BR102014013453A2 - método para a produção de lipase de aspergillus niger utilizando resíduos do processameto de polpas de mangaba como substrato - Google Patents

Abstract

método para a produção de lipase de aspergillus niger utilizando resíduos do processamento de polpas de mangaba como substrato. a presente invenção consiste na produçao de lipase de aspergillus niger a partir da fermentação em estado sólido de resíduos do processamento de polpas de mangaba. a inovaçao do trabalho foi a utilização deste resíduo da indústria processadora de polpas de frutas do estado de sergipe, comumente descartado em lixos ou destinado a alimentação de porcos. o resíduo, o qual foi utilizado como única fonte de nutrientes, por possuir quantidade significativa de lipídeos em sua composição induz a produção da enzima durante a fermentação pelo micro-organismo sem a necessidade de adição de nenhum óleo como indutor. a lipase obtida apresentou boa estabilidade térmica nas temperaturas de 37°c, 50°c e 55°c, no ph ótimo de 5,0, podendo apresentar potencial para ser utilizada como biocatalisador em reações de modificação de lipideos (hidrólise, interesterificação ou esterificação) onde sejam exigidas temperaturas até 55 °c.

Description

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE LIPASE DE Aspergillus niger UTILIZANDO RESÍDUOS DO PROCESSAMENTO DE POLPAS DE MANGABA COMO SUBSTRATO

FINALIDADE, APLICAÇÃO, CAMPO DE UTILIZAÇÃO 001 A presente invenção refere-se a produção da enzima Lipase a partir do processo de fermentação em estado sólido de resíduos do processamento de polpas de mangaba utilizando o micro-organismo Aspergillus niger. Esta enzima constitui o mais importante grupo de biocatalisadores para aplicações biotecnológicas, principalmente, pela versatilidade de suas propriedades e fácil produção de massa. A aplicação de lípases em reações de hidrólise, interesterificação e sínteses de ésteres consistem nos processos mais promissores para a modificação de lipídeos. As reações de hidrólise envolvem o ataque na ligação éster do triglicerídeo na presença de moléculas de água para produzir glicerol e ácidos graxos (Coelho, M.A.Z.; Leite, S.G.F.; Rosa, M.F.; Furtado, A.A.L. (2001) em Aproveitamento de resíduos agroindustriais: produção de enzimas a partir da casca de coco verde. Boletim do CEPPA, 19, 1, 3342, 2001.) A reação de esterificação entre álcoois polihídricos e ácidos graxos livres é a reação inversa da hidrólise do glicerídeo correspondente. A interesterificação refere-se à troca de radicais acil entre um éster e um ácido (acidólise), um éster e um álcool (alcoólise) ou um éster e outro éster (transesterificação) (Paques, F.W.; Macedo, G.A. (2006) Lipases de látex vegetais: propriedades e aplicações industriais. Química Nova, 29,1, 93-99). 002 As lipases devido a diversidade nas suas propriedades enzimáticas e sua especificidade a substratos são muito atrativas para aplicações industriais na obtenção de vários produtos tais como: alimentos, detergentes, produtos farmacêuticos, cosméticos, produtos têxteis, entre outros (Hassan, F.; Shah, A.A.; Hameed, A. Industrial applications of microbial lípases (2006) Enzyme and Microbial Technology, 39, 235-251). 003 A inovação deste trabalho é a produção da enzima utilizando como único substrato para o microrganismo os resíduos do processamento de polpas de mangaba. 004 A lipase de Aspergillus niger é comercializada pela Sigma-Aldrich no valor de R$ 223,00 para 1 g e R$ 773,00 para 5 g do pó enzimático. O preço elevado de enzimas comerciais está associado ao processo de obtenção e purificação. O uso de resíduos agroindustriais como substrato para a produção de enzimas por fermentação em estado sólido pode reduzir os custos do processo. Neste sentido a presente pesquisa demonstra o potencial de um novo resíduo proveniente do processamento de polpas de mangaba para a obtenção de Lipase de Aspergillus niger.

