CN101775427A

CN101775427A - 一种调控微生物代谢脂肽化合物组成的方法

Info

Publication number: CN101775427A
Application number: CN 201010107949
Authority: CN
Inventors: 牟伯中; 杨世忠; 刘金峰; 杨娟
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2010-02-09
Filing date: 2010-02-09
Publication date: 2010-07-14
Anticipated expiration: 2030-02-09
Also published as: CN101775427B

Abstract

本发明涉及一种调控微生物代谢脂肽化合物组成的方法，该方法包括如下步骤：(1)在基础培养基中添加氨基酸；(2)培养微生物；(3)收获脂肽。与现有技术相比，本发明通过在培养基中添加不同的氨基酸来提高特定类型脂肽化合物的含量，具有生产成本低，节约分离纯化费用等优点，是工业制备目标脂肽化合物的快速、有效的方法。

Description

一种调控微生物代谢脂肽化合物组成的方法

技术领域

本发明涉及一种调控代谢组成的方法，尤其是涉及一种调控微生物代谢脂肽化合物组成的方法。

背景技术

脂肽是一类由脂肪酸和肽组成的具有两亲结构的微生物代谢产物，具有低毒，可生物降解，环境友好等特性，它具有良好的表面活性，能促进烃的生物降解，通过与部分重金属结合能移除被污染的土壤和沉积物中的重金属，同时，还具有特殊的生物活性，能提高尿激酶的活性，防止血液凝结，在食品、化妆品、生物医药和环境等领域具有潜在的应用价值。

通过优化培养条件获得脂肽产量是目前脂肽制备中普遍关注的问题。1968年Arima等人发现surfactin时产量只有0.05～0.10g/L；1998年Kim等采用改良的Cooper培养基，并通过控制氮的变化和溶氧量，使surfactin的产量达到7.0g/L；2006年Yoneda等以麦芽糖培养基对诱变菌Bacillus subtilis SD 901培养20～90h使surfactin的产量从8g/L提高到50g/L；2007年贡国宏等通过采用4％的基本无机盐培养基培养Bacillus subtilis E8，使脂肽粗提物的产量达到5-13g/L；Doekel等用地衣芽孢杆菌BAS50生产抗菌脂肽lichenysin A时，由于在培养基中分别添加了L-谷氨酸和L-天门冬氨酸而使抗菌脂肽lichenysin A产量分别增加了2倍和4倍。以上都是通过优化培养基提高了脂肽混合物的产量，其缺陷是无法针对性地生产新型的产品或提高发酵液中某类特定的脂肽化合物的含量。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种提高特定类型脂肽化合物的含量、生产成本较低的调控微生物代谢脂肽化合物组成的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种调控微生物代谢脂肽化合物组成的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)基础培养基预处理：向基础培养基中加入氨基酸组成介质；

(2)培养微生物：将微生物置于由基础培养基和氨基酸组成的介质中培养，微生物的加入量为介质的2％(v/v)，控制培养温度为37℃，培养时间为72h，得到微生物的发酵液；

(3)收获脂肽：采用酸化-沉淀分离-浸提的方法处理步骤(2)中得到的微生物的发酵液，即可收获脂肽。

所述步骤(1)中的基础培养基为微生物正常的生长代谢提供营养，该基础培养基的组成为蔗糖20.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L，KH₂PO₄ 6.0g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 6.0g/L，MgSO₄ 0.3g/L，酵母粉0.5g/L，CaCl₂ 0.001g/L，CoCl₂·6H₂O 0.018g/L，NiCl₂·6H₂O 0.007g/L，CuCl₂·2H₂O 0.002g/L及FeSO₄·7H₂O 0.083g/L。

所述步骤(1)中的氨基酸包括丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、巯基丙氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯基丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)及缬氨酸(Val)，各氨基酸的加入量均为1.0g/L。

所述步骤(2)中的微生物为具有代谢脂肽类化合物性能的微生物，该微生物包括枯草杆菌。

所述的枯草杆菌为市售的Bacillus subtilis TD-7。

所述步骤(3)中酸化-沉淀分离-浸提工艺包括以下步骤：将除细胞后的发酵液用盐酸或硫酸调节pH至2.0以下，再通过离心收集沉淀，沉淀采用有机溶剂浸提，最后除去有机溶剂即获得脂肽。

