한다.
분리조(40)에 어쿠스틱세포필터와 같은 초음파공명장 발생장치(41)를 설치함에 따라, 초음파 발진기(43)의 작용으로 초음파 진동자(44)에 의해 제1 진행파를 발생시키고, 초음파 진동자(44)로부터 반사막(45)에 가해진 제1 진행파는 반사막(45)에서 역방향으로 반사하여 제2 진행파를 발생시키며, 결국 초음파 진동자(44)에서 발생한 제1 진행파와 반사막(45)에서 반사되어 반대방향으로 진행하는 제2 진행파가 어쿠스틱챔버(42)에서 충돌하여, 초음파 진동자(44)와 반사막(45) 사이에 정재파(standing wave)를 발생시킨다. 정재파는 서로 반대방향에서 나오는 두 개의 독립적인 진행파(traveling wave)가 합쳐져 형성한다.
이와 같은 초음파의 정재파는, 일정 거리 이격하여 서로 마주보게 설치된 초음파 진동자(예, 압전 트랜스듀서: piezoelectric transducer)와 반사막(45)의 구조나, 일정 거리 이격하여 서로 마주보게 설치된 두 개의 독립적인 초음파 진동자로부터 발생시킬 수 있다.
초음파의 정재파는 마디(node: 절)와 배(antinode) 부분을 가지게 되는데 이러한 초음파의 정재파의 압력진폭(pressure amplitude)은 배 부분에서 가장 크며 마디에서 최소값을 갖고 하나의 파장에 두 번씩 나타난다. 이렇게 형성된 초음파공명장 내에서 입자, 세포 또는 방울(droplet)의 불연속성(discontinuity) 때문에 초음파공명장에는 위치 의존성 음향에너지(position-dependent acoustic potential energy)를 형성한다. 이러한 현상에 의해 세포는 음향에너지(acoustic potential energy)가 가장 낮은 곳으로 이동하여 초음파의 정재파에 포집(entrapment)된다. 이로써 세포는 파장의 절반의 위치마다 존재하는 압력절점(pressure node)에 포집된다. 이렇게 포집된 입자들은 정상파 내부에서 응집되어 응집체(aggregates)를 형성한다.
다른 초음파공명장 발생장치(41)로서는, 상부유리기판의 양끝에 연결되어 있으며 외부로부터의 전기적 입력을 기계적 진동으로 변환하여 상기 상부유리기판에 가하는 압전 트랜스듀서, 및 상기 상부유리기판과 평행한 하부기판 상에 배열된 하나 혹은 N개의 전극을 포함하되, 상기 상부유리기판과 상기 하부기판의 사이는 세포가 혼합된 유체로 채워지고, 상기 각 전극은 상기 압전 트랜스듀서의 길이 방향과 수직인 방향으로 놓여져 있으며, 상기 N개의 전극들은 상기 압전 트랜스듀서의 길이 방향을 따라 일정 간격으로 배열되어 있는 세포분리장치를 적용할 수 있다(도시 생략).
이런 세포분리장치에 의하면, 상기 압전 트랜스듀서에 의해 상기 상부유리기판에 가해진 진동은 상기 상부유리기판을 진행하는 표면파를 발생시키고, 표면파의 진행방향과 반대방향으로 진행하는 다른 표면파와 충돌하여, 유체 내의 세포 등의 입자를 상기 압전 트랜스듀서의 길이 방향과 수직이면서, 상기 상부유리기판에 수직인 방향으로 움직이는 정재파(standing wave)를 발생시킨다. 상기 표면파에 의해 상기 유체 내에는 상기 상부유리기판에서 상기 하부기판으로 진행하는 어쿠스틱(acoustic)파를 발생시키고, 상기 어쿠스틱파는 상기 하부기판에서 반사되어 상기 상부유리기판으로 반사되면서 상기 유체 내에 초음파공명장을 생성시킨다.
상기 중력침강장치(46)는 세포와 배지의 침강속도(sedimentation velocity)의 차이, 장치내 용액이 흐르는 관의 기울기 및 전자기 진동자(Electromagnetic vibrator) 등을 이용하여 세포를 응집시켜 정체 및 분리시킨다. 이런 중력침강장치(46)로서는 예를 들어 Cell settler(Biotechnology Solutions 사, USA)를 사용할 수 있다.
도2에 예시한 중력침강장치(46)는 내부에 일정 간격을 두고 일정한 경사를 이루는 다수 층의 경사판(46a)을 복수개 설치한 구성으로서, 도시된 구체예에서 경사판(46a)은 상부와 하부의 2단으로 구성되어 있다. 경사판(46a)들은 상하 일정 간격의 상부, 중간 및 하부 거치프레임(46b)에 의해 지지된다. 상부의 경사판(46a)과 하부의 경사판(46a)은 서로 엇갈리게 설치되며, 이는 유하되는 유속을 감소시켜 세포의 침전효율을 향상시키기 위함이다.
혼합조(30)로부터의 세포배양액과 지용성물질추출용매의 혼합액은, 라인(34)에 연결된 유입구(46c)를 통해 중력침강장치(46)로 유입되어 침강과정을 거치게 된다. 경사판(46a)의 후단에는 침강된 세포를 수집 후 배출시키기 위한 세포수집부(46d)가 설치되어 있고, 세포수집부(46d)에 수집된 세포는 세포수집부(46d)에 설치된 세포배출구(46e)를 통해 외부로 배출된다. 침강 완료된 세포가 제거된 용액은 상측의 유출웨이(46f)를 넘어 용액배출구(46g)를 통해 흘러나가 다음 처리단계로 넘어가게 된다.
바람직하게, 중력침강장치(46)에는 진동발생부(46h)가 설치되어 경사판(46a)을 좌ㅇ우로 유동시킴으로써 경사판 내측에 응집 및 정체된 세포를 효과적으로 분리하도록 할 수 있다.
도1에 도시된 구체예에 있어서는, 혼합조(30)와 분리조(40)를 별도의 분리된 구성으로 구축한 예를 도시하였지만, 점선으로 표시된 바와 같이 혼합조(30)와 분리조(40)를 그 기능이 통합된 하나의 반응조(100)로 통합 구성하는 것도 가능하다.