ESTADO DA TÉCNICA 005 As lipases (triglicerol acil-hidrolases, E.C. 3.1.1.3) são definidas como hidrolases de ésteres contendo ácidos graxos de cadeia longa, saturados ou insaturados, com dez ou mais átomos de carbono, que atuam sobre as ligações ésteres de tri, di e monoacilgliceróis (GUTARRA et al., 2009). As lipases podem ser produzidas por plantas, animais e microrganismos. Geralmente, as comerciais são obtidas de uma variedade de microrganismos que as produzem intra ou extracelularmente através de processos fermentativos. A maioria das lipases de origem microbiana são produzidas por fungos filamentosos do seguintes gênero: - Aspergillus (Kamini, N.R.; Mala, J.G.S.; Puvanakrishnan, R. (1998). Lipase production from Aspergillus niger by solid-state fermentation using gingelly oil cake. Process Biochemistry, 33, 505-511.; Gulati, R.; Saxena, R. K.; Gupta, R. (2000) Fermentation and downstream processing of lipse from Aspergillus terreus. Process Biochemistry, 36, 149-155; Mahadik, N. D.; Puntambekar, U. S.; Bastawde, K. B.; Khire, J. M.; Gokhale, D. V. (2002). Production of acidic lipase by Aspergillus niger in solid, fermentation. Process Biochemistry, 38, 715-721; Saxena, R.K.; Davidson, W.S.; Sheoran, A.; Giri, B. (2003) Purification and characterization of na alkaline thermostable lipase from Aspergillus carneus. Process Biochemistry, 39, 239-247; Ellaiah, P.; Prabhakar, T.; Ramakrishna, B.; Taleb, A.T.; Adinarayana, K. (2004) Production of lipase by immobilized cells of Aspergillus niger. Process Biochemistry, 39, 525-528; Mhetras, N.C.; Bastawde, K.B.; Gokhale, D.V. (2009) Purification and characterization of acidic lipase from Aspergillus niger NCIM 1207. Bioresource Technology, 100,1486-1490.); - Mucor (Abbas, FL; Hiol, A.; Deyris V.; Comeau, L. (2002) Isolation and characterization of an extracellular lipase from Mucor sp strain isolated from palm fruit. Enzyme and Microbial Technology, 31, 968-975). 006 As lipases podem ser produzidas por processos em fermentação submersa ou fermentação em estado sólido. A fermentação em estado sólido é um processo microbiológico que ocorre, em grande parte, na superfície de materiais sólidos com capacidade de absorver ou conter água, com ou sem sólidos solúveis. A FES tem sido um método bastante utilizado devido a sua simplicidade, por requerer um menor volume quando comparada com a fermentação submersa (a qual utiliza grandes volumes de meios de cultivo líquidos), além de não requerer equipamentos complexos, e principalmente, devido a uma redução nos custos de produção de compostos interessantes para a indústria como as enzimas. 007 No processo de fermentação em estado sólido é necessário utilizar substratos sólidos contendo os nutrientes necessários para o crescimento do micro-organismo, o qual através de reações metabólicas irá produzir a enzima de interesse (Couto, S.R.; Sanromán, M.A. (2006). Application of solid-state fermentation to food industry- a review. Journal of Food Engineering, 76, 291-302). Neste contexto os resíduos agroindustriais, comumente descartados no ambiente ou em lixos, possuem vários nutrientes que podem servir como substrato para o crescimento de micro-organismos e consequentemente podem ser produzidos compostos de alto valor agregado. No caso específico da produção de lipases, o substrato sólido precisa ser rico em lipídeos, para estimular a produção destas enzimas pelo micro-organismo. 008 A Lipase de Aspergillus niger tem sido obtida por FES utilizando os seguintes resíduos agroindustriais: - Farelo de trigo suplementado com meio de cultivo para Aspergillus e óleo de oliva ou Til (630 U/g) obtido por Mahadik, N. D.; Puntambekar, U. S.; Bastawde, K. B.; Khire, J. M; Gokhale, D. V. (2002) em Production of acidic lipase by Aspergillus niger in solid, fermentation. Process Biochemistry, 38, 715-721. A máxima produção da enzima foi obtida em 120 h de fermentação. Quando o resíduo foi suplementado com óleo de Til e extração foi realizada com NaCl 1% + triton XI00 0,5% obteve-se produção máxima da enzima (630 U/g). A enzima apresentou máxima atividade em temperatura de 45°C e pH 7,0. Nas temperaturas de 50°C e 60°C a atividade relativa da enzima foi mantida em tomo de 100% durante 300 min de incubação. - Farinha de sementes de abóbora utilizada