CN106591399A - 一种发酵培养基及鼠李糖脂的生物制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种发酵培养基及鼠李糖脂的生物制备方法，包括如下步骤：(1)将鼠李糖脂生产菌种子液接入铁限制的发酵培养基中进行发酵培养；将纳米颗粒加入所述发酵培养基中；(2)用酸沉淀冷冻干燥法提取所得发酵液的鼠李糖脂。本发明运用致病能力较弱的缺失群体感应基因lasR的突变菌株，在适当的培养条件下以合适的纳米颗粒刺激鼠李糖脂的合成，这不仅能促进鼠李糖脂的分泌，而且大大降低了生产过程中的健康风险，同时具有成本低、操作简单的特点。

Description

一种发酵培养基及鼠李糖脂的生物制备方法
技术领域
本发明涉及生物合成领域与纳米材料应用领域，具体涉及一种高效无害化的鼠李糖脂生物制备方法。
背景技术
表面活性剂能使目标溶液表面张力显著下降，是一类重要的化工原料，素有“工业味精”之称，它在石油工业、环境工程、食品工业、精细化工等许多领域中占有特殊和重要的地位。目前，几乎所有的表面活性剂都是以石油为原料化学合成而来，化学合成的表面活性剂在生产和使用过程中常常会带来严重的环境污染问题。生物表面活性剂是表面活性剂家族中的后起之秀，它是由微生物所产生的一类具有表面活性的生物大分子物质。与化学合成的表面活性剂相比，生物表面活性剂除具有降低表面张力、稳定乳化液和增加泡沫等相同作用外，还具有一般化学合成表面活性剂所不具备的无毒、能生物降解等优点。随着人们崇尚自然和环保意识的增强，生物表面活性剂将越来越受到人们的青睐，并有可能成为化学合成表面活性剂的替代品或升级换代品。
鼠李糖脂是一种常见的生物表面活性剂，具有良好的溶解性及化学稳定性，被广泛的运用在各行各业。目前鼠李糖脂生产菌主要为铜绿假单菌和伯克氏菌。主要通过理化诱变及基因改造技术增强菌株的生产能力。在申请号201510078536.X的发明专利中介绍了一种通过基因工程手段构建了pa3286蛋白表达量增加的菌株，使假单胞菌合成鼠李糖脂的能力提高了50％。但是多数铜绿假单胞菌和伯克氏菌具有条件致病性的特点，由于菌株的致病因子和鼠李糖脂同受高丝酰胺内酯类群体感应系统所调控，在提高鼠李糖脂合成量的过程中，具有提高致病性的风险。因此，如何降低致病性、提高鼠李糖脂的新方法需要探寻。
在铜绿假单胞菌体内，具有多个群体感应系统，其中lasIR系统调控很多致病因子的分泌。多数临床分离的铜绿假单胞菌群体感应lasR缺失突变株，其致病因子表达显著下降。使用铜绿假单胞菌lasR突变株用于鼠李糖脂的合成，具体提高所制备的鼠李糖脂生物安全性的优点。
鼠李糖脂合成受rhlIR系统调控。环境因子可以影响rhlIR的表达，从而影响鼠李糖脂的合成量。一方面，铁限制培养条件可以显著提高rhlIR的表达；另一方面，纳米材料由于具有与宏观物质所迥异的表面效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应和量子限域效应，可对细菌的合成代谢产生特异性的影响。即可以形成促进鼠李糖脂的培养条件，进行其产量的提高。
综上所述，运用致病能力较弱的缺失群体感应基因lasR的突变菌株，在适当的培养条件下以合适的纳米颗粒刺激鼠李糖脂的合成，这不仅能促进鼠李糖脂的分泌，而且大大降低了生产过程中的健康风险，还具有成本低、操作简单的特点。
发明内容
为解决现有技术中所存在的问题，本发明提供一种高效无害化的鼠李糖脂生物制备方法。
一种发酵培养基，由PM培养基添加酪蛋白或谷氨酸组成，其中，所述发酵培养基中酪蛋白或谷氨酸的浓度为8～12g/L，Fe2+的浓度为2～3μM。
进一步地，酪蛋白或谷氨酸的浓度为10g/L，Fe2+的浓度为2.5μM。
PM培养基组成如下：c((NH4)2SO4)1g/L；c(KH2PO4)1.7g/L；c(NaHPO4)1.775g/L；c(EDTA)0.0025g/L；c(ZnSO4·7H2O)0.011g/L；c(MnSO4·H2O)0.00154g/L；c(CuSO4·5H2O)0.000392g/L；c(Co(NO3)2·6H2O)0.00025g/L；c(Na2B4O7·10H2O)0.000177g/L；c(CaCl2·2H2O)0.0667g/L；c(MgSO4)0.289g/L；c((NH4)6Mo7O24·4H2O)＝0.000185g/L；c(KOH)0.146g/L；c(氨三乙酸)0.2g/L；c(FeSO4·7H2O)以Fe2+的浓度为2～3μM进行添加。
