CN108823251B - 一种基于微量金属离子调控的生物表面活性剂发酵生产工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于微量金属离子调控的生物表面活性剂发酵生产工艺，在生物表面活性剂生产菌培养过程中补加微量元素Fe2+和Mn2+。与现有技术相比，本发明基于微量元素对生产菌种的生长代谢的影响及发酵液中微量元素变化的特性，通过向发酵液中适时补加微量元素，提高生产菌株的生长和代谢活性，提高生产效率和生物表面活性剂产量。

Description

一种基于微量金属离子调控的生物表面活性剂发酵生产工艺
技术领域
本发明涉及生物表面活性剂发酵生产工艺，具体涉及基于微量金属离子调控的生物表面活性剂发酵生产工艺。
背景技术
由于具有高度的结构多样性和优良的表界面活性、生物可降解性、低毒性、适应性好等特性，生物表面活性剂在提高原油采收率、环境生物修复、食品加工和制药领域中发挥着重要作用。
利用生物反应器发酵生产生物表面活性剂是复杂的生化反应过程，生物表面活性剂的类型、质量和数量依赖于培养介质组成和发酵工艺条件，如：pH、温度、搅拌、通风、稀释率、金属离子浓度、碳源和氮源种类。不同的元素如铁和锰影响生物表面活性剂的生产。培养介质中加入铁和锰可提高表面活性剂的产量。
现有技术仅关注培养基中微量元素的加入量，未充分关注发酵过程中可利用的微量元素量的变化及其对生物表面活性剂产量的影响。
研究发现，随着发酵进行，发酵液中生物表面活性剂浓度不断增大，当浓度超过CMC(表面活性剂临界胶束浓度)时，会形成胶束。基于电荷等相互作用，胶束会将阳离子束缚住，导致微生物可利用的微量元素离子的减少，由此对微生物生长代谢产生影响。生物表面活性剂发酵培养基多为人工配置的半合成或合成培养基，其中、Fe2+、Mn2+、Zn2+、Co2+等微量金属离子有着严格的配比关系。微量金属离子对合成有着巨大影响，这些金属离子被认为是合成反应中某些酶的辅酶，缺少某种离子或者金属离子的比例关系不当都会影响整个表面活性剂的合成体系。可见，微量金属离子相比某些必要营养物质对生产来说可能有着更加重要的意义。现有技术仅对培养基中微量元素进行了优化，未充分考虑随发酵进行，生物表面活性剂胶束对微量元素离子的束缚作用，导致生产菌株生长及发酵生产生物表面活性剂能力的降低。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于微量金属离子调控的生物表面活性剂发酵生产工艺。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于微量金属离子调控的生物表面活性剂发酵生产工艺，其特征在于，将生物表面活性剂生产菌置于发酵罐中，发酵培养，当发酵液pH降至6.5～6.7时，补加微量元素Fe2+和Mn2+。
所述的微量元素Fe2+的添加量为使Fe2+浓度20～40mg/L。
所述的微量元素Mn2+的添加量为使Mn2+浓度0.5～4mg/L。
所述的微量元素为Fe2+、Mn2+单独添加或同时添加。
所述的生物表面活性剂生产菌包括枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis TD7(专利ZL201010107949.3公开)或铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa FN2(文献(Liu J F,WuG,Yang S Z,et al.Structural characterization of rhamnolipid produced byPseudomonas aeruginosa strain FIN2isolated from oil reservoir water.WorldJournal of Microbiology&Biotechnology,2014,30(5):1473-84)公开)。
基于微量金属离子调控的生物表面活性剂发酵生产工艺：在发酵罐中放入培养基，将生物表面活性剂生产菌接种于培养基中，发酵罐中液体的pH降至6.5～6.7时补加微量元素Fe2+和Mn2+。接种量为2wt％，发酵温度为35～37℃。
当生物表面活性剂生产菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis TD7时，发酵培养基为：蔗糖20.0g/L，(NH4)2SO4 2.0g/L，KH2PO4 6.0g/L，Na2HPO4·12H2O 6.0g/L，MgSO40.3g/L，酵母粉0.5g/L，CaCl2 0.001g/L，CoCl2·6H2O 0.018g/L，NiCl2·6H2O 0.007g/L，CuCl2·2H2O 0.002g/l，FeSO4·7H2O 0.083g/L。
当生物表面活性剂生产菌为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa FN2时，发酵培养基为：葡萄糖24g/L，尿素6g/L，酵母粉1g/L，磷酸二氢钾6.0g/L 1g/L，硫酸镁2.4％g/L，氯化钙0.04g/L，氯化铬0.008g/L。
与现有技术相比，本发明通过大量研究发现，在发酵生产生物表面活性剂阶段，如适时补充微量元素，可以弥补因胶束束缚导致微生物可以利用的相应离子的不足，有效刺激生产菌株的生长及代谢，进一步提高生物表面活性剂产量。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
