BR112021013812A2

BR112021013812A2 - Método para a produção de lipídios microbianos

Info

Publication number: BR112021013812A2
Application number: BR112021013812-9A
Authority: BR
Inventors: Mahmoud Masri; Thomas Brück
Original assignee: Technische Universität München
Priority date: 2019-02-18
Filing date: 2020-02-18
Publication date: 2021-09-21
Also published as: JP2022519874A; EP3696273A1; WO2020169586A1; CA3129128A1; EP3894575A1; US20240052384A1; CN113423838A

Abstract

método para a produção de lipídios microbianos. a presente invenção se refere a um método para produzir lipídios microbianos.

Description

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE LIPÍDIOS MICROBIANOS

[0001] A presente invenção se refere a um método para produzir lipídios microbianos.

[0002] Em vista de um impacto potencialmente negativo da produção vegetal de óleos de triglicerídeos devido ao uso excessivo da terra, monoculturas e limpeza de habitats diversos biologicamente em favor de uma única espécie, a produção de óleo microbiano foi identificada como uma alternativa atraente potencial ao mesmo. No entanto, economicamente, a disponibilidade e os custos da matéria-prima, a produtividade do óleo de triglicerídeo, bem como o número de etapas do processo envolvidas até a recuperação do óleo são os principais desafios que impedem uma produção em escala industrial. De acordo com Koutinas et al. 2014, Fuel, Volume 116, páginas de 566 a 577, um óleo produzido de maneira microbiana é estimado em aproximadamente US$ 5,5/kg, ao passo que o óleo de soja e o óleo de palma custam apenas aproximadamente US$ 0,79 e 0,66/kg, respectivamente. Portanto, a fim de reduzir essa diferença de preço significativa, um processo de óleo microbiano necessita ser projetado para maximizar a produtividade e minimizar o número de etapas do processo, além da exploração dos desperdícios do processo. Um problema é a identificação de uma matéria-prima sustentável e econômica que possa ser usada na fabricação microbiana de óleos. Um aspecto adicional que necessita ser considerado é a otimização dos processos a jusante para a recuperação de lipídios, pois estes parecem ter um alto impacto geral na economia do processo. Os procedimentos de extração de lipídios convencionais envolvem tipicamente uma destruição da parede celular seguida pela extração de lipídios usando solventes orgânicos os quais, em muitos casos, são tóxicos, tais como clorofórmio ou hexano. Adicionalmente, no caso de paredes celulares rígidas, tratamentos adicionalmente severos são tipicamente implementados, tais como choques de temperatura, tratamento químico ou homogeneizações de alta pressão que adicionam aos custos do processo em geral. O uso de solventes orgânicos e extrações de lipídios impacta negativamente a qualidade do produto finalizado e limita a possibilidade de uso de tais lipídios para aplicações alimentícias e/ou farmacêuticas.

[0003] Por Conseguinte, a presente invenção visa prover um método que seja fácil e simples de realizar e que, portanto, reduza o esforço geral necessário para a produção de lipídios microbianos usando a cultivação de microrganismos oleaginosos.

[0004] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a um método para a produção de lipídios microbianos, o referido método compreendendo as etapas: a) prover um microrganismo oleaginoso; b) fazer crescer o referido microrganismo oleaginoso em um meio compreendendo uma fonte de carbono e um ácido orgânico, e permitindo assim que o referido microrganismo oleaginoso produza lipídios microbianos; c) realizar um tratamento puramente enzimático do referido microrganismo oleaginoso crescido sem qualquer extração à base de solvente ou demulsificação à base de produtos químicos, para tornar os referidos lipídios microbianos produzidos passíveis de coleta subsequente; d) coletar os referidos lipídios microbianos produzidos por um método de separação com base na densidade.

[0005] Em uma modalidade, o referido microrganismo oleaginoso é selecionado a partir de leveduras, fungos, bactérias e microalgas, em que, preferencialmente, o referido microrganismo oleaginoso é uma levedura oleaginosa, em que mais preferencialmente, a referida levedura oleaginosa é selecionada a partir do gênero Rhodospirillum, Trichosporon, Rhodosporidium, Rhodosporon, Candida, Cryptococcus, Lipomyces, Yarrowia, Rhodotorula, Apiotrichum e Cutaneotrichosporon.

[0006] Se o referido microrganismo oleaginoso for um fungo, é um fungo oleaginoso, em que, preferencialmente, o referido fungo oleaginoso é selecionado a partir do gênero Cunninghamella, Aspergillus, Mortierella e Humicola.

[0007] Se o referido microrganismo oleaginoso for uma bactéria, é uma bactéria oleaginosa, em que, preferencialmente, a referida bactéria oleaginosa é selecionada a partir do gênero Rhodococcus, Acinetobacter e Bacillus.

[0008] Se o referido microrganismo oleaginoso for uma microalga, é uma microalga oleaginosa, em que, preferencialmente, a referida microalga é selecionada a partir do gênero Chlorella, Pseudoclorococcum, Nannochloris, Nannochloropsis, Isochrysis, Tribonema, Dunaliella, Ankistrodesmus, Botryococonema, Pavlova, Scenedesmus, Skeletonema e Nitzschia.

[0009] As espécies preferenciais de leveduras oleaginosas são: Trichosporon oleaginosus, Trichosporon capitatu, Trichosporon asahii, Lipomyces starkeyi, Rhodosporidium toruloides, Yarrowia lipolytica, Rhodotorula graminis, Rhodotorula glutinis, Cutaneotrichosporon oleaginosus, Apiotrichum curvarum, Cryptococcus curvatus, Candida sp, Rhodotorula gracilis. Uma espécie particularmente preferencial de levedura oleaginosa é Cutaneotrichosporon oleaginosus

[0010] As espécies preferenciais de microalgas oleaginosas são: Chlorella sp., Pseudochlorococcum sp., Nannochloris sp, Nannochloropsis sp., Isochrysis sp, Tribonema minus, Dunaliella sp., Ankistrodesmus sp., Botryococcus braunii, Pavlova sp., Scenedesmus sp., Skeletonema sp., Nitzschia sp.

[0011] As espécies preferenciais de bactérias oleaginosas são: Rhodococcus opacus, Acinetobacter calcoaceticus e Bacillus alcalophilus.

[0012] As espécies preferenciais de fungos oleaginosos são: Cunninghamella sp, Aspergillus sp, Mortierella sp e Humicola sp.

[0013] Em uma modalidade, a referida fonte de carbono é selecionada a partir do grupo que compreende carboidratos; aminoácidos; ácidos graxos; preferencialmente monossacarídeos, preferencialmente pentoses ou hexoses, mais preferencialmente glicose, xilose; e/ou manitol; oligossacarídeos; hidrolisados de tecidos animais, tecidos vegetais ou de microrganismos; e combinações de qualquer um dos anteriores, em que mais preferencialmente, a referida fonte de carbono é glicose.

[0014] Em uma modalidade, o referido ácido orgânico é selecionado a partir do grupo que compreende ácidos acético, ácido malônico, ácido oxálico, ácido cítrico, ácido propiônico, ácido valérico, ácido acrílico, ácido crotônico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido isovalérico, ácido 3-hidroxibutírico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido 2-hidroxibutírico, ácido láctico e o(s) respectivo(s) sal(is) de tal ácido, bem como misturas de qualquer um dos ácidos orgânicos anteriores. Preferencialmente, o referido ácido orgânico é ácido acético ou acetato. Em uma modalidade, o referido ácido orgânico é ácido acético ou acetato apenas; em outra modalidade, o referido ácido orgânico é uma combinação de ácido acético ou acetato, com qualquer um dos outros ácidos orgânicos supracitados.

[0015] Deve-se notar que o termo "ácido orgânico", tal como usado neste documento, pretende abranger o respectivo ácido orgânico indiferentemente do seu grau de protonação, ou seja, pretende abranger o referido ácido no(s) seu(s) estado(s) protonado(s), bem como no(s) estado(s) desprotonado(s), por exemplo, quando em solução aquosa a um pH ao qual está protonado ou desprotonado, respectivamente, dependendo do(s) respectivo(s) valor(es) de pKa. O termo "ácido orgânico", tal como usado neste documento, também pretende a abranger sal(is) do ácido orgânico, por exemplo, os respectivos sais de metal de tal ácido orgânico. Exemplos de tais sais de metal são os sais alcalinos ou sais alcalinos terrosos do respectivo ácido orgânico. Os sais podem estar na sua forma dissociada ou não dissociada. O termo "misturas de ácidos orgânicos", tal como usado neste documento, pretende abranger misturas de ácidos orgânicos em sua respectiva forma ácida, ou seja, com outros ácidos orgânicos, misturas de ácidos orgânicos em sua forma ácida com outros ácidos orgânicos em sua forma de sal e misturas de sais de ácidos orgânicos com outros sais de ácidos orgânicos.

[0016] Deve-se notar também que o termo "ácido orgânico", conforme usado neste documento, não abrange ácidos graxos ou aminoácidos.

[0017] A frase "uma fonte de carbono e um ácido orgânico", conforme usada neste documento, implica que a "fonte de carbono" é diferente do "ácido orgânico". Portanto, as duas entidades são quimicamente diferentes.

[0018] Em uma modalidade, a concentração da referida fonte de carbono durante a etapa b) está na faixa de 150 a 400 mM, preferencialmente de 200 a 300 mM. Em uma modalidade, a concentração do referido ácido orgânico durante a etapa b) está em uma faixa de 30 a 100 mM, preferencialmente de 50 a 70 mM. Em uma modalidade, a concentração da referida fonte de carbono durante a etapa b) está na faixa de 150mM a 400mM, preferencialmente de 200 a 300 mM, e a concentração do referido ácido orgânico durante a etapa b) está na faixa de 30mM a 100mM, preferencialmente 50 a 70 mM.

[0019] Em uma modalidade, durante a etapa b), a razão em peso de carbono para nitrogênio (C:N) no meio é (100-200):1, especialmente se for um meio de nitrogênio limitado. Em outra modalidade, durante a etapa b); a razão em peso de carbono para nitrogênio (C:N) no meio é (10-100):1, preferencialmente (10-50):1, especialmente quando não é um meio limitado por nitrogênio. Em uma modalidade, o meio usado na etapa b) é um meio rico em nitrogênio.

[0020] As razões em peso indicadas acima e mais abaixo são razões em peso no meio de partida, ou seja, quando a etapa b) começa.

Conforme usado neste documento, o termo "meio rico em nitrogênio" se refere a um meio que não é um meio de nitrogênio limitado. Em uma modalidade, um "meio rico em nitrogênio" se refere a um meio no qual a razão em peso de carbono para nitrogênio (C:N) é inferior a 100, preferencialmente igual ou inferior a 80.

[0021] Em uma modalidade, o referido tratamento puramente enzimático do referido microrganismo oleaginoso crescido é um tratamento do referido microrganismo com uma hidrolase, sozinha ou em combinação com/seguida por uma protease.

[0022] Tal como usado neste documento, o termo "um tratamento puramente enzimático do referido microrganismo oleaginoso crescido sem qualquer pré-tratamento, extração à base de solvente ou demulsificação à base de produtos químicos" destina-se a referir-se a um tratamento enzimático do referido microrganismo oleaginoso, no qual há a) nenhuma extração usando um ou vários solventes ou b) nenhuma demulsificação usando um ou vários reagentes químicos (adequados) ou c) nenhum dentre a) e b). Preferencialmente, esse termo pretende referir-se a um tratamento enzimático desprovido de qualquer exposição a um solvente de extração e desprovido de qualquer exposição a um reagente químico demulsificante. O termo também pretende excluir a realização de qualquer outro pré-tratamento do referido microrganismo oleaginoso crescido.

[0023] Deve-se notar que nas modalidades da invenção, o "tratamento puramente enzimático" exclui a realização de qualquer pré- tratamento do microrganismo oleaginoso crescido, cujo pré-tratamento pode ser químico (usando um ou vários reagentes químicos aos quais o microrganismo oleaginoso crescido seria exposto) ou físicos (tal como a mudança de uma condição física, por exemplo, temperatura, pressão, ultrassom, luz, irradiação com radiação eletromagnética, etc.).

[0024] Em uma modalidade, a referida hidrolase foi obtida a partir de um fungo, preferencialmente um fungo filamentoso, mais preferencialmente um fungo do gênero Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Aureobasilium e Fusarium.

[0025] Em uma modalidade, o referido método de separação com base na densidade é selecionado a partir da separação com base na gravidade natural, separação de fase assistida por gravidade e centrifugação, em que cada uma das referidas separações com base na gravidade natural, na separação de fases assistida por gravidade e na centrifugação são realizadas sozinhas ou em combinação com uma decantação, aspiração ou outro método de coleta mecânica.

[0026] Em uma modalidade, as etapas b) e c) são realizadas dentro do mesmo recipiente de reação.

[0027] Em uma modalidade, a etapa c) e/ou d) resulta em uma fase lipídica e um hidrolisado do referido microrganismo oleaginoso. Em alguns casos, a etapa c) e/ou d) também pode resultar adicionalmente em uma biomassa residual do referido microrganismo oleaginoso, cuja biomassa residual é diferente da referida fase lipídica e do referido hidrolisado. Em uma modalidade, o referido método envolve uma realização repetida das etapas de b) a d), e em que o referido hidrolisado do referido microrganismo oleaginoso resultante das etapas c) e/ou d) é reusado/reciclado para a realização da etapa b).

