CN102732573A

CN102732573A - 一种用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法

Info

Publication number: CN102732573A
Application number: CN2012101723210A
Authority: CN
Inventors: 成卓韦; 陈建孟; 蒋轶锋; 朱润晔; 顾信娜
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2012-05-25
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2012-10-17

Abstract

本发明涉及一种用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法，其特征在于：将假单胞菌经培养获得的菌悬液投入到含α-蒎烯的污水试样中，菌浓度最终达36.5mg·L^-1±3.0，在K⁺浓度为0.01～0.1g/L，Mn²⁺浓度为0.01～0.1g/L，NH⁴⁺浓度为0.2～0.8g/L的条件下培养，假单胞菌PT在利用α-蒎烯的过程中产生生物表面活性剂，使污水试样的表面张力下降。本发明方法简单易行，稳定性好，所产生的生物表面活性剂无毒、可生物降解、环境温和。

Description

一种用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法

技术领域

本发明涉及一种用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法，该生物表面活性剂可以在环境污染治理中广泛使用。

背景技术

表面活性剂是指具有固定的亲水亲油基团，在溶液的表面能定向排列，使溶液表面张力显著下降的物质。根据来源不同，表面活性剂通常可分为天然表面活性剂、化学合成表面活性剂和生物表面活性剂三大类。其中，化学合成类在表面活性剂的生产和使用中占有较大的比重，该类废水排放至环境中，不仅会影响曝气、沉淀等污水处理过程的效率，还会毒害一些微生物，抑制微生物在污染物表面的吸附，延缓污染物降解，带来的环境压力不容忽视。

生物表面活性剂是微生物在代谢过程中分泌的集亲水基和憎水基于一体的两性化合物。根据组成基团的不同，生物表面活性剂可分为六类：（1）糖脂；（2）中性脂/脂肪酸；（3）含氨基酸类脂；（4）磷脂；（5）聚合物；（6）全细胞表面本身。和传统的化学合成表面活性剂相比，生物表面活性剂除了具有增溶、润湿、发泡、稳定乳化液、降低表面张力等一般特性外，还具有无毒、可生物降解、环境温和、稳定性好等优点，在医药、食品、化工、石油等领域发挥了重要的作用，特别是近年来在环境污染生物治理方面逐渐显示出了其巨大的应用潜力。

近年来，研究者相继从油类污染的湖泊、土壤或海洋中分离得到了许多能产生生物表面活性剂的菌株。一些研究也表明，不同种类的微生物能产生具有特定结构的生物表面活性剂。例如，假单胞菌（Pseudomonas sp.）主要产生糖脂类生物表面活性剂（如鼠李糖脂），革兰氏阳性芽孢杆菌（Bacillus sp.）主要产生脂肽类生物表面活性剂（如环脂肽）等。通常，微生物容易摄取那些易溶于水的物质，而对于一些疏水性的物质（水中溶解度较小），一些菌株为了增加自身与这些物质的接近程度，能够在其利用疏水性物质的过程中产生类似表面活性剂的物质，增大这些疏水性物质的表观溶解度，从而提高微生物对这些物质的利用程度。

《中国环境科学》2011,31（4），“1株α-蒎烯降解菌的分离鉴定及降解特性研究”一文中公开了一种假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）PT，该菌种目前保藏在位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2008年10月29日，保藏编号为M208182。假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）PT是一种常见的短杆菌，能够在降解α-蒎烯的过程中产生具有表面活性的物质，降低溶液的表面张力。经检索专利和其他相关文献，未见该菌株利用α-蒎烯作为碳源合成生物表面活性剂的报道。该降解菌的发现，对于利用微生物合成法产生生物表面活性剂，实现污染物的资源化具有重要的理论和现实意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的不足而提供一种用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法，该方法简单易行，稳定性好，所产生的生物表面活性剂无毒、可生物降解、环境温和。

本发明解决上述技术问题采用的技术方案是：该用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法，其特征在于：将假单胞菌经培养获得的菌悬液投入到含α-蒎烯的污水试样中，菌浓度最终达36.5mg·L-1±3.0，在K⁺浓度为0.01～0.1g/L，Mn²⁺浓度为0.01～0.1g/L，NH⁴⁺浓度为0.2～0.8g/L的条件下培养，假单胞菌PT在利用α-蒎烯的过程中产生生物表面活性剂，使污水试样的表面张力下降。