por Santos, A.C.R.; Araújo, B.K.; Soares, F.M.C.; Aquino, L.C.L. (2012).Evaluation of temperature and moisture response surface on the lipase from pumpkin seeds fermentation using Aspergillus niger. Acta Scientiarum Technology , 34, 3, 255-260. A máxima produção da enzima (71,88 U/ g seca de resíduo), à temperatura de 30°C e 30% de umidade resíduo em 120 h de fermentação. A enzima apresentou o pH ótimo 4,0 e maior estabilidade neste pH e temperatura ótima 37 °C, sendo a maior estabilidade em 30°C (Santos, A.C.R.; Araújo, B.K.; Soares, F.M.C.; Lima, A.S.; Aquino, L.C.L. (2014). Microbial lipase obtained from the fermentation of pumpkin seeds: Potential of immobilization in hydrophobic matrices que sera publicada na revista Acta Scientarium Tecnology (artigo no prelo)) - Farelo de trigo suplementado com compostos inorgânicos, extrato de levedura, glicose e óleo de oliva utilizado por Contesini, F.J., Silva, V.C.F., Maciel, R.F., Lima, R.J., Barros, F.F.C. Oliveira Carvalho, P. (2009). Response surface analysis for the production of an enantioselective lipase from Aspergillus niger by solid-state fermentation. The Journal of Microbiology, 47, 563571. Os autores obtiveram máxima produção da enzima de 28,99 U/mL em 96 horas de fermentação. Não foram realizados estudos das características bioquímicas da enzima. - Torta residual da produção de óleo de gergelim utilizada por Kamini, N. R.; Mala, J. G. S.; Puvanakrishnan, R. (1998). Lipase production from Aspergillus niger by solid-state fermentation using gingelly oil cake. Process Biochemistry, 33, 505-511. A máxima produção de lipase (363,6 U/g seca de resíduo) foi obtida em 72 h de fermentação. A enzima apresentou pH e temperatura ótimos de 7,0 e 37°C, foi estável em pH 4,0 à 10,0 e temperatura de 4 à 50°C. - Mistura de farelo de trigo, torta de óleo de coco e rawa de trigo utilizado por Edwinoliver, N.G.; Thirunavukarasu, K.; Naidu, R.B.; Gowthaman, M.K.; Kambe, T.N.; Kamini, N.R (2010). Scale-up of a novel of a tri-substrate fermentation for enhanced production of Aspergillus niger lipase for tallow hydrolysis. Bioresource Technology, 101, 6791-6796. A máxima produção de lipase foi 628,7U/g seca de resíduo à 30°C e 96 h de fermentação. Os autores não estudaram as características bioquímicas da enzima. - Farelo de soja e casca de arroz utilizado por Colla, L.M.; Rizzardi, J.; Pinto, M.H.; Reinehr, C.O.; Bertolin, T.E.; Costa, J.A.V. (2010). Simultaneous production of lipases and biosurfactants by submerged and solid substrate process. Bioresource Technology, 101, 8308-8314. A maxima produção de lipase de 25,22 U. Os autores não estudaram as características bioquímicas da enzima. - Foi publicado um trabalho preliminar pelo nosso grupo de pesquisa Souza, F.M.; Aquino, L.C.L. (2012) Potencial da farinha de sementes de mangaba para a produção de lipase de Aspergillus niger Influência da temperatura e umidade no processo. Revista Scientia Plena, 8, 12, 1-5. Especificamente esta publicação trata-se dos experimentos preliminares de produção de Lipase de Aspergillus niger de uma aluna de iniciação, sob minha orientação. Essa publicação não interfere na patente requerida pois o método utilizado para a determinação da atividade hidrolítica foi otimizado após essa publicação, baseado na metodologia utilizada por pesquisadores do nosso grupo de pesquisa que trabalham com produção e imobilização de lipases no Instituto de Tecnologia e Pesquisa da Universidade Tiradentes, Aracaju, Sergipe. Além disto, desta publicação não foram estudados diferentes solventes para a extração da enzima, a enzima não foi purificada e não foram determinadas as características bioquímicas. 