[0028] Em uma modalidade, as etapas de b) a d) são realizadas de 2 a n vezes, em que n é um número inteiro, selecionado a partir de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50.

[0029] Em uma modalidade, a referida hidrolase é obtida a partir de um fungo que foi cultivado na presença de um sistema de indução, em que, preferencialmente, o referido sistema de indução é um componente do referido microrganismo oleaginoso, mais preferencialmente um ou vários componentes da parede celular do referido microrganismo oleaginoso usado para a produção de lipídios microbianos, de modo a obter uma preparação de hidrolase que permite uma lise da parede celular do referido microrganismo oleaginoso. Em uma modalidade, o referido sistema de indução é a referida biomassa residual do referido microrganismo oleaginoso produzido durante a etapa c) e/ou d), ou é uma parte ou componente da referida biomassa residual.

[0030] Em uma modalidade, o referido meio usado na etapa b) é um meio rico em nitrogênio.

[0031] Em uma modalidade, o referido meio usado na etapa b) compreende adicionalmente uma fonte de nitrogênio, preferencialmente na forma de um hidrolisado de proteína, tal como peptona, triptona ou outro hidrolisado peptídico, em que, preferencialmente, o referido hidrolisado peptídico compreende tecido animal, tecido vegetal e/ou componentes do referido microrganismo oleaginoso.

[0032] Em uma modalidade, a referida protease, se presente, é selecionada a partir de proteases produzidas por Aspergillus sp., Streptomyces sp. ou Bacillus sp.

[0033] Em uma modalidade, a referida hidrolase obtida a partir do referido fungo é preparada separadamente (a partir da realização das etapas de b) a c) da presente invenção) e é usada na etapa c) como uma preparação líquida obtida diretamente da cultura do referido fungo, ou como uma preparação liofilizada que é subsequentemente reconstituída em solução para ser usada na etapa c).

[0034] Em uma modalidade, a referida hidrolase contém uma ou várias atividades, por exemplo, mas não se limitando a atividades enzimáticas selecionadas a partir de celulase, xiloglucanase, beta- glucosidase, mananase, xilanase e atividades enzimáticas laminarinase.

[0035] Em uma modalidade, o referido método é realizado em lotes descontínuos alimentados, de modo semicontínuo ou contínuo, em que, preferencialmente, o referido método envolve a adição repetida de um ácido orgânico, conforme definido acima, em que, preferencialmente, o referido método envolve a adição repetida de orgânico ácido, por exemplo, ácido acético ou acetato.

[0036] Deve-se notar que a composição dos lipídeos microbianos produzidos na etapa b) pode ser influenciada pelas condições empregadas nesta etapa. As condições típicas para a etapa b) são as seguintes: Em uma modalidade, a temperatura de crescimento durante a etapa b) está em uma faixa de 5°C a 32°C. Em uma modalidade da etapa b), o pH está na faixa de 5 a 8. Em uma modalidade preferencial da etapa b), a temperatura de crescimento durante a etapa b) está em uma faixa de 10°C a 28°C. Em outra modalidade preferencial da etapa b), o pH está na faixa de 5,5 a 7,5. Em ainda uma modalidade preferencial adicional, a temperatura de crescimento durante a etapa b) está na faixa de 5°C a 32°C, e o pH está na faixa de 5 a 8. Em uma modalidade particularmente preferencial, a temperatura de crescimento durante a etapa b) está na faixa de 10°C a 28°C, e o pH está na faixa de 5,5 a 7,5.

[0037] Em uma modalidade, o método é particularmente adequado para a produção de lipídios com teor de > 60% de ácidos graxos insaturados em relação ao teor de ácidos graxos totais e/ou um ponto de fluidez em uma faixa de < 10°C, por exemplo, de 9°C a 5°C, tal como, por exemplo, aproximadamente 5°C. Isso é particularmente verdade, se os seguintes parâmetros forem escolhidos para a etapa b): o crescimento do referido microrganismo oleaginoso em um meio compreendendo uma fonte de carbono e um ácido orgânico sob as seguintes condições: fonte de carbono=glicose; ácido orgânico=ácido acético + adição de ácido crotônico; temperatura de 10 a 15°C, teor de oxigênio dissolvido de 10 a 30% e adição de ácido crotônico (de 4 a 10% do ácido orgânico total), permitindo assim que o referido microrganismo oleaginoso produza lipídios microbianos, que são caracterizados por um

"ponto de fluidez" em uma faixa de < 10°C, por exemplo, de 9°C a 5°C, tal como por exemplo ca. 5°C, e/ou um teor de ácido graxo insaturado de > 60% em relação ao teor de ácido graxo total. O "ponto de fluidez", conforme usado neste documento, é normalmente determinado de acordo com qualquer um dos seguintes padrões: DIN51597, DIN EN 23015:1994-05, DIN ISO 3015:1982-10, DIN ISO 3016:1982-10, ASTM D97, ASTM D5985, preferencialmente usando DIN ISO 3016.

[0038] Os microrganismos oleaginosos são conhecidos a um versado na técnica. De acordo com uma modalidade, de acordo com a presente invenção, o microrganismo oleaginoso que é usado no método de acordo com a presente invenção é uma levedura oleaginosa. Em uma modalidade, a referida levedura oleaginosa é selecionada a partir de um grupo de gênero que compreende os gêneros Rhodospirillum, Trichosporon, Rhodosporidium, Rhodosporon, Candida, Cryptococcus, Lipomyces, Yarrowia, Rhodotorula, Apiotrichum e Cutaneotrichosporon. Em uma modalidade preferencial, o referido microrganismo/levedura oleaginoso é Cutaneotrichosporon oleaginosum (C. oleaginosum).

[0039] Durante o cultivo de microrganismos para a produção de óleos microbianos, há uma compensação, ou na produtividade de lipídios ou na produtividade de biomassa, para a produção de óleo microbiano. Convencionalmente, os lipídios são gerados em um sistema de duas fases que compreende uma primeira etapa para a produção de biomassa em condições não limitantes, seguida por uma fase de limitação de nutrientes durante a qual o crescimento da biomassa é interrompido e apenas os lipídios são acumulados. Sob estas condições, a produtividade dos lipídios não excede 70% p/p. Inovadoramente, esta invenção divulga uma rota completamente nova para a produção de lipídios, em que o crescimento da biomassa e o acúmulo de lipídios podem ser alcançados simultaneamente.

[0040] Isso provê uma opção para rendimento de biomassa e lipídio excedendo a 200g L-1 de biomassa contendo em excesso 85% de lipídio p/p. Em uma modalidade, o microrganismo oleaginoso é feito crescer em um meio que compreende uma fonte de carbono e um ácido orgânico, conforme definido acima. Dependendo do pH em que o referido meio está, o ácido orgânico é dissociado/desprotonado, em cujo caso está presente como forma aniônica de sal/carboxilato, ou não é dissociado, em cujo caso está presente como ácido orgânico em sua forma protonada. O meio no qual o referido microrganismo oleaginoso é feito crescer compreende uma fonte de carbono juntamente com tal ácido carboxílico/carboxilato. Sem desejar ser limitado por qualquer teoria, os presentes inventores acreditam que a presença de ácido orgânico, por exemplo, ácido acético/acetato permite aumentar a produtividade de lipídios, ao passo que a presença de uma fonte de carbono permite um aumento na biomassa total. Deve-se notar que a “fonte de carbono” e o ácido orgânico, conforme definido acima, são duas entidades diferentes que são diferentes uma da outra. Em uma modalidade, a fonte de carbono é selecionada a partir do grupo que compreende ácidos graxos, aminoácidos, carboidratos, preferencialmente monossacarídeos, preferencialmente pentoses ou hexoses, mais preferencialmente glicose, xilose, manitol; oligossacarídeos; hidrolisados de tecidos animais, tecidos vegetais ou de microrganismos; e combinações de qualquer um dos anteriores, em que mais preferencialmente, a referida fonte de carbono é glicose. A referida glicose pode ser usada sozinha ou pode, por exemplo, ser usada em combinação com hidrolisados adequados, tais como peptona, triptona, etc.

[0041] Em uma modalidade, o hidrolisado é um hidrolisado de algas, um hidrolisado lignocelulósico, um hidrolisado vegetal, um hidrolisado de biomassa marinha, tal como um hidrolisado de macro e microalgas marinhas, um hidrolisado de milho, um hidrolisado de trigo ou outro hidrolisado. Em algumas modalidades do método de acordo com a presente invenção que envolvem uma etapa de reciclagem, o hidrolisado também pode ser um hidrolisado microbiano, por exemplo, um hidrolisado de levedura, derivado a partir da hidrólise do microrganismo oleaginoso, por exemplo, a própria levedura, preferencialmente após tal hidrolisado ter sido usado para produzir lipídios.

[0042] O crescimento do microrganismo oleaginoso em um meio adequado compreendendo uma fonte de carbono e um ácido orgânico conforme definido acima, permite que o referido microrganismo oleaginoso produza lipídios microbianos. No entanto, tipicamente, esses lipídios microbianos ainda estão contidos nas células do microrganismo oleaginoso e, para uma recuperação subsequente, portanto, necessitam ser tornados acessíveis. As modalidades da presente invenção, portanto, provêm um tratamento enzimático do microrganismo oleaginoso crescido que torna os lipídios microbianos produzidos passíveis ou acessíveis para uma recuperação subsequente do receptáculo de cultura. Deve-se notar que o método de acordo com a presente invenção envolve um tratamento puramente enzimático do microrganismo oleaginoso crescido sem ter que se embasar em quaisquer etapas de pré-tratamento, por exemplo, etapas de pré-tratamento químico ou extração subsequente ou concomitante dos referidos lipídios usando um solvente. Exemplos de tais etapas de pré- tratamento químico ou etapas de extração subsequentes ou concomitantes são a extração à base de solvente ou a demulsificação à base de produtos químicos. Tais etapas de pré-tratamento excluídas podem, no entanto, também ser etapas físicas, tais como mudanças de temperatura, mudanças de pressão, centrifugação, sonificação, irradiação, etc.

[0043] O termo "demulsificação com base em produtos químicos", tal como usado neste documento, refere-se à exposição da biomassa crescida a um demulsificante, de modo a habilitar a quebra de qualquer emulsão (que possa ter se formada).

[0044] De acordo com as modalidades da invenção, o método não envolve uma extração à base de solvente, demulsificação à base de produtos químicos ou outros tratamentos, tais como choque de temperatura, tratamento químico ou homogeneização de alta pressão ou homogeneização por ultrassom. Isto aumentaria potencialmente os custos ou a caráter perigoso do método e são evitados pela presente invenção. Os presentes inventores verificaram inovadoramente que tais etapas de tratamento severas não são estritamente necessárias.

[0045] Em modalidades de acordo com a presente invenção, subsequentemente, os lipídios microbianos produzidos são coletados usando um método de separação com base na densidade. Em sua forma mais simples, tal método de separação com base na densidade pode ser um processo em que a cultura do microrganismo oleaginoso é simplesmente deixada em repouso por um período de tempo como resultado do qual a fase lipídica se separará de uma fase aquosa devido a diferentes densidades e/ou solubilidade em água. Isto pode ser combinado com uma decantação, aspiração ou outra remoção mecânica subsequente da fase lipídica da cultura. Em outras modalidades, a separação pode ocorrer por meio de uma separação de fase assistida por gravidade, por meio de uma centrifugação, sozinha ou em combinação com uma remoção mecânica subsequente ou a fase lipídica, por exemplo, uma decantação ou aspiração.

[0046] Em uma modalidade, durante a etapa c), o "tratamento puramente enzimático do referido microrganismo oleaginoso cultivado sem qualquer extração à base de solvente" é um tratamento do referido microrganismo com uma hidrolase. Preferencialmente, tal hidrolase é obtida a partir de outro microrganismo, preferencialmente de um fungo, mais preferencialmente a partir de um fungo filamentoso. Em uma modalidade, o fungo é selecionado a partir do gênero Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Aureobasillium e Fusarium. Em uma modalidade mais preferencial, o fungo filamentoso é Trichoderma reesei, porque este provou produzir uma hidrolase particularmente eficiente que permite a lise da parede celular do microrganismo oleaginoso. Em uma modalidade, a referida hidrolase é obtida a partir de um fungo, preferencialmente um fungo filamentoso, que foi cultivado na presença de um sistema de indução, em que, preferencialmente, o referido sistema de indução é um componente do referido microrganismo oleaginoso, preferencialmente um ou vários componentes da parede celular do referido microrganismo oleaginoso usado para a produção de lipídios microbianos, de modo a obter uma preparação de hidrolase que permite uma lise da parede celular do referido microrganismo oleaginoso.

Em uma modalidade, o referido sistema de indução é a referida biomassa residual que pode ser produzida durante as etapas c) e d) ou componentes da mesma.

Preferencialmente, essa hidrolase é produzida cultivando o referido fungo filamentoso na presença de fragmentos da parede celular do referido microrganismo oleaginoso.