本发明所述的污水试样中α-蒎烯的浓度为300～2000mg/L，生物表面活性剂最大比产生速率为0.1333mg/(mg cells·h)。

本发明所述的培养时间为36小时。

本发明所述的污水试样中当K⁺、Mn²⁺和NH₄ ⁺的浓度分别为69.8mg/L、65.1mg/L和482.5mg/L时，污水试样表面张力从初始状态的72.0mN/m下降到40.7mN/m。

本发明所述的生物表面活性剂为紫苏酸，属于脂肪酸类物质。将积累有生物表面活性剂的培养液经过8000r/min，离心20min去除菌体，上清液用6mol/L的盐酸调pH值为2.0，等体积的乙酸乙脂萃取2次，合并有机相，40℃减压蒸馏完全（＜5ml），氮气吹干，得到黄褐色油状产物。经表面薄层层析、红外光谱、液相-质谱和核磁共振等分析，确定该生物表面活性剂为脂肪酸类物质，分子式为C₁₀H₁₄O₂，结合相关代谢途径分析，确定该生物表面活性剂为紫苏酸。该生物表面活性剂对微生物的毒害性、生态毒性均小于化学表面活性剂。

将分离纯化得到的上述生物表面活性剂添加至生物滴滤塔的循环液中，当停留时间分别为29、58、72s，疏水性物质α-蒎烯进气浓度分别为50～100、100～150、200～350mg/m³时，与不添加表面活性剂的生物滤塔相比，α-蒎烯的气液传质率提高了约60%。配制该生物表面活性剂的水溶液，使其浓度达到500mg/L，菲、萘、芘在水中的溶解度分别为1.201、33.18和0.121mg/L，与未添加生物表面活性剂的水溶液相比，溶解度分别提高了2.65%、6.07%、10.0%。

本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明所述的假单胞菌PT取自废水处理单元，能以α-蒎烯为唯一碳源生长，并能在代谢α-蒎烯的过程中合成生物表面活性剂，降低培养液的表面张力；同时，从培养液中分离得到的生物表面活性剂能强化疏水性有机物的气液传质过程，增加菲、萘、芘等多环芳香烃在水溶液中的溶解度，可广泛用于环境污染治理。与其他化学法合成的表面活性剂相比，利用假单胞菌PT生产表面活性剂，其原料简单、过程简便、费用低，且不产生任何污染，合成的生物表面活性剂低毒高效、对环境无害。

附图说明

图1为假单胞菌在降解不同浓度的α-蒎烯过程中，培养液表面张力随时间变化曲线图。

图2为假单胞菌在降解不同浓度的α-蒎烯过程中，培养液生物量随时间变化曲线图。

图3为本发明所述的生物表面活性剂生态毒性试验图。

图4为本发明所述的生物表面活性剂对疏水性VOCs传质强化效果曲线图。

图5为本发明所述的生物表面活性剂对菲增溶效果曲线图。

图6为本发明所述的生物表面活性剂对芘增溶效果曲线图。

图7为本发明所述的生物表面活性剂对萘增溶效果曲线图。

本发明所述的假单胞菌分类命名为荧光假单胞菌PT（Pseudomonas fluorescens PT），该菌种目前保藏在位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2008年10月29日，保藏编号为CCTCC NO:M208182。

具体实施方式

参见图1～图7，本发明所述的菌株属于假单胞菌属（Pseudomonas sp.），命名为PT，菌株16S rDNA的GenBank登陆号为FJ169494。该菌株的特征为：菌落呈透明状，边缘整齐，光滑湿润。透射电镜下观察该菌体的形态为短杆菌，没有鞭毛，成对聚集，革兰氏染色阴性，氧化酶试验、过氧化氢酶试验、吲哚试验、甲基红试验等均为阳性，淀粉水解酶试验阴性；菌株PT能利用葡萄糖，但不能利用乳糖。