009 Na base de busca de patentes WIPO foram encontrados pesquisas relacionados a lipases nos seguintes temas: - Métodos e compostos usados para a inibição de lipase; - Elaboração de composições contendo lipases para melhorar a digestibilidade - Novas formulações de detergentes surfactantes e bioinseticidas contendo lipase; - Isolamento de polipeptídeos com atividade de lipase; - descoberta de vários tipos de inibidores de lipase; - Uso de resíduo agroindustrial para a imobilização de enzimas, dentre elas lipase; - Desenvolvimento de suplementar alimentar com atividade lipolítica; - Métodos de produção de biodiesel e gorduras utilizando lipase como catalisador; - Método de produção de lipase por fermentação de Candida cylindracea usando o óleo de palma como substrato (WO/2013/109136); - obtenção de variantes de lípases a partir de lípases existentes; -Métodos de obtenção de patatina, lípase obtido de batatas; - Métodos usando patatina; - Obtenção de lípase recombinante usando Escherichia coli; -Métodos de imobilização de lípase; - Método para a produção de lípase alcalina usando Penicillium cyclopium (patente 102766612); - processos de interesterificação usando lípases; - Lipase isolada de plantas; - Método de produção de lípase por Yarrowia lipolytica (patente 102703404); -Método para tratamento de pacientes com deficiência de lípase; - produção de lípase a partir de novos micro-organismos (2450458) - Método de obtenção de lípase por Aspergillus niger RFW5 a partir da fermentação em estado sólido de resíduo de gorduras, (patente 102229919) - Método de obtenção de lípase por fermentação em estado sólido usando bactérias e farelo de trigo e resíduo de soja como substratos (patente 102191232); -Produção de lípase de Burkholderia sp. por fermentação submersa (patente ; WO/2011/081513) - Produção de lípase de Yarrowia lipolytica mutante por fermentação submersa (patente 101440350). - Método de obtenção de lípase a partir de várias linhagens de Aspergillus Niger (patente: 1730653); - Processo para preparação de policarbonato usando várias inclusive a lípase de Aspergillus Niger comercial (Lipase A) (patente : WO/2005/098013). 010 Na base de busca de patentes ESP@CENET foram encontrados pesquisas relacionados a lípases nos seguintes temas: - Obtenção de várias enzimas com propriedades específicas, dentre elas lípases, isoladas de micro-organismos dentre eles Aspergillus niger; - Lipase imobilizada 011 Na base de busca de patentes do INPI foram encontrados pesquisas relacionados a lípases nos seguintes temas: - composições farmacêuticas contendo lípase microbiana; -Lipase imobilizada em suporte solúvel; - Reações catalisadas por lípases; - Inibidores de lipase; - Produção de lípase recombinante - Composição de detergentes contendo lípase; - Produção de biodiesel contendo lípase como catalisador; -Aplicação de lípase em fermentação; -Método melhorado para a determinação de lípase; -Preparação de lipase, cepa de Streptomyces griseus, processo para produzir uma Preparação de lipase, e, composição detergente (PI 9307711-4) -Processo de produção de variante de lipase, aditivo de detergente, composição detergente e amaciante (PI 9406384-2) - Variante de lipase de uma lipase precursora, lipase A de C. Antarctica, sequência de DNA codificando lipase a de C. Antarctica, constructo de DNA , vetor de expressão recombinante, célula, método de produzir um variante de lipase e uso de uma lípase cultura biologicamente pura de uma espécie pertencendo ao genero hyphozyma, enzima lipolítica, processo para sua obtenção, processo para controle enzimatico de Breu (PI 9306694-5) 012 Não foram encontradas patentes sobre a utilização de resíduos do processamento da polpa de mangaba para a produção de Lipase de Aspergillus niger.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS 013 A FIGURA 1 mostra a Atividade hidrolítica da Lipase de Aspergillus niger obtida pela fermentação em estado sólido dos resíduos do processamento de polpa de mangaba após a extração com diferentes solventes. 014 A FIGURA 2 mostra a Máxima produção de Lipase de Aspergillus niger obtida pela fermentação em estado sólido dos resíduos do processamento de polpa de mangaba. 015 A FIGURA 3 mostra a Efeito do pH na atividade hidrolítica da Lipase de Aspergillus niger obtida pela fermentação em estado sólido dos resíduos do processamento de polpa de mangaba. 016 A FIGURA 4 mostra a Estabilidade em pH da Lipase de Aspergillus niger obtida pela fermentação em estado sólido dos resíduos do processamento de polpa de mangaba. 017 A FIGURA 5 mostra a Efeito da temperatura na atividade hidrolítica da Lipase de Aspergillus niger obtida pela fermentação em estado sólido dos resíduos do processamento de polpa de mangaba. 018 A FIGURA 6 mostra a Estabilidade térmica da Lipase de Aspergillus niger obtida pela fermentação em estado sólido dos resíduos do processamento de polpa de mangaba.