发酵培养基：蔗糖20.0g/L，(NH4)2SO4 2.0g/L，KH2PO4 6.0g/L，Na2HPO4·12H2O6.0g/L，MgSO4 0.3g/L，酵母粉0.5g/L，CaCl2 0.001g/L，CoCl2·6H2O 0.018g/L，NiCl2·6H2O 0.007g/L，CuCl2·2H2O 0.002g/l，FeSO4·7H2O 0.083g/L。
生物表面活性剂生产菌：枯草杆菌Bacillus subtilis TD-7(ZL201010107949.3)
将枯草杆菌Bacillus subtilis TD-7接种到上述培养基中，接种量为2wt％，发酵温度为37℃，初始pH7.0，接种后12h，发酵液pH＝6.5，启动补料系统，补加微量元素Fe2+至发酵液中Fe2+浓度20mg/L至发酵结束，发酵液中脂肽含量为4.1g/L。(现有技术在初始培养基组成、接种量、发酵温度、pH均相同条件下进行发酵，但后期不补充Fe2+，发酵液中脂肽含量为1.0g/L)。与现有技术比较，产量提高3.1倍。
实施例2
发酵培养基：蔗糖20.0g/L，(NH4)2SO4 2.0g/L，KH2PO4 6.0g/L，Na2HPO4·12H2O6.0g/L，MgSO4 0.3g/L，酵母粉0.5g/L，CaCl2 0.001g/L，CoCl2·6H2O 0.018g/L，NiCl2·6H2O 0.007g/L，CuCl2·2H2O 0.002g/l，FeSO4·7H2O 0.083g/L。
生物表面活性剂生产菌：枯草杆菌Bacillus subtilis TD-7(ZL201010107949.3)
将枯草杆菌Bacillus subtilis TD-7接种到上述培养基中，接种量为2wt％，发酵温度为37℃，初始pH7.0，接种后12h，发酵液pH＝6.7，启动补料系统，补加微量元素Fe2+至发酵液中Fe2+浓度40mg/L至发酵结束，发酵液中脂肽含量为4.8g/L。(现有技术在初始培养基组成、接种量、发酵温度、pH均相同条件下进行发酵，但后期不补充Fe2+，发酵液中脂肽含量1.0g/L)。与现有技术比较，产量提高3.8倍。
实施例3
发酵培养基：葡萄糖24g/L，尿素6g/L，酵母粉1g/L，磷酸二氢钾6.0g/L1g/L，硫酸镁2.4％g/L，氯化钙0.04g/L，氯化铬0.008g/L。
生物表面活性剂生产菌：铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa FN2(Liu J F,Wu G,Yang S Z,et al.Structural characterization of rhamnolipid produced byPseudomonas aeruginosa strain FIN2isolated from oil reservoir water.WorldJournal of Microbiology&Biotechnology,2014,30(5):1473-84).
将铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa FN2接种到上述培养基中，接种量为2wt％，发酵温度为35℃，初始pH7.0，接种后8.2h，发酵液Ph＝6.6，启动补料系统，补加微量元素Fe2+至发酵液中Fe2+浓度25mg/L至发酵结束，发酵液中糖脂含量为8.2g/L。(现有技术在初始培养基组成、接种量、发酵温度、pH均相同条件下进行发酵，但后期不补充Fe2+，发酵液中糖脂含量为3.8g/L)。与现有技术比较，产量提高1.1倍。
实施例4
发酵培养基：葡萄糖24g/L，尿素6g/L，酵母粉1g/L，磷酸二氢钾6.0g/L1g/L，硫酸镁2.4％g/L，氯化钙0.04g/L，氯化铬0.008g/L。
生物表面活性剂生产菌：铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa FN2(Liu J F,Wu G,Yang S Z,et al.Structural characterization of rhamnolipid produced byPseudomonas aeruginosa strain FIN2isolated from oil reservoir water.WorldJournal of Microbiology&Biotechnology,2014,30(5):1473-84).
将铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa FN2接种到上述培养基中，接种量为2wt％，发酵温度为35℃，初始pH7.0，接种后8.2h，发酵液pH＝6.6，启动补料系统，补加微量元素Mn2+至发酵液中Mn2+浓度0.5mg/L至发酵结束，发酵液中糖脂含量为9.6g/L。(现有技术在初始培养基组成、接种量、发酵温度、pH均相同条件下进行发酵，但后期不补充Mn2+，发酵液中糖脂含量为3.8g/L)。与现有技术比较，产量提高1.5倍。
实施例5
发酵培养基：葡萄糖24g/L，尿素6g/L，酵母粉1g/L，磷酸二氢钾6.0g/L1g/L，硫酸镁2.4％g/L，氯化钙0.04g/L，氯化铬0.008g/L。
生物表面活性剂生产菌：铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa FN2(Liu J F,Wu G,Yang S Z,et al.Structural characterization of rhamnolipid produced byPseudomonas aeruginosa strain FIN2isolated from oil reservoir water.WorldJournal of Microbiology&Biotechnology,2014,30(5):1473-84).
将铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa FN2接种到上述培养基中，接种量为2wt％，发酵温度为35℃，初始pH7.0，接种后8.6h，发酵液pH＝6.7，启动补料系统，补加微量元素Mn2+至发酵液中Mn2+浓度4mg/L至发酵结束，发酵液中糖脂含量为9.4g/L。(现有技术在初始培养基组成、接种量、发酵温度、pH均相同条件下进行发酵，但后期不补充Mn2+，发酵液中糖脂含量为3.8g/L)。与现有技术比较，产量提高1.5倍。
实施例6
发酵培养基：蔗糖20.0g/L，(NH4)2SO4 2.0g/L，KH2PO4 6.0g/L，Na2HPO4·12H2O6.0g/L，MgSO4 0.3g/L，酵母粉0.5g/L，CaCl2 0.001g/L，CoCl2·6H2O 0.018g/L，NiCl2·6H2O 0.007g/L，CuCl2·2H2O 0.002g/l，FeSO4·7H2O 0.083g/L。
生物表面活性剂生产菌：枯草杆菌Bacillus subtilis TD-7(ZL201010107949.3)
将枯草杆菌Bacillus subtilis TD-7接种到上述培养基中，接种量为2wt％，发酵温度为37℃，初始pH7.0，接种后11.6h，发酵液pH＝6.5，启动补料系统，补加微量元素Mn2+至发酵液中Mn2+浓度3.6mg/L至发酵结束，发酵液中脂肽含量为4.5g/L。(现有技术在初始培养基组成、接种量、发酵温度、pH均相同条件下进行发酵，但后期不补充Mn2+，发酵液中脂肽含量为1.0g/L)。与现有技术比较，产量提高3.5倍。
实施例7
发酵培养基：蔗糖20.0g/L，(NH4)2SO4 2.0g/L，KH2PO4 6.0g/L，Na2HPO4·12H2O6.0g/L，MgSO4 0.3g/L，酵母粉0.5g/L，CaCl2 0.001g/L，CoCl2·6H2O 0.018g/L，NiCl2·6H2O 0.007g/L，CuCl2·2H2O 0.002g/l，FeSO4·7H2O 0.083g/L。
生物表面活性剂生产菌：枯草杆菌Bacillus subtilis TD-7(ZL201010107949.3)
将枯草杆菌Bacillus subtilis TD-7接种到上述培养基中，接种量为2wt％，发酵温度为37℃，初始pH7.0，接种后11.6h，发酵液pH＝6.5，启动补料系统，补加微量元素Mn2+至发酵液中Mn2+浓度3.6mg/L，同时补加微量元素Fe2+至发酵液中Fe2+浓度28mg/L至发酵结束，发酵液中脂肽含量为6.0g/L。(现有技术在初始培养基组成、接种量、发酵温度、pH均相同条件下进行发酵，但后期不补充Mn2+，发酵液中脂肽含量为1.0g/L)。与现有技术比较，产量提高5倍。

Claims (6)

1.一种基于微量金属离子调控的生物表面活性剂发酵生产工艺，其特征在于，在生物表面活性剂生产菌培养过程中补加微量元素Fe2+和Mn2+；
所述的生物表面活性剂生产菌包括枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis TD7或铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa FN2；
所述的微量元素的添加时机为发酵培养用发酵液pH降至6.5～6.7时。
2.根据权利要求1所述的基于微量金属离子调控的生物表面活性剂发酵生产工艺，其特征在于，所述的微量元素Fe2+的添加量为使Fe2+浓度20～40mg/L。
3.根据权利要求1所述的基于微量金属离子调控的生物表面活性剂发酵生产工艺，其特征在于，所述的微量元素Mn2+的添加量为使Mn2+浓度0.5～4mg/L。
4.根据权利要求1所述的基于微量金属离子调控的生物表面活性剂发酵生产工艺，其特征在于，所述的微量元素为Fe2+、Mn2+单独添加或同时添加。
5.根据权利要求1所述的基于微量金属离子调控的生物表面活性剂发酵生产工艺，其特征在于，所述的生物表面活性剂生产菌在培养基中的接种量为2wt％。
6.根据权利要求1所述的基于微量金属离子调控的生物表面活性剂发酵生产工艺，其特征在于，发酵罐内发酵温度为35～37℃。
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