상기 분획조(50)는, 분리조(40)로부터의 라인(51)을 통해 분리조(40)로부터 이송된 세포가 제거된 용액을, 지용성물질-용매(층)(세포 배양액의 지용성물질이 지용성물질추출용매에 용해된 용액)와 물로 분획하기 위한 장치이다. 즉, 분획조(50)에서는 분리조(40)로부터의 용액이 상층의 지용성물질-용매(층)와 하층의 물로 분획된다.
이후에 설명하는 바와 같이, 분리조(40)에서 분리된 세포는 세포-수용장치(80)로 이송되어 이후의 목적하는 용도에 사용되고, 분획조(50)에서 분획된 상층의 지용성물질-용매(층)는 지용성물질-수용장치(90)로 이송되어 이후의 목적하는 용도에 사용된다.
선택적으로 부가할 수 있는 상기 세포-순환라인(60)은, 분리조(40)의 하층에 분리된 세포를 선택적으로 다시 배양조(10)로 순환하는 라인이다. 즉, 바람직한 실시예에서, 분리조(40)의 세포는 세포-수용장치(80)로 이송되거나 세포-순환라인(60)을 통해 배양조(10)로 재공급된다.
선택적으로 부가할 수 있는 상기 용매-순환라인(70)은, 분획조(50)에서 상층에 분획된 지용성물질-용매를 선택적으로 다시 용매조(20)로 순환하는 라인이다. 즉, 바람직한 실시예에서, 분획조(50)의 지용성물질-용매는 지용성물질-수용장치(90)로 이송되거나 용매-순환라인(70)을 통해 용매조(20)로 재공급된다.
순환된 세포는 배양조(10)에서 재배양되고, 재배양된 세포와 용매조(20)의 지용성물질추출용매 또는 순환된 지용성물질-용매가 다시 혼합조(30)에 공급 및 혼합되어 세포로부터의 지용성물질의 용해가 더욱 진행된 후에, 그 혼합액이 다시 분리조(40) 및 분획조(50)에 공급됨으로써 앞서와 같이 세포의 분리 및 지용성물질-용매의 분획이 반복적으로 실행된다.
바람직하게, 이런 세포의 재배양/재분리 및 지용성물질-용매의 재분획은, 세포가 목적하는 정도의 밀도로 고밀도화되고 지용성물질-용매에 용해된 지용성물질이 목적하는 정도로 농축될 때까지 1회 또는 2회 이상 다수회 반복할 수 있다.
상기 세포-수용장치(80)는 분리조(40)에서 1번 분리된 세포를 바로 이송 받거나 또는 세포-순환라인(60)을 순환하면서 1회 이상 재배양된 세포가 목적하는 정도의 밀도로 고밀도화 되었을 때 해당 고밀도 세포를 분리조(40)로부터 이송 받아, 이후의 목적하는 처리를 위해 일시 수용하거나 목적하는 처리를 하는 장치이다.
예를 들어, 세포-수용장치(80)에서는 고밀도 세포를 에탄올발효, 부탄올발효, 유기산발효 등 각종 처리를 하여 세포로부터 바이오화합물, 의약품, 건강기능성 식품, 바이오연료 및 단백질가수분해산물 등 각종 유용물질을 생산하거나, 이런 유용물질을 생산하기 위한 처리장치에 보내기에 앞서 일시 수용한다.
예를 들어, 세포-수용장치(80)에서 에탄올발효와 같은 각종 발효를 실행하는 경우라면 세포-수용장치(80)는 발효조가 되고, 세포-수용장치(80)가 별도의 발효조로 보내기 전에 일시적으로 고밀도 세포를 저장하는 경우라면 세포-수용장치(80)는 저장조가 된다.
상기 지용성물질-수용장치(90)는 분획조(50)에서 1번 분획된 지용성물질-용매를 바로 이송 받거나, 용매-순환라인(70)을 순환하면서 분획조(50)에서 1회 이상 재분획된 지용성물질-용매의 지용성물질이 목적하는 정도의 농도로 농축되었을 때 지용성물질-용매를 분획조(50)로부터 이송 받아서, 이후의 목적하는 처리를 위해 일시 수용하거나 목적하는 처리를 하는 장치이다.
예를 들어 지용성물질-수용장치(90)는, 지용성물질-용매로부터 지용성물질을 추출하고 각종 처리를 하여 지용성물질로부터 의약품, 건강기능성 식품, 바이오디젤 등의 각종 유용물질을 생산하거나 이런 유용물질을 생산하기 위한 처리장치에 보내기에 앞서 일시 수용한다.
예를 들어, 지용성물질-수용장치(90)에서 지용성물질-용매로부터 지용성물질을 추출하고 추출된 지용성물질로부터 바이오디젤을 생산하는 경우라면 지용성물질-수용장치(90)는 증류-바이오디젤 생산조가 되고, 별도의 증류-바이오디젤 생산조로 지용성물질-용매를 보내기 전에 일시 저장하는 경우라면, 지용성물질-수용장치(90)는 저장조가 된다.
바람직하게, 본 발명의 장치(1)는, 분리조(40)에서 ·분리된 세포를 그 밀도에 따라 선택적으로 세포-순환라인(60)을 통해 배양조(10)로 이송하거나 세포-수용장치(80)로 이송하는 제2 연동펌프(3)를 포함한다. 이를 위해, 분리조(40)와 배양조(10) 사이의 세포-순환라인(60)에는 제2 연동펌프(3)가 설치되고, 제2 연동펌프(3)로부터 추가의 라인(81)은 세포-수용장치(80)에 연결된다.
바람직한 구체예에서, 이와 같은 제2 연동펌프(3)의 작용으로 분리조(40)의 세포의 밀도가 목적하는 밀도에 이르지 못하면 세포는 반복적으로 배양조(10)로 순환되어 1회 이상 반복적으로 재배양, 세포의 지용성물질 용해, 세포의 분리가 진행되고, 목적하는 밀도에 이르면 세포-수용장치(80)로 이송된다.