INVENÇÃO 019 Levando em consideração que a utilização e reciclagem de fontes renováveis resulta na chamada “tecnologia limpa”, onde resíduos agroindustriais que podem ser prejudiciais ao ambiente apresentam potencial de utilização para a obtenção de produtos de alto valor agregado e diante das vantagens já relatadas da fermentação em estado sólido para obtenção de lipases de origem microbiana, a presente invenção teve como objetivo a produção de Lipase de Aspergiüus niger utilizando como único substrato a farinha obtida dos resíduos do processamento da polpa de mangaba, comumente descartado em lixos ou destinado a alimentação de porcos pelas indústrias de polpas de frutas do Estado de Sergipe.

As etapas para a produção da Lipase de Aspergillus niger serão descritas a seguir: Tratamento dos resíduos 020 Os resíduos do processamento da polpa de mangaba (caracterizados por sementes de mangaba) foram coletados em uma Indústria de polpas de frutas situada em Aracaju-SE e conduzidos para o laboratório de Microbiologia de Alimentos no Departamento de Tecnologia de Alimentos da UFS. Os resíduos foram lavados e submetidos à secagem à temperatura de 60°C, durante 8 h (secador elétrico Pardal PE 100 Semi-industrial), em seguida foram triturados em liquidificador industrial, peneirados e esterilizados à 121°C durante 15 min. Após este processo, os resíduos foram caracterizados quanto aos teores de: umidade, proteínas, lipídios, carboidratos, acidez e pH. Todas as análises foram executadas em triplicata, de acordo com os métodos analíticos do Instituto Adolfo Lutz (2005).