Sem desejar ser limitado por qualquer teoria, os presentes inventores acreditam que a exposição do fungo filamentoso, por exemplo, T. reesei, à presença de tal componente da parede celular do referido microrganismo oleaginoso permite que tal fungo filamentoso produza exatamente a(s) enzima(s) adequada(s) para completar a lise das paredes celulares do microrganismo oleaginoso.

Em uma modalidade particularmente preferencial, um fungo filamentoso a partir do gênero Trichoderma é usado, por exemplo, Trichoderma reesei, e em uma modalidade particularmente preferencial, um mutante de Trichoderma reesei é usado, tal como o mutante com o(s) número(s) de deposição ATCC 56765 e 13631. Uma vez que o fungo filamentoso foi cultivado, a cultura resultante pode ser adicionalmente processada, tal como concentrada e a biomassa do próprio fungo é removida, e o sobrenadante resultante pode ser usado em tal forma ou pode ser liofilizado e conservado para armazenamento e reconstituição subsequente em solução aquosa apropriada.

Novamente, sem desejar ser limitado por qualquer teoria, os presentes inventores acreditam que a hidrolase produzida deste modo pode representar uma combinação de várias atividades enzimáticas, por exemplo, uma celulase, xiloglucanase, β- glucosidase, mananase, xilanase e laminarinase e, possivelmente, outras.

[0047] Em uma modalidade, de acordo com a presente invenção, as etapas b) e c) são realizadas no mesmo receptáculo de reação. Este é também, neste documento, algo referido como um "método one-pot" ou "processo one-pot". Nesta modalidade, o método de acordo com a presente invenção pode ser considerado um processo one-pot para a fabricação de lipídeos microbianos. Normalmente, a etapa c) e/ou etapa d) resulta em uma fase lipídica e uma fase de hidrolisado do microrganismo oleaginoso e o método, preferencialmente, envolve uma realização repetida das etapas de b) a d). Em tal modalidade, o hidrolisado resultante das etapas c) e/ou d) pode ser reusado/reciclado para realizar a etapa b). Em tal modalidade, o hidrolisado de microrganismo resultante das etapas c) e/ou d) é realimentado no meio usado na etapa b) e pode atuar como a fonte de carbono ou como uma fonte de carbono adicional (adicional à fonte de carbono que foi escolhido e presente inicialmente). As modalidades, em que, nas etapas de b) a d), os produtos colaterais são reusados/reciclados, por exemplo, em que os produtos resultantes das etapas c) e/ou d) são reusados/reciclados na etapa b), evitam a ocorrência de produtos residuais. Tais modalidades podem, portanto, também neste documento, às vezes, ser referidas como um "processo sem desperdícios" ou "método sem desperdícios".

[0048] Em uma modalidade, particularmente onde o hidrolisado do microrganismo oleaginoso é reusado/reciclado para realizar a etapa b), o método de acordo com a presente invenção é um método em que as etapas de b) a d) são realizadas repetidamente, preferencialmente duas, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, sete vezes, oito vezes, nove vezes, dez vezes, ou possivelmente 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou até 50 vezes 50. Em uma modalidade, as etapas de b) a d) são realizadas 2 a 3 vezes. Uma reciclagem repetida permite fazer uso eficiente dos vários meios envolvidos e evita a produção de resíduos excessivos, uma vez que os produtos resultantes do processo, tal como um hidrolisado do microrganismo oleaginoso, são reusados como meio de partida para o crescimento de tal microrganismo oleaginoso.

[0049] Em uma modalidade, o meio usado na etapa b) compreende adicionalmente uma fonte de nitrogênio, preferencialmente na forma de um hidrolisado de proteína, tal como peptona, triptona ou outro hidrolisado peptídico. Sem desejar se limitar a qualquer teoria, os presentes inventores acreditam que a presença de tal fonte de nitrogênio adicional permite aumentar a produção de lipídios e biomassa, no total.

[0050] Em uma modalidade, o meio usado na etapa b) é um meio rico em nitrogênio. O termo "meio rico em nitrogênio", tal como usado neste documento, refere-se a um meio no qual a razão em peso de carbono para nitrogênio (C:N) é < 100, preferencialmente ≤ 80, mais preferencialmente de 25 a 80.

[0051] Em uma modalidade de acordo com a presente invenção, o "tratamento puramente enzimático" realizado na etapa c) envolve adicionalmente o tratamento do referido microrganismo com uma protease (mas ainda exclui um pré-tratamento ou extração à base de solvente ou demulsificação à base de produtos químicos). Deve-se notar que tal protease, se e quando usada, segue ou é combinada com um tratamento usando a hidrolase supracitada. Mais uma vez, sem desejar ser limitado por qualquer teoria, os presentes inventores acreditam que o tratamento envolvendo uma protease permite a separação dos lipídios produzidos a partir de quaisquer proteínas a eles associadas e, portanto, auxilia na liberação de lipídios. Em uma modalidade, a protease é selecionada a partir do grupo de proteases produzidas por Aspergillus sp., Streptomyces sp. ou Bacillus sp.

[0052] Em uma modalidade, o método de acordo com a presente invenção é realizado em uma maneira de lote descontínuo alimentado ou em modo contínuo, sendo preferencialmente um modo descontínuo alimentado. Preferencialmente, se o método de acordo com a presente invenção for realizado em um lote descontínuo alimentado, para a realização da etapa b), quantidades definidas da referida fonte de carbono, conforme definido acima, e do referido ácido orgânico são adicionadas repetidamente, preferencialmente tantas vezes quanto a etapa b) é realizada. Em uma modalidade preferencial, a concentração de ácido orgânico durante a etapa b) deve ser mantida em uma concentração ao longo do tempo de fermentação em uma faixa de 30 a 100 mM, preferencialmente de 50 a 70 mM.

[0053] Adicionalmente, é feita referência às figuras, em que A Figura 1 mostra o fluxo de biomassa envolvido em modalidades de acordo com a presente invenção, que envolvem uma reciclagem de alguns dos produtos resultantes da realização do método em particular resultante de uma hidrólise do microrganismo oleaginoso; A Figura 2 mostra o crescimento da biomassa e o consumo de alimentação ao longo do tempo de fermentação usando diferentes alimentações (a) usando ácido acético sozinho; (b) glicose sozinha; A Figura 3 mostra o consumo de alimentação do crescimento da biomassa e o acúmulo de lipídios ao longo do tempo de fermentação usando diferentes alimentações (a) crescimento de biomassa e combustão de substrato versus tempo de fermentação usando ácido acético e co- fermentação de glicose em meio de nitrogênio limitado; (b) Acúmulo de lipídios versus a fermentação ao longo do tempo usando tanto ácido acético quanto co-fermentação de glicose em meio de nitrogênio limitado; (a) crescimento de biomassa e combustão de substrato versus tempo de fermentação usando tanto ácido acético quanto co-fermentação de glicose em meio rico em nitrogênio; e (d) Acúmulo de lipídios versos tempo de fermentação ao longo do tempo usando ácido acético e co-fermentação de glicose em meio rico em nitrogênio A Figura 4 mostra o crescimento da biomassa, o acúmulo de lipídios e o consumo de alimentos ao longo do tempo de fermentação usando diferentes alimentos (a) crescimento da biomassa e combustão do substrato versus tempo de fermentação usando ácido acético e co- fermentação de glicose junto com hidrolisado de laminaria digitata (b) acúmulo e produtividade de lipídios da cultura de (a), expressa tanto em gL- 1 (colunas cinza claro) quanto em % p/ps de biomassa (porcentagem em peso/por peso seco de biomassa) (colunas cinza escuro); (c) crescimento da biomassa e combustão de substrato versus tempo de fermentação usando ácido acético e co-fermentação de glicose em meio rico em nitrogênio usando um modo semicontínuo, ou seja, em que os lotes de ácido acético são adicionados repetidamente, por exemplo, 2 vezes, e a biomassa é coletada também repetidamente, por exemplo, 2 vezes; e (d) acúmulo de lipídios e produtividade versus tempo de fermentação usando ácido acético e co-fermentação de glicose em meio rico em nitrogênio (novamente usando um modo semicontínuo como em 3a)); A Figura 5 mostra o crescimento da biomassa e o acúmulo de lipídios versus o tempo de fermentação usando ácido acético e co-fermentação de glicose em meio rico em nitrogênio usando um modo de fermentação contínua; (a) crescimento da biomassa medida por OD600nm versus tempo de fermentação; (b) crescimento da biomassa medida pela contagem de células, versus tempo de fermentação; (c) crescimento de biomassa medida por um método gravimétrico versus tempo de fermentação; e (d) acúmulo de lipídios e produtividade medida pelo método gravimétrico versus tempo de fermentação; A Figura 6 mostra (a) a diminuição relativa no peso da biomassa versus tempo de hidrólise enzimática usando T. reesei (ATCC 13631); (b) a diminuição relativa no peso da biomassa versus o tempo de hidrólise enzimática usando T. reesei RUT C-30 (ATCC 56765); (c) peso da biomassa residual relativa após 12 e 18 horas de incubação com os sistemas enzimáticos: Mix 1 (mistura comercial), Mix 2 (mistura comercial), o T. reesei ATCC 13631 e T. reesei RUT C-30 (ATCC 56765) e dois controles: controle 1 = biomassa não tratada; controle 2 = biomassa incubada sob as mesmas condições, mas sem tratamento com hidrolase; (d) o peso relativo de lipídios liberado após 12 e 18 horas de incubação com os sistemas enzimáticos: Mix 1 (mistura comercial), Mix 2 (mistura comercial), T. reesei ATCC 13631 e T. reesei RUT C-30 (ATCC 56765), em comparação com lipídios liberados usando extração por solvente convencional (usando clorofórmio: MeOH como solvente (2:1 (v/v)), e um controle no qual uma biomassa foi incubada sob as mesmas condições, mas sem tratamento com hidrolase.

Mix 1: Uma mistura de Mananase (Clariant- Suíça), Cellic Ctec2 (Novozymes-Dinamarca), Cellic Htec (Novozymes-Dinamarca) e β–glucosidase (Novozymes-Dinamarca). Mix 2: Uma mistura de Liquebeet (Clariant- Suíça), CLA (Clariant- Suíça), Mananase (Clariant- Suíça), 1,3-β-glucanase (Megazyme- França) e β- glucosidase (Novozymes-Dinamarca); A Figura 7 mostra (a) diagramas de gráfico de densidade celular de densidade celular de C. oleaginosus versus tempo de hidrólise enzimática.

O gráfico de densidade celular mostra a intensidade da dispersão direta (FSC) (no eixo x) e da dispersão lateral (SSC) (no eixo y); (b) o aumento na concentração de açúcar versus tempo de hidrólise enzimática; (c) a diminuição na contagem de células de C. oleaginosus versus tempo de hidrólise enzimática; A Figura 8 mostra (a) uma imagem de microscópio de fluorescência para células de levedura após 10 horas de hidrólise enzimática.

O lipídio foi colorado com Vermelho do Nilo; (b) a cultura após a hidrólise enzimática, em que a cultura foi deixada durante a noite na bancada de trabalho; (c) a cultura após centrifugação (a 9000g durante 20 min); (d) o lipídio flutuado após a sua decantação sem qualquer purificação adicional; A Figura 9 mostra o crescimento da biomassa, medido pelo método gravimétrico versus o tempo de fermentação usando ácido acético e co- fermentação de glicose.

No ciclo 1, o meio usado foi um meio rico em nitrogênio usando tanto glicose quanto ácido acético, adicionalmente incluindo um hidrolisado de peptídeo.

Nos ciclos 2 e 3, o meio usado incluiu hidrolisado(s) gerado(s) no ciclo anterior; A Figura 10 mostra o aumento do teor de lipídios e produtividade, medido como gL-1 (colunas cinza-claros) e em % de p/ps da biomassa (porcentagem de peso/por peso seco da biomassa) (colunas cinza escura) versus tempo de fermentação usando apenas ácido acético (a fermentação foi realizada em frasco de 2 litros a temperatura de 28oC, pH 6,5 e pO2 ≥ 50%; A Figura 11 mostra imagens de microscópio de fluorescência mostrando um aumento marcante no volume celular e teor de lipídios para: Fermentação à base de glicose em meio de nitrogênio mínimo (à esquerda) e co-fermentação em meio rico em nitrogênio (à direita); A Figura 12 mostra o aumento na intensidade da dispersão direta [FSC] (no eixo x) e dispersão lateral [SSC] (no eixo y) de um ácido acético e co-fermentação de glicose versus tempo de fermentação em meio rico em nitrogênio.

A fermentação foi realizada em lote de 21 litros, temp.: 28°C, pH 6,5 e pO2 ≥ 50%; A Figura 13 mostra as alterações observadas no perfil de ácidos graxos (expressos como % em peso por peso de ácidos graxos totais) de um ácido acético e co-fermentação de glicose versus tempo de fermentação em meio rico em nitrogênio.

