JP7418321B2

JP7418321B2 - 少なくとも２種の炭素源を使用する、ラムノリピドの向上した生産

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Publication number: JP7418321B2
Application number: JP2020505135A
Authority: JP
Inventors: ロヒサーン，ナッタポーン
Original assignee: ステパンカンパニー
Priority date: 2017-07-31
Filing date: 2018-07-30
Publication date: 2024-01-19
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Description

ラムノリピド（ＲＬ）を生産する改善された方法であって、ラムノリピド産生微生物を、少なくとも２種の炭素源、特にトリグリセリド含有油および甘味剤を含む培地中で培養するステップを含む方法が提供される。

環境への関心が高まっていることを理由に、バイオ界面活性剤は、世間および消費者に大きな注目を集めている。バイオ界面活性剤として最も需要のあるものの１つが、ラムノリピド（ＲＬ）であり、これは、ラムノリピドが、泡立ち、洗浄、分散、乳化および表面張力低下の能力が高いからである［１，２］。ラムノリピドは、炭水化物（ラムノース）と脂肪族酸（ヒドロキシ脂肪酸）とを含有する界面活性糖脂質である。ラムノリピドは、１個のラムノース単位（モノラムノシルリピド（monorhamnosylipid）またはモノラムノリピド）または２個のラムノース単位（ジラムノシルリピド（dirhamnosylipid）またはジラムノリピド）と、１個または２個（主に２個）の３－ヒドロキシ脂肪酸残基とを含有する。ラムノリピドは、主にシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）の好気性発酵により生産される。その他のシュードモナス属（Pseudomonas）種および大腸菌（E.coli）もラムノリピドを産生すると報告されているが、それらの収率は、Ｐ．エルギノーサ（P.aeruginosa）よりも力価および生産率がはるかに低い［３］。

ラムノリピド（ＲＬ）で、石油系合成界面活性剤、例えばラウレス硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）およびラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳまたはＳＤＳ）に競合するには、ＲＬの製造コストを著しく低下させる必要がある。プロセスの最適化および発酵の性能が、主なコスト推進要因である。様々な供給原料、遺伝子組み換え株および発酵戦略を含む多くのアプローチが、ＲＬの生産率および力価を向上させるために実施されてきた。Banat等［４］およびKaskatepe等［５］は、低コストの供給原料（すなわち、農業および様々な産業からの廃棄物流）を使用したバイオ界面活性剤の生産について、幅広い検討をしている。ラムノリピドはラムノース（糖）部分と３－ヒドロキシ脂肪酸テール部とを含有するため、幾人かの研究者は、糖蜜を単独の炭素供給原料として使用することを試みた。彼らのうち誰も、２～１０％の糖蜜濃度で６ｇ／Ｌ超のラムノリピド濃度を示していない［６～９］。他方で、植物油は、糖蜜供給原料に比べてより高い濃度でラムノリピドを生産するために使用されてきた。これまでに、ＲＬの生産のために両方の供給原料を組み合わせた者はいない。植物油を用いたＲＬの生産についての発酵性能の要約が、表１に示される。

米国特許第５，５０１，９６６号明細書［１０］では、１１日（２６４時間）の発酵で１１２ｇＲＬ／ＬのＲＬを生産するフェドバッチ法の特許を請求しており、したがって、計算されるＲＬの生産率は、僅か０．４２ｇＲＬ／Ｌ／時であり、これは低いと考えられる。生産率（ｇＲＬ／Ｌ／時）は、ラムノリピドが特定の発酵容量からどの程度速く生産されるかを表すため、非常に重要なプロセスパラメーターである。ＲＬの生産率が高いほど、ＲＬの製造コストが安くなる。

甘味剤（例えば、未精製甘味剤または糖）を、中鎖もしくは長鎖トリグリセリド含有油（例えば、ココナッツ油または植物油）または２種の油の組合せに添加し、このようにして、脂肪酸からのラムノースのデノボ合成を低減することにより、ラムノリピドの製造を向上させる手段が提供される。これにより、発酵時間が短縮され、したがって、ＲＬの生産率（ｇＲＬ／Ｌ／時）が向上する。

１種または複数種のラムノリピド（ＲＬ）を含む複数の発酵物を生産する半連続方法であって、（ａ）ラムノリピド産生微生物を、少なくとも１種の炭素源が甘味剤でありかつ少なくとも１種の炭素源が中鎖または長鎖トリグリセリド含有油である少なくとも２種の炭素源、少なくとも１種の窒素源、少なくとも１種のリン源、少なくとも１種のマグネシウム源、少なくとも１種のカリウム源、少なくとも１種の硫黄源、少なくとも１種の塩化物源、および少なくとも１種のナトリウム源を含む培養培地中で、少なくとも約１日、より詳細には約１日～約４日、さらにより詳細には約１日～約３日、なおさらにより詳細には約１日～約２日にわたり培養して、少なくとも約１．５ｇＲＬ／Ｌ／時、詳細には約１．７ｇＲＬ／Ｌ／時、より詳細には少なくとも約１．８ｇＲＬ／Ｌ／時、さらにより詳細には約１．８ｇＲＬ／Ｌ／時～約３．０ｇＲＬ／Ｌ／時、なおさらにより詳細には約１．８ｇＲＬ／Ｌ／時～約２．７ｇＲＬ／Ｌ／時の速度でＲＬを生成する、１種または複数種のラムノリピド（ＲＬ）と１種または複数種のラムノリピド産生微生物とを含む第１の発酵培地を得るステップと、（ｂ）（ａ）で得られた前記第１の発酵培地の少なくとも約７０％を除去するステップであり、特定の実施形態において、撹拌の間および空気流の維持の間に行われ、ここで特定の実施形態において、前記空気流が、酸素富化空気を用いて前記発酵培地を含有する容器内で維持される、ステップと、（ｃ）（ｂ）で除去した前記第１の発酵培地を、ステップ（ａ）に示される組成を有する培養培地と交換するステップと、（ｄ）ステップ（ａ）～（ｃ）を少なくとも１回繰り返して、ラムノリピドを含む次の発酵物を得るステップであり、前記ステップ（ａ）～（ｃ）が、少なくとも約２０日、より詳細には少なくとも約３０日にわたり繰り返すことが可能である、ステップとを含む、方法も提供される。