바람직하게, 본 발명의 장치(1)는 분획조(50)에서 분획된 지용성물질-용매를 그 농축도에 따라 용매조(20)로 이송하거나 지용성물질-수용장치(90)로 이송하는 제3 연동펌프(4)를 포함한다. 이를 위해, 분획조(50)와 용매조(20) 사이의 용매-순환라인(70)에 제3 연동펌프(4)가 설치되고, 제3 연동펌프(4)로부터 추가의 라인(91)이 지용성물질-수용장치(90)에 연결된다.
바람직한 구체예에서, 이와 같은 제3 연동펌프(4)의 작용으로 분획조(50)의 지용성물질-용매의 지용성물질의 농도가 목적하는 농도에 이르지 못하면 지용성물질-용매는 다시 용매조(20)로 순환되어 1회 이상 재분획에 사용되고, 목적하는 농도에 이르면 지용성물질-수용장치(90)로 이송된다.
이하, 도1 내지 도6을 참조하여 본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법을 설명한다.
1. 세포의 (고밀도)배양
배양조(10)에서 배양하는 세포는, 식물세포, 곰팡이, 규조류, 와편모조강, 착편모조류, 남조강, 홍조강, 녹조강, 원핵생물 등을 포함한다.
예를 들어 본 발명에는 Chlorella protothecoides를 이용할 수 있다. C. protothecoides는 대부분의 미세조류보다 10배 이상의 세포 밀도로 배양이 가능하여 바이오매스 확보 차원에 매우 적절하다. C. protothecoides는 종속영양상태인 이상적인 조건에서 최대 35 gfw/L의 수율로 바이오매스를 수확할 수 있으며, 바이오매스의 대략 55%를 지용성물질로 저장할 수 있다.
세포에 의한 지용성물질의 비교적 일정한 생산 속도를 가정하면, 보다 높은 생물량 밀도는 부피당 생산되는 유용물질의 총량을 보다 많게 할 것임은 당연하다. 세포를 성장시키기 위한 현재의 통상적인 발효 방법은 약 50 내지 약 80 g/L 또는 그 미만의 생물량 밀도를 생성한다.
본 발명자는 본 발명의 방법을 적용함으로써, 현재 공지된 생물량 밀도보다 유의하게 더 높은 생물량 밀도를 달성할 수 있음을 발견하였다.
바람직하게, 본 발명의 방법은 적어도 약 100 g/L, 더 바람직하게 적어도 약 130 g/L, 더 바람직하게 적어도 약 150 g/L, 더욱 더 바람직하게 적어도 약 170 g/L, 가장 바람직하게는 200 g/L 를 초과하는 세포의 생물량 밀도를 달성한다.
따라서, 그러한 높은 세포의 생물량 밀도에서, 세포의 유용물질 생산 속도가 약간 감소되더라도, 부피당 전체 유용물질 생산 속도는 현재 공지된 공정보다 유의하게 더 높다.
바람직한 구체예에서 본 발명의 방법은, 세포를 배양한 후, 1차적으로 세포배양액과 지용성물질추출용매의 혼합, 세포의 응집/분리 이후에, 분리된 세포를 재배양하고 재배양된 세포를 다시 지용성물질추출용매 혹은 지용성물질-용매(세포 배양액의 지용성물질이 지용성물질추출용매에 용해된 용액)와 혼합, 응집 및 재분리하는 과정을 필요에 따라 다수회 반복적으로 수행하며, 이로써 세포배양액의 세포가 목적하는 밀도가 될 정도로 세포를 고밀도 배양하여 높은 생산성을 확보한다.
C. protothecoides는 글루코오스 또는 옥수수 감미료 가수분해물(CSH)에 종속 영양적으로 성장할 수 있다. 종속영양성장은 지용성물질 함량을 증가시키고, 태양 에너지에 대한 직접적 의존성을 감소시킬 수 있다. C. protothecoides로부터 생산된 바이오디젤의 에너지 밀도는 석유 기반 디젤과 실질적으로 동등하다. Chlorella는 분자생물적인 방법으로 엔지니어링하기 용이하고 강화된 CO2로 대규모 포토바이오렉터에서 배양이 가능하다.
2. 세포에서 지용성물질의 추출
세포를 이용한 바이오매스 및 유용물질 생산에 관련된 주요 비용은 큰 부피의 배양액으로부터 세포를 수확하는 과정에서 발생한다. 세포 배양액으로부터 세포를 수확하고 건조한 후 파괴하여 지용성물질을 추출하는 과정을 포함하는 종래의 지용성물질 생산 방법에서, 이런 과정에 소요되는 비용이 전체 비용의 40-60%를 차지한다.
종래의 방법은 지용성물질을 추출하는 과정에서 세포가 파괴되어 지용성물질을 제외한 다른 생체분자를 수확하기 어려우나, 본 발명은 저비용의 비파괴적인 재순환 배양에 의해 이런 종래의 문제점을 완화 및 극복한다.
본 발명에 사용하는 지용성물질추출용매는, 지용성물질에 대해 선택성이 높고, 생물학적으로 적합하여 세포 활성에 커다란 손실 없이 세포와 접촉할 수 있는 용매로서, 일반적으로 옥탄올 개수(log Poct, 옥탄올 물 분할 계수의 로그)가 5이상이다(Dodecanone은 이 규칙에서 예외이다). 옥탄올 개수 4-5인 용매 중에 헥산(hexane), 헵탄(heptane)은 세포에 유독하고, 데칸올(decanol), 다이펜틸 에테르(dipentyl ether)는 세포에 무해하다.
본 발명에 적용할 수 있는 예시적인 지용성물질추출용매로서는, 1,12-도데칸디오익 산 디에틸 에테르(1,12-dodecanedioic acid diethyl ether), n-헥산(n-hexane), n-헵탄(n-heptane), n-옥탄(n-octane), n-도데칸(n-dodecane), 초산 도데실(dodecyl acetate), 데칸(decane), 다이헥실 에테르(dihexyl ether), 이소파(isopar), 1-도데칸올(1-dodecanol), 1-옥탄올(1-octanol), butyoxyethoxyehteane, 3-옥타논(3-octanone), 고리형 파라핀(cyclic paraffins), 바솔(varsol), 이소파라핀(isoparaffins), 분지형의 알칸(branched alkane), 올레일 알코올(oleyl alcohol), dihecylether, 2-도데칸(2-dodecane) 등이 포함된다.