本发明通过以下几个方面对假单胞菌PT在代谢α-蒎烯的过程中合成生物表面活性剂进行了研究。

一、响应面优化菌株Pseudomonas fluorescens PT利用α-蒎烯产生生物表面活性剂的环境因子。

1.响应面试验设计及菌株产生物表面活性剂产率预测模型的获得

考察了培养液中K⁺、Mn²⁺和NH₄ ⁺浓度等3个因素对菌株利用α-蒎烯的程度及生物表面活性剂产生量的影响，利用SAS system软件对试验获得的溶液表面张力进行模型拟合，从而获得能够预测菌株Pseudomonas fluorescens PT在不同培养条件下利用α-蒎烯产生生物表面活性剂，使培养液表面张力下降值。具体实施步骤如下：

分别以NH₄ ⁺ 0.5g/L（X₁，Code=0）、K⁺0.055gL（X₂，Code=0）和Mn²⁺0.055g/L（X3，Code=0）为中心值，利用SAS system软件进行三因素三水平试验设计（表1）。按表1配制无机盐培养基，分装于250mL盐水瓶中，装液量为50mL/个，110℃灭菌40min。待培养液冷却后，每个盐水瓶中加入处于对数生长期的PT菌悬液，使初始生物量达到36.54mg/L。以α-蒎烯为唯一碳源，初始浓度为300mg/L，密封后置于摇床振荡培养。另取装有相同培养液的盐水瓶，灭菌后加入α-蒎烯但不加入PT菌悬液，置于相同的条件下培养，作为空白对照。培养30h后，分析培养液的表面张力，同时测定生物量。根据测得的降解速率，利用SAS system软件对其进行二次多元回归，拟合得到的预测模型为：1/Y=0.031415-0.001309X₁+0.000367X₂+0.001223X₃+0.002815X₁*X₁-0.002431X₁X ₂-0.000045X₁X₃+0.000426X₂X₂-0.004124X₂X₃+0.002405X₃X₃

式中，Y为培养液表面张力的下降值（72.7-培养液的表面张力）（mN/m），X₁，X₂，X₃分别为NH₄ ⁺、K⁺和Mn²⁺浓度的Code值。多元回归方程的相关系数R²=0.9744，说明该预测模型所预测的培养液表面张力的下降值与实际表面张力的下降值具有很好的相关性（表1），可用于预测不同培养条件下菌株利用α-蒎烯产生表面活性剂使溶液表面张力下降值。

表1 不同培养条件下培养液表面张力实测值与预测值

*：X₁为NH₄ ⁺，Code值0时为0.5gL，-1时为0.2，+1时为0.8g/L；

X₂为K⁺’，Code值0时为0.055g/L，-1时为0.01，+1时为0.1g/L；

X₃为Mn²⁺，Code值0时为0.055g/L，-1时为0.01，+1时为0.1g/L。

2.菌株Pseudomonas fluorescens PT利用α-蒎烯产生物表面活性剂的最佳环境因子

利用SAS system软件对获得的预测模型进行分析，令其一阶偏导数为零，获得菌株Pseudomonas fluorescens PT利用α-蒎烯产生物表面活性剂的最佳环境因子，当NH₄ ⁺、K⁺和Mn²⁺浓度分别为482.5mg/L、69.8mgL和65.1mg/L时，此时模型所预测的溶液表面张力下降至40.7mN/m（72.7-32）。菌株在上述培养条件下能使溶液表面张力下降至40.63mN/m（72.7-32.07），与预测值较为接近。具体实施步骤如下：

取200mL（pH7.2）无机盐培养液，加入NH₄ ⁺、K⁺和Mn²⁺，使其浓度分别达到480mg/L、70mg/L和65mg/L，分装至4个250mL的盐水瓶中，110℃灭菌40min。待培养液冷却后，取其中三瓶加入处于生长对数期的PT菌悬液，使初始细胞量达到35mg/L，以α-蒎烯为唯一碳源，初始浓度为300mg/L。另取一瓶只加入α-蒎烯而不加入菌悬液作为空白对照。上述4瓶盐水瓶置于30℃摇床中振荡培养，30h后，分析检测培养液的表面张力，同时测定培养液中的生物量。

在此培养基组成下，Pseudomonasfluorescens PT利用α-蒎烯产生生物表面活性剂，能使培养液的表面张力下降至40.5、40.8和40.6mN/m，培养液平均表面张力为40.63mN/m，接近于模型预测值，表明此培养基组成为菌株PT利用α-蒎烯产生生物表面活性剂的最佳组成。