一実施形態において、この方法は、１種または複数種の微量栄養素を、１日あたりの総発酵容量の０．１～０．２％ｖ／ｖの濃度で含む組成物を添加するステップをさらに含んでいてもよい。なお別の特定の実施形態では、前記方法を使用して、少なくとも約４０ｇＲＬ／Ｌが得られる。なお別の特定の実施形態では、５０ｇＲＬ／Ｌが得られ、さらにより特定の実施形態では、少なくとも約５５ｇＲＬ／Ｌが得られ、なお別の特定の実施形態では、少なくとも約６０ｇＲＬ／Ｌが得られ、さらにより特定の実施形態では、少なくとも約６５ｇＲＬ／Ｌが得られ、なおさらにより特定の実施形態では、少なくとも約７０ｇＲＬ／Ｌが得られ、なおさらにより特定の実施形態では、少なくとも約８０ｇＲＬ／Ｌが得られ、なおさらにより特定の実施形態では、少なくとも約９０ｇＲＬ／Ｌが得られる。さらにより特定の実施形態では、約４０ｇＲＬ／Ｌ～１１０ｇＲＬ／Ｌが得られる。

１種または複数種のラムノリピドを生産する方法であって、ラムノリピド産生微生物を、少なくとも１種の炭素源が未精製甘味剤であり、かつ少なくとも１種の炭素源が植物油である少なくとも２種の炭素源、少なくとも１種の窒素源、少なくとも１種のリン源、少なくとも１種のマグネシウム源、少なくとも１種のカリウム源、少なくとも１種の硫黄源、少なくとも１種の塩化物源、少なくとも１種のナトリウム源、および任意で少なくとも１種の乳化剤を含む培養培地中で、少なくとも約１日にわたり培養し、それにより、少なくとも約４０ｇＲＬ／Ｌ、より詳細には少なくとも約５０ｇＲＬ／Ｌ、さらにより詳細には少なくとも約５５ｇＲＬ／Ｌ、なおさらにより詳細には少なくとも約６０ｇＲＬ／Ｌ、なおさらにより詳細には少なくとも約７０ｇＲＬ／Ｌ、なおさらにより詳細には少なくとも約８０ｇＲＬ／Ｌ、なおさらにより詳細には少なくとも約９０ｇＲＬ／Ｌ、もしくは約４０ｇＲＬ／Ｌ～約１１０ｇＲＬ／Ｌの力価を得る、および／または少なくとも約１．５ｇＲＬ／Ｌ／時の速度を得るステップを含む、方法も提供される。この方法は、前記ラムノリピド（複数可）を前記ラムノリピド含有発酵培地から単離するステップをさらに含んでいてもよい。特定の実施形態において、培養培地は微量栄養素を含まない。この培養培地は、半連続発酵、特に先に示される半連続方法で、またバッチおよびフェドバッチ発酵で使用されてもよい。ラムノリピドは、当技術分野において公知の方法を使用して単離および精製されてもよい（例えば、米国特許第９，８８４，８８３号明細書および２０１７年６月１日出願の米国特許出願第１５６１１０４５号明細書を参照）。

定義
値の範囲を示す場合、文脈から明らかにそうでないと判断されない限り、その範囲の上限と下限の間の、下限の単位の１０分の１までの各介在値、および記載範囲内のその他の記載値または介在値が、本発明に包含されると理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、記載した範囲内で限界値が具体的に除外されることを前提として、このより小さな範囲内に独立的に含まれていてもよく、また本発明に包含される。記載した範囲が限界値の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界値の一方または両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。

特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載したものと同様または等価のあらゆる方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することもできるが、これより、好ましい方法および材料を記載する。

本開示で引用されるあらゆる刊行物および特許を、その全体について参照により援用する。本明細書のいかなる記載も、本発明が先行発明によるそのような開示に先行できないと認めるものとして解釈されるべきではない。参照により援用された資料が本明細書と矛盾するか、またはこれと不適合である場合、そのような資料よりも本明細書が優先される。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されているように、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈から明らかにそうでないと判断されない限り、複数の指示物を含むことに言及する必要がある。

特に定めのない限り、一連の要素の前に付く「少なくとも」という用語は、一連の各要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態についての多数の等価物を認識するか、または日常実験だけを使用して確認することができるだろう。そのような等価物が本発明に包含されることが意図されている。文脈からそうでないと解釈されない限り、本明細書および以下の特許請求の範囲を通して、「含む（comprise）」という語、ならびに「含む（comprises）」および「含む（comprising）」などの変化形は、記載された整数もしくはステップ、またはグループの整数もしくはステップを含むことを示唆しているが、その他の整数もしくはステップ、またはグループの整数もしくはステップを除外することを示唆してはいないと理解される。したがって、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含有する（containing）」および「有する（having）」などの用語は、広い意味で、またはオープンエンドでかつ制限なしに読み取られるべきである。本明細書において使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、「含有する（containing）」という用語で置き換えられてもよく、または本明細書において使用される場合往々にして、「有する（having）」という用語で置き換えられてもよい。

本明細書において定義されているように、「甘味剤」とは、食用品を甘くする物質である。

本明細書において定義されているように、「未精製甘味剤」とは、製糖の副産物として水および糖を含有するが、精製プロセスにかけられていない甘味剤である。これは、樹液、根（例えば、ジャガイモ、サツマイモ、ビート、特にテンサイ）、花蜜、花、葉、果実、茎、木、柄を含むものから直接抽出することができるが、これらに限定されてはいない。