본 발명에 사용되는 지용성물질추출용매는, C4-C16 탄화수소 1개 이상을 포함할 수 있고, C10, C11, C12, C13, C14, C15 또는 C16 개의 탄화수소를 포함할 수 있다.
진동분쇄장치(31)에 의한 세포 손상 없는 미생물에의 초음파조사는, 저주파에서 양-의존적(dose-dependent)이다. 주파수가 증가하면, 긴 조사시간에도 미생물이 생존한다. 세포 활성에 영향이 없고 지용성물질의 추출을 최적화할 수 있는 주파수 법위(20 kHz ~ 1 MHz)에서 적절하게 세분된 주파수범위 및 다른 노출시간에 따른 강도를 결정하는 연구를 수행하여 다양한 다른 주파수, 강도와 노출되는 시간 등이 추출 효율에 영향을 줌을 알았다.
적정주파수 범위(20 kHz ~ 60 kHz)에서 다른 노출시간에 따른 이상적인 강도로 세포에 손상 없이 지용성물질의 추출을 최적화하기 위해 이용될 수 있다. 즉, 주파수, 강도와 노출시간 등이 지용성물질 추출효율에 영향을 미친다. 세포 크기, 세포 형상, 세포벽 조성물 그리고 생리학적 상태가 세포와 초음파의 상호작용에 복합적으로 영향을 주기 때문에 이상적인 지용성물질의 추출을 위해 20 kHz와 1 MHz, 20-100 kHz, 20-60 kHz, 30-50 kHz, 또는 40 kHz 등의 다양한 주파수 중 이상적인 주파수를 결정하여 사용할 수 있다. 지용성물질추출용매와 진동분쇄의 적절한 조합으로, 거의 100%까지 지용성물질(세포 총 지방산의 10%)의 추출효율을 달성할 수 있다.
진동분쇄 대신에 세포 배양액과 지용성물질 추출용액 혼합액을 교반장치(32)로 교반할 경우에도 세포 배양액과 지용성물질추출용매의 접촉을 증가(개선)시킴으로써, 진동분쇄와 같이 지용성물질 추출효율을 향상시킬 수 있다. 물론 진동분쇄와 교반을 함께 실행하는 것도 가능하다.
3. 세포손상이 없는 세포의 응집, 정체 및 분리
분리조(40)에는 세포에 손상을 주지 않으면서도 정교하고 효율적으로 세포 이동, 응집, 정체 및 분리를 수행할 수 있도록 하는 연속관류배양의 세포분리장치(40a)가 설치된다. 세포분리장치(40a)로서는 전술한 바와 같은 초음파공명장이 적용되는 초음파공명장 발생장치(41) 또는 중력침강이 적용되는 중력침강장치(46)를 적용할 수 있다.
예를 들어 초음파공명장 발생장치(41)를 세포분리장치(40a)로 적용할 경우에, 지용성물질추출용매와 초음파공명장의 초음파 진동수, 초음파 진동자(44)와 반사막(45) 간의 거리 등의 적절한 조합으로, 거의 100%까지 지용성물질(세포 총 지방산의 10%)의 추출효율을 달성할 수 있다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법을 설명한다.
실시예 1. 세포의 배양
Chlorella protothecoides를 프로테오스 사면한천(proteose agar slant)에 유지하면서 본 발명에 사용하였다.
기본배지의 성분은 1 리터당 KH2P04(0.7g), K2HPO4(0.3g), MgSO4·7H2O( 0.3g), FeSO4·7H2O(3mg). 우레아(1g), Arnon's A Solution(1 ml), thiamine hvdrochloride(10 ㎍), pH 6.3.이었다. 배양은 5 % CO2, 20도, 15,000 lux 형광등에서 실행하였다.
Arnon's A5 용액의 조성은 리터당 H3BOS3(2.9g), MnCl2·4H2O(1.8g), ZnSO4·7H2O(0.22g), CuSO4· 5H2O(0.08g), MoO3(0.018g) 이었다.
Chlorella protothecoides의 종속영양 배양은 기본배지에서 0.1% 우레아 대신에 0.01% 우레아를 및 4.0% 포도당을 첨가하여 수행했다.
실시예 2. 세포에 미치는 지용성물질추출용매의 효과
C. protothecoides 배양액에 C10 내지 C16 알칸(alkanes)의 지용성물질추출용매를 5:1비율로 5분간 처리한 후, 분획된 C. protothecoides 용액 1 ml을 1/100,000배 희석하여 1.5% 아가 플레이트에 도말하여 형성된 콜로니를 계수하여 지용성물질추출용매가 C. protothecoides의 생존에 미치는 영향을 평가하였으며, 그 결과는 도3과 같으며, 지용성물질추출용매가 세포의 생존에 아무런 영향이 없었음을 알 수 있다.
실시예 3. 세포의 지용성물질 추출에 미치는 지용성물질추출용매 및 초음파진동분쇄의 효과
C. protothecoides의 생장율이 로그구간에 있는 배양액과 헥산(hexane)과 데칸(decane) 용매(지용성물질추출용매)를 5:1비율로 5분간 처리한 후, 수조에서 2초간 40 kHz로 진동 분쇄하였다.
지용성물질추출용매로 추출된 지용성물질은 비누화되었으며 유리 지방산을 C17을 표준으로 하여 LC-MS 분석하여 측정하였다. 그 결과는 도4와 같으며, 10%의 총세포 지방산이 5분간의 지용성물질추출용매 혼합과 추가적인 2초간의 진동 분쇄로 추출되었다. 짧은 진동 분쇄가 지용성물질 추출 정도를 75% 정도 증가시켰다.
실시예 4. 세포의 지용성물질 추출에 미치는 지용성물질추출용매 및 초음파공명장의 효과
C. protothecoides의 생장율이 로그구간에 있는 배양액과 헥산(hexane) 혹은 데칸(decane) 용매(지용성물질추출용매)를 5:1비율로 5분간 처리한 후, 어쿠스틱세포필터(41)가 작동하는 분리조(40)로 이송하여 세포를 분리하고, 연속적으로 분획조(50)로 이송하여 지용성물질-용매를 분획하였다.