Preparo da suspensão de esporos de Aspergillus niger 021 O micro-organismo IOC 3677 foi adquirido da coleção de culturas do Instituto Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro, Brasil), conservado em placas de petri com meio PDA (Dextrose ágar batata) e estocados a 4°C, no Laboratório de Microbiologia de Alimentos (LMA) da Universidade Federal de Sergipe (UFS). Os esporos contidos em 2 placas de petri foram raspados e adicionados à 50 mL de água destilada estéril para se obter uma concentração de esporos 107 esporos/mL determinada através da contagem em câmara de neubauer.

Produção de lipase microbiana 022 Os resíduos tratados (lOg) foram colocados em placas de petri e estes foram umedecidos com a solução de esporos de Aspergillus niger em água destilada estéril para se obter a umidade final do resíduo de 30%. A seguir as placas de petri foram colocadas em estufa bacteriológica para incubação à temperatura de 30°C. A cada 24 horas de fermentação coletou-se um fermentado para determinar a atividade hidrolítica e consequentemente determinar a máxima produção da enzima.

Extração da lipase 023 A extração da enzima foi testada com diferentes soluções: tampão fosfato de sódio 0,1 M, ρΗ 7,0, água destilada estéril, Cloreto de sódio 1% e tween 80 a 0,5% e cloreto de sódio 1%. Os experimentos foram realizados em erlenmeyers contendo o fermentado e as soluções na proporção 1:5, mantendo-se sob agitação à temperatura de 30 °C durante 15 min. A seguir, foi realizada a filtração em funil simples, a fim de obter-se o extrato bruto enzimático (a metodologia foi adaptada de Wolski, E.; Menusi, E.; Remonatto, D.; Vardanega, R.; Arbter, F.; Rigo, E.; Ninow, J.; Mazutti, M.A.; Di Luccio, M.; Oliveira, D.; Treichel, H. (2009). Partial characterization of lipases produced by a newly isolated Penicillium sp. in solid State and submerged fermentation: a comparative study. Food Science and Technology, 42, 1557-1560 e Edwinoliver, N.G.; Thirunavukarasu, K.; Naidu, R.B.; Gowthaman, Μ. K.; Kambe, T.N.; Kamini, N.R. (2010) Scale-up of a novel of a tri-substrate fermentation for enhanced production of Aspergillus niger lipase for tallow hydrolysis. Bioresource Technology, 101, 6791-6796). Purificação parcial da lipase produzida 024 O extrato enzimático obtido contendo lipase foi parcialmente purificado através de precipitação com sulfato de amônio. O procedimento consistiu em adicionar ao extrato enzimático sulfato de amônio a 80%, deixando-se à 4°C por 30 min. Em seguida, centrifugou-se a 1.000 rpm durante 10 min. O extrato obtido foi filtrado e dialisado (peso de corte de 10.000 a 12.000 kDa) contra água destilada a 4°C durante 20 h. (metodologia adaptada de Souza, R.L.; Resende, W.C.; Barão, C.E.; Zanin, G.M.; Castro, H.F.; Santos, O.A.A.; Fricks, A.T.; Figueiredo, R.T.; Lima, A.S.; Soares, C.M.F. (2012). Influence of the use of Aliquat 336 in the immobilization procedure in sol-gel of lipase from Bacillus sp. ITP-001. Jornal of Molecular Catalysis B- Enzymatic, 84, 152- 159). Após este tempo a lipase parcialmente purificada obtida foi liofilizada à -50°C e pressão de 40 pHg, Determinação da Atividade Hidrolítica 025 A atividade enzimática do extrato enzimático foi determinada pelo método de hidrólise do azeite de oliva de acordo com o procedimento adaptado de Soares, C.M.F.; Castro, H.F.; Moraes, F.F.; Zanin, G.M. (1999). Characterization and utilization of Candida rugosa lipase immobilized on controlled pore silica. Applied Biochemistry and Biotechnology, 77-79, 745758. Inicialmente preparou-se uma solução contendo 50 mL de azeite de oliva e 50 mL de goma arábica à 7%, a qual foi homogeneizada em liquidificador até ser obtido uma emulsão. Em frascos Erlenmeyeres de 125mL foram adicionados: 5 mL da emulsão, 2 mL de solução tampão fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0) e 1 mL de extrato enzimático. Os Erlenmeyers foram incubados à 37°C por 5 min em agitador orbital tipo” Shaker” à 150 rpm. Após este tempo, Erlenmeyers contendo 2mL de solução acetona-etanol-água (1:1:1) (usado para paralisar a reação) foram colocados na balança, tarou-se, e em seguida, adicionou-se 0,33 g da solução enzimática que reagiu. Em seguida, adicionou-se o indicador fenolftaleína e titulou-se os ácidos graxos produzidos. Os ácidos graxos liberados foram titulados com solução de KOH 0,04 M, utilizando fenolftaleína como indicador. 026 Uma unidade de atividade é definida como a quantidade de enzima que libera 1 pmol de ácido graxo por min. de reação, nas condições de ensaio (37°C/pH 7,0/150 rpm). As atividades foram expressas em (lU/g=lpmol/min). Para cada análise de atividade foi preparado um branco (controle) utilizando tampão fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0) em substituição ao extrato enzimático.