本发明还提供一种鼠李糖脂的生物制备方法，包括如下步骤：
(1)将鼠李糖脂生产菌种子液接入本发明所述发酵培养基中，进行发酵培养；然后将纳米颗粒以10μg/L～5mg/L加入发酵培养基中；
(2)步骤(1)所得发酵液进行分离提取，得鼠李糖脂。
本发明中促进鼠李糖脂产生的培养基为铁限制培养基，铁限制条件可以提高rhlIR的表达，从而使鼠李糖脂的产生量显著提高。所用的纳米颗粒皆为常见的纳米颗粒，对微生物毒性作用不明显，但能促进鼠李糖脂的分泌。所用的提取鼠李糖脂的方法用酸沉淀冷冻干燥法代替常用的氯仿/甲醇萃取法，更为绿色环保。
鼠李糖脂合成受rhlIR系统调控。环境因子可以影响rhlIR的表达，从而影响鼠李糖脂的合成量。一方面，铁限制培养条件可以显著提高rhlIR的表达；另一方面，纳米材料由于具有与宏观物质所迥异的表面效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应和量子限域效应，可对细菌的合成代谢产生特异性的影响。即两方面协同可以形成促进鼠李糖脂的培养条件，进行其产量的提高。
本发明的发酵培养基及生物制备方法适用于所有的鼠李糖脂生产菌，本发明采用其中的集中进行实验并作了优化，优选采用铜绿假单胞菌野生株、缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株或洋葱伯克氏菌株，其中缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株的致病性小，是更好的选择。如使用缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株作为鼠李糖脂生产菌，大大减弱了铜绿假单胞菌与伯克氏菌所带来的致病性。
在铜绿假单胞菌体内，具有多个群体感应系统，其中lasIR系统调控很多致病因子的分泌。多数临床分离的铜绿假单胞菌群体感应lasR缺失突变株，其致病因子表达显著下降。即使用铜绿假单胞菌lasR突变株用于鼠李糖脂的合成，具体提高所制备的鼠李糖脂生物安全性的优点。
综上，如运用致病能力较弱的缺失群体感应基因lasR的突变菌株，在适当的培养条件下以合适的纳米颗粒刺激鼠李糖脂的合成，这不仅能促进鼠李糖脂的分泌，而且大大降低了生产过程中的健康风险，还具有成本低、操作简单的特点。
铜绿假单胞菌野生株和洋葱伯克氏菌株采用常规分离方法自行分离即可。缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株已在(Chugani S A,Whiteley M,Lee K M,et al.QscR,amodulator of quorum-sensing signal synthesis and virulence in Pseudomonasaeruginosa.[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America,2001,98(5):2752-7.)中公开，本发明中，按照该文献所公开的方法采用现有分子生物学手段进行构建。
本发明对鼠李糖脂合成的种子液培养时间进行优化，优选使用处于对数生长期或稳定期前期的种子液。
本发明对促进鼠李糖脂产生的培养基进行优化，优选使用铁限制的培养基，进一步地，所述铁限制的培养基为铁限制谷氨酸培养基或铁限制酪蛋白培养基。
优选地，所述纳米颗粒为纳米二氧化钛、碳纳米管或石墨烯，粒径≤50nm。进一步优选地，所述纳米颗粒的粒径≤50nm，纯度≥98％的二氧化钛颗粒。
为使纳米颗粒能更好的分散在培养基中，优选地，所述纳米颗粒加入前超声分散在无离子水中，然后加入所述发酵培养基中。
优选地，所述纳米颗粒在发酵培养基中的浓度为100μg/L～1mg/L。在最优培养条件下，加入此浓度范围的纳米颗粒可使菌株产生鼠李糖脂产量提高40～80％。
作为优选，本发明对纳米颗粒种类和剂量均进行优化，进一步优选，所述纳米颗粒在发酵培养基中的浓度为0.5mg/L～1mg/L；最优选使用1mg/L的纳米二氧化钛，该条件下鼠里糖脂产量提高了70～75％。