어쿠스틱세포필터(41)는, 도1에 도시된 바와 같은, 어쿠스틱챔버(42), 3MHz 초음파 발진기(43), 초음파 진동자(44) 그리고 반사막(45)으로 구성된 것을 사용하였다. 어쿠스틱챔버(42)는 아크릴관을 이용하여 제작하였고, 반사막(45)으로는 유리를 사용하였다. 어쿠스틱챔버(42)에서 초음파공명장에 의한 세포 응집이 일어나는 것을 확인할 수 있었다.
지용성물질추출용매로 추출된 지용성물질은 비누화되었으며 유리 지방산을 C17을 표준으로 하여 LC-MS 분석하여 측정하였다. 그 결과는 도5와 같으며, 10%의 총세포 지방산이 5분간의 지용성물질추출용매 혼합과 어쿠스틱세포필터의 처리로 추출되었다. 어쿠스틱세포필터(41)가 지용성물질 추출 정도를 75% 정도 증가시켰다.
실시예 5. 세포의 정체, 분리 및 지용성물질-용매의 분획
5L의 배양조(10)에서 교반속도, 150 rpm, 조도 15,000 lux 하 혹은 암반응하 에서 C. protothecoides를 로그구간까지 배양하였다.
배양조(10)의 세포배양액과 용매조(20)의 데칸(decane) 용매(지용성물질추출용매)를 혼합조(30)로 이송하되 5:1비율로 이송하여 이들을 혼합시켰다.
결과의 혼합액을 초음파공명장 발생장치(41)로서의 어쿠스틱세포필터 혹은 중력침강장치(46)로서의 CS 10 Cell settler(Biotechnology Solutions 사, USA)가 작동하는 분리조(40)로 이송하였으며, 이때 세포는 응집되어 세포응집체를 형성하면서 아래로 침강하였다. 침강하여 정체 및 분리된 세포를 제외한 나머지 용액을 연속적으로 분획조(50)로 이송하여 분획하였으며, 이로써 지용성물질-용매(층)와 물(층)이 상하로 분획되었다.
이후 분리조(40)의 세포는 세포-순환라인(60)을 통해 배양조(10)로 이송하고 배양액을 첨가하여 재배양하였고, 분획조(50)의 지용성물질-용매(층)는 용매-순환라인(70)을 통해 용매조(20)로 이송하였다.
실시예 6. 세포의 (고밀도)재배양
실시예 5로부터 획득한, 지용성물질을 추출한 후에 분리된 세포에 대해 재배양을 실행하여 분석한 결과, 즉 지용성물질 추출로 지용성물질추출용매에 의해 저해를 받은 세포배양액을 배양조(10)로 이송하여 재배양한 결과, 성장 속도가 0.028 g/h로 나타났다.
배양조에서의 일반적인 발효조 배양의 경우 성장 속도가 약 0.033 g/h 인 것과 비교하면 동시 추출 후 균주의 재배양하는 것에는 문제가 없다는 결과를 얻었다.
상기 배양, 혼합, 분리 및 분획 과정을 1일 1회 실시하거나, 일일 1회식 2~20회 반복하여 세포를 50~200 gfw/L의 밀도로 배양하고 농축된 지용성물질이 포함된 지용성물질-용매를 확보하였다. 이와 같은 분리, 분획 및 배양 과정을 반복함에 따라 세포의 밀도 및 지용성물질이 매 단계마다 2~3 배 증가하여 포화됨을 확인하였다.
실시예 7. 분획된 지용성물질-용매에서 지방산의 추출
지용성물질인 지방산의 추출은 지용성물질-수용장치(90)의 예에 해당하는 둥근 바닥형 플라스크가 부착된 Buchi 210/215 회전식 증발기(rotovapor)(스위스, Buchi사)를 사용하였다. 분획된 지용성 물질-용매를 증발기로 이송하여 둥근 바닥형 플라스크 안에 위치하게 하였다. 차가운 원수는 응축 장치로 유입되고 증류 플라스크의 오일 배스는 174℃에 세팅하였다.
증류가 시작했을 때, 가스 데칸(decane)이 기구를 통과하여 콘덴서에 유입되고 액체 상태로 수용 플라스크에 모였다. 증류가 종결될 때, 수용 플라스크에 회수된 데칸(decane)의 부피 및 증류 플라스크 내에 남겨진 세포 기원 지용성물질의 부피를 측정하고 C17을 표준으로 하여 LC-MS 분석하여 측정하였다. 회수된 데칸용매는 용매조(20)로 이송하여 재사용하였다.
실시예 8. 세포 지방산에서 바이오디젤 추출
메탄올과 가성소다를 교반하여 메톡시드(methoxide)를 제조하고, 제조된 메톡시드를 교반기에 투입하고 교반하여, 추출된 세포 지용성물질과 메톡시드를 반응시켜 바이오디젤과 글리세린 및 비누 고형성분을 형성하였다. 이들 생성물들을 원심분리기에 공급하여 원심 분리시키고, 각각의 비중 차이에 의해 상부에는 바이오디젤이 위치되고 하부에는 비중이 무거운 글리세린 및 비누 성분이 위치되게 상하 분리시켰다.
이와 같이 분리되어 하부에 위치된 글리세린과 비누 성분은 별도의 글리세린 저장탱크로 배출하였고, 상부에 위치된 바이오디젤과 바이오디젤 량의 2배 정도의 물을 교반기에 투입하여 교반시킴으로써, 바이오디젤 안에 포함되어 있는 글리세린과 비누성분 및 메탄올 성분이 물에 용해시키고, 이와 같이 교반된 용액을 다시 원심분리기에 투입하여 분리시킴으로써 물에 용해된 글리세린 등의 잡성분이 분리하였고, 이들 잡성분을 포함한 폐수용액은 별도의 배출라인을 통하여 글리세린 저장탱크로 배출하였으며, 최종적으로 히터장치인 증류기를 작동시켜 바이오디젤 속에 잔류하는 1~2% 정도의 물을 증발시켜 날려 보내는 증류공정을 실시하여 최종적으로 바이오디젤을 수확하였다.