本明細書において定義されているように、「精製された甘味剤」とは、当技術分野において公知の方法を使用して精製プロセスにかけられた甘味剤である。

本明細書において定義されているように、「乳化剤」とは、エマルション（非混和性流体の準安定混合物）を十分に分散させておくために典型的に使用される一種の界面活性剤である。乳化剤は典型的には、疎水性（水を嫌う）および親水性（水を好む）の部分を有する。油と水とを含むエマルションにおいて、乳化剤は、その疎水性部分を油に向けて油を囲み、したがって、油分子が融合できないように保護層を形成する。この作用は、分散相を小粒子に保つ助けになり、エマルションが維持される。乳化剤は、アニオン性であっても、非イオン性であっても、またはカチオン性であってもよい。

本明細書において定義されているように、「中鎖トリグリセリド」は、６～１２個の炭素原子の脂肪族テール部を有する脂肪酸を含有する。

本明細書において定義されているように、「長鎖トリグリセリド」は、１３個より多くの炭素原子の脂肪族テール部を有する脂肪酸を含有する。

本明細書において定義されているように、「植物油」は、植物またはその一部分に由来するトリグリセリドの混合物を含有する。

本明細書において定義されているように、「ラムノリピド」とは、１個または複数個の、典型的には直鎖状の、飽和または不飽和のβ－ヒドロキシカルボン酸部分を含む脂質部分と、１個または複数個のラムノース単位の糖部分とを有する糖脂質を指す。糖部分および脂質部分は、糖部分のラムノース部分の１－ＯＨ基と、脂質部分のβ－ヒドロキシカルボン酸の３－ＯＨ基との間のβ－グリコシド結合を介して結合されている。したがって、１個のカルボン酸部分のカルボキシル基によりラムノリピドの端部が画定される。１個より多くのラムノース部分がラムノリピドに含まれる場合、脂質部分に結合されていない各ラムノース部分は、１，４－β－グリコシド結合を介して別のラムノース部分に結合されている。２個以上のβ－ヒドロキシカルボン酸がラムノリピドに存在する実施形態において、β－ヒドロキシカルボン酸部分は、互いに独立して選択される。幾つかの実施形態において、それぞれ複数のβ－ヒドロキシカルボン酸部分のβ－ヒドロキシカルボン酸部分は、同一であってもよい。幾つかの実施形態において、これらは互いに異なる。

本明細書において定義されているように、「微量栄養素組成物」とは、約２０ｍｇ／Ｌ以下の量で存在する微量栄養素を含む組成物である。

「培養培地」、「発酵培地」という用語は、同義語であり、同義で使用することができる。

糖蜜の添加を変更した場合および変更しない場合の発酵のｐＨの傾向を示すグラフである。

本明細書では、ラムノリピドを生産する改善された方法が提供される。特定の実施形態において、ラムノリピドは構造（Ｉ）を有していてもよい。

式中、ｍ＝２、１または０、特に１または０であり、ｎ＝１または０、または特に１であり、Ｒ^１およびＲ^２は、互いに独立して、２～２４個、好ましくは５～１３個の炭素原子を有する同じまたは異なる有機基、特に、任意で分枝鎖状の、任意で置換された、特にヒドロキシル置換された、任意で不飽和の、特に任意で一不飽和、二不飽和または三不飽和アルキル基、好ましくは、ペンテニル、ヘプテニル、ノネニル、ウンデセニルおよびトリデセニル、ならびに（ＣＨ_２）_Ｏ－ＣＨ_３（式中、ｏ＝１～２３、好ましくは４～１２）からなる群から選択されるものである。

主鎖および分枝鎖のどちらも、ヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＳｅもしくはＳｉをさらに含有していてもよく、または炭素原子が、これらのヘテロ原子のうちの１つにより置き換えられてもよい。脂肪族部分は、１種または複数種の官能基により置換されていても、または置換されていなくてもよい。置換基は、任意の官能基、例えば、アミノ、アミド、カルボニル、カルボキシル、ヒドロキシル、ニトロ、チオおよびスルホニルであってもよいが、これらに限定されることはない。

ラムノリピド産生微生物
先に言及したように、この方法は、ラムノリピド産生微生物を培養するステップを含む。ラムノリピド産生微生物は、ラムノリピドを産生する宿主細胞であり得る。ラムノリピドを産生する組換え宿主細胞は、ＲｈｌＡ遺伝子もしくはそのオルソログ、および／またはＲｈｌＢ遺伝子もしくはそのオルソログ、および／またはＲｈｌＣ遺伝子もしくはそのオルソログ、および／またはＲｈｌＲ遺伝子もしくはそのオルソログ、および／またはＲｈｌＩ遺伝子もしくはそのオルソログ、および／またはＲｈｌＧ遺伝子もしくはそのオルソログなどを発現する宿主細胞、例えば細菌細胞であり得る。

あるいは、「ラムノリピド産生微生物」は、ラムノリピドを適切な条件下で合成／産生する能力を有する微生物、例えば細菌であってもよく、これとしては、アクチノバクテリア（Actinobacteria）、フィルミクテス（Fimicutes）およびプロテオバクテリア（Proteobacteria）門の細菌が挙げられるが、これらに限定されることはない。特定の実施形態において、ラムノリピド産生微生物は、ガンマプロテオバクテリア（Gammaproteobacteria）綱の細菌である。さらなる実施形態において、ラムノリピド産生微生物は、シュードモナス（Pseudomonadales）目の細菌である。なお別のさらなる実施形態において、ラムノリピド産生微生物は、シュードモナス（Pseudomonadacae）科の細菌である。さらにさらなる実施形態において、ラムノリピド産生微生物は、シュードモナス（Pseudomonas）属の細菌、例えば、Ｐ．アルカリゲネス（P.alcaligenes）、Ｐ．エルギノーサ（P.aeruginosa）、Ｐ．クロロラフィス（P.chlororaphis）、Ｐ．クレマンセア（P.clemancea）、Ｐ．コリエレア（P.collierea）、Ｐ．フルオレッセンス（P.fluorescens）、Ｐ．ルテオラ（P.luteola）、Ｐ．プチダ（P.putida）、Ｐ．スタッツェリ（P.stutzeri）、およびＰ．テシデア（P.teessidea）である。さらなる実施形態において、ラムノリピド産生微生物は、Ｐ．エルギノーサ（P.aeruginosa）である。