本发明对纳米颗粒促进剂加入至鼠李糖脂发酵液的时间进行优化，在鼠李糖脂生产菌生长为指数生长前期时加入纳米颗粒。所述纳米颗粒的加入时机为培养6-8h后。
本发明对鼠李糖脂发酵液培养时间进行优化，优选使用培养20～28h后的发酵液，最优选为培养24h后的发酵液。
本发明对鼠李糖脂的提取方法进行优化，为酸沉淀冷冻干燥法或氯仿/甲醇萃取法，进一步优选使用酸沉淀冷冻干燥法。
所述酸沉淀冷冻干燥法具体步骤如下：
(1)2～5℃下离心去菌体；(2)盐析离心去蛋白沉淀；(3)调节pH至1.5～2.5；(4)抽滤并冷冻干燥。
进一步优选地，(1)4℃下离心去菌体；(2)盐析离心去蛋白沉淀；(3)调节pH至2；(4)抽滤并冷冻干燥。
本发明中的制备工艺，最优选地，所述培养基为谷氨酸铁限制培养基，其中Fe2+的浓度为2～3μM；发酵培养6～8小时候以0.5～1mg/L向发酵培养基中加入纳米二氧化钛。该最优选的培养条件适用于缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株时效果更好。
本发明的方法与现有的方法相比具有如下优点：
(1)鼠李糖脂生产菌株可采用缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株，大大减弱了由铜绿假单胞菌带来的致病性。
(2)所用的促进鼠李糖脂产生的培养基为铁限制培养基能在lasR基因缺失的情况下也能使铜绿假单胞菌rhlIR的表达提高，从而使鼠李糖脂有高产量保证。
(3)所用的纳米颗粒无毒性作用，对菌株的生长没有影响，不会诱导菌株突变而造成菌株的不稳定性。
(4)所用的纳米颗粒的剂量低，只需要100μg/L～1mg/L便能起效。
(5)所用的提取鼠李糖脂的方法用酸沉淀冷冻干燥替代氯仿/甲醇的萃取法，更为绿色环保。
(6)使用成本低，使用的工作剂量低，相应成本低。
(7)效果明显，能显著促进鼠李糖脂的分泌。
(8)操作简单，无复杂的技术要求。
附图说明
图1是本方法的施用流程图
具体实施方式
以下实施例中所用铜绿假单胞菌野生菌株和洋葱伯克氏菌株均采用常规分离方法分离得到，所用缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株参照Chugani S A,Whiteley M,LeeK M,et al.QscR,a modulator of quorum-sensing signal synthesis and virulencein Pseudomonas aeruginosa.[J].Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America,2001,98(5):2752-7.)中公开的方法采用现有分子生物学手段进行构建：从铜绿假单胞菌野生菌全基因组中获得目的基因(lasR基因)及上下游序列，设计同源臂，通过同源重组方法敲除目的基因，利用100μg/mL gentamicin和含10％(m/v)蔗糖无盐LB进行突变株筛选，并通过PCR扩增及测序进一步鉴定。
以下实施例均参照图1所示流程进行。
实施例1
(1)培养用于鼠李糖脂合成的种子液10h-12h至处于对数生长期或稳定期前期。所用的鼠李糖脂的生产菌分别为：1.铜绿假单胞菌野生菌株，2.缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株，3.洋葱伯克氏菌株。
(2)制备促进鼠李糖脂产生的铁限制培养基：c((NH4)2SO4)＝1g/L，c(KH2PO4)＝1.7g/L，c(NaHPO4)＝1.775g/L，c(EDTA)＝0.0025g/L，c(ZnSO4·7H2O)＝0.011g/L，c(MnSO4·H2O)＝0.00154g/L，c(CuSO4·5H2O)＝0.000392g/L，c(Co(NO3)2·6H2O)＝0.00025g/L，c(Na2B4O7·10H2O)＝0.000177g/L，c(CaCl2·2H2O)＝0.0667g/L，c(MgSO4)＝0.289g/L，c((NH4)6Mo7O24·4H2O)＝0.000185g/L，c(KOH)＝0.146g/L，c(氨三乙酸)＝0.2g/L，c(FeSO4·7H2O)＝0.000698g/L，c(谷氨酸)＝10g/L。