수확한 바이오디젤에 대한 GC-TOF-MS(Gas Chromatography/Time of flight/Mass spectrometry; GC-6890N,. Agilent Technologies, USA) 분석을 한 결과는 도6과 같다.
실시예 9. 분획된 지용성물질-용매에서 베타-카로틴의 분석
상기에서 분획된 지용성물질-용매에 있는 베타-카로틴의 함량을 워터스 스페리소브(Waters Spherisorb) S5 ODS2 카트리지 칼럼(4.6x250 mm)이 장착된 HPLC(Hewlett Packard Series model 1100)를 사용하여 측정하였다.
색소를 분리하기 위해 용매를 1.0ml/분의 속도로 흘려주면서 0 내지 1분 사이에는 아세토니트릴 90%, 증류수 9.99% 및 트리에틸아민이 0.01%, 2 내지 14분에는 아세토니트릴 86%, 증류수 8.99%, 트리에틸아민 0.01% 및 에틸아세테이트5%로 하였으며, 15 내지 21분 동안은 100% 에틸아세테이트를 사용하였다. 포스트 런(post-run)은 처음 시작한 용매로 9분간 하였다. 레퍼런스(Jin et al., 2001 Biochim Biophys Acta 1506:244-2597)를 550nm로 한 경우 베타-카로틴 색소는 445nm에서 검출되었으며, 베타-카로틴(DHI water and environment사, Denmark)을 정량한 표준곡선을 기초로 베타-카로틴의 양을 측정한 그 결과 8.72x10-10μM이었다.
실시예 10. 분획된 세포의 에탄올 발효
세포-수용장치(80)의 예인 발효기는 미생물발효기(INNO 200603, 이노바이오사, 한국)를 이용하여 구성하였다. 분획된 세포를 각각 제시된 양을 함유하는 GS-2 배지를 포함하는 배양관에서, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스를 증식시켰다.
GS-2 배지는 효모 추출물 6.0, 우레아 2.1, K2HPO4 2.9, KH2PO4 1.5, MOPS 10.0, 트리소디움 시트레이트 디하이드레이트 3.0, 시스테인 하이드로클로라이드 2.0(각각 g/L로 표시됨)을 포함한 것이었다. 배지의 초기 pH는 7.5 이고, 초기 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 농도는 0.8 ~ 1.1×107 세포/mL이고, 30℃의 N2 분위기 하에서 배양하였다.
분획된 세포의 발효 완료시 에탄올 농도를 결정하였다. 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스는 에탄올 발효와 동시에 수소를 발생시켰다. 에탄올 농도는 RI 검출기가 장착된 HPLC (Breeze HPLC system, Waters Co., USA)를 사용하여 분석하였으며, 칼럼은 Aminex HPX-87H(3007.8㎜, Bio-rad)를 사용하였다.
분획된 세포 밀도가 10 g/L일 때, 에탄올의 농도는 0.23 ~ 0.26%(v/v) 이었다. 분획된 세포 밀도가 20 g/L일 때, 에탄올의 농도는 0.42 ~ 0.54%(v/v)이었다. 분획된 세포 밀도가 40 g/L일 때, 에탄올의 농도는 0.92 ~ 1.20%(v/v)이었다. 에탄올 증류는 증류조를 이용하여 수행하였다.
이런 결과는, 분획된 세포의 밀도가 증가함에 따라 에탄올의 농도가 증가하기 때문에, 더 높은 밀도의 분획된 세포 이 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스의 작용을 저해하지 않음을 나타낸다. 결국, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스가 분획된 세포 공급 원료의 화학적 전처리 및 셀룰라제 또는 다른 효소의 첨가 없이, 이들 셀룰로스 공급원료를 에탄올로 발효시킴을 알 수 있다.
실시예 11. 에탄올의 추출
에탄올 발효로 생성된 발효산물을 증류기로 이송하여 에탄올 증류하였다. 이때 에탄올의 증발이 이루어지도록 오일배스를 작동시켜 에탄올의 증발온도 이상으로 가열시켰다. 가열시 물의 증발온도보다 높을 경우 수분이 증발되어 에탄올과 섞여 에탄올의 농도가 저하될 수 있으므로, 기화온도는 섭씨 78.3∼85℃ 사이에서 형성시켜 일정시간동안 가열하며, 고농도의 에탄올을 기화시킨 후 별도의 에탄올저장탱크에서 응축하여 저장하였다.
실시예 12. 분획된 세포의 부탄올 발효
세포-수용장치(80)의 예인 발효기는 미생물발효기(INNO 200603, 이노바이오사, 한국)를 이용하여 구성하였다.
Clostridium thermocellum을 DSM 배지에서 온도 60℃, 혐기성조건, 150 rpm으로 교반하며 혐기배양하였다. 분획된 세포 을 5L의 발효조(50)로 이송하고 상기 C. thermocellum 배양액(5%, v/v)을 접종한 후, 온도 60℃, 혐기성조건, 150 rpm으로 교반하며 3일간 배양하여 당화시켰다[Biotechnology Letters Vol 7 No 7 509-514 (1985)]. 접종한 후에, 상기 배양액에는 질소 기체를 주입하여 혐기성 조건을 유지하였다.
부탄올 발효를 위해 포자상태의 현탁액으로 있는 Clostridium acetobutylicum에 섭씨 80도에서 10분 동안 열을 가하였다. 그 후 배지 내에서 온도 37℃의 온도에서 혐기배양 하였다.
상기 발효기에 상기 C. acetobutylicum 배양액(5%, v/v)을 접종한 후, 온도 37℃, 혐기성조건, 180 rpm 교반하면서 혐기성 부탄올 발효를 하였다. 발효 과정 중에, 주기적으로 시료를 채취하여 미생물의 생장 및 부탄올 농도 분석을 수행하였다.
사용한 DSM 배지는 리터당 1.3g의 (NH4)2SO4, 2.6 g의 MgCl2·6H2O, 1.43 g의 KH2PO4, 7.2g의 K2HPO4·3H2O, 0.13g의 CaCl2·6H2O, 1.1mg의 FeSO4·7H2O, 6.0g의 sodium β-glycerophosphate, 4.5g의 이스트 추출물(yeast extract), 10g의 탄소원(필터 페이퍼, 셀룰로스로 가공된 덩어리 또는 셀로바이오스), 0.25g의 환원된 글루타티온 및 1mg의 레사주린(resazurin)을 포함하였다. pH는 1M HCl 혹은 1 M NaOH으로 5.0에서 8.0까지 조정하였다.