培養（発酵）培地
ラムノリピド含有微生物は、培養（発酵とも称される）培地中で培養される。前記培養培地は、少なくとも２種の炭素源、少なくとも１種の窒素源、少なくとも１種のリン源、少なくとも１種の硫黄源、少なくとも１種のナトリウム源、少なくとも１種のマグネシウム源、少なくとも１種のカリウム源、少なくとも１種の硫黄源、および少なくとも１種の塩化物源を含む。

特定の実施形態において、炭素源は、甘味剤、ならびに１種または複数種の中鎖および／または長鎖トリグリセリドを含む油（本明細書ではそれぞれ中鎖含有トリグリセリド油および長鎖トリグリセリド含有油とも称される）であってもよい。より特定の実施形態において、各甘味剤は、約０．１％～約２％ｗ／ｖの量で存在していてもよく、および／または各油は、約３％～約１５％ｗ／ｗ、特に約４％～約１０％ｗ／ｗ、より詳細には約６％～約１２％ｗ／ｗの量で存在していてもよい。

甘味剤は、精製されていても、または未精製甘味剤であってもよい。精製された甘味剤の例としては、スクロース（グラニュー糖）およびステビアを挙げることができるが、これらに限定されることはない。未精製甘味剤は、製糖に由来していても、および／または樹液、１種もしくは複数種の根、果実、１種もしくは複数種の種子、１種もしくは複数種の花蜜、１種もしくは複数種の花、１種もしくは複数種の葉、１種もしくは複数種の木、１種もしくは複数種の柄、および／または１種もしくは複数種の動物に由来していてもよい。より特定の実施形態において、使用される前記未精製甘味剤は、糖蜜、米もしくは大麦麦芽シロップ、花蜜、ヤーコンシロップ、テンサイシロップ、コーンシロップ、ソルガムシロップ、メープルシロップ、ヤシ糖、またはジャガイモもしくはサツマイモに由来する甘味剤のうちの少なくとも１種であってもよい。最も特定の実施形態において、未精製甘味剤は糖蜜である。別の実施形態において、炭素源は、単糖類、例えば、グルコース、二糖類、例えば、スクロース、糖アルコール、例えば、グリセロール、長鎖アルカン、例えば、ｎ－ヘキサデカン、脂肪酸、例えばカプリル酸（オクタン酸とも称する）またはそれらの混合物、有機酸（例えば、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸）、アルコール（例えば、エタノール）、およびそれらの混合物をさらに含んでいてもよい。

特定の一実施形態において、油は、市販の中鎖トリグリセリド油であり得る中鎖トリグリセリド含有油であり、これは、ココナッツ油、ヤシ油および／もしくはその他の中鎖トリグリセリド（例えば、カプリル酸を含有する）の混合物、ココナッツ油、またはヤシ油を含有していてもよい。長鎖トリグリセリドは、ダイズ油、キャノーラ油、ヒマワリ油、ベニハナ油、ラッカセイ油、ヘンプシード油、ジャトロファ油、カラバッシュ油、アマニ油、コーン油、ポピーシード油、イブニングプリムローズ油、オリーブ油であってもよい。一実施形態において、長鎖トリグリセリドは、１３個より多くの炭素原子の脂肪族テール部を有する脂肪酸を含有し、特定の実施形態において、長鎖トリグリセリドは、１３～２１個の炭素原子の脂肪族テール部を有する脂肪酸を含有する。

特定の実施形態において、油は植物油であってもよい。植物油は、ダイズ油、ベニハナ油、ラッカセイ油、ヘンプシード油、キャノーラ油、ジャトロファ油、カラバッシュ油、アマニ油、コーン油、ポピーシード油、イブニングプリムローズ油、オリーブ油、パーム核油、ヤシ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマワリ油、グレープシード油、クルミ油、小麦胚芽油、または植物油の組合せであってもよい。

より特定の実施形態において、長鎖トリグリセリドは植物油であってもよく、甘味剤は未精製甘味剤であってもよい。

別の特定の実施形態において、中鎖または長鎖トリグリセリドは、コーン油、キャノーラ油もしくはダイズ油である植物油であってもよく、またはココナッツ油である中鎖トリグリセリドであってもよく、甘味剤は、糖蜜、テンサイシロップまたはソルガムシロップである未精製甘味剤である。

特定の実施形態において、培養培地は、少なくとも２種の炭素源が甘味剤でありかつ少なくとも１種の炭素源が中鎖または長鎖トリグリセリド含有油である少なくとも３種の炭素源を含んでいてもよい。さらにより特定の実施形態では、少なくとも２種の炭素源が未精製甘味剤であり、少なくとも１種の炭素源が中鎖トリグリセリド含有油、例えばココナッツ油である。

別の特定の実施形態において、培養培地は、少なくとも２種の炭素源が、中鎖または長鎖トリグリセリド含有油でありかつ少なくとも２種の炭素源が甘味剤である少なくとも４種の炭素源を含む。より特定の実施形態において、少なくとも１種の炭素源は、中鎖トリグリセリド含有油（例えばココナッツ油）であり、１種の炭素源は、長鎖トリグリセリド含有油（例えばキャノーラ油などの植物油）であり、少なくとも２種の炭素源は、未精製甘味剤（例えば、糖蜜、ソルガムシロップ、テンサイシロップ）である。