(3)将(1)种子液接入(2)培养基中发酵培养。
(4)制备促进鼠李糖脂分泌的纳米二氧化钛颗粒促进剂：称取0.004g纳米二氧化钛加入至200mL灭菌水中。于超声波下进行超声至纳米颗粒均匀分散地溶于水中。从而配成纳米颗粒溶液的母液，浓度为20mg/L。临用时现配。
(5)将(4)促进剂以1mg/L浓度在(3)发酵液培养6h-8h至处于对数生长前期时加入培养基。
(6)用酸沉淀冷冻干燥法提取培养至24h的发酵液中的鼠李糖脂。
结果如表1所示：
表1
三种菌株的鼠李糖脂分泌量没有显著性差别，但通过蛋白酶的分泌量进行对比，缺失lasR基因的突变株明显低于其他两种菌株。因此选用缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株是优选。
实施例2
(1)培养用于鼠李糖脂合成的种子液。所用的鼠李糖脂的生产菌为缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株。将种子液分别培养至1.2h对数生长前期；2.12h稳定期前期；3.20h稳定期后期。
(2)制备促进鼠李糖脂产生的铁限制培养基：c((NH4)2SO4)＝1g/L，c(KH2PO4)＝1.7g/L，c(NaHPO4)＝1.775g/L，c(EDTA)＝0.0025g/L，c(ZnSO4·7H2O)＝0.011g/L，c(MnSO4·H2O)＝0.00154g/L，c(CuSO4·5H2O)＝0.000392g/L，c(Co(NO3)2·6H2O)＝0.00025g/L，c(Na2B4O7·10H2O)＝0.000177g/L，c(CaCl2·2H2O)＝0.0667g/L，c(MgSO4)＝0.289g/L，c((NH4)6Mo7O24·4H2O)＝0.000185g/L，c(KOH)＝0.146g/L，c(氨三乙酸)＝0.2g/L，c(FeSO4·7H2O)＝0.000698g/L，c(谷氨酸)＝10g/L。
(3)将(1)种子液分别接入(2)培养基中发酵培养。
(4)制备促进鼠李糖脂分泌的纳米二氧化钛颗粒促进剂：称取0.004g纳米二氧化钛加入至200mL灭菌水中。于超声波下进行超声至纳米颗粒均匀分散地溶于水中。从而配成纳米颗粒溶液的母液，浓度为20mg/L。临用时现配。
(5)将(4)促进剂以1mg/L浓度在(3)发酵液培养6h-8h至处于对数生长前期时加入培养基。
(6)用酸沉淀冷冻干燥法提取培养至24h的发酵液中的鼠李糖脂。
结果如表2所示：
表2
通过对比不同生长时期的种子液接入培养基发酵后的鼠李糖脂产量，发现种子液培养至对数生长期或稳定前期效果较好，作为优选。
实施例3
(1)培养用于鼠李糖脂合成的种子液10h-12h至处于对数生长期或稳定期前期。所用的鼠李糖脂的生产菌为缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株。
(2)制备促进鼠李糖脂产生的培养基分别为：1.谷氨酸铁限制培养基：c((NH4)2SO4)＝1g/L，c(KH2PO4)＝1.7g/L，c(NaHPO4)＝1.775g/L，c(EDTA)＝0.0025g/L，c(ZnSO4·7H2O)＝0.011g/L，c(MnSO4·H2O)＝0.00154g/L，c(CuSO4·5H2O)＝0.000392g/L，c(Co(NO3)2·6H2O)＝0.00025g/L，c(Na2B4O7·10H2O)＝0.000177g/L，c(CaCl2·2H2O)＝0.0667g/L，c(MgSO4)＝0.289g/L，c((NH4)6Mo7O24·4H2O)＝0.000185g/L，c(KOH)＝0.146g/L，c(氨三乙酸)＝0.2g/L，c(FeSO4·7H2O)＝0.000698g/L，c(谷氨酸)＝10g/L；2.酪蛋白铁限制培养基：c((NH4)2SO4)＝1g/L，c(KH2PO4)＝1.7g/L，c(NaHPO4)＝1.775g/L，c(EDTA)＝0.0025g/L，c(ZnSO4·7H2O)＝0.011g/L，c(MnSO4·H2O)＝0.00154g/L，c(CuSO4·5H2O)＝0.000392g/L，c(Co(NO3)2·6H2O)＝0.00025g/L，c(Na2B4O7·10H2O)＝0.000177g/L，c(CaCl2·2H2O)＝0.0667g/L，c