Propriedades bioquímicas da lipase de Aspergillus niger 027 As propriedades bioquímicas da enzima consistiram em verificar: o efeito do pH e da temperatura e a estabilidade em pH e temperatura. Estas informações são importantes para determinar quais são as condições melhores de pH e temperatura para a aplicação deste enzima como biocatalisador de reações. A metodologia utilizada para os experimentos foi adaptada de Soares, C.M.F.; Castro, H.F.: Moraes, F.F.; Zanin, G.M. (1999). Characterization and utilization of Candida rugosa lipase immobilized on controlled pore silica. Applied Biochemistry and Biotechnology, 77-79, 745-758. 028 A atividade da enzima foi expressa em atividade relativa (%) calculada dividindo-se a atividade hidrolítica da enzima em cada condição de pH ou de temperatura pela máxima atividade hidrolítica obtida no experimento de pH ou de temperatura multiplicado por 100.

Efeito do pH e da temperatura na atividade enzimática 029 O efeito do pH sobre a atividade enzimática da lipase foi realizado através dos experimentos de atividade hidrolítica variando-se os tampões como segue: tampão citrato de sódio 0,1M para os pHs 2,0, 3,0,4,0, 5,0; tampão fosfato de sódio 0,1M para os pFIs 6,0, 7,0, 8,0 e tampão carbonato-bicarbonato de sódio 0,1M para os pHs 9,0,10,0,11,0 . 030 O efeito da temperatura na atividade enzimática foi realizado através dos experimentos de atividade hidrolítica no tampão onde obteve-se máxima atividade enzimática, incubando-se nas seguintes temperaturas: 30, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 70 e 80 °C.

Estabilidade em diferentes pHs 031 A determinação da estabilidade da enzima foi realizada através da reação de hidrólise, utilizando três tampões no pH onde obteve-se maior atividade enzimática. Os experimentos consistiram na incubação de 10 mg da lipase à temperatura de 37°C utilizando o tampão citrato de sódio 0,1M. Nos tempos 05, 15, 30, 60, 120, 150, 180, 210 e 240 minutos foram retiradas amostras para a dosagem da atividade hidrolítica.

Estabilidade térmica 032 Os experimentos de estabilidade térmica foram realizados através da incubação de 10 mg da lipase em tampão citrato de sódio 0,1M pH 5,0 (o pH ótimo da enzima) nas 3 temperaturas onde obteve-se maior atividade enzimática. Nos tempos de 05, 15, 30, 60, 120, 150, 180, 210 e 240 minutos, foram retiradas amostras para a dosagem da atividade hidrolítica.