窒素源は、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、およびコーンスティープリカーであってもよい。特定の実施形態において、窒素源はＮａＮＯ_３である。なお別の実施形態において、窒素は、約５～２０ｇ／Ｌの量で存在していてもよい。

特定の実施形態において、リン源は、Ｈ_３ＰＯ_４またはＫ_２ＨＰＯ_４であってもよい。なお別の特定の実施形態において、前記リンは、約１～１５ｇ／Ｌの量で存在する。

特定の実施形態において、マグネシウムイオンは、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏおよび／またはＭｇＣｌ_２であってもよい。特定の実施形態において、マグネシウムは約０．２～２ｇ／Ｌの量で存在する。

カリウムは、ＫＣｌおよび／またはＫＯＨであってもよい。特定の実施形態において、カリウムは、約０．１～約２ｇ／Ｌの量で存在する。

ナトリウムは、ＮａＣｌ、ＮａＮＯ_３およびＮａＯＨであってもよい。特定の実施形態において、前記ナトリウムイオンは、約１～１５ｇ／Ｌの量で存在する。

塩化物は、ＫＣｌおよびＮａＣｌであってもよい。特定の実施形態において、前記の塩化物イオンは、約０．１～１ｇ／Ｌの量で存在する。

硫黄はＨ_２ＳＯ_４であってもよい。特定の実施形態において、前記硫黄イオンは、約０．１～１ｇ／Ｌの量で存在する。

硫黄および塩化物源は、米国特許第９，８８４，８８３号明細書に記載された手順を使用して得られる水層廃液流に由来していてもよく、またはこれは、酸処理精製発酵ブロスの水性液相もしくは水相とも称される。特定の実施形態では、ラムノリピドが、酸処理精製発酵ブロスの溶液から沈殿し、固相および油性液相を底部に形成し、水性液相が、このステップに使用される容器の上部に生成される。水性液相は、当技術分野において公知の手順を使用し、特定の実施形態においては、先に示される方法（例えば、濾過、または遠心分離、またはデカントと組み合わせた沈降）を使用して除去される。先に参照した水性層は、硫黄または塩化物源（約１．５～２．５、優先的には約２．０５～約２．１５のこのｐＨ調整の間に使用される酸の種類に応じる）であり、また微量栄養素源である。

培養培地は、乳化剤をさらに含んでいてもよい。特定の実施形態において、乳化剤としては、アラビアガム、グアーガムおよびラムノリピドを挙げることができるが、これらに限定されることはない。なお別の特定の実施形態において、前記培養培地中の炭素源に対する乳化剤の比は、約０．１％～約２０％ｗ／ｗである。なお別の特定の実施形態において、前記乳化剤は、約０．１～２重量％の量で存在していてもよい。

特定の実施形態において、培養培地または発酵培地は、当技術分野において公知の方法を使用して殺菌される。これらの方法は、濾過に基づいていても、熱に基づいていても、化学薬品に基づいていても、または紫外線に基づいていてもよい。特定の実施形態において、熱に基づく処理は、湿熱殺菌、特にオートクレーブ処理による処理であってもよい。

一実施形態において、培養培地（例えば発酵培地）は、先の手順のうちの１つにより殺菌されてもよい。別の実施形態において、発酵培地は、先に示される手順のうちの１つより多くにより殺菌されてもよく、これらの殺菌は、任意の順序であってもよい。これは、発酵において発酵の第１のサイクルで殺菌されてもよいが、次のサイクルにて別の容器内で殺菌されることが望ましい。

微量栄養素組成物
先に言及したように、前記方法は、微量栄養素の溶液または組成物を添加するステップをさらに含んでいてもよい。前記微量栄養素は、痕跡量のＦｅ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｎａであってもよい。特定の実施形態において、前記微量栄養素は、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｚｎ、ＮａまたはＣｕの塩である。より特定の実施形態において、前記微量栄養素組成物は、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｚｎ、ＮａおよびＣｕの塩を含む。この組成物は、濾過により殺菌されてもよい。

特定の実施形態において、前記Ｃｕ塩は、ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２ＯおよびＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏのうちの少なくとも１種であり、微量栄養素溶液１Ｌあたり約０．５～３ｇ（約０．５～３ｇ／Ｌ）の量で存在していてもよく、前記Ｍｎ塩は、ＭｎＳＯ_４・Ｈ_２ＯおよびＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏのうちの少なくとも１種であり、微量栄養素溶液１Ｌあたり約０．１～２ｇ（約０．１～２ｇ／Ｌ）の量で存在していてもよく、前記Ｚｎ塩は、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２ＯまたはＺｎＣｌ_２であり、微量栄養素溶液１Ｌあたり約０．５～３ｇ（約０．５～３ｇ／Ｌ）の量で存在していてもよく、前記Ｆｅ塩は、ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２ＯまたはＦｅＳＯ_４のうちの少なくとも１種であり、微量栄養素溶液１Ｌあたり約０．１～１ｇ（約０．１～１ｇ／Ｌ）の量で存在していてもよく、前記ナトリウム塩は、Ｎａ_３Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７・２Ｈ_２Ｏであり、微量栄養素溶液１Ｌあたり約１～５ｇ（約１～５ｇ／Ｌ）の量で存在していてもよい。