二、Pseudomonas fluorescens PT代谢不同浓度α-蒎烯产生生物表面活性剂。

在最佳培养基组成（NH₄ ⁺480mgL、K⁺70mgL和Mn²⁺65mgL）下，考察了菌株PT对初始浓度300～2000mg/L α-蒎烯的代谢及生物表面活性剂合成情况。结果表明，菌株PT均能利用300～2000mg/L α-蒎烯产生表面活性剂，且当初始α-蒎烯浓度为500mg/L时，菌株PT合成生物表面活性剂的能力最强，生长19h后就能使溶液的表面张力下降至31.6mN/m，而此时在初始α-蒎烯浓度为2000mg/L的培养液中，表面张力为45.9mN/m。具体实施步骤如下：

配制pH为7.2的无机盐培养液，加入NH₄ ⁺、K⁺和Mn²⁺，使其浓度分别达到480mg/L、70mgL和65mg/L，分装于250mL的盐水瓶中，每瓶50mL，110℃灭菌40min。待培养液冷却后，取其中6瓶加入处于对数生长期的LX-1菌悬液，使初始生物量达到36.54mg/L，同时加入α-蒎烯作为唯一碳源，使其浓度达到300、500、800、1000、1500和2000mg/L；其余6瓶只加入相同量的α-蒎烯而不加入PT菌悬液作为空白对照。盐水瓶密封后30℃振荡培养，定时测定培养液表面张力及生物量，绘制菌株PT代谢不同初始浓度α-蒎烯，溶液表面张力变化曲线，同时计算相应的比产生速率。

结果如图1和图2所示。菌株PT均能代谢初始浓度300～2000mgL的α-蒎烯，并且在这范围内随着浓度的增加，菌株生长出现了较为明显的滞后期，溶液表面张力也因此呈现出不同的变化趋势。当初始α-蒎烯浓度较低时（300～800mg/L），菌株PT生长较快，且代谢生成生物表面活性剂的速率也较快，特别是当初始浓度为500mg/L时，培养19h后溶液的表面张力就下降到最低值（31.6mN/m），表明菌株PT在此浓度下代谢α-蒎烯合成生物表面活性剂的能力较强。当α-蒎烯初始浓度超过800mg/L，菌株生长明显出现了滞后期，表明菌株对于高浓度的α-蒎烯，其生长需要一定的适应期。从图1和图2还可以看出，当初始浓度较高时，菌株PT合成生物表面活性剂的能力有限，可能是由于高浓度的α-蒎烯对菌株产生了一定的毒害作用。当α-蒎烯浓度为2000mg/L时，培养19h后溶液的表面张力仅下降至45.9mN/m，62h后下降至最低值36.3mN/m，高于低浓度的α-蒎烯。对积累有生物表面活性剂的培养液进行离心、溶剂萃取、减压蒸馏等操作，分离生物表面活性剂粗品。当α-蒎烯初始浓度为500mg/L时，1L的培养液中分离纯化能得到生物表面活性剂粗品为585mg，此时细胞生物量浓度为99.91mg/L，计算得到生物表面活性剂最大比产生速率为0.2638mg表面活性剂/(mg cells·h)。

三、Pseudomonas fluorescens PT代谢α-蒎烯的培养液中生物表面活性剂的分离纯化及鉴定。

在最佳培养基（NH₄ ⁺480mg/L、K⁺70mgL和Mn²⁺65mg/L）、初始α-蒎烯浓度为500mg/L的条件下培养菌株PT，当培养液中生物表面活性剂积累达到一定量后，采用离心、减压蒸馏等处理方法对生物表面活性剂进行分离纯化，并采用薄层色谱、红外光谱、液相-质谱和核磁共振等方法对其进行鉴定。结果表明，所分离得到的生物表面活性剂为脂肪酸类物质，分子式为C₁₀H₁₄O₂，同时结合相关代谢途径分析，确定该生物表面活性剂为α-蒎烯的代谢产物——紫苏酸。具体实施步骤如下：