A fermentação foi realizada em lote de 21 litros, temp.: 28°C, pH 6,5 e pO2 ≥ 50%;

A Figura 14 mostra a cultura de levedura oleosa após uma fermentação usando tanto glicose quanto ácido acético em co-fermentação e após centrifugação a 15.000g por 30 min; A Figura 15 mostra imagens de microscópio eletrônico para células C. oleaginous após tratamento com um homogeneizador de alta pressão aplicando 2400 bar três vezes; A Figura 16 mostra amostras de lipídios produzidas sob diferentes condições de operação; A Figura 17 mostra um perfil de ácido graxo de um óleo de levedura obtido após o cultivo de C. oleaginosus em meio usando 100% de ácido acético; A Figura 18 mostra um perfil de ácido graxo de óleo de levedura obtido após o cultivo de C. oleaginosus em meio usando uma mistura de ácido acético 90% e ácido isobutírico 10%; A Figura 19 mostra um perfil de ácido graxo de óleo de levedura obtido após o cultivo de C. oleaginosus em meio usando uma mistura de 90% de ácido acético e 10% de ácido isovalérico; A Figura 20 mostra um perfil de ácido graxo de óleo de levedura obtido após o cultivo de C. oleaginosus em meio usando uma mistura de 90% e 10% de ácido crotônico.

[0054] Além disso, é feita referência aos seguintes exemplos que são dados para ilustrar e não limitar a presente invenção. Exemplos

1.1 Maximizando a produtividade de lipídios Exemplo 1 (ácido acético único, a fermentação de glicose única para comparação)

[0055] Várias configurações de fermentação (ácido acético único, glicose única, co-fermentação de ácido acético e glicose) com nitrogênio limitado e condições de meio rico foram investigadas. No que diz respeito à fermentação de substrato único, a fermentação de glicose única

(Meio A) (Figura 2b) mostra uma maior produtividade de biomassa em relação ao ácido acético único (Meio B) (Figura 2a). No entanto, a fermentação de ácido acético única provê uma produtividade de lipídios ligeiramente maior (Figura 10) sobre a configuração de fermentação de glicose única, provendo 0,13 g L-1 h-1 [Biomassa 22 g L-1, lipídio 72% (p s lipídio/p biomassa)] e 0,09 g L-1 h-1 [Biomassa 34 g L-1, Lipídio 45% (p s lipídio/p biomassa)], respectivamente.

[0056] Além disso, a produção de lipídios convencional com organismos oleaginosos é um processo de duas etapas, em que a primeira etapa provê a formação da biomassa sob condições não limitantes (fase de crescimento exponencial), a segunda etapa de indução de lipídios (fase de limitação de nutrientes) proporciona alto acúmulo de lipídios intracelulares contagens de células em estagnação. Os dados dos presentes inventores demonstram pela primeira vez que a co-fermentação de açúcares e um ácido orgânico, por exemplo, ácido acético, pode prover biomassa e formação lipídica simultâneas sem a necessidade de estressores metabólicos, tal como limitação de nitrogênio. A estratégia de fermentação atual atingiu a taxa de produção de biomassa e lipídios (Biomassa 240g L-1, Lipídio 87% (p/p)) substituindo qualquer um dos dados publicados previamente.

[0057] Cepa: Cutaneotrichosporon oleaginosus (ATCC 20509) foi cultivada em frascos Erlenmeyer contendo caldo do meio YPD (10 g L-1 de extrato de levedura, 20 g L-1 de peptona e 20 g L-1 de glicose) contendo antibióticos (10 mg L-1 de ampicilina, 10 mg L-1 canamicina e 12 mg L-1 de tetraciclina). Os frascos foram incubados em agitador rotativo a 100 rpm e temperatura de 28ºC por 2 dias, então foram usados como inóculo

[0058] Meio A: glicose 30 g L-1, extrato de levedura 0,5 g L-1, NH4Cl 0,5 g L-1, KH2PO4 2,4 g L-1, Na2HPO4.12H2O 0,9 g L-1, MgSO4.7H2O 1,5g L-1, FeCl3.6H2O 0,08 g L-1, ZnSO4.7H2O 0,01g L-1, CaCl2.2H2O 0,1g L-1, MnSO4.5H2O 0,1mg L-1, CuSO4. 5H2O 0,1mg L-1, Co(NO3)2.6 H2O 0,1mgL-1.

[0059] Meio B: extrato de levedura 0,5 g L-1, acetato de sódio 4,1 g L-1, NH4Cl 0,5 g L-1, KH2PO4 2,4 g L-1, Na2HPO4.12H2O 0,9 g L-1, MgSO4.7H2O 1,5 g L-1, FeCl3.6H2O 0,08 g L-1, ZnSO4.7H2O 0,01 g L-1, CaCl2.2H2O 0,1 g L-1, MnSO4. 5H2O 0,1 mg L-1, CuSO4.5H2O 0,1 mg L-1, Co(NO3) 2,6H2O 0,1 mg L-1.

[0060] Biorreator de 2-L: O cultivo em lotes descontínuos alimentado de T. oleaginosus foi realizado em um biorreator de 2-L (sistema de INFORS HT, Suíça) com um volume de trabalho de 1 L do meio correspondente. A temperatura foi mantida constante a 28 °C e o pH do biorreator foi ajustado para pH 6,5 ± 0,2 com NaOH 1 M ou HCl 1 M (no caso da fermentação de glicose) e ácido acético 50% (no caso de fermentação AA). A agitação (de 350 a 1000 rpm) e aeração (de 1,0 a 2,0 NL/V de ar) foram reguladas automaticamente para manter o oxigênio dissolvido acima de 50%. A espuma foi prevenida pela adição de 0,01% (V/V) de um agente antiespuma (Antifoam 204, Sigma Aldrich). Exemplo 2 (co-fermentação de ácido acético e glicose no meio de nitrogênio limitado)

[0061] Em comparação, a co-fermentação de glicose e ácido acético no meio de nitrogênio limitado (Meio C) (Figura 3a) atingiu uma biomassa de 20 g L-1 com um teor de lipídios de 20% (plipídio/psbiomassa) nas primeiras 24 horas)] (Figura 3b). Ao passo que, ao mesmo tempo, a biomassa de fermentação de glicose e ácido acético individual atingiu apenas 10 g L-1 com um teor de lipídios de 12% (plipídio/psbiomassa) e 5 g L-1 de biomassa com 30% (plipídio/psbiomassa) lipídio, respectivamente. Isso corresponde a uma produtividade de lipídio de 0,2 g L-1 h-1 a partir do primeiro dia em comparação com 0,075 g L-1 h-1 em relação à glicose e fermentação individual em lote de ácido acético.

[0062] A produtividade de lipídio, sob condições limitadas de nitrogênio, diminuiu posteriormente para 0,18 g L-1 h-1 [Biomassa 43 g L-1, lipídio 73,5% (plipídio/psbiomassa)] no quinto dia de fermentação. A eficiência carbono: carbono calculado foi de 0,22 g g-1 lipídio por carbono total. Esta diminuição pode ser atribuída aos recursos limitados de nitrogênio.

[0063] Cepa: Cutaneotrichosporon oleaginosus (ATCC 20509) foi cultivada em frascos Erlenmeyer contendo caldo do meio YPD (10 g L-1 de extrato de levedura, 20 g L-1 de peptona e 20 g L-1 de glicose) contendo antibióticos (10 mg L-1 de ampicilina, 10 mg L-1 canamicina e 12 mg L-1 de tetraciclina). Os frascos foram incubados em agitador rotativo a 100 rpm e uma temperatura de 28°C por 2 dias, então foram usados como inóculo.

[0064] Meio C: glicose 30 gL-1, extrato de levedura 0,5 g L-1, acetato de sódio 4,1 g L-1, NH4Cl 0,5 g L-1, KH2PO4 2,4 g L-1, Na2HPO4. 12H2O 0,9 g L-1, MgSO4. 7H2O 1,5 g L-1, FeCl3. 6H2O 0,08 g L-1, ZnSO4. 7H2O 0,01 g L-1, CaCl2. 2H2O 0,1 g L-1, MnSO4. 5H2O 0,1mg L-1, CuSO4. 5H2O 0,1mg L-1, Co(NO3) 2,6H2O 0,1mgL-1.

[0065] Biorreator de 2-L: O cultivo em lotes descontínuos alimentado de T. oleaginosus foi realizado em um biorreator de 2-L (sistema de INFORS HT, Suíça) com um volume de trabalho de 1 L do meio correspondente. A temperatura foi mantida constante a 28 °C e o pH do biorreator foi ajustado para pH 6,5 ± 0,2 com NaOH 1 M ou HCl 1 M (no caso da fermentação de glicose) e ácido acético 50% (no caso de fermentação AA). A agitação (de 350 a 1000 rpm) e aeração (de 1,0 a 2,0 NL/V de ar) foram reguladas automaticamente para manter o oxigênio dissolvido acima de 50%. A espuma foi prevenida pela adição de 0,01% (V/V) de um agente antiespuma (Antifoam 204, Sigma Aldrich). Exemplo 3 (co-fermentação de ácido acético e glicose em meio rico em nitrogênio)

[0066] Relevantemente, a fermentação com base em meio rico em nitrogênio (meio D) potencializou a produtividade de lipídios, no primeiro dia, para 0,67 g L-1 h-1 (Figura 3c e 3d). Notavelmente, a co-fermentação com base em meio rico em nitrogênio mostra uma formação simultânea de biomassa e lipídios intracelulares imediatamente após o início da fermentação. Sob essas condições, um teor de lipídios em excesso de 70% (plipídio/psbiomassa) foi alcançado no segundo dia de fermentação. Posteriormente, o rendimento de lipídios aumentou ainda mais atingindo 85% (plipídio /psbiomassa) após 120 h. Este é o maior rendimento de lipídio intracelular já observado com leveduras oleaginosas. Sob essas condições experimentais, o rendimento de biomassa também continuou a aumentar linearmente sem nivelar em uma fase de platô (Figura 3c). O protocolo de co-fermentação de ácido acético e açúcar aplicado melhorou a produtividade de lipídios em até 0,53g L-1 h-1 [Biomassa 84 gL-1, 84,9% (plipídio/psbiomassa)]. No entanto, a eficiência carbono: carbono foi de 0,24 g g-1 lipídio por carbono total. A imagem de microscopia de fluorescência confirmatória indicou um aumento marcante no volume celular e no teor de lipídios (Figura 11).

[0067] Presumivelmente, e sem desejar ser limitado por qualquer teoria, o ácido acético pode ser assimilado a partir da mídia e convertido diretamente em acetil-CoA, um metabólito de plataforma geral associado ao crescimento celular, biossíntese de lipídios e metabolismo energético. Essa transformação é catalisada pelo acetato-CoA ligase, que foi previamente relatada em uma análise transcriptômica de C. oleaginosus. Portanto, o acetato-CoA ligase pode ser uma atividade enzimática essencial levando ao alto teor de lipídios associado a um atalho na via de biossíntese de lipídios, independente da razão C:N relativa conforme relatado para fermentações à base de açúcar.

[0068] Especificamente, o acetato-CoA é um intermediário central do TCA ligado à homeostase e ao crescimento celular. No entanto, os dados dos presentes inventores com o uso de apenas ácido acético (ou seja, sem fonte de carbono separada) indicam que o acetato é preferencialmente canalizado na biossíntese de ácidos graxos e não garante a propagação celular. Nesse sentido, é essencial esclarecer se a produção de biomassa pode ser induzida em paralelo com a biossíntese de lipídios. A formação simultânea de biomassa e lipídios é um fator chave para a viabilidade econômica do processo. Nesse sentido, a co- fermentação de uma fonte de carbono e um ácido orgânico, por exemplo, de um açúcar e ácido acético, parece ser o procedimento mais eficiente para iniciar a propagação rápida de biomassa e o acúmulo de lipídios.

[0069] Cepa: Cutaneotrichosporon oleaginosus (ATCC 20509) foi cultivada em frascos Erlenmeyer contendo caldo do meio YPD (10 g L-1 de extrato de levedura, 20 g L-1 de peptona e 20 g L-1 de glicose) contendo antibióticos (10 mg L-1 de ampicilina, 10 mg L-1 canamicina e 12 mg L-1 de tetraciclina). Os frascos foram incubados em agitador rotativo a 100 rpm e uma temperatura de 28°C por 2 dias, então foram usados como inóculo.

[0070] Meio D: glicose 30 g L-1, extrato de levedura 0,5 g L-1, peptona 5 g L-1, acetato de sódio 4,1 g L-1, NH4Cl 0,5 g L-1, KH2PO4 2,4 g L- 1 , Na2HPO4. 12H2O 0,9 g L-1, MgSO4. 7H2O 1,5 g L-1, FeCl3. 6H2O 0,08 g L- 1 , ZnSO4. 7H2O 0,01 g L-1, CaCl2. 2H2O 0,1 g L-1, MnSO4. 5H2O 0,1 mg L-1, CuSO4. 5H2O 0,1 mg L-1, Co(NO3)2. 6H2O 0,1 mgL-1.