RESULTADOS 033 Os resíduos apresentaram a seguinte composição: 10,25% de proteínas, 6% de umidade (antes da correção para 30%), 23% de lipídeos, 8,54% de acidez, pH 5,82, 2,09% de cinzas, 58,66% de carboidratos. Inicialmente foi realizada uma fermentação para determinar qual o solvente era o mais adequado para a extração da enzima do resíduo fermentado. Após o processo de fermentação a lipase de produzida foi extraído do resíduo utilizando diferentes solventes. Após cada extração a atividade enzimática foi determinada como mostrado na Figura 1. Diante dos resultados, o tampão fosfato de sódio 0,1M pH 7,0 foi o mais efetivo para a extração da enzima, sendo portanto o mais adequado para a extração da lipase de Aspergillus niger do resíduo do processamento de polpas de mangaba após o processo de fermentação. 034 A Figura 2 mostra a cinética de produção da lipase de Aspergillus niger por FES do resíduo do processamento de polpa de mangaba. A máxima produção da enzima (62,46 U/g seca de resíduo) foi obtida em 120 horas de fermentação. A elevada produção da enzima associado ao reduzido tempo da fermentação estado sólido do resíduo agroindustrial toma vantajoso este processo para a obtenção de Lipase de Aspergillus niger. Após a purificação parcial e liofilização a atividade foi 1875,38 U/g. 035 Na Figura 3 está apresentado o efeito do pH na atividade hidrolítica da Lipase de Aspergillus niger obtida pela fermentação em estado sólido dos resíduos do processamento de polpa de mangaba. O efeito do pH é um parâmetro importante para determinar as melhores condições para o bom desempenho desta enzima em reações catalíticas. De acordo com os resultados, verificou-se que nos pHs de 2,0 a 4,0 a atividade relativa da enzima variou entre 65% e 82%. No pH 5,0 obteve-se a máxima atividade relativa da enzima de 100%. Nos pHs 6,0 e 7,0 a atividade relativa da enzima também foi alta em tomo de 90%, nos pHs seguintes de 8,0 a 11,0 a atividade relativa diminuiu gradativamente atingindo cerca de 40% no pH 11,0. 036 Como nos pHs 5,0 , 6,0 e 7,0 obteve-se as maiores atividade relativas da lipase de Aspergillus niger, estudou-se a estabilidade da enzima nestes pHs durante 240 min de incubação, como mostrado na Figura 4. Nos pHs 5,0 e 7,0 a atividade relativa da enzima manteve-se acima de 90% durante o período de incubação. No pH 6,0 a atividade relativa apresentou uma diminuição atingindo cerca de 80% em 240 min de incubação. Estes resultados demonstraram que a enzima apresentou boa estabilidade nos pHs estudados. 037 A Figura 5 mostra o comportamento da enzima após a incubação em diferentes temperaturas. A atividade relativa da enzima foi mantida em cerca de 100% na temperatura de 55°C. Nas temperaturas de 37°C, 45 °C e 50°C, as atividades relativas foram de 92%, 85% e 90%, respectivamente. Nas temperaturas mais elevadas a partir de 60°C, a atividade relativa da enzima diminuiu atingindo cerca de 67% na temperatura de 70°C. 038 Foi avaliada a estabilidade da enzima nas temperaturas de 37°C, 50°C e 55°C, onde foram obtidas as maiores atividades relativas, e os resultados estão apresentados na Figura 6. Foi verificado que em todas estas temperaturas a atividade relativa da enzima foi mantida acima de 85% até o tempo final de incubação (240 min). O fato da enzima apresentar boa estabilidade em temperaturas entre 37°C e 55°C significa que do ponto de vista industrial esta enzima pode ser utilizada para catalisar reações dentro desta faixa de temperatura. Isto acarretaria uma redução cic custos de energia para as empresas, pois a enzima apresenta potencial para catalisar reações em condições brandas de temperatura. Algumas reações de hidrólise de óleos que são efetuadas em condições elevadas de temperatura através da catálise química poderíam ser avaliadas pela catálise bioquímica utilizando a lipase de Aspergillus niger produzida nesta pesquisa.

REINVIDICAÇÕES

Claims (2)

1) “MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE LIPASE DE Aspergillus niger UTILIZANDO RESÍDUOS DO PROCESSAMENTO DE POLPAS DE MANGABA COMO SUBSTRATO” caracterizada pela produção da enzima a partir da fermentação em estado sólido dos resíduos do processamento da polpa de mangaba com a umidade ajustada para n 30% de umidade, utilizando uma solução de 10 esporos/ mL de Aspergillus niger em água destilada estéril. A fermentação foi conduzida à temperatura de 30°C em placas de petri, sem agitação, durante 120 h de fermentação. Este resíduo o qual contém cerca de 23% de lipídeos e 58% de carboidratos foi utilizado pelo microrganismo como única fonte de nutrientes para a produção da enzima.

2) “MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE LIPASE DE Aspergillus niger UTILIZANDO RESÍDUOS DO PROCESSAMENTO DE POLPAS DE MANGABA COMO SUBSTRATO” de acordo com a reinvidicação 1, caracterizada pela produção da enzima com máxima atividade relativa preferencialmente em pH 5,0 e temperatura de 55°C. A enzima demonstrou boa estabilidade nos pHs 5,0, 6,0 e 7,0 com atividade relativa acima de 80% até 240 min de incubação à temperatura de 37°C. A enzima apresentou boa estabilidade térmica nas temperaturas de 37°C, 50°C e 55°C com atividades relativas acima de 87% até 240 min de incubação em pH 5,0.