配制pH 7.2的无机盐培养液5L，加入NH₄ ⁺、K⁺和Mn²⁺，使其浓度分别达到480mg/L、70mg/L和65mg/L，110℃灭菌40min后装入有效容积为5L的发酵罐中，待冷却后加入处于对数生长期的PT菌悬液，使其初始生物量达到40mg/L，同时加入α-蒎烯作为唯一碳源，初始浓度达到500mg/L，定时测定培养液的表面张力和生物量。待表面张力下降至最低值时，取培养液在8000r/min，离心20min去除菌体，上清液用6mol/L的盐酸调pH值为2.0，等体积的乙酸乙脂萃取2次，合并有机相，40℃减压蒸馏浓缩至5mL，氮气吹干，得到黄褐色油状产物。取纯化的黄褐色油状产物溶于二氯甲烷中，进行薄层色谱实验。KBr压片法制备油状产物的固体片剂，采用傅立叶变换显微红外光谱仪对片剂进行官能团分析，波数精度和分辨率分别优于0.01/cm和0.09/cm。采用高效液相色谱/质谱仪对分离得到的产物进行测试，液相色谱柱为C₁₈反相柱（150mm×46mm×5μm），流动相为乙腈-水，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：初始乙腈配比为10%，保持3min，之后25min内乙腈配比由10%线性增大到90%并保持该配比运行5min；流速为1mL·min^-1，检测波长为长230nm；质谱条件为：喷雾电压4.0KV，SIM扫描电压65V，脱溶温度300℃，柱后流出物导入离子源速率8μL/min，质谱扫描质量数范围40～1000m/z。最后采用核磁共振进行进一步分析。将分离得到的生物表面活性剂用适量的氯仿溶液转移到5mm的NMR谱用测试管中，氮气吹干，加入0.5mL氘代氯仿（CDCl₃）溶解，进行¹H-NMR、 ¹³C-NMR等分析。测试条件为：操作温度298K，5mm TXI反相三共振探头， ¹H-NMR测定的谱宽-1～14ppm（9000Hz），¹³C-NMR谱测定的谱宽-50～250ppm（9000Hz），采样时间5.80min，弛豫时间20s，采样次数16次。

结果分析如下。将溶于二氯甲烷的生物表面活性剂进行薄层分析，在显色剂茚三酮、2,7-二氯荧光黄-三氯化铝-三氯化铁的作用下，薄层板上出现红色斑点，说明提取到的生物表面活性剂属于脂类化合物。红外图谱上，在3098.5cm^-1、2962.3～2928.2cm^-1、1689.7～1644.1cm^-1、1421.1～1200cm^-1、895.6～802.8cm^-1、654.8～550.7cm^-1处分别有吸收峰，对照标准图谱，这些吸收锋可能是O-H（N-H）、CH₂、C=O、C-H、C=C和C-C环骨架。由于这些振动峰的特征与脂类化合物的较为吻合，推断分离得到的生物表面活性剂可能是脂肪酸类或脂肽类化合物。高效液相色谱/质谱分析表明，对应物质的m/z为167.1084，分子式为C₁₀H₁₄O₂，进一步推测该生物表面活性剂为脂肪酸类化合物。核磁共振¹H-NMR图谱中，δ=7.0ppm为环上C=C键上的氢，δ=4.7和4.8ppm为C=C烯烃键上的氢，δ=1.9ppm为环上-CH₂-的氢，δ=0.9ppm为端甲基-CH₃的氢。¹³C-NMR图谱中，δ=179.5ppm为环上C=O键上的碳，δ=151.3～109.8ppm为环状结构中的碳基团峰，δ=30.5ppm和20ppm则分别归属为CH₂和CH₃，这些化学位移代表的结构式与脂肪酸类化合物的基本吻合。通过薄层色谱、红外光谱、液相色谱/质谱和核磁共振分析，确定该生物表面活性剂为脂肪酸类物质，结构中具有2个不饱和度（C=C和C=O），特征官能基团为O-H、碳环、CH₂和CH₃等。结合微生物降解α-蒎烯的代谢途径，最终确定该物质为紫苏酸。查阅相关的文献，未见有关其作为表面活性剂的报道。紫苏酸的结构式如下：

四、分离得到的生物表面活性剂生态毒性测试。

对分离得到的生物表面活性剂进行生态毒性测试，受试藻种为普通小球藻（Chlorella vulgaris），并采用曲拉通（Triton X-100）和十二烷基硫酸钠（SDS）等化学表面活性剂作为对照。结果表明，分离得到的生物表面活性剂对于小球藻的毒性远远小于其他两种化学合成类表面活性剂，半致死浓度EC₅₀值为32.47mg/L，高于Triton X-100和SDS的EC₅₀值（0.16和0.08mg/L）。具体实施方案如下：