[0071] Biorreator de 2-L: O cultivo em lotes descontínuos alimentado de T. oleaginosus foi realizado em um biorreator de 2-L (sistema de INFORS HT, Suíça) com um volume de trabalho de 1 L do meio correspondente. A temperatura foi mantida constante a 28 °C e o pH do biorreator foi ajustado para pH 6,5 ± 0,2 com NaOH 1 M ou HCl 1 M (no caso da fermentação de glicose) e ácido acético 50% (no caso de fermentação AA). A agitação (de 350 a 1000 rpm) e aeração (de 1,0 a 2,0 NL/V de ar) foram reguladas automaticamente para manter o oxigênio dissolvido acima de 50%. A espuma foi prevenida pela adição de 0,01% (V/V) de um agente antiespuma (Antifoam 204, Sigma Aldrich). Exemplo 4 (co-fermentação de ácido acético e meio hidrolisado de algas marrons)

[0072] Nas execuções anteriores, um meio sintético com glicose pura foi aplicado. No entanto, para evitar o impacto da co-fermentação na mudança do uso do solo, a biomassa de algas marinhas marrons, L. digitata, serviu como fonte de açúcar. O hidrolisado de L. digitata relatado anteriormente (referência: Masri, et al, Journal Appl. Energ., 2018, vol. 224, 1-12.) que contém, entre outras coisas, glicose e manitol como uma fonte de carbono, foi usado em um modo de co-fermentação com ácido acético. A co-fermentação do hidrolisado de L. digitata com ácido acético resultou na formação simultânea de biomassa e lipídios sem limitação de nutrientes. Além disso, o rendimento de biomassa ultrapassou a formação de lipídios intracelular e devido ao maior rendimento de biomassa, a produtividade total de lipídios aumentou em 0,59 g L-1 h-1 [Biomassa 114 gL-1, 64% (plipídio/psbiomassa) lipídio]. Nesta configuração experimental, a eficiência do carbono foi de 0,24 g g-1 lipídio por carbono total (Figuras 4a e 4b).

[0073] A produção de biocombustíveis e oleoquímicos a partir de terras convertidas cria uma dívida de carbono inerente ao liberar de 17 a 420 vezes mais CO2 do que as reduções anuais de gases de efeito estufa (GEE) que esses biocombustíveis proporcionariam. Por exemplo, o biodiesel de óleo de palma, que foi plantado em florestas tropicais de turfeiras convertidas, necessita de cerca de 423 anos para pagar a dívida de carbono criada. Em contraste, biocombustíveis e oleoquímicos produzidos a partir de resíduos de biomassa (tal como resíduos florestais) ou terras agrícolas abandonadas incorrem em pouca ou nenhuma dívida de carbono. Por outro lado, essa biomassa residual ou plantação de terras agrícolas abandonadas criará uma alta pressão sobre a indústria de alimentos, resultando em aumentos de preços devido à limitação de terras.

[0074] A esse respeito, os presentes inventores decidiram usar um hidrolisado enzimático da alga marrom L. digitata, que eles haviam demonstrado anteriormente ser uma excelente base de fermentação para C. oleaginous (Masri, et al, Journal Appl. Energ., 2018, vol. 224, 1-12.). Além disso, no que diz respeito ao impacto do ciclo de vida e sustentabilidade do processo, a biomassa marinha, tal como o hidrolisado de algas marrons de L. digitata, é superior a quaisquer resíduos de biomassa terrestre, pois não compete com a atividade agrícola, cresce significativamente mais rápido do que os equivalentes terrestres e pode ser facilmente hidrolisada sem pré-tratamento físico-químico de uso intensivo de energia que a biomassa lingo-celulósica terrestre requer.

[0075] Cepa: Cutaneotrichosporon oleaginosus (ATCC 20509) foi cultivada em frascos Erlenmeyer contendo caldo do meio YPD (10 g L-1 de extrato de levedura, 20 g L-1 de peptona e 20 g L-1 de glicose) contendo antibióticos (10 mg L-1 de ampicilina, 10 mg L-1 canamicina e 12 mg L-1 de tetraciclina). Os frascos foram incubados em agitador rotativo a 100 rpm e uma temperatura de 28 ºC por 2 dias, então foram usados como inóculo.

[0076] Hidrolisado de L. digitata: a hidrólise enzimática das amostras de algas marrons de Laminaria digitata (L. digitata) foi realizada em frascos de vidro de 5 litros (Schott) contendo 20 litros de solução tampão de acetato (50,0 mM, pH 5,0) e 60,0 g de biomassa. As reações foram iniciadas pela adição de uma solução de enzima e incubação a 50 °C enquanto se agitava a 400 rpm usando agitador magnético por 72 horas. A mistura de reação foi então centrifugada por 30 min a 8000 g, seguida por filtração cruzada (membrana de 10 kDa feita de celulose regenerada foi usada com os seguintes parâmetros: pressão de entrada (P1) 2 bar, pressão de arraste (P2) 0,3 - 0,5 bar e permeado estava aberto à pressão atmosférica. As taxas de fluxo de arraste e permeado foram ca. 2 L.min-1 e ca. 0,1 L.min-1, respectivamente. Cápsulas de filtro de 0,2 µm foram instaladas na saída para esterilizar o hidrolisado resultante).

[0077] Biorreator de 2-L: O cultivo em lotes descontínuos alimentado de T. oleaginosus foi realizado em um biorreator de 2-L (sistema de INFORS HT, Suíça) com um volume de trabalho de 1 L do meio correspondente. A temperatura foi mantida constante a 28 °C e o pH do biorreator foi ajustado para pH 6,5 ± 0,2 com NaOH 1 M ou HCl 1 M (no caso da fermentação de glicose) e ácido acético 50% (no caso de fermentação AA). A agitação (de 350 a 1000 rpm) e aeração (de 1,0 a 2,0 NL/V de ar) foram reguladas automaticamente para manter o oxigênio dissolvido acima de 50%. A espuma foi prevenida pela adição de 0,01% (V/V) de um agente antiespuma (Antifoam 204, Sigma Aldrich). Exemplo 5 (co-fermentação de ácido acético e glicose em meio rico em nitrogênio - Um modo de operação semicontínuo)

[0078] Com relação à eficiência econômica, diferentes modos de operação foram testados. Portanto, os modos de operação semicontínuo e contínuo foram testados em um tempo de execução estendido.

[0079] Um modo de operação semicontínuo com dois pontos de coleta foi executado por cerca de 12 dias. Os dois pontos de coleta parcial foram conduzidos no ponto de tempo de 162 e 234 h, onde 40-50% (v/v) da cultura foi removida do biorreator e substituída por meio fresco E. A co- fermentação inicial com meio rico N (Meio D) e ácido acético ao longo de um período de tempo prolongado é representado nas Figura 4c e 4d. Conforme observado anteriormente, a biomassa e a formação de lipídios estavam simultaneamente atingindo a produtividade de lipídios de 0,57gL-1 h-1 [biomassa 106 g L-1, lipídio 87% (plipídio/psbiomassa)], após 162 h. Nesse momento, o primeiro ponto de coleta havia ocorrido com a coleta de 40% (v/v) da cultura, o que resultou na diminuição da concentração de biomassa para 69 g L-1.

[0080] Nas 42 h subsequentes de operação, a concentração de biomassa aumentou rapidamente para atingir 235 g L-1. Além disso, o teor de lipídios pode ser notavelmente mantido acima de 80% (plipídio/psbiomassa) com produtividade de lipídios de 0,90g L-1h-1. Esta foi a maior produtividade de lipídios observada neste ponto de otimização do processo.

[0081] No ponto de tempo de 234 h, a segunda etapa de coleta foi realizada, onde 50% (v/v) do volume de cultura foi removido (Figura 4c). Portanto, a concentração de biomassa foi reduzida para 158 g L-1. Interessantemente, a concentração de biomassa voltou a 240 gL-1 com um teor de lipídios de 87,5% (plipídio/psbiomassa) nas 32 horas subsequentes de fermentação.

[0082] No final da operação, a produtividade total de lipídios foi de 0,8 gL-1 h-1 [biomassa 240 gL-1 lipídio 87,6% (plipídio/psbiomassa)]. No entanto, a eficiência do carbono em relação à formação de lipídios foi de 0,39 g g-1. No entanto, esse valor de produtividade não leva em conta a quantidade de cultura coletada, que superou 80% (v/v) do volume da cultura original. A densidade celular extremamente alta e o teor de lipídios podem ser manifestados visualmente através de uma viscosidade extremamente alta e hidrofobicidade das células quando expostas à água.

[0083] Cepa: Cutaneotrichosporon oleaginosus (ATCC 20509) foi cultivada em frascos Erlenmeyer contendo caldo do meio YPD (10 g L-1 de extrato de levedura, 20 g L-1 de peptona e 20 g L-1 de glicose) contendo antibióticos (10 mg L-1 de ampicilina, 10 mg L-1 canamicina e 12 mg L-1 de tetraciclina). Os frascos foram incubados em agitador rotativo a 100 rpm e uma temperatura de 28ºC por 2 dias, então foram usados como inóculo.

[0084] Meio D: glicose 30 g L-1, extrato de levedura 0,5 g L-1, peptona 5 g L-1, acetato de sódio 4,1 g L-1, NH4Cl 0,5 g L-1, KH2PO4 2,4 g L- 1 , Na2HPO4. 12H2O 0,9 g L-1, MgSO4. 7H2O 1,5 g L-1, FeCl3. 6H2O 0,08 g L- 1 , ZnSO4. 7H2O 0,01 g L-1, CaCl2. 2H2O 0,1 g L-1, MnSO4. 5H2O 0,1 mg L-1, CuSO4. 5H2O 0,1 mg L-1, Co(NO3)2. 6H2O 0,1 mg L-1.

[0085] Meio E: extrato de levedura, 1,0 g.L-1, peptona 1,0 g.L-1, NH4Cl 0,5 g.L-1, KH2PO4 2,4 g.L-1, Na2HPO4. 12H2O 0,9 g.L-1 MgSO4. 7H2O 1,5 g.L-1, FeCl3. 6H2O 0,08 g.L-1, ZnSO4. 7H2O 0,01 g.L-1, CaCl2. 2H2O 0,1 g.L-1, MnSO4. 5H2O 0,1 mg.L-1, CuSO4. 5H2O 0,1 mg.L-1, Co(NO3)2. 6H2O 0,1 mg.L-1.

[0086] Biorreator de 2-L: O cultivo em lotes descontínuos alimentado de T. oleaginosus foi realizado em um biorreator de 2-L (sistema de INFORS HT, Suíça) com um volume de trabalho de 1 L do meio correspondente. A temperatura foi mantida constante a 28 °C e o pH do biorreator foi ajustado para pH 6,5 ± 0,2 com NaOH 1 M ou HCl 1 M (no caso da fermentação de glicose) e ácido acético 50% (em caso de fermentação AA). A agitação (de 350 a 1000 rpm) e aeração (de 1,0 a 2,0 NL/V de ar) foram reguladas automaticamente para manter o oxigênio dissolvido acima de 50%. A espuma foi prevenida pela adição de 0,01% (V/V) de um agente antiespuma (Antifoam 204, Sigma Aldrich). Exemplo 6 (co-fermentação de ácido acético e glicose em meio rico em nitrogênio - Um modo de operação contínuo se ampliando)

[0087] Para validar os dados dos inventores em escalas tecnicamente relevantes, uma co-fermentação em meio rico em N foi conduzida em uma escala de 25 L. A fermentação foi operada em um modo contínuo pelo uso de ácido acético a 50% (p/p) como diluição contínua. Como a levedura inicia um metabolismo de ácido acético significativo cerca de 48 h após o início da execução experimental, há uma diluição crescente do volume do reator conforme a alimentação de ácido acético foi efetuada a uma concentração de 50% (p/p). A esse respeito, deve-se notar que com o aumento do metabolismo do ácido acético ao longo do período experimental, o fator de diluição aumentou consecutivamente.

[0088] Nas primeiras 24h, a alimentação de ácido acético foi de 2 kg por dia e, a posteriormente, aumentou exponencialmente para 6 kg em 96h. Nessa taxa de alimentação, o volume de cultura aumentou 4,5 L em 96h [aumento de volume de 18% (v/v)], o que corresponde a uma diluição de 7,5 mL L-1h-1. Este aumento de volume foi compensado por uma coleta diária de um volume de cultura equivalente (4,5L dia-1). Após 96h, uma contagem de células constantes OD (por citometria de fluxo) puderam ser detectadas, o que foi atribuído a um equilíbrio entre a taxa de crescimento e o fator de diluição aplicado da reação (Figura 5a e 5b). No entanto, enquanto a contagem de células era constante, um aumento contínuo na formação de biomassa foi medido, o qual pode ser atribuído a um aumento constante nos lipídios intracelulares (Figura 5c e 5d). Portanto, o aumento na biomassa é apenas devido à expansão do volume celular, que está correlacionado com uma expansão volumétrica das vesículas lipídicas intracelulares, detectada por citometria de fluxo (Figura 12). A Figura 13 mostra as alterações no perfil de ácidos graxos ao longo do tempo de fermentação.

[0089] Com base nos dados atuais em escala de 25 L, a alimentação com ácido acético 50% (plipídio/psbiomassa) permite a coleta de 20% (v/v) do volume de fermentação diariamente ou continuamente sem qualquer impacto na densidade da cultura. No entanto, ampliando este processo para um fermentador de 10.000 L, o volume diário coletado será de 1.800 litros contendo 108 kg de óleo. Esta quantidade pode ser continuamente transferida para o processo a jusante.