所述的有机溶剂为无水乙醚。

与现有技术相比，本发明通过在培养基中添加不同的氨基酸来提高特定类型脂肽化合物的含量，具有生产成本低，节约分离纯化费用等优点，是工业制备目标脂肽化合物的快速、有效的方法。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种调控微生物代谢脂肽化合物组成的方法，该方法包括以下步骤：

(1)基础培养基预处理：向基础培养基中加入氨基酸组成介质，所用培养基：蔗糖20.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L，KH₂PO₄ 6.0g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 6.0g/L，MgSO₄0.3g/L，酵母粉0.5g/L，CaCl₂ 0.001g/L，CoCl₂·6H₂O 0.018g/L，NiCl₂·6H₂O 0.007g/L，CuCl₂·2H₂O 0.002g/L，FeSO₄·7H₂O 0.083g/L。在上述液体培养基中分别加入1.0g/L的下述氨基酸：丙氨酸(Ala)，精氨酸(Arg)，天冬酰胺(Asn)，天冬氨酸(Asp)，巯基丙氨酸(Cys)，谷氨酸(Glu)，谷氨酰胺(Gln)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，赖氨酸(Lys)，蛋氨酸(Met)，苯基丙氨酸(Phe)，脯氨酸(Pro)，丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)，色氨酸(Trp)，酪氨酸(Tyr)，缬氨酸(Val)。

(2)培养微生物：利用枯草杆菌Bacillus subtilis TD-7发酵生产脂肽，将微生物枯草杆菌Bacillus subtilis TD-7置于由基础培养基和氨基酸组成的介质中培养，微生物的加入量为介质的2％(v/v)，控制培养温度为37℃，培养时间为72h，得到微生物的发酵液。

(3)收获脂肽：培养结束后，采用酸化-沉淀分离-浸提的方法处理步骤(2)中得到的微生物的发酵液，将除细胞后的发酵液用盐酸调节pH至2.0，再通过离心收集沉淀，沉淀采用无水乙醚浸提，最后除去无水乙醚即获得脂肽。

采用电喷雾质谱分析结合气质联用分析鉴定。结果表明：Bacillus subtilisTD-7在含20种不同氨基酸培养基中和未加氨基酸的基础培养基中产生的生物表面活性剂都为surfactin类脂肽。其中，未加氨基酸的基础培养基培养获得的脂肽混合物中脂肪酸的组成趋势为C15＞C14＞C13＞C16(分别指β羟基15酸、β羟基14酸、β羟基13酸和β羟基16酸，下同)，C14和C 15构成了脂肪酸的主要部分，C13和C16仅占有11％。加不同的氨基酸的培养基导致不同链长的surfactin组成的变化：Arg，Gln或Val添加到发酵培养基中引起了β-羟基脂肪酸组成显著变化，这三种氨基酸都显著提高了C14的含量，使得各个组分的组成的总体变化趋势转为C14＞C15＞C13＞C16，加入Arg或Gln使得C14的含量超过50％，Val的加入使得C14和C16的含量同时达到了最高(C14为66.2％，C16为6.7％)；培养基中加入Cys、His、Ile、Leu、Met、Ser或者Thr，显著提高了奇数碳数的β-羟基脂肪酸的含量。加入Cys或者His使得C15的含量超过60％，His还使得isoC15的含量大于anteisoC15的含量。Ile的加入使得C13的含量达到13％，C15的含量超过了80％，其中anteisoC15占78％，C13和anteisoC 15的含量同时达到了最大值，而且还出现了一小部分的C17，偶数碳数的β-羟基脂肪酸只占了很少的一部分(C14＜5％，C16＜1％)。向培养基中加入Leu使得isoC15的含量达到39％，将近是anteisoC15含量的两倍。培养基中加入Met后，C15的含量接近61％，其中anteisoC15占42％，仅低于加入Thr和Ile时的含量。当向培养基中加入Ser，则显著提高了C13的含量，其含量仅低于加入Leu时的含量，而加入Thr，使得C 15的含量达到了最高(83％)，且产生了一部分C17，偶数β-羟基脂肪酸含量的总和只有6％；培养基中加入Ala、Asn、Asp、Glu、Gly、Phe、Pro、Trp或者Tyr并不能显著影响脂肪酸部分的组成。