采用灭过菌的水生四号培养基活化普通小球藻（Chlorella vulgaris），绘制其生长曲线，从而确定普通小球藻对数生长期。将分离得到的生物表面活性剂和化学表面活性剂（Triton X-100和SDS）分别加入灭过菌的水生四号培养基，使其浓度达到50、100、150mg/L，同时以不加表面活性剂作为空白对照，加入处于生长对数期的小球藻（OD₆₈₀=0.01），四层纱布封口后放置于智能人工气候箱（light:dark=14:10）培养，定时取样分析，采用冷冻浸提法测定其中藻类叶绿素含量，根据概率值分析法计算相应的24h抑制率和EC₅₀值。

结果如图3所示。无论是生物表面活性剂还是化学表面活性剂，对小球藻的生长均有一定的抑制作用，且随着表面活性剂浓度的增大，抑制生长情况愈明显，抑制率与表面活性剂浓度对数值之间呈线性关系。经过相应计算，得出Triton X-100、SDS和生物表面活性剂的半致死浓度（EC₅₀）分别为，说明分离得到的生物表面活性剂对小球藻的生态毒性小于化学表面活性剂。试验结果表明，该生物表面活性剂对环境影响较小，可替代化学表面活性剂广泛用于环境污染的修复中。

五、分离得到的表面活性剂对疏水性物质强化传质过程的效果分析。

建立两个相同规格的滴滤塔，采用添加生物表面活性剂的蒸馏水（300mg/L）和不添加生物表面活性剂的蒸馏水作为循环喷淋液，考察在相同运行条件下两塔对于α-蒎烯的传质效果。为了抑制微生物的生长，分别在循环液中添加0.02%（wt/vol）的叠氮化锂。结果表明，在添加生物表面活性剂的蒸馏水作为循环喷淋液的生物滴滤塔中，当α-蒎烯进气浓度为50～200mg/m³时，其最大有效传质率达到了60%，远远大于对照塔，说明分离得到的生物表面活性剂对于疏水性物质的气液传质过程具有强化作用。具体实施步骤如下：

建立总高950cm、内径8cm的滴滤塔，采用聚氨酯泡沫小球作为填料，同时配有模拟发生气源系统和循环液喷淋系统。循环液采用蒸馏水，添加一定浓度的叠氮化锂（0.02%，wt/vol）抑制微生物生长。两个塔在相同条件下运行，初始α-蒎烯浓度50mg/m³。待滤塔进出口浓度相同时，往其中一个塔的循环喷淋液中添加分离得到的生物表面活性剂，使其浓度达到300mg/L，而另外一个塔的循环液仍采用蒸馏水。在进口α-蒎烯浓度为50～200mg/m³，空床停留时间为29s的条件下，比较了48h内两个塔进出口α-蒎烯的浓度。

结果如图4所示。在不添加生物表面活性剂的对照塔中，48h内进、出口α-蒎烯浓度基本保持一致，计算所得的有效传质率为1～5%。而在添加生物表面活性剂的滴滤塔中，当进气浓度较低时（50～100mg/m³），出口α-蒎烯浓度明显低于进口，计算所得的有效传质率约为62～82%；当进口浓度逐渐升高至200mg/m³，有效传质率下降至31%，但仍然大于对照塔。由于在循环液中添加了抑制微生物生长的物质，因此进出口α-蒎烯浓度的差值可认为是由于循环液吸收造成的。以上结果说明，分离得到的生物表面活性剂能有效强化疏水性α-蒎烯气液传质过程，这将有利于后续微生物降解过程的进行。同时，采用低浓度苯、甲苯等苯系化合物作为模拟气源，平均气液传质效果能提高50%以上，进一步表面该生物表面活性剂能促进典型疏水性物质的气液传质过程，在废气生物净化过程中有巨大的应用前景。