(MgSO4)＝0.289g/L，c((NH4)6Mo7O24·4H2O)＝0.000185g/L，c(KOH)＝0.146g/L，c(氨三乙酸)＝0.2g/L，c(FeSO4·7H2O)＝0.00698g/L，c(酪蛋白)＝10g/L；3.LB培养基：c(蛋白胨)＝10g/L，c(酵母提取物)＝5g/L，c(NaCl)＝5g/L。
(3)将(1)种子液接入(2)培养基中发酵培养。
(4)制备促进鼠李糖脂分泌的纳米二氧化钛颗粒促进剂：称取0.004g纳米二氧化钛加入至200mL灭菌水中。于超声波下进行超声至纳米颗粒均匀分散地溶于水中。从而配成纳米颗粒溶液的母液，浓度为20mg/L。临用时现配。
(5)将(4)促进剂以1mg/L浓度在(3)发酵液培养6h-8h至处于对数生长前期时加入培养基。
(6)用酸沉淀冷冻干燥法提取培养至24h的发酵液中的鼠李糖脂。
结果如表3所示：
表3
通过对三种不同种类的培养基分泌的鼠李糖脂量作对比可知谷氨酸铁限制培养基效果最好作为优选。
实施例4
(1)培养用于鼠李糖脂合成的种子液10h-12h至处于对数生长期或稳定期前期。所用的鼠李糖脂的生产菌为缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株。
(2)制备促进鼠李糖脂产生的培养基分别为：1.铁限制培养基：c((NH4)2SO4)＝1g/L，c(KH2PO4)＝1.7g/L，c(NaHPO4)＝1.775g/L，c(EDTA)＝0.0025g/L，c(ZnSO4·7H2O)＝0.011g/L，c(MnSO4·H2O)＝0.00154g/L，c(CuSO4·5H2O)＝0.000392g/L，c(Co(NO3)2·6H2O)＝0.00025g/L，c(Na2B4O7·10H2O)＝0.000177g/L，c(CaCl2·2H2O)＝0.0667g/L，c(MgSO4)＝0.289g/L，c((NH4)6Mo7O24·4H2O)＝0.000185g/L，c(KOH)＝0.146g/L，c(氨三乙酸)＝0.2g/L，c(FeSO4·7H2O)＝0.000698g/L，c(谷氨酸)＝10g/L；2.磷限制培养基：c((NH4)2SO4)＝1g/L，c(KH2PO4)＝0.17g/L，c(NaHPO4)＝0.1775g/L，c(EDTA)＝0.0025g/L，c(ZnSO4·7H2O)＝0.011g/L，c(MnSO4·H2O)＝0.00154g/L，c(CuSO4·5H2O)＝0.000392g/L，c(Co(NO3)2·6H2O)＝0.00025g/L，c(Na2B4O7·10H2O)＝0.000177g/L，c(CaCl2·2H2O)＝0.0667g/L，c(MgSO4)＝0.289g/L，c((NH4)6Mo7O24·4H2O)＝0.000185g/L，c(KOH)＝0.146g/L，c(氨三乙酸)＝0.2g/L，c(FeSO4·7H2O)＝0.00698g/L，c(谷氨酸)＝10g/L；3.正常培养基：c((NH4)2SO4)＝1g/L，c(KH2PO4)＝1.7g/L，c(NaHPO4)＝1.775g/L，c(EDTA)＝0.0025g/L，c(ZnSO4·7H2O)＝0.011g/L，c(MnSO4·H2O)＝0.00154g/L，c(CuSO4·5H2O)＝0.000392g/L，c(Co(NO3)2·6H2O)＝0.00025g/L，c(Na2B4O7·10H2O)＝0.000177g/L，c(CaCl2·2H2O)＝0.0667g/L，c(MgSO4)＝0.289g/L，c((NH4)6Mo7O24·4H2O)＝0.000185g/L，c(KOH)＝0.146g/L，c(氨三乙酸)＝0.2g/L，c(FeSO4·7H2O)＝0.00698g/L，c(谷氨酸)＝10g/L。
(3)将(1)种子液接入(2)培养基中发酵培养。