C. acetobutylicum 배양 배지는 0.75g의 KH2PO4, 0.75g의 K2HPO4, 0.4g의 MgSO4·H2O, 0.01g의 MnSO4·H2O, 0.01g의 FeSO4·7H2O, 0.5g의 시스테인; 5g의 이스트 추출물, 2g의 아스파라긴·H2O, 2g의 (NH4)2SO4을 포함했다.
상기 연속 공정 후 미생물이 생산한 아세톤, 부탄올 및 에탄올은 FID(Flame Ionization Detector)가 장착된 가스크로마토그래피 (Agilent technology 6890N Network GC system)를 이용하여 정량하였으며, 컬럼은 HP-INNOWAX (30 cm x 250㎛ x 0.25㎛, Agilent technology)를 사용하였다. 시료 주입부 및 검출부의 온도는 250℃로, 오븐은 50℃에서 10℃/분의 속도로 170℃까지 상승하도록 설정하였다. 발효액에는 부탄올 13g/L, 아세톤 8g/L, 에탄올 0.5g/L 이 함유되었다.
실시예 13. 부탄올의 추출
이온성 액체인 BMIM-TFSI 이미드[1-부틸-3-메틸 이미다졸리움 비스(트리플루오로메틸설포닐)][1-butyl-3-methyl imidazolium bis(trifluoromethylsulfonyl) imide], 및 BMIM-PF6(1-부틸-3-메틸 이미다졸리움 헥사플루오로포스페이트)(1-butyl-3-methyl imidazolium hexafluorophosphate)를 이용하여 부탄올을 추출하였다. 상기 발효기에 있는 발효액에 BMIM-TFSI(시그마 알드리치, 미국) 동량으로 혼합한 혼합액, 및 상기 발효액 동량으로 BMIM-PF6(시그마 알드리치, 미국)을 혼합한 혼합액을 각각 볼텍싱하여 부탄올을 추출하였다. 이때 일반적인 이온성 액체 제조 방법을 사용하여 제조한 것을 이용하는 것도 가능하다. 실험 결과 BMIM-TFSI를 사용한 경우에는 60ㅁ1%의 부탄올이 추출되었고, BMIM-PF6를 이용한 경우에는 64±1%의 부탄올이 추출되었음을 확인하였다.
실시예 14. 분획된 세포 에서 유기산 발효
세포-수용장치(80)의 예인 발효기는 미생물발효기(INNO 200603, 이노바이오 사, 한국)를 이용하여 구성하였다. 젖산발효균주인 Lactobacillus brevis subsp. brevis)는 PYG 배양액(배지조성은 1 리터당 펩톤 20.0g, 포도당 5.0g, 이스트파우터 10.0g, NaCl 0.08g, Cysteine hydrochloride 0.5g, Calcium chloride 0.008g, MgSO4 0.008g, K2HPO4 0.04g, KH2PO4 0.04g, Sodium bicarbonate 0.4g, pH 7.1-7.3)을 포함하는 배양기에서 증식시킨 후, 원심분리방법으로 수확하여 0.085% 식염수로 세척하였다. 이를 이송된 세포 이 있는 발효조(50)에 접종하였다. 배지의 초기 pH는 7.2 이고, 초기 젖산발효균주 0.8 ~ 1.1×108 세포/mL이고, 30℃의 N2 가스를 주입하면서 배양하였다. 분획된 세포의 발효 완료시 유기산인 말산(malate), 젖산(lactate), 초산(acetate), 구산(citrate) 및 낙산(butyrate) 농도를 결정하였다.
유기산인 말산, 젖산, 초산 및 구산의 농도는 Platinum EPS C18 유기산 분석 컬럼 (250mm X 4.6mm, 5μm)이 있는 HPLC (HP placard, Japan)로 측정하였으며 pH 2.4에서 0.05M KH2PO4로 하였다. 낙산은 CP 58 Wax (FFAP) (30cm X 0.25mm ID, 0.25μm) 컬럼을 사용하여 가스 크로마토크래프 (HP placard, Japan)로 분석하였다.
그 결과는 말산, 젖산, 초산, 구산 및 낙산이 각각 870.30+13.15, 746.16+8.91, 4,233.23+76.06, 318.04+47.75 및 1.99+1.99 mM의 농도로 있었다.
이런 결과는, 젖산발효균주가 분획된 세포 공급 원료의 화학적 전처리 및 셀룰라제 또는 다른 효소의 첨가없이, 이들 셀룰로스 공급원료를 젖산으로 발효시킴을 알 수 있다.
실시예 15. 젖산의 추출
상기 발효액에 Ca(OH)2를 첨가하여 pH10로 조정한 후 가열함으로써, 젖산칼슘(Ca-lactate)의 용해도를 증가시키고, 젖산균을 사멸시키고, 단백질을 응고시켰다. 이를 고온에서 여과하여 젖산칼슘으로 회수하고 냉각하여 젖산칼슘을 침전시켰다. 고온에서 젖산칼슘을 용해시킨 후, 황산을 처리하여 CaSO4가 침전되어 젖산을 회수하였다.