利用Bacillus subtilis TD-7在分别加有20种不同氨基酸的培养基发酵24h收获脂肽。分析结果表明：在培养基中加入Arg，Gln或Val能显著提高含偶数碳的β-羟基脂肪酸的surfactin的含量，而加入Cys、His、Ile、Leu、Met、Ser或Thr则会显著提高含奇数碳数的β-羟基脂肪酸的surfactin的含量，加入Ala、Asn、Asp、Glu、Gly、Phe、Pro、Trp或者Tyr并不能显著影响脂肪酸部分的组成。

实施例2

(1)基础培养基预处理：向基础培养基中加入氨基酸组成介质，所用培养基：蔗糖20.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L，KH₂PO₄ 6.0g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 6.0g/L，MgSO₄ 0.3g/L，酵母粉0.5g/L，CaCl₂ 0.001g/L，CoCl₂·6H₂O 0.018g/L，NiCl₂·6H₂O 0.007g/L，CuCl₂·2H₂O 0.002g/L，FeSO₄·7H₂O 0.083g/L。在上述液体培养基中分别加入1.0g/L的下述氨基酸：丙氨酸(Ala)，精氨酸(Arg)，天冬酰胺(Asn)，天冬氨酸(Asp)，巯基丙氨酸(Cys)，谷氨酸(Glu)，谷氨酰胺(Gln)，甘氨酸(Gly)，组氨酸(His)，异亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，赖氨酸(Lys)，蛋氨酸(Met)，苯基丙氨酸(Phe)，脯氨酸(Pro)，丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)，色氨酸(Trp)，酪氨酸(Tyr)，缬氨酸(Val)。

(3)收获脂肽：培养结束后，采用酸化-沉淀分离-浸提的方法处理步骤(2)中得到的微生物的发酵液，将除细胞后的发酵液用硫酸调节pH至1.0，再通过离心收集沉淀，沉淀采用无水乙醚浸提，最后除去无水乙醚即获得脂肽。

Claims

1.一种调控微生物代谢脂肽化合物组成的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种调控微生物代谢脂肽化合物组成的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的基础培养基为微生物正常的生长代谢提供营养，该基础培养基的组成为蔗糖20.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L，KH₂PO₄ 6.0g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 6.0g/L，MgSO₄ 0.3g/L，酵母粉0.5g/L，CaCl₂ 0.001g/L，CoCl₂·6H₂O 0.018g/L，NiCl₂·6H₂O 0.007g/L，CuCl₂·2H₂O 0.002g/L及FeSO₄·7H₂O 0.083g/L。

3.根据权利要求1所述的一种调控微生物代谢脂肽化合物组成的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的氨基酸包括丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、巯基丙氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯基丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)及缬氨酸(Val)，各氨基酸的加入量均为1.0g/L。

4.根据权利要求1所述的一种调控微生物代谢脂肽化合物组成的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的微生物为具有代谢脂肽类化合物性能的微生物，该微生物包括枯草杆菌。

5.根据权利要求4所述的一种调控微生物代谢脂肽化合物组成的方法，其特征在于，所述的枯草杆菌为市售的Bacillus subtilis TD-7。

6.根据权利要求1所述的一种调控微生物代谢脂肽化合物组成的方法，其特征在于，所述步骤(3)中酸化-沉淀分离-浸提工艺包括以下步骤：将除细胞后的发酵液用盐酸或硫酸调节pH至2.0以下，再通过离心收集沉淀，沉淀采用有机溶剂浸提，最后除去有机溶剂即获得脂肽。

7.根据权利要求6所述的一种调控微生物代谢脂肽化合物组成的方法，其特征在于，所述的有机溶剂为无水乙醚。