(4)制备促进鼠李糖脂分泌的纳米二氧化钛颗粒促进剂：称取0.004g纳米二氧化钛加入至200mL灭菌水中。于超声波下进行超声至纳米颗粒均匀分散地溶于水中。从而配成纳米颗粒溶液的母液，浓度为20mg/L。临用时现配。
(5)将(4)促进剂以1mg/L浓度在(3)发酵液培养6h-8h至处于对数生长前期时加入培养基。
(6)用酸沉淀冷冻干燥法提取培养至24h的发酵液中的鼠李糖脂。
结果如表4所示：
表4
在铁限制培养基中无论是铜绿假单胞菌的野生菌株还是突变株分泌的鼠李糖脂都比正常培养基显著性增多，而在磷限制培养基中突变株分泌鼠李糖脂的效果比野生菌株分泌鼠李糖脂的效果低。因此铁限制的培养基为优选。
实施例5
(1)培养用于鼠李糖脂合成的种子液10h-12h至处于对数生长期或稳定期前期。所用的鼠李糖脂的生产菌为缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株。
(2)制备促进鼠李糖脂产生的铁限制培养基：c((NH4)2SO4)＝1g/L，c(KH2PO4)＝1.7g/L，c(NaHPO4)＝1.775g/L，c(EDTA)＝0.0025g/L，c(ZnSO4·7H2O)＝0.011g/L，c(MnSO4·H2O)＝0.00154g/L，c(CuSO4·5H2O)＝0.000392g/L，c(Co(NO3)2·6H2O)＝0.00025g/L，c(Na2B4O7·10H2O)＝0.000177g/L，c(CaCl2·2H2O)＝0.0667g/L，c(MgSO4)＝0.289g/L，c((NH4)6Mo7O24·4H2O)＝0.000185g/L，c(KOH)＝0.146g/L，c(氨三乙酸)＝0.2g/L，c(FeSO4·7H2O)＝0.000698g/L，c(谷氨酸)＝10g/L。
(3)将(1)种子液接入(2)培养基中发酵培养。
(4)制备促进鼠李糖脂分泌的纳米颗粒促进剂：称取0.004g纳米颗粒加入至200mL灭菌水中。于超声波下进行超声至纳米颗粒均匀分散地溶于水中。从而配成纳米颗粒溶液的母液，浓度为20mg/L。临用时现配。所用纳米颗粒分别为：1.纳米二氧化钛；2.碳纳米管；3.石墨烯。
(5)将(4)促进剂以1mg/L浓度在(3)发酵液培养6h-8h至处于对数生长前期时加入培养基。
(6)用酸沉淀冷冻干燥法提取培养至24h的发酵液中的鼠李糖脂。
结果如表5所示：
表5
通过三种不同的纳米颗粒促进剂加入培养基中与不加纳米颗粒促进剂所分泌的鼠李糖脂分泌量进行对比，纳米二氧化钛效果最好作为优选。
实施例6
(1)培养用于鼠李糖脂合成的种子液10h-12h至处于对数生长期或稳定期前期。所用的鼠李糖脂的生产菌为缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株。
(2)制备促进鼠李糖脂产生的铁限制培养基：c((NH4)2SO4)＝1g/L，c(KH2PO4)＝1.7g/L，c(NaHPO4)＝1.775g/L，c(EDTA)＝0.0025g/L，c(ZnSO4·7H2O)＝0.011g/L，c(MnSO4·H2O)＝0.00154g/L，c(CuSO4·5H2O)＝0.000392g/L，c(Co(NO3)2·6H2O)＝0.00025g/L，c(Na2B4O7·10H2O)＝0.000177g/L，c(CaCl2·2H2O)＝0.0667g/L，c(MgSO4)＝0.289g/L，c((NH4)6Mo7O24·4H2O)＝0.000185g/L，c(KOH)＝0.146g/L，c(氨三乙酸)＝0.2g/L，c(FeSO4·7H2O)＝0.000698g/L，c(谷氨酸)＝10g/L。
(3)将(1)种子液接入(2)培养基中发酵培养。
(4)制备促进鼠李糖脂分泌的纳米二氧化钛颗粒促进剂：称取0.004g纳米二氧化钛颗粒加入至200mL灭菌水中。于超声波下进行超声至纳米颗粒均匀分散地溶于水中。从而配成纳米颗粒溶液的母液，浓度为20mg/L。临用时现配。
(5)将(4)促进剂分别以1.100μg/L；2.1mg/L；3.10mg/L的浓度在(3)发酵液培养6h-8h至处于对数生长前期时加入培养基。
(6)用酸沉淀冷冻干燥法提取培养至24h的发酵液中的鼠李糖脂。
结果如表6所示：
表6