[実施例１]
未硫化サトウキビ廃糖蜜（unsulfured blackstrap sugar cane molasse）添加剤と、乳化剤としてアラビアガムとを用いる、ラムノリピドの６％ダイズ油半連続発酵
ラムノリピドの発酵を、７．５Ｌの作業容量を有する１０Ｌの発酵槽（Ｌａｂｆｏｒｓ５、ＩｎｆｏｒｓＨＴ、スイス）内で実施する。発酵培地は、残分としての脱イオン（ＤＩ）水中に、乳化された油と栄養素溶液とを含有する。まず、乳化剤として使用される０．８％のアラビアガムを有する８％の乳化されたダイズ油１．５Ｌを、キッチンブレンダーを使用して調製する。糖蜜の添加（硫黄を含まない廃糖蜜、ＧｏｌｄｅｎＢａｒｒｅｌ、アメリカ合衆国）では、糖蜜を、１％、０．５％または０．２５％ｗ／ｖで、１２１℃での５０分にわたるオートクレーブ内での殺菌前に乳化された油に添加する。これを３７℃に冷却した後に、９．６９ｇ／Ｌの８５％Ｈ_３ＰＯ_４、５．２１ｇ／ＬのＮａＯＨ、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１ｇ／ＬのＫＣｌ、および１５ｇ／ＬのＮａＮＯ_３を含有する、０．２ミクロンの殺菌済の濾過された栄養素溶液を添加する。８５％のＨ_３ＰＯ_４を除くすべての化学薬品が、少なくとも９９％の純度である。２０１７年６月１日に出願された米国特許出願第１５６１１０４５号明細書の実施例３から得られる２．５％のＲ４培養物を接種する前に、Ｈ_２ＳＯ_４を使用して発酵培地のｐＨを６．３に調整する。

発酵を、３７℃、０．１４ｖｖｍの空気供給速度、および３００～６５０ｒｐｍの撹拌速度で実施して、溶存酸素（ＤＯ）を少なくとも１５％に維持する。撹拌速度が６５０ｒｐｍに達しているものの、％ＤＯがなおも１５％未満である場合、純粋な酸素を空気とともに加えて、総気体流量を一定に保つ（０．１４ｖｖｍ）。米国特許出願公開第２０１６０３２６５６１号明細書として公開されている米国特許出願第１５／１４６，５０８号明細書に記載されている実施例２に従って調製されたおよそ２０％の微量痕跡元素組成物を、ペリスルタティックポンプ（peristatic pump）を使用して、発酵器に８０ｍｌ／日で連続的に添加する。ケイ素系消泡剤（ＳｎａｐｓｉｌＦＤ３０、ＢＲＢ、オランダ）を自動的に添加して、発酵の間に泡を除去する。ｐＨが７．９を上回らない限り、発酵はｐＨ制御なしで起こる。この時点で、２５％のＨ_２ＳＯ_４を自動的に添加して、ｐＨを７．９に制御する。

発酵が完了した後に、ポンプを使用して、％ＤＯを１５％に維持（すなわち、撹拌および気体供給がまだオンになっている）しながら、約７７％の発酵ブロス（５．８Ｌ）を取り出す。この実施例の最初の段落で述べた、別個の容器内で調製された、殺菌したばかりの８％の乳化された油の培養培地５．８Ｌを、新たな供給原料として発酵器に供給する。「ドローアンドフィル（draw and fill）（ＤＦ）」と称されるこの方法は、米国特許出願公開第２０１６０３２６５６１号明細書として公開されている米国特許出願第１５／１４６，５０８号明細書に開示されている。接種後に発酵器から除去される第１の７７％の発酵ブロスを、バッチＤＦ０と称する。続いて、ＤＦ０の後に発酵器から抜き出される次の発酵ブロスを、ＤＦ１等と称する。

図１に示される、ＤＦ１（糖蜜なし）、ＤＦ５、６および７（０．５％の糖蜜添加）についての発酵の過程にわたるｐＨの傾向は、３相のパターンのｐＨ変化を示す。第１に、ｐＨは、発酵の開始時に迅速に上昇する。第２に、ｐＨは、ｐＨが再び上昇する第３相前に、安定を保つか、または僅かに低下する。第２相は、糖蜜の添加により短縮される。第３相では、ｐＨが％ＤＯの増加に伴って迅速に上昇し、その一方で撹拌および空気流は一定であり、これは、発酵が完了したことを示す。上部の油層を有しない透明な上清が、除去された発酵ブロスを、９５００ｒｐｍで１０分にわたり、または１４，０００ｒｐｍで５分にわたり遠心分離した後に得られる。その後、各ＤＦから得られた透明なＲＬ上清を、殺菌し、再び遠心分離して、清澄化されたブロス（ＣＢ）を得、これを、ＤＩ水で希釈する前に、材料の開始濃度に応じて少なくとも１００～２００回、０．２ミクロンで濾過する。その後、希釈した試料を、ラムノリピド定量化のためにＨＰＬＣ－ＥＬＳＤに注入する（詳細な方法論は実施例２に示される）。

様々な濃度の糖蜜添加による発酵の結果は、表２に示される。１０Ｌの発酵槽を停止することなく使用して、この「ドローアンドフィル」法により発酵を１８日間にわたり連続的に行い、６５Ｌを超える発酵ブロスを生成した。表２中の結果は、糖蜜濃度にかかわらず、糖蜜を添加することにより、主に第２相のｐＨ変化の間に、発酵時間が短縮され（図１）、それにより、糖蜜なしのものに比べて、ＲＬ生産率がより高くなることを明らかに示す。これは、ｇＣＤＷ／Ｌ（１Ｌあたりのｇ細胞乾燥重量）の列に示される細菌細胞質量の増加による可能性もある。

[実施例２]
ラムノリピド分析の定量化および構造
１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）と、逆相カラムであるＲｅｓｔｅｋのＰｉｎｎａｃｌｅＤＢＣ１８（１００×２．１ｍｍ、３ミクロン部分＃９４１４３１２）とを備えるＡｇｉｌｅｎｔ１２６０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを使用して、試料におけるラムノリピドの濃度を定量化する。カラム温度を４０℃で一定に保つ。試料注入容量は２５μＬである。移動相は、同容量の５ｍＭの酢酸アンモニウムおよびアセトニトリルを０．２５ｍｌ／分で含有する。霧化物および蒸発器の温度は、１．７ＳＬＭの窒素で、４０℃である。ＲＬ濃度は、希釈係数と、薄層クロマトグラフィーを使用してインハウスで得られた標準物の既知の濃度（すなわち、純粋なジラムノリピドおよび純粋なモノラムノリピドの較正曲線）とを使用して計算する。