[0090] Com modalidades do novo processo de acordo com a presente invenção, os presentes inventores substituíram as melhores produtividades de lipídios relatadas para várias leveduras oleaginosas e condições de cultivo: A esse respeito, a produtividade de lipídio de Lipomyces starkey em uma co-fermentação de 90 gL-1 celobiose e xilose era 0,12 g L-1 h-1 [Biomassa 31,5 g L-1, lipídio 55% (plipídio/psbiomassa)] (Z. Gong, Q. Wang, H. Shen, C. Hu, G. Jin e ZK Zhao, Bioresource Technol., 2012, 117, 20-24.). No caso de meio complexo, o uso de hidrolisado de palha de milho, por exemplo, leva a uma produtividade de lipídio de 0,23 g L-1 h-1 [Biomassa 48 gL-1, lipídio 34% (plipídio/psbiomassa)] com Rhodotorula graminis (S. Galafassi, D. Cucchetti, F. Pizza, G. Franzosi, D. Bianchi e C. Compagno, Bioresource Technol., 2012, 111, 398-403). Da mesma forma, Rhodosporidium toruloides Y4 cultivado em um fermentador de tanque agitado de 15 L com glicose proporcionou uma produtividade lipídica de 0,54 g L-1 h-1, [Biomassa 106,5 gL-1, lipídeo 67,5% (plipídio/psbiomassa)] (Y. Li, ZK Zhao e F. Bai, Enzyme Microbial Technol., 2007, 41, 312-317).

[0091] Com relação ao desempenho relatado de C. oleaginosus, uma fermentação pH-stat com base em ácido acético adquiriu uma produtividade de 0,66 g L-1 h-1 [Biomassa 168 g L-1, lipídio 75% (plipídio/psbiomassa)] (Z. Chi, Y. Zheng, J. Ma e S. Chen, Int. J. Hydrogen Energ., 2011, 36, 9542-9550). Além disso, uma cepa geneticamente otimizada de Yarrowia lipolytica NS432 alcançou uma produtividade de0,73 g L-1 h-1 [Biomassa 110 gL-1, lipídio 77% (plipídio/psbiomassa)] em uma fermentação de glicose em lote descontínuo alimentado (J. Friedlander, V. Tsakraklides, A. Kamineni, EH Greenhagen, AL Consiglio, K. MacEwen, DV Crabtree, J. Afshar, RL Nugent e MA Hamilton, Biotechnol. Biofuels, 2016, 9, 77.). No entanto, os melhores dados da literatura foram obtidos em uma cultura de lote rica em oxigênio de Rhodotorula glutinis com uma produtividade de 0,87 g L-1 h-1[Biomassa 185 g L-1, lipídio 40% (plipídio/psbiomassa)] (JG Pan, MY Kwak e JS Rhee, Biotechnol. Lett., 1986, 8, 715-718). Com relação a Rhodotorula glutinis, deve-se notar que esta levedura oleaginosa, além dos triglicerídeos, gera quantidades significativas de ß-caroteno (lipídios à base de terpeno), o que pode interpretar o rendimento geral de lipídios neste relatório. Com base nos dados atuais dos inventores e relatórios cumulativos da literatura, parece que vários parâmetros, tais como, concentração de ácido acético, composição geral do meio, pH, tempo de fermentação, aeração e o próprio sistema de fermentação podem modular a produtividade de lipídios.

[0092] Neste ponto do procedimento de otimização, os presentes inventores aplicaram com sucesso um meio definido à base de açúcar e ácido orgânico, por exemplo, ácido acético, co-fermentação com C. oleaginous em lote descontínuo alimentado, modo de processo semicontínuo ou contínuo, até uma escala de 25 L. Nessa escala, a melhor produtividade de lipídio de 1,2 g L-1 h-1 foi alcançada com um modo de fermentação semicontínuo utilizando rico em N sintético (meio D) e ácido acético. Este número é uma melhoria de 138% na formação de lipídios em relação à melhor produtividade de lipídios relatada para Rhodotorula glutinis. No entanto, um aumento adicional no rendimento e produtividade de lipídios foi alcançado neste estudo, quando o hidrolisado de células de levedura foi usado como fonte de carbono.

[0093] Cepa: Cutaneotrichosporon oleaginosus (ATCC 20509) foi cultivada em frascos Erlenmeyer contendo caldo do meio YPD (10 g L-1 de extrato de levedura, 20 g L-1 de peptona e 20 g L-1 de glicose) contendo antibióticos (10 mg L-1 de ampicilina, 10 mg L-1 canamicina e 12 mg L-1 de tetraciclina). Os frascos foram incubados em agitador rotativo a 100 rpm e uma temperatura de 28ºC por 2 dias, então foram usados como inóculo.

[0094] Meio D: glicose 30 g L-1, extrato de levedura 0,5 g L-1, peptona 5 g L-1, acetato de sódio 4,1 g L-1, NH4Cl 0,5 g L-1, KH2PO4 2,4 g L- 1 , Na2HPO4. 12H2O 0,9 g L-1, MgSO4. 7H2O 1,5 g L-1, FeCl3. 6H2O 0,08 g L- 1 , ZnSO4. 7H2O 0,01 g L-1, CaCl2. 2H2O 0,1 g L-1, MnSO4. 5H2O 0,1 mg L-1, CuSO4. 5H2O 0,1 mg L-1, Co(NO3)2. 6H2O 0,1 mgL-1.

[0095] Meio E: extrato de levedura, 1,0 g L-1, peptona 1,0 g L-1, NH4Cl 0,5 g L-1, KH2PO4 2,4 g L-1, Na2HPO4. 12H2O 0,9 g L-1 MgSO4. 7H2O 1,5 g L-1, FeCl3. 6H2O 0,08 g L-1, ZnSO4. 7H2O 0,01 g L-1, CaCl2. 2H2O 0,1 g L-1, MnSO4. 5H2O 0,1 mg L-1, CuSO4. 5H2O 0,1 mg L-1, Co(NO3)2. 6H2O0,1 mg L-1.

[0096] Biorreator de 50 L: O cultivo de lote descontínuo alimentado de T. oleaginosus foi realizado em um biorreator de 50 L (Bio- Engineer, EUA) com um volume de trabalho de 50 L do meio correspondente. A temperatura foi mantida constante a 28 °C e o pH do biorreator foi ajustado para pH 6,5 ± 0,2 com NaOH 1 M ou HCl 1 M (no caso da fermentação de fungos) e ácido acético 50% (no caso de fermentação AA). Agitação (de 350 a 800 rpm), aeração (de 1,0 a 2,0 NL/V de ar) e pressão (0,2-1 bar) foram regulados automaticamente para manter o oxigênio dissolvido acima de 60%. A espuma foi prevenida pela adição de 0,01% (V/V) de um agente antiespuma (Antifoam 204, Sigma Aldrich).

1.2. Processamento a jusante e recuperação de lipídios Exemplo 7 (Produção das enzimas de hidrólise)

[0097] Dois mutantes de T. reesei, RUT C-30 (ATCC 56765) e (ATCC 13631), foram cultivados individualmente em um fermentador de escala de 50 litros usando glicose como fonte de carbono inicial. No segundo dia de fermentação, o teor de glicose no meio estava quase esgotado. Posteriormente, a biomassa parcialmente purificada de C. oleaginosus a biomassa foi adicionada ao meio de fermentação na concentração de 10 g L-1 (Meio F). Observação visual e subsequente análise de açúcar foram usadas para seguir o desvanecimento das células de C. oleaginosus ao longo do tempo [Dados não mostrados]. Isso indica que T. reesei foi capaz de hidrolisar as células de C. oleaginosus e utilizá- las como uma fonte de carbono. No terceiro dia de cultivo, os restos de células de C. oleaginosus estavam completamente decompostos. A fermentação continuou por mais um dia para estressar os fungos e induzir a secreção da enzima hidrolase máxima. Centrifugação, filtração de meio com filtração de fluxo cruzado de 10 kDa e troca de tampão foram subsequentemente aplicadas para concentrar, enriquecer e purificar a enzima hidrolase. A solução enzimática final foi de cerca de 1 L com uma concentração de proteína de 3,2-3,5% (pproteína/vsolução) da solução de enzimas de RUT C-30 (ATCC 56765) e (ATCC 13631), respectivamente.

[0098] Quatro etapas foram seguidas para avaliar as atividades enzimáticas: 1-incubação com polissacarídeos puros, 2- incubação com a biomassa de levedura purificada, 3- incubação com cultura real. Subsequentemente, e 4- escalonamento para 25 litros para verificar as atividades enzimáticas.

[0099] Fungos: Trichoderma reesei RUT C-30 (ATCC 56765) e (ATCC 13631) foi ativado no meio LB (5 g L-1 de extrato de levedura, 10 g L-1 de Triptona). Foi usado então como inóculo para a fermentação

[00100] Meio F: parede celular TO 10 g.L-1, extrato de levedura 10 g.L-1, glicose 10 g.L-1, (NH4)2SO4 1,4 g.L-1, KH2PO4 2 g.L-1, CaCl2·2H2O 0,4 g.L-1, MgSO4·7H2O 0,3 g.L-1, FeSO4·7H2O 0,005 g.L-1, CoCl2·6H2O

0,0037 g.L-1, MnSO4 H2O 0,0016 g.L-1, ZnSO4·7H2O 0,0014 .gL-1. A parede celular parcialmente purificada foi preparada da seguinte forma: Após a extração de lipídios, a biomassa residual de C. oleaginosus foi lavada com água de dupla destilação (dd.) três vezes, seca por liofilização por 2 dias e triturada, então, usada como matéria-prima para T. reesei.

[00101] Biorreator de 50 L: O cultivo de lote descontínuo alimentado de T. oleaginosus foi realizado em um biorreator de 50 L (Bio- Engineer, EUA) com um volume de trabalho de 50 L do meio correspondente. A temperatura foi mantida constante a 28 °C e o pH do biorreator foi ajustado para pH 6,5 ± 0,2 com NaOH 1 M ou HCl 1 M (no caso da fermentação de fungos) e ácido acético 50% (no caso de fermentação AA). Agitação (de 350 a 800 rpm), aeração (de 1,0 a 2,0 NL/V de ar) e pressão (0,2-1 bar) foram regulados automaticamente para manter o oxigênio dissolvido acima de 60%. A espuma foi prevenida pela adição de 0,01% (V/V) de um agente antiespuma (Antifoam 204, Sigma Aldrich). Exemplo 8 (Avaliação de enzimas produzidas em polissacarídeos puros - etapa de ensaio de atividade 1 e biomassa de levedura pura - etapa de ensaio de atividade 2)

[00102] Durante a incubação da solução de enzima (a 0,35% (penzima/pssubstrato)) com substratos de açúcar polimérico puro, os presentes inventores puderam detectar atividades enzimática de celulase, xiloglucanase, β-glucosidase, mananase, xilanase e laminarinase em ambas as preparações [Dados não são mostrando]. Subsequentemente, os sistemas enzimáticos resultantes foram testados em preparações de parede celular purificadas de C. oleaginosus. As Figuras 6a e 6b mostram a diminuição do peso da biomassa residual ao longo do tempo de incubação, onde apenas menos de 16 e 20% (p/p) de biomassa permaneceu após 28 horas de incubação com solução de enzima a partir de ATCC13631 e ATCC56765, respectivamente.

[00103] Ensaio de atividade enzimática: para testar as atividades enzimáticas de celulase, xiloglucanase, β-glucosidase, mananase, xilanase e laminarinase, 50,0 mg de celulose, xiloglucano, celobiose, manana, xilana e laminarina foi incubada com 1 ml de tampão (acetato de Na, 50 mM, pH 5,0) e 0,35% (p/pbiomassa) de solução de enzima. Para testar a atividade da enzima da biomassa de C. oleaginosus, 50,0 mg de parede celular parcialmente purificada foram incubados com 1 ml de tampão (acetato de Na, 50 mM, pH 5,0) e 0,35% (p/pbiomassa) de solução de enzima. Todos os testes foram incubados por 28 horas a 50 °C. A análise gravimétrica/açúcar (HPLC) foi usada para seguir a hidrólise. Exemplo 9 (Avaliação de enzimas produzidas em cultura fresca - etapa 3 do ensaio de atividade)

[00104] Posteriormente, as soluções enzimáticas foram testadas em uma cultura fresca de C. oleaginosus. Para comparação, foram preparadas duas misturas de sistemas enzimáticos comerciais. Essas duas misturas, denominadas Mix 1 e 2, continham as mesmas atividades enzimáticas do sistema enzimático derivado de T. reesei. A concentração final de proteína em ambas as misturas foi de 14,2 a 14,5% (pproteína/vsolução), respectivamente. Individualmente, 100 µl de cada um dos quatro sistemas enzimáticos foram incubados com 1,0 g de biomassa em 5,0 ml de tampão de acetato (50 mM, pH 5,0) por 18 horas. Usar o mesmo volume da preparação de enzima leva a uma razão de enzima/biomassa diferente (p/p). Nesse sentido, a relação de enzima: biomassa foi de cerca de 1,4% (penzima/psbiomassa) nas misturas comerciais e cerca de 0,35% (penzima/psbiomassa) para o sistema de enzima gerado por T. reesei, respectivamente. No caso das misturas comerciais, de 40 a 48% (p/p) de biomassa foi solubilizada em comparação com 57 a 63% (p/p) com a preparação de enzima derivada de T. reesei (Figura 6c). No entanto, cerca de 40% (p/p) de lipídio foi liberado em todas as preparações (Figura 6d).