通过对不同浓度的纳米二氧化钛颗粒促进剂加入至培养基后鼠李糖脂分泌量进行对比，1mg/L浓度纳米二氧化钛效果最佳作为优选。
实施例7
(1)培养用于鼠李糖脂合成的种子液10h-12h至处于对数生长期或稳定期前期。所用的鼠李糖脂的生产菌为缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株。
(2)制备促进鼠李糖脂产生的铁限制培养基：c((NH4)2SO4)＝1g/L，c(KH2PO4)＝1.7g/L，c(NaHPO4)＝1.775g/L，c(EDTA)＝0.0025g/L，c(ZnSO4·7H2O)＝0.011g/L，c(MnSO4·H2O)＝0.00154g/L，c(CuSO4·5H2O)＝0.000392g/L，c(Co(NO3)2·6H2O)＝0.00025g/L，c(Na2B4O7·10H2O)＝0.000177g/L，c(CaCl2·2H2O)＝0.0667g/L，c(MgSO4)＝0.289g/L，c((NH4)6Mo7O24·4H2O)＝0.000185g/L，c(KOH)＝0.146g/L，c(氨三乙酸)＝0.2g/L，c(FeSO4·7H2O)＝0.000698g/L，c(谷氨酸)＝10g/L。
(3)将(1)种子液接入(2)培养基中发酵培养。
(4)制备促进鼠李糖脂分泌的纳米二氧化钛颗粒促进剂：称取0.004g纳米二氧化钛颗粒加入至200mL灭菌水中。于超声波下进行超声至纳米颗粒均匀分散地溶于水中。从而配成纳米颗粒溶液的母液，浓度为20mg/L。临用时现配。
(5)将(4)促进剂以1mg/L的浓度加入至(3)发酵液。促进剂加入的时间分别为：1.(3)培养基进行培养发酵前；2.(3)培养基培养发酵至6h，处于指数生长前期；3.(3)培养基培养发酵至12h，处于指数生长后期。
(6)用酸沉淀冷冻干燥法提取培养至24h的发酵液中的鼠李糖脂。
结果如表7所示：
表7
通过对纳米二氧化钛颗粒促进剂加入至(3)培养基的三个时间作对比，当培养鼠李糖脂生产菌的发酵液处于对数生长前期时加入纳米颗粒促进剂效果最好为优选。
实施例8
(1)培养用于鼠李糖脂合成的种子液10h-12h至处于对数生长期或稳定期前期。所用的鼠李糖脂的生产菌为缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株。
(2)制备促进鼠李糖脂产生的铁限制培养基：c((NH4)2SO4)＝1g/L，c(KH2PO4)＝1.7g/L，c(NaHPO4)＝1.775g/L，c(EDTA)＝0.0025g/L，c(ZnSO4·7H2O)＝0.011g/L，c(MnSO4·H2O)＝0.00154g/L，c(CuSO4·5H2O)＝0.000392g/L，c(Co(NO3)2·6H2O)＝0.00025g/L，c(Na2B4O7·10H2O)＝0.000177g/L，c(CaCl2·2H2O)＝0.0667g/L，c(MgSO4)＝0.289g/L，c((NH4)6Mo7O24·4H2O)＝0.000185g/L，c(KOH)＝0.146g/L，c(氨三乙酸)＝0.2g/L，c(FeSO4·7H2O)＝0.000698g/L，c(谷氨酸)＝10g/L。
(3)将(1)种子液接入(2)培养基中发酵培养。
(4)制备促进鼠李糖脂分泌的纳米二氧化钛颗粒促进剂：称取0.004g纳米二氧化钛颗粒加入至200mL灭菌水中。于超声波下进行超声至纳米颗粒均匀分散地溶于水中。从而配成纳米颗粒溶液的母液，浓度为20mg/L。临用时现配。
(5)将(4)促进剂以1mg/L浓度在(3)发酵液培养6h-8h至处于对数生长前期时加入培养基。
(6)用酸沉淀冷冻干燥法分别提取培养至1.16h；2.20h；3.24h的发酵液中的鼠李糖脂。结果如表8所示：
表8
通过提取不同时间发酵液中的鼠李糖脂可得出提取24h时的发酵液中鼠李糖脂为优选。
实施例9
(1)培养用于鼠李糖脂合成的种子液10h-12h至处于对数生长期或稳定期前期。所用的鼠李糖脂的生产菌为缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株。