ラムノリピドの構造は、ＷａｔｅｒｓＺＱ２０００シングル四重極質量分析装置に接続されたＷａｔｅｒｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ２６９５セパレーションモジュールを使用してエレクトロスプレーイオン化（ＬＣ／ＭＳ）で分析する。ＬＣカラムは、ＨＰＬＣの構成で使用されるものと同じである。注入容量は５μＬである。移動相は、５ｍＭの酢酸アンモニウム（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）からなる。流速は０．２ｍＬ／分であり、Ａ＝６０％（Ｂ＝４０％）を２分間、その後、１５分で１００％のＢに勾配し、これを残りのＬＣ処理にわたり保つ。試料を４℃に保ち、カラム温度を４０℃で一定に保つ。ラムノリピドの検出についてのＬＣ／ＭＳ条件は、以下の表３に記載されている。

[実施例３]
乳化剤としてラムノリピドを用いる、７．８％のダイズ油および０．５％の未硫化サトウキビ廃糖蜜のＲＬ半連続発酵
発酵条件、培地および栄養素組成物は、実施例１から生産された精製されたラムノリピドを乳化剤として使用することを除いて、実施例１に示されるものと同じである。炭素供給原料は、０．５％の未硫化廃糖蜜を有する７．８％のダイズ油である。精製されたラムノリピドを、殺菌したばかりの培養培地を用いて、乳化剤として始めに培養培地に添加する。

ラムノリピド（ＲＬ）濃度および生産率は、表４に示される。ＲＬは、ＤＦ０の場合は０．５％で、ＤＦ１～ＤＦ３の場合は０．１％で乳化剤として始めに培地に添加されるため、これらの量は差し引き、発酵から生じる実際のＲＬ濃度を調整済ＲＬ（ｇ／Ｌ）として報告する。

微生物は、ＬＢブロスを含有する振とうフラスコからダイズ油を含有する発酵器へと新たな環境に適応する時間を必要とするため、ＤＦ０について発酵により長い時間がかかることは、言及する価値がある。示されるＤＦ０のすべてのＲＬ生産率は、ＤＦ１＋から得られるＲＬ生産率よりも低い。また、これは、ＲＬ生産率および発酵処理効率が第１の接種（ＤＦ０）後に増加するため、半連続発酵法の利点でもある。バッチ発酵法では、発酵を最初から開始する（すなわち、各バッチに新しく接種する）必要があるため、新たなバッチを開始する度に、この遅れが問題となる。

％炭素変換率は、ラムノリピド中の炭素に変換された、ダイズ油中に含有される炭素の量に基づいて計算される。ＬＣ／ＭＳの結果により、ラムノリピド試料が、Ｃ１０～Ｃ１０およびＣ１０～Ｃ１２テール部を有するモノラムノースおよびジラムノースを主に含有することが示された。この結果に基づくと、ラムノリピド生産のためのダイズ油からの炭素変換率の計算値は、８０％超である。

[実施例４]
０．５％の未硫化サトウキビ廃糖蜜を用いる、８．８％のコーン油のＲＬ半連続発酵
発酵条件、培地および栄養素組成物は、乳化剤として実施例１から生産された精製されたラムノリピドを使用し、７．５ｍｌの微量痕跡元素を毎日添加することを除いて、実施例１に示されるものと同じである。炭素供給原料は、０．５％の未硫化サトウキビ廃糖蜜を有する８．８％コーン油であり、精製されたラムノリピドを、ＤＦ０の始めにのみ０．１％で、乳化剤として培養培地に添加する。ＤＦ１～ＤＦ５については、乳化剤としてラムノリピドを添加しない。

コーン油の発酵から得られたＲＬ生産率は、ダイズ油からのＲＬ生産率と同程度に良好である。ＲＬ生産率は、２～２．３ｇＲＬ／Ｌ／時の範囲にある。

[実施例５]
様々な濃度でテンサイおよびソルガムシロップを用いる振とうフラスコ実験
振とうフラスコ実験を、２５０ｍｌのＰｙｒｅｘエルレンマイヤーバッフルフラスコ内で、ＭａｘＱ（商標）８０００ＳｔａｃｋａｂｌｅＯｒｂｉｔａｌＳｈａｋｅｒｓ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、３７℃にて２５０ｒｐｍで実施する。各フラスコは、実施例１に記載したものと同じ栄養素組成物を有するものの、微量痕跡元素は含まない８％のダイズ油を含有する４０ｍｌの培養培地を含んでいた。バッフルフラスコを、１２１℃で２０分にわたりオートクレーブ処理し、室温に冷却した後、Ｐ．エルギノーサ（P.aeruginosa）培養物を用いて２．５％ｖ／ｖで接種する。殺菌したピペットを使用して、６８時間、９２時間、および１１６時間で試料を採取する。試料を、１４，０００ｒｐｍで５分にわたり遠心分離して、透明な上清（油層なし）を得、その後、これを殺菌し、０．２ミクロンで濾過した後、ＨＰＬＣ／ＥＬＳＤを使用したＲＬ濃度分析のために、希釈する。

透明な上清なし（すなわち、上部に油層を有する）の試料は、「ＣＢなし」と表示され、これは、試料中の油濃度が高過ぎるためにこれがＨＰＬＣに注入されなかったことを意味する。表６に示されるこれらの結果により、ラムノリピド生産が、テンサイシロップおよびソルガムシロップの添加によっても向上することが明らかに示される。