[00105] Ensaio 2 de atividade enzimática: A parede celular parcialmente purificada foi preparada da seguinte forma: Após a extração de lipídios, a biomassa residual de C. oleaginosus foi lavada com água de dd. três vezes, seca por liofilização por 2 dias e triturada, então, usada como matéria-prima para T. reesei. As misturas enzimáticas comerciais são: Mix 1: Mananase (Clariant-Suíça), Cellic Ctec2 (Novozymes- Dinamarca), Cellic Htec (Novozymes-Dinamarca) e β-glucosidase (Novozymes-Dinamarca). Mix 2: Liquebeet (Clariant- Suíça), CLA (Clariant- Suíça), Mananase (Clariant-Suíça), 1,3-β-glucanase (Megazyme-França) e β-glucosidase (Novozymes-Dinamarca). Exemplo 10 (Avaliação das enzimas produzidas na escala de 25 L - etapa 4 do ensaio de atividade)

[00106] Subsequentemente a experimentos com base em laboratório, os presentes inventores validaram o procedimento de lise de C. oleaginosus à base de enzima com uma fermentação em escala de 25 L. A fermentação inicial de C. oleaginosus foi efetuada conforme descrito acima, onde o crescimento de C. oleaginosus foi interrompido pela interrupção da aeração. Neste ponto, nenhuma coleta de biomassa foi efetuada. Em vez disso, a temperatura do fermentador foi aumentada para 45 °C, o pH foi ajustado para 4,5 e a velocidade do agitador foi aumentada para 800 rpm para habilitar a subsequente lise com base em hidrolase de T. reesei de células de C. oleaginosus contendo alto teor de lipídios. A lise celular foi iniciada pela adição de 0,4% (penzima/psbiomassa) de cada preparação de enzima de T. reesei [a concentração total foi de 0,8% (penzima/psbiomassa)]. Após 20 horas de tratamento, as condições de reação foram modificadas; pH a 7,0, temperatura a 37 °C. Posteriormente, 0,5% (penzima/psbiomassa) da preparação de protease comercial (Lavergy™, BASF) foi adicionado para quebrar as proteínas celulares e induzir a demulsificação da reação, que auxilia na liberação de lipídios.

[00107] A lise celular resolvida no tempo e os procedimentos de liberação de lipídios foram analisados por meio de contagens de células com base em citometria de fluxo e liberação de açúcar com base em HPLC. A Figura 7a mostra o gráfico de densidade celular como uma população localizada na área celular intacta (R3). Ao longo do tempo de hidrólise, a densidade celular na área R3 diminui, no entanto, uma nova população na área menor (R4) é gerada. Esta nova população representa os restos celulares. As contagens de células (Figura 7c) confirmam as mudanças no gráfico de densidade pela queda na contagem de células de 983 x106 células mL-1 antes da hidrólise enzimática para 139 x106 células mL-1. A análise do açúcar (Figura 7b) mostra o aumento no teor de açúcar ao longo do tempo de hidrólise.

[00108] Esses dados foram suplementados adicionalmente com microscópio de fluorescência, o que permitiu uma percepção visual do processo de lise (Figura 8a). Posteriormente, a biomassa foi submetida a centrifugação, onde a fração da camada superior continha o lipídio liberado em uma forma interessantemente pura. A esse respeito, as Figuras 8b, 8c e 8d mostram o lipídio liberado após o tratamento enzimático antes e após a centrifugação. Dados cumulativos demonstram que 85% (p/p) das células de levedura C. oleaginosus foram hidrolisadas e cerca de 90% (p/p) do lipídio intracelular total foi liberado com sucesso.

[00109] Biorreator de 50 L: O cultivo de lote descontínuo alimentado de T. oleaginosus foi realizado em um biorreator de 50 L (Bio- Engineer, EUA) com um volume de trabalho de 50 L do meio correspondente. A temperatura foi mantida constante a 28 °C e o pH do biorreator foi ajustado para pH 6,5 ± 0,2 com NaOH 1 M ou HCl 1 M (no caso da fermentação de fungos) e ácido acético 50% (no caso de fermentação AA). Agitação (de 350 a 800 rpm), aeração (de 1,0 a 2,0 NL/V de ar) e pressão (0,2-1 bar) foram regulados automaticamente para manter o oxigênio dissolvido acima de 60%. A espuma foi prevenida pela adição de 0,01% (V/V) de um agente antiespuma (Antifoam 204, Sigma Aldrich).

[00110] O processo a jusante, em particular a extração de lipídios, tem um impacto significativo tanto na eficiência econômica quanto ecológica do processo, bem como na qualidade do produto no que diz respeito a setores de mercado certificados, tal como a indústria de alimentos. Processo de produção de lipídios a jusante convencionalmente processado em cinco etapas; concentração de biomassa com base em densidade (tal como separador de disco), destruição de células (como um homogeneizador de alta pressão), extração de solvente (tal como hexano ou clorofórmio) e, finalmente, separação e recuperação de solvente (tal como separador de tipo sólido/líquido seguido por um evaporador de efeito único). Além do alto custo, muitos obstáculos técnicos impedirão a aplicação industrial desses processos para a geração comercial de óleos microbianos. Em primeiro lugar, o alto teor de lipídios (mais de 50% (plipídio/psbiomassa)) das células previne a separação eficiente, pois as células com alto teor de lipídios permanecerão suspensas no sobrenadante ou flutuadas como camada não fixada no topo em centrifugação com alta força g (cerca de 50.000 g) (Figura 14) que tornam a etapa de coleta ineficiente. Na etapa subsequente, as células de levedura rígidas fazem homogeneização de alta pressão, mesmo em etapas insuficientes. A Figura 15 mostra uma micrografia de dispersão de elétrons para células de levedura após 3 ciclos de homogeneização de alta pressão a 2.400 bar (ou seja, não tratada de acordo com a presente invenção). Finalmente, as células homogeneizadas precisam ser extraídas por meio de um solvente orgânico. Para esse fim, os lipídios extraídos com solventes orgânicos são difíceis de certificar para aplicações de alimentos e rações de alto valor. Além da qualidade do produto, os solventes orgânicos irão se acumular na água do processo e também nos fluxos de resíduos celulares, o que faz com que ocorra um problema ambiental significativo na valorização ou reciclagem desses fluxos de processo.

[00111] Neste estudo, os presentes inventores desenvolveram um novo processo de tratamento enzimático in situ que permite uma lise celular quantitativa e recuperação/purificação de lipídios sem a necessidade de um pré-tratamento ou aplicação de uma etapa de recuperação de lipídios auxiliada por solvente orgânico. No entanto, os produtos da hidrólise de carboidratos e proteínas (os açúcares monoméricos e aminoácidos) podem ser potencialmente reusados em fermentações subsequentes, uma vez que não estão contaminados com quaisquer vestígios de solvente.

1.3. Reciclagem de biomassa e frações de hidrolisado Exemplo 11 (Teste do hidrolisado de levedura como meio de fermentação - Experiência de reciclagem)

[00112] Inicialmente, 500 mL de meio G foram utilizados no primeiro ciclo de cultivo de C. oleaginosus. A Figura 9 mostra a taxa de crescimento inicial de C. oleaginosus ao longo do tempo de fermentação. Com este conjunto experimental, a produtividade de lipídio foi de 1,23 g L-1 h-1 [Biomassa 72g L-1, Lipídio 77% (plipídio/psbiomassa)] após 45 h. No final da fermentação (às 138 h) a produtividade de lipídio era de 0,71 g L-1 h-1 [biomassa 115,6 L-1, Lipídio 85% (plipídio/psbiomassa)].

[00113] Subsequentemente, a lise da biomassa de C. oleaginosus e a liberação de lipídios foram mediadas por tratamentos subsequentes de gluco-hidrolase e protease, conforme descrito acima. O hidrolisado líquido resultante contendo açúcares, aminoácidos e micronutrientes foi filtrado por filtro cruzado de 10 KDa para esterilização e para remover os resíduos enzimáticos restantes. Posteriormente, o hidrolisado foi ajustado para 60g L-1 de glicose e usado como o meio de fermentação em um ciclo de cultivo adicional.

[00114] Interessantemente, com este meio de fermentação contendo hidrolisado, a produtividade da biomassa aumentou consideravelmente para 147 gL-1 após 45 h. Concomitantemente, a produtividade de lipídeo foi registrada como sendo 2,4 L-1 h-1[biomassa 147g L-1, Lipídio 73% (plipídeo/psbiomassa)]. Estes resultados podem ser reproduzidos exatamente na terceira execução da cultivação seguinte (Figura 9). As produtividades de biomassa e lipídios, bem como os respectivos rendimentos totais são superiores a qualquer um dos resultados prévios. Consequentemente, esses dados excedem significativamente os melhores valores da literatura para produtividades de biomassa e lipídios 45 em 1,5 e 2,9 vezes, respectivamente . Além disso, os dados atuais dos presentes inventores indicam que as produtividades de biomassa e lipídios superiores são obtidas nas primeiras 45 horas do experimento. Portanto, os presentes inventores sugerem que para uma fermentação eficiente em termos de custo e massa, um curto tempo de cultivo de 45 a 72h é suficiente para obter rendimentos máximos.

[00115] Meio G: Glicose 50-60 g.L-1, extrato de levedura 5 g.L-1, Peptona 5 g.L-1, (NH4)2SO4 1,4 g.L-1, KH2PO4 2 g.L-1, CaCl2·2H2O 0,4 g.L-1, MgSO4·H2O 0,3 g.L-1, FeSO4·7H2O 0,005 g.L-1, CoCl2·6H2O 0,0037 g.L-1, MnSO4·H2O 0,0016 g.L-1, ZnSO4·7H2O 0,0014 g.L-1.

[00116] Biorreator 1-L: Sistema de biorreator paralelo DASGIP® (Eppendorf, Alemanha) com um volume de trabalho de 4 vezes 1 L do meio correspondente. A temperatura foi variada de 28 a 30 °C, e o pH do biorreator foi ajustado para pH 7,0 a 6,5 ± 0,2 com NaOH 1 M ou ácido acético 70 a 100%. Agitação (de 350 a 800 rpm), proporção de oxigênio (de 21 a 100%) e aeração (de 1,0 a 2,0 NL/V de ar) foram regulados automaticamente para manter o oxigênio dissolvido acima de pO2≥ 50%. A espuma foi prevenida pela adição de 0,01% (V/V) de um agente antiespuma (Antifoam 204, Sigma Aldrich).

[00117] Os presentes inventores apresentaram um sistema de co-fermentação de C. oleaginosus que habilita a assimilação simultânea da fonte de carbono e do ácido orgânico, por exemplo, açúcar e ácido acético levando a rendimentos de biomassa e lipídeos simultaneamente elevados sem a necessidade de restrição de nutrientes. Enquanto o lipídio é considerado a principal fonte de rendimento para este processo, a biomassa residual após a extração do lipídio é convencionalmente considerada um produto secundário de baixo valor. Em processos padrão que dependem de extração/purificação de lipídios assistida por solvente, este fluxo lateral de biomassa é contaminado com resíduos de solvente e deve ser tratado como um fluxo de desperdícios ambientalmente prejudicial que deve ser descartado sob rígidos requisitos regulamentares que adicionam inerentemente custos de processo.

[00118] Em contraste com esses processos convencionais, a hidrólise enzimática dos presentes inventores converteu resíduos de biomassa de levedura em açúcares fermentáveis em uma concentração total de 18 g L-1, sem qualquer envolvimento de solventes orgânicos. Adicionalmente, o hidrolisado de levedura resultante também contém aminoácidos valiosos, fosfolipídios solúveis, minerais e metabólitos secundários hidrofílicos, que podem potencializar o crescimento de C. oleaginosus. Para esse fim, a reciclagem desse hidrolisado tem muitas vantagens, tais como economia de matéria-prima e eliminação de fluxos de desperdícios. Em experimentos subsequentes, os presentes inventores exploraram a reciclagem do lisado de células de C. oleaginosus como uma base de fermentação para cultivos em lote repetidos e produção de lipídios. Exemplo 12 (Teste de diferentes condições de operação)

[00119] Neste conjunto de experimentos, diferentes condições de operação foram aplicadas. A Tabela 1 mostra a configuração de operação aplicada.