1: 본 발명의 장치 2: 제1 연동펌프
3: 제2 연동펌프 4: 제3 연동펌프
10: 배양조 11, 21, 33, 34, 51, 81, 91: 라인
20: 용매조 30: 혼합조
31: 진동분쇄장치 32: 교반장치
40: 분리조 40a: 세포분리장치
41: 초음파공명장 발생장치(어쿠스틱세포필터)
42: 어쿠스틱챔버 43: 초음파 발진기
44: 초음파 진동자 45: 반사막
46: 중력침장장치 46a: 경사판
46b: 거치프레임 46c: 유입구
46d: 세포수집부 46e: 세포배출구
46f: 유출웨이 46g: 용액배출구
46h: 진동발생부 50: 분획조
60: 세포-순환라인 70: 용매-순환라인
80: 세포-수용장치 90: 지용성물질-수용장치
3: 제2 연동펌프 4: 제3 연동펌프
10: 배양조 11, 21, 33, 34, 51, 81, 91: 라인
20: 용매조 30: 혼합조
31: 진동분쇄장치 32: 교반장치
40: 분리조 40a: 세포분리장치
41: 초음파공명장 발생장치(어쿠스틱세포필터)
42: 어쿠스틱챔버 43: 초음파 발진기
44: 초음파 진동자 45: 반사막
46: 중력침장장치 46a: 경사판
46b: 거치프레임 46c: 유입구
46d: 세포수집부 46e: 세포배출구
46f: 유출웨이 46g: 용액배출구
46h: 진동발생부 50: 분획조
60: 세포-순환라인 70: 용매-순환라인
80: 세포-수용장치 90: 지용성물질-수용장치
Claims (10)
- 지용성물질을 함유하는 세포를 배양하는 과정;
상기 지용성물질이 용해되는 지용성물질추출용매와 상기 세포의 배양액을 혼합하여 상기 지용성물질추출용매를 상기 세포배양액에 접촉시킴으로써 상기 세포의 상기 지용성물질을 상기 지용성물질추출용매에 용해시키는 과정;
상기 혼합액에 초음파공명장 또는 중력침강을 적용함으로써, 상기 혼합액으로부터 세포를 응집, 정체 및 분리하는 과정;
상기 세포가 분리된 나머지 용액을, 상기 지용성물질추출용매에 상기 지용성물질이 용해된 지용성물질-용매와 물로 분획하는 과정; 및
분리된 상기 세포와 상기 지용성물질-용매를 각각 수득하는 과정;
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 분리된 상기 세포를 재배양하고, 재배양된 상기 세포 배양액을 상기 지용성물질추출용매 또는 분획된 상기 지용성물질-용매와 혼합 및 접촉시켜 상기 세포의 상기 지용성물질을 상기 지용성물질추출용매에 더 용해시키는 과정, 및 그 이후 과정을 반복하되, 상기 세포의 재배양, 상기 지용성물질의 재용해, 상기 세포의 재분리, 및 상기 지용성물질-용매의 재분획을 1회 이상 다수회 함으로써, 최종적으로 목적하는 고밀도의 상기 세포와, 목적하는 농축된 상기 지용성물질이 포함된 상기 지용성물질-용매를 수득하는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법. - 제1항 또는 제4항에 있어서,
상기 세포 배양액과 상기 지용성물질 추출용매를 혼합할 때, 상기 세포 배양액을 진동 분쇄하는 과정 및 혼합액을 교반하는 과정 중 적어도 하나의 과정을 실행하여, 상기 세포 배양액과 상기 지용성물질 추출용매의 접촉을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 방법. - 지용성물질을 함유하는 세포를 배양하는 배양조(10);
상기 지용성물질이 용해되는 지용성물질추출용매를 저장하는 용매조(20);
상기 배양조(10)로부터의 상기 세포의 배양액과 상기 용매조(20)로부터의 상기 지용성물질추출용매를 혼합하는 혼합조(30);
상기 혼합조(30)의 혼합액에 초음파공명장을 적용하여 상기 혼합액에서 상기 세포를 분리하는 초음파공명장 발생장치(41)와, 상기 혼합액에 중력침강을 적용하여 상기 혼합액에서 상기 세포를 분리하는 중력침강장치(46) 중에 선택되는 세포분리장치(40a)를 구비하고, 상기 혼합조(30)로부터의 혼합액에서 상기 세포를 응집, 정체 및 분리하는 분리조(40);
상기 세포가 분리된(제거된) 상기 분리조(40)로부터의 용액을, 상기 지용성물질추출용매에 상기 세포배양액의 상기 지용성물질이 용해된 지용성물질-용매와 물로 분획하는 분획조(50);
상기 분리조(40)로부터 분리된 상기 세포를 수용 또는 처리하는 세포-수용장치(80); 및
상기 분획조(50)로부터 분획한 상기 지용성물질-용매를 수용 또는 처리하는 지용성물질-수용장치(90);
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 장치. - 삭제
- 제6항에 있어서,
상기 분리조(40)로부터의 분리된 상기 세포를 상기 배양조(10)로 순환하는 세포-순환라인(60); 및
상기 분획조(50)로부터의 분획된 상기 지용성물질-용매를 상기 용매조(20)로 순환하는 용매-순환라인(70); 을 더 포함하고:
상기 세포-수용장치(80)는, 상기 세포-순환라인(60)을 통해 상기 배양조(10)에서 1회 또는 2회 이상 재배양한 후에 상기 분리조(40)로부터 최종 분획한 고밀도의 상기 세포를 수용 또는 처리하고;
상기 지용성물질-수용장치(90)는, 상기 용매-순환라인(70)을 통해 상기 분획조(50)에서 1회 또는 2회 이상 재분획한 후에 상기 분획조(50)로부터 최종 분획한 농축된 상기 지용성물질-용매를 수용 또는 처리하는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 장치. - 제8항에 있어서,
상기 배양조(10)의 상기 세포 배양액과 상기 용매조(20)의 지용성물질추출용매를 상기 혼합조(30)로 일정량 공급하는 제1 연동펌프(2);
상기 분리조(40)에서 분리된 상기 세포를 그 밀도에 따라 선택적으로 상기 세포-순환라인(60)을 통해 상기 배양조(10)로 이송하거나 상기 세포-수용장치(80)로 이송하는 제2 연동펌프(3); 및
상기 분획조(50)에서 분획된 상기 지용성물질-용매를 그 농축도에 따라 상기 용매조(20)로 이송하거나 상기 지용성물질-수용장치(90)로 이송하는 제3 연동펌프(4);
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 장치. - 제6항 또는 제8항에 있어서,
상기 혼합조(30)에는, 상기 세포 배양액과 상기 지용성물질 추출용매의 접촉을 증가시키도록, 상기 세포 배양액을 진동 분쇄하는 진동분쇄장치(31) 및 상기 혼합액을 교반하는 교반장치(32) 중 적어도 하나의 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포배양을 통한 세포 및 지용성물질의 생산 장치.
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