(2)制备促进鼠李糖脂产生的铁限制培养基：c((NH4)2SO4)＝1g/L，c(KH2PO4)＝1.7g/L，c(NaHPO4)＝1.775g/L，c(EDTA)＝0.0025g/L，c(ZnSO4·7H2O)＝0.011g/L，c(MnSO4·H2O)＝0.00154g/L，c(CuSO4·5H2O)＝0.000392g/L，c(Co(NO3)2·6H2O)＝0.00025g/L，c(Na2B4O7·10H2O)＝0.000177g/L，c(CaCl2·2H2O)＝0.0667g/L，c(MgSO4)＝0.289g/L，c((NH4)6Mo7O24·4H2O)＝0.000185g/L，c(KOH)＝0.146g/L，c(氨三乙酸)＝0.2g/L，c(FeSO4·7H2O)＝0.000698g/L，c(谷氨酸)＝10g/L。
(3)将(1)种子液接入(2)培养基中发酵培养。
(4)制备促进鼠李糖脂分泌的纳米二氧化钛颗粒促进剂：称取0.004g纳米二氧化钛颗粒加入至200mL灭菌水中。于超声波下进行超声至纳米颗粒均匀分散地溶于水中。从而配成纳米颗粒溶液的母液，浓度为20mg/L。临用时现配。
(5)将(4)促进剂以1mg/L浓度在(3)发酵液培养6h-8h至处于对数生长前期时加入培养基。
(6)分别用1.酸沉淀冷冻干燥法；2.氯仿/甲醇萃取法提取培养至24h的发酵液中的鼠李糖脂。结果如表9所示：
表9
通过对两种不同提取鼠李糖脂的方法作对比，两种方法提取的鼠李糖脂的量和性能没有显著区别，而酸沉淀冷冻干燥法更为绿色环保因此为作为优选。
综上9个案例说明，本方法适用于对鼠李糖脂的高效无害生物制备。用致病能力能力弱的缺失群体感应基因lasR的铜绿假单胞菌突变株在铁限制的培养基下可以恢复其分泌鼠李糖脂的能力，并对多种培养基的效果进行对比，用铁限制的谷氨酸培养基效果最佳。对种子液培养的时间进行对比，当种子液培养至对数生长期或稳定前期时效果最佳。常见纳米颗粒在低剂量下显著促进鼠李糖脂的分泌且也不改变鼠李糖脂作为表面活性剂的性能。对多种常见纳米颗粒进行对比，采用纳米二氧化钛的效果最佳。对纳米二氧化钛不同浓度梯度进行对比，采用1mg/L的效果最佳。对加入纳米颗粒于培养基中的时间进行对比，在鼠李糖脂发酵液处于对数生长前期加入效果最佳。随着发酵液培养时间的延长，所分泌的鼠李糖脂增多，在24h时提取鼠李糖脂效果最佳。而对两种不同的方法提取鼠李糖脂进行对比，酸沉淀冷冻干燥更为绿色环保无害。
以上所述仅为本发明专利的具体实施案例，单本发明专利的技术特征并不局限于此，任何相关领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (10)

1.一种发酵培养基，其特征在于，由PM培养基添加酪蛋白或谷氨酸组成，其中，所述发酵培养基中酪蛋白或谷氨酸的浓度为8～12g/L，Fe2+的浓度为2～3μM。
2.如权利要求1所述发酵培养基，其特征在于，酪蛋白或谷氨酸的浓度为10g/L，Fe2+的浓度为2.5μM。
3.一种鼠李糖脂的生物制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将鼠李糖脂生产菌种子液接入如权利要求1所述发酵培养基中，进行发酵培养；然后将纳米颗粒以10μg/L～5mg/L加入发酵培养基中；
(2)步骤(1)所得发酵液进行分离提取，得鼠李糖脂。
4.根据权利要求3所述生物制备方法，其特征在于，种子液为处于对数生长期或稳定期前期的种子液。
5.根据权利要求3所述生物制备方法，其特征在于，所述纳米颗粒为纳米二氧化钛、碳纳米管或石墨烯，粒径≤50nm。
6.根据权利要求5所述生物制备方法，其特征在于，所述纳米颗粒加入前超声分散在无离子水中，然后加入所述发酵培养基中。
7.根据权利要求3所述生物制备方法，其特征在于，所述纳米颗粒在发酵培养基中的浓度为100μg/L～1mg/L。
8.根据权利要求3所述生物制备方法，其特征在于，所述纳米颗粒的加入时机为发酵培养6-8h后。
9.根据权利要求3所述生物制备方法，其特征在于，所述发酵培养的时间为20～25小时，温度为30～40℃。
10.根据权利要求3所述生物制备方法，其特征在于，步骤(2)中提取方法为酸沉淀冷冻干燥法或氯仿/甲醇萃取法。
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