[00120] Os resultados mostram que o estado do lipídio resultante a 20 °C (Tabela 1, Figura 16) está alterando de rígido/sólido para líquido conforme a temperatura de fermentação, bem como o oxigênio dissolvido é reduzido de 28 para 10 e de 70 para 30, respectivamente. No entanto,

baixa temperatura e oxigênio dissolvido resultam em óleo avermelhado escuro. Adicionar ácido crotônico ao ácido acético em combinação com baixa temperatura e oxigênio dissolvido melhora a cor do lipídio e o torna amarelo muito claro. ponto de Temperatura fluidez Fonte Estado do Código de de Oxigênio Ácido Código da configuração crescimento Dissolvido de orgânico lipídio DIN carbono em (20 °C) cor (°C) ISO 3016 (°C) Configuração Ácido 15 1 28 70 Glicose acético Rígido Claro Rígido/com 14 Configuração Ácido 2 28 40 Glicose acético pouco Claro líquido Configuração Ácido viscoso 11 3 16 50 Glicose acético rígido/líquido Claro 9 Amarelo Configuração Ácido escuro/ 10 50 Glicose Líquido/turvo 4 acético avermelhado claro 8 Amarelo Configuração Ácido 5 10 30 Glicose acético Líquido claro escuro/ avermelhado Ácido 5 Configuração v. Amarelo 10 50 Glicose acético/ácido Líquido claro 6 claro crotônico Ácido Líquido 5 Configuração v. Amarelo 10 30 Glicose acético/ácido altamente 7 claro crotônico claro

[00121] Cepa: Cutaneotrichosporon oleaginosus (ATCC 20509) foi cultivada em frascos Erlenmeyer contendo caldo do meio YPD (10 g L-1 de extrato de levedura, 20 g.L-1 de peptona e 20 g.L-1 de glicose) contendo antibióticos (10 mg L-1 de ampicilina, 10 mg L-1 canamicina e 12 mg L-1 de tetraciclina). Os frascos foram incubados em agitador rotativo a 100 rpm e uma temperatura de 28ºC por 2 dias, então foram usados como inóculo.

[00122] Meio D: glicose 30 g L-1, extrato de levedura 0,5 g L-1, peptona 5 g L-1, acetato de sódio 4,1 g L-1, NH4Cl 0,5 g L-1, KH2PO4 2,4 g L- 1 , Na2HPO4. 12H2O 0,9 g L-1, MgSO4. 7H2O 1,5 g L-1, FeCl3. 6H2O 0,08 g L- 1 , ZnSO4. 7H2O 0,01 g L-1, CaCl2. 2H2O 0,1 g L-1, MnSO4. 5H2O 0,1 mg L-1, CuSO4. 5H2O 0,1mg L-1, Co(NO3)2. 6H2O 0,1mg L

[00123] Biorreator 1-L: Sistema de biorreator paralelo DASGIP® (Eppendorf, Alemanha) com um volume de trabalho de 4 vezes 1 L do meio correspondente. A temperatura foi variada de 28 a 30 °C, e o pH do biorreator foi ajustado para pH 7,0 a 6,5 ± 0,2 com NaOH 1 M ou ácido acético 70 a 100%. Agitação (de 350 a 800 rpm), proporção de oxigênio (de 21 a 100%) e aeração (de 1,0 a 2,0 NL/V de ar) foram regulados automaticamente para manter o oxigênio dissolvido acima de pO2≥ 50%. A espuma foi prevenida pela adição de 0,01% (V/V) de um agente antiespuma (Antifoam 204, Sigma Aldrich). Exemplo 13

[00124] Neste experimento, os presentes inventores estudaram o efeito da aplicação de outros ácidos orgânicos como matéria-prima no crescimento da levedura oleosa, acumulação de lipídios e o perfil de ácidos graxos produzidos no óleo. Portanto, ácido acético (AA), ácido isobutírico (iBA), ácido isovalérico (iVA) e ácido crotônico (CA) foram aplicados como fonte(s) de ácido orgânico em co-fermentação com glicose. O uso de ácido acético no sistema de co-fermentação foi validado nos exemplos anteriores. Assim, o ácido acético foi usado como um controle neste exemplo.

[00125] O sistema de biorreatores DASGIP® de quatro paralelos da Eppendorf foi selecionado para este experimento. No biorreator 1, 100% de ácido acético foi aplicado como uma fonte de ácido orgânico, ao passo que uma mistura de 90% de ácido acético em combinação com 10% de ácido isobutírico, ácido isovalérico ou crotônico foi aplicada como misturas de ácido orgânico em biorreatores 2, 3 e 4, respectivamente.

[00126] Cepa: Cutaneotrichosporon oleaginosus (ATCC 20509) foi cultivada em frascos Erlenmeyer contendo caldo do meio YPD (10 g.L-1 de extrato de levedura, 20 g.L-1 de peptona e 20 g.L-1 de glicose) contendo antibióticos (10 mg.L-1 de ampicilina, 10 mg.L-1 canamicina e 12 mg.L-1 de tetraciclina). Os frascos foram incubados em agitador rotativo a 100 rpm e uma temperatura de 28ºC por 2 dias, então foram usados como inóculo.

[00127] Meio D: glicose 30 g L-1, extrato de levedura 0,5 g L-1, peptona 5 g L-1, acetato de sódio 4,1 g L-1, NH4Cl 0,5 g L-1, KH2PO4 2,4 g L-

, Na2HPO4. 12H2O 0,9 g L-1, MgSO4. 7H2O 1,5 g L-1, FeCl3. 6H2O 0,08 g L- 1 , ZnSO4. 7H2O 0,01 g L-1, CaCl2. 2H2O 0,1 g L-1, MnSO4. 5H2O 0,1 mg L-1, CuSO4. 5H2O 0,1 mg L-1, Co(NO3)2. 6H2O 0,1mg L.

[00128] Biorreator 1-L: Sistema de biorreator paralelo DASGIP® (Eppendorf, Alemanha) com um volume de trabalho de 4 vezes 1 L do meio correspondente. A temperatura variou de 28 a 30 °C, e o pH do biorreator foi ajustado para pH 7,0-6,5 ± 0,2 com NaOH 1 M ou ácido acético 100% ou mistura de ácido acético com outro ácido orgânico. Agitação (de 350 a 800 rpm), proporção de oxigênio (de 21 a 100%) e aeração (de 1,0 a 2,0 NL/V de ar) foram regulados automaticamente para manter o oxigênio dissolvido acima de pO2≥ 50%. A espuma foi prevenida pela adição de 0,01% (V/V) de um agente antiespuma (Antifoam 204, Sigma Aldrich).

[00129] GC-FID: Perfis de ácidos graxos foram medidos usando cromatografia gasosa com detector de ionização de chama (GC-FID) após metilação. A metilação foi feita brevemente incubando 1 mg de óleo com 1 ml de NaOCH3 (por 20 min a 80 °C). Foi adicionado, então, 1 ml de HCl (37% em metanol) e a mistura foi incubada novamente durante 20 min a 80 °C. Os ésteres metílicos de ácidos graxos resultantes (FAMEs) foram extraídos por hexano em GC-FID injetado (Shimadzu, Japão). O triglicerol C19:0 foi usado como um padrão interno.

[00130] O acúmulo de biomassa e lipídios revelou-se semelhante em todos os biorreatores. Isso confirma a possibilidade de aplicar iBA, iVA e CA como matéria-prima. No entanto, e em certa medida, a análise de GC- FID para os perfis de ácidos graxos mostrou uma distribuição de ácidos graxos variada dependendo da matéria-prima aplicada. As Figuras 17, 18, 19 e 20 mostram a alteração na intensidade do pico de C16:0, C18:0, C18:1 e C18:2, que pode ser atribuída a alterações nas concentrações de ácidos graxos contingentes ao ácido usado. Além disso, novos picos que se referem a um novo ácido graxo são detectados. Por exemplo, a Figura 17 mostra o perfil típico de ácidos graxos, que é obtido pela aplicação de ácido acético como matéria-prima. No entanto, a aplicação de 10% de iBA resulta na formação de C17:0 e C17:1 (Figura 18). Além disso, cinco picos desconhecidos adicionais foram formados intensamente no caso da aplicação de 10% de iVA (Figura 19). Conclusão

[00131] Os presentes inventores demonstram unidades de operação integradas para bioconversão de ácido acético e açúcar em lipídios sustentáveis em produtividade maximizada juntamente com geração de desperdícios e consumo de energia minimizados. Para esse fim, a lacuna de custo para lipídios à base de plantas foi consideravelmente reduzida.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a produção de lipídios microbianos, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas: a) prover um microrganismo oleaginoso; b) fazer crescer o referido microrganismo oleaginoso em um meio compreendendo uma fonte de carbono e um ácido orgânico, permitindo assim que o referido microrganismo oleaginoso produza lipídios microbianos; c) realizar um tratamento puramente enzimático do referido microrganismo oleaginoso crescido sem qualquer extração à base de solvente ou demulsificação à base de produtos químicos, para tornar os referidos lipídios microbianos produzidos passíveis de coleta subsequente; d) coletar os referidos lípidios microbianos produzidos por um método de separação com base na densidade.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido microrganismo oleaginoso é selecionado a partir de leveduras, fungos, bactérias e microalgas, em que, preferencialmente, o referido microrganismo oleaginoso é uma levedura oleaginosa, em que mais preferencialmente, a referida levedura oleaginosa é selecionada a partir do gênero Rhodospirillum, Trichosporon, Rhodosporidium, Rhodosporon, Candida, Cryptococcus, Lipomyces, Yarrowia, Rhodotorula, Apiotrichum e Cutaneotrichosporon.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a referida fonte de carbono é selecionada a partir do grupo que compreende carboidratos; aminoácidos; ácidos graxos; preferencialmente monossacarídeos, preferencialmente pentoses ou hexoses, mais preferencialmente glicose, xilose, manitol; oligossacarídeos; hidrolisados de tecidos animais, tecidos vegetais ou de microrganismos; e combinações de qualquer um dos anteriores, em que mais preferencialmente, a referida fonte de carbono é glicose.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o referido ácido orgânico é selecionado a partir do grupo que compreende ácido acético, ácido malônico, ácido oxálico, ácido cítrico, ácido propiônico, ácido valérico, ácido acrílico, ácido crotônico, ácido butírico, ácido isobutírico, ácido isovalérico, ácido 3-hidroxibutírico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido 2-hidroxibutírico, ácido láctico e o(s) respectivo(s) sal(is) de tal ácido, bem como misturas de qualquer um dos ácidos orgânicos anteriores, em que, preferencialmente, o referido ácido orgânico é ácido acético ou acetato.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o referido tratamento puramente enzimático do referido microrganismo oleaginoso crescido é um tratamento do referido microrganismo com uma hidrolase, sozinha ou em combinação com/seguida por uma protease.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida hidrolase foi obtida de um fungo, preferencialmente um fungo filamentoso, mais preferencialmente um fungo selecionado a partir do gênero Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Aureobasillium e Fusarium.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o referido método de separação com base na densidade é selecionado a partir da separação com base na gravidade natural, separação de fase assistida por gravidade e centrifugação, em que cada uma das referidas separações com base na gravidade natural, na separação de fases assistida por gravidade e na centrifugação são realizadas sozinhas ou em combinação com uma decantação, aspiração ou outro método de coleta mecânica.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as etapas b) e c) são realizadas dentro do mesmo receptáculo de reação.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa c) e/ou d) resulta em uma fase lipídica, uma biomassa residual do referido microrganismo oleaginoso e um hidrolisado do referido microrganismo oleaginoso, em que o referido método envolve uma realização repetida das etapas de b) a d), e em que o referido hidrolisado do referido microrganismo oleaginoso resultante das etapas c) e/ou d) é reusado/reciclado para a realização da etapa b).

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, particularmente a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as etapas de b) a d) são realizadas de 2 a n vezes, em que n é um número inteiro, selecionado a partir de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 e 6 ou de 7 a 10, quando dependente de qualquer uma das reivindicações 5 e 6, caracterizado pelo fato de que a referida hidrolase é obtida a partir de um fungo que foi cultivado na presença de um sistema de indução, em que, preferencialmente, o referido sistema de indução é um componente do referido microrganismo oleaginoso, preferencialmente um ou vários componentes da parede celular do referido microrganismo oleaginoso usado para a produção de lipídios microbianos, de modo a obter uma preparação de hidrolase que permite uma lise da parede celular do referido microrganismo oleaginoso.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o referido meio usado na etapa b) é um meio rico em nitrogênio, em que, preferencialmente, o referido meio rico em nitrogênio é um meio no qual a razão em peso de carbono para nitrogênio (C:N) é < 100, mais preferencialmente ≤ 80, e está, ainda mais preferencialmente, em uma faixa de 25 a 80.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o referido meio usado na etapa b) compreende adicionalmente uma fonte de nitrogênio, preferencialmente na forma de um hidrolisado de proteína, tal como peptona, triptona ou outro hidrolisado peptídico, em que, preferencialmente, o referido hidrolisado peptídico compreende tecido animal, tecido vegetal e/ou componentes do referido microrganismo oleaginoso.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 13, caracterizado pelo fato de que a referida protease, se presente, é selecionada a partir de proteases produzidas por Aspergillus sp., Streptomyces sp. ou Bacillus sp.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 14, caracterizado pelo fato de que a referida hidrolase obtida a partir do referido fungo é preparada separadamente e é usada na etapa c) como uma preparação líquida obtida diretamente a partir da cultura do referido fungo ou como uma preparação liofilizada que é subsequentemente reconstituída em solução para ser usada na etapa c).

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 15, caracterizado pelo fato de que a referida hidrolase contém uma ou várias atividades selecionadas a partir de atividades enzimáticas de celulase, xiloglucanase, beta-glucosidase, mananase, xilanase e laminarinase.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 16, caracterizado pelo fato de que o referido método é realizado em lotes descontínuos alimentados, de modo semicontínuo ou contínuo, em que, preferencialmente, o referido método envolve a adição repetida do referido ácido orgânico, preferencialmente do referido ácido acético ou acetato.