六、分离得到的表面活性剂对多环芳香烃增溶效果分析。

选取了菲、萘、芘等典型多环芳香烃为目标物质，分别溶于含生物表面活性剂的水溶液和未含生物表面活性剂的水溶液，同时加入0.02%（wt/vol）的叠氮化锂抑制微生物的生长。结果表明，菲、萘、芘在含生物表面活性剂的水溶液中溶解度增加较为明显，且当生物表面活性剂浓度大于其临界胶束浓度时，菲、萘、芘的溶解度随生物表面活性剂浓度的增加而增加，二者之间呈线性相关的关系。具体实施步骤如下：

25mL磨口三角瓶中加入过量的萘、菲和芘，同时加入分离得到的生物表面活性剂，使其浓度分别达到0、200、400、600、800、1000、1200和1400mg/L为抑制微生物的生长，加入0.02%（wt/vol）的叠氮化锂水溶液。磨口三角瓶密封后，置于室温（25℃）、160r/min的摇床振荡培养。震荡48h后，将溶液转移至离心管，5000r/min离心15min，除去未溶解的固态物质，取上清液滤膜过滤后采用高效液相色谱分析。

结果如图5～图7所示。当生物表面活性剂浓度低于其临界胶束浓度时，菲、萘、芘的溶解度没有变化，溶解的量几乎与其在不含有生物表面活性剂的水溶液中相等。当生物表面活性剂浓度超过其临界胶束浓度（500mg/L）时，菲、萘、芘的溶解度都有一定程度地增加，且与生物表面活性剂溶度之间呈现出良好的线性相关性。以菲为例，当生物表面活性剂浓度低于500mg/L时，其溶解度在1.2mg/L左右；当生物表面活性剂浓度大于500mg/L时，菲的溶解度迅速增加，当生物表面活性剂浓度为1500mg/L时，菲的溶解度增加到了34.8mg/L，与不添加生物表面活性剂的水溶液相比，溶解度增加了近30倍。以上结果表明，分离得到的生物表面活性剂能促进多环芳香烃类等难溶于水的物质的溶解度，并增大微生物对这些物质的摄取，从而有助于这些物质的环境污染修复。

基于上述研究，本发明得出一种用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法，将假单胞菌经培养获得的菌悬液投入到含α-蒎烯的污水试样中，菌浓度最终达36.5mg·L^-1±3.0，污水试样中α-蒎烯的浓度为300～2000mg/L，在K⁺浓度为0.01～0.1gL，Mn²⁺浓度为0.01～0.1g/L，NH₄ ⁺浓度为0.2～0.8g/L的条件下培养36小时，当K⁺、Mn²⁺和NH₄ ⁺的浓度分别为69.8mg/L、65.1mg/L和482.5mg/L时为最佳环境，假单胞菌PT在利用α-蒎烯的过程中产生生物表面活性剂，该生物表面活性剂为紫苏酸，属于脂肪酸类物质。上述生物表面活性剂最大比产生速率为0.1333mg/(mg cells·h)，其可以使污水试样的表面张力下降，在最佳环境下，可以使污水表面张力从初始状态的72.0mN/m下降到40.7mN/m。

虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。

Claims

1. 一种用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法，其特征在于：将假单胞菌经培养获得的菌悬液投入到含α-蒎烯的污水试样中，菌浓度最终达36.5 mg·L-1±3.0，在K⁺浓度为0.01～0.1g/L，Mn2⁺浓度为0.01～0.1 g/L，NH4⁺浓度为0.2～0.8 g/L的条件下培养，假单胞菌PT在利用α-蒎烯的过程中产生生物表面活性剂，使污水试样的表面张力下降。

2.根据权利要求1所述的用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法，其特征在于：所述的污水试样中α-蒎烯的浓度为300～2000 mg/L，生物表面活性剂最大比产生速率为0.1333 mg/(mg cells·h)。

3.根据权利要求1所述的用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法，其特征在于：所述的培养时间为36小时。

4.根据权利要求3所述的用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法，其特征在于：当K⁺、Mn²⁺和NH₄ ⁺的浓度分别为69.8 mg·L^-1、65.1 mg·L^-1和482.5 mg·L^-1时，污水试样表面张力从初始状态的72.0 mN·m^-1下降到40.7 mN·m^-1。

5.根据权利要求1或2所述的用假单胞菌产生生物表面活性剂的方法，其特征在于：所述的生物表面活性剂为紫苏酸，属于脂肪酸类物质。