[実施例６]
８％のダイズ油と０．５％の未硫化サトウキビ廃糖蜜とを用いたＲＬバッチ発酵
発酵条件、培地および栄養素組成物は、これが、発酵がＲ４接種（時間＝０）で開始し、発酵が完了したら発酵を停止し、洗浄することを意味するバッチ発酵であることを除いて、実施例４に示されるものと同じである。炭素供給原料は、０．５％の未硫化廃糖蜜を有する８％のダイズ油である。精製されたラムノリピドは、殺菌したばかりの培養培地を用いて、乳化剤として０．１％で培養培地に添加される。

発酵は、完了までに４４時間かかる。ラムノリピド（ＲＬ）濃度は、４４時間で８８ｇ／Ｌで得られ、したがって、ＲＬ生産率は、糖蜜が添加されない実施例１に示されるＤＦ０で得られる１ｇ／Ｌ／時に比べて、１．９ｇ／Ｌ／時である。

[実施例７]
乳化剤としてラムノリピドを用いる、８％のココナッツ油および０．５％の未硫化サトウキビ廃糖蜜のＲＬ半連続発酵
発酵条件、培地および栄養素組成物は、炭素供給原料が８％のココナッツ油であることを除いて、実施例３に示されるものと同じである。ラムノリピドは、ＤＦ０から生成されるため、ＤＦ１～ＤＦ４については乳化剤として添加しない。０．５％の糖蜜添加では、発酵時間は、３２～３６時間で一貫している。

[実施例８]
糖添加剤と組み合わせた８％のココナッツ油のＲＬ発酵
発酵条件、培地および栄養素組成物は、糖添加剤が、未硫化サトウキビ廃糖蜜、ソルガムシロップおよびテンサイシロップであることを除いて、実施例７に示されるものと同じである。

[実施例９]
０．５％の未硫化サトウキビ廃糖蜜を用いる、中鎖および長鎖トリグリセリド油のＲＬ発酵
発酵条件、培地および栄養素組成物は、それぞれ中鎖および長鎖トリグリセリド油を表す４％のココナッツ油および４％のキャノーラ油が、０．５％の糖蜜を有する供給原料として使用されることを除いて、実施例７に示されるものと同じである。発酵は、８８ｇ／ＬのＲＬ濃度の場合、３２時間で完了し、したがって、ＲＬ生産率は、２．８ｇ／Ｌ／時である。
参考文献
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なお、本発明には、以下の実施形態が包含される。
［１］１種または複数種のラムノリピド（ＲＬ）を含む複数の発酵物を生産する半連続方法であって、
（ａ）ラムノリピド産生微生物を、少なくとも１種の炭素源が甘味剤でありかつ少なくとも１種の炭素源が中鎖または長鎖トリグリセリド含有油である少なくとも２種の炭素源、少なくとも１種の窒素源、少なくとも１種のリン源、少なくとも１種のマグネシウム源、少なくとも１種のカリウム源、少なくとも１種の硫黄源、少なくとも１種の塩化物源、および少なくとも１種のナトリウム源を含む培養培地中で、任意で乳化剤の存在下で、少なくとも約１日にわたり培養して、１種または複数種のラムノリピド（ＲＬ）を含むラムノリピドと少なくとも１種のラムノリピド産生微生物とを含む第１の発酵培地を得るステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記第１の発酵培地の少なくとも約７０％を除去するステップと、
（ｃ）（ｂ）で除去した前記第１の発酵培地を、ステップ（ａ）に示される組成を有する培養培地と交換するステップと、
（ｄ）ステップ（ａ）～（ｃ）を少なくとも１回繰り返して、ラムノリピドと少なくとも１種のラムノリピド産生微生物とを含む次の発酵培地を得るステップと
を含む、方法。
［２］前記培養するステップ（ａ）により少なくとも約１．７ｇＲＬ／Ｌ／時が得られ、および／または前記方法により少なくとも約４０ｇＲＬ／Ｌが得られる、前記［１］に記載の方法。
［３］前記ラムノリピド産生微生物が、ステップ（ａ）で約１日～約４日にわたり培養される、前記［１］または［２］に記載の方法。
［４］１種または複数種の微量栄養素を微量栄養素溶液１Ｌあたり２０ｍｇ以下の濃度で含む組成物を、ステップ（ａ）の前記培養培地に、１日あたりの総発酵容量の０．１％ｖ／ｖで添加するステップをさらに含む、前記［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］前記発酵培地が、ステップ（ｂ）で、撹拌の間に空気流を維持しながら除去される、前記［１］から［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］前記発酵培地が、ステップ（ｂ）で、撹拌の間に酸素富化空気を用いて空気流を維持しながら除去される、前記［５］に記載の方法。
［７］ステップ（ａ）と（ｂ）との間に沈降ステップがない、前記［１］から［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］１種または複数種のラムノリピドを生産する方法であって、ラムノリピド産生微生物を、炭素源が甘味剤および中鎖または長鎖トリグリセリド含有油である少なくとも２種の炭素源、少なくとも１種の窒素源、少なくとも１種のリン源、少なくとも１種のマグネシウム源、少なくとも１種のカリウム源、少なくとも１種の硫黄源、少なくとも１種の塩化物源、少なくとも１種のナトリウム源、および任意で乳化剤を含む培養培地中で、少なくとも約１日にわたり培養して、少なくとも約４０ｇ／Ｌのラムノリピド力価を、および／または少なくとも約１．５ｇＲＬ／Ｌ／時の速度で得るステップと、任意で前記１種または複数種のラムノリピドを前記培養培地から単離するステップとを含む、方法。
［９］前記培養培地が微量栄養素を含まない、前記［８］に記載の方法。
［１０］前記培養するステップが、半連続発酵法、バッチ発酵法またはフェドバッチ発酵法を使用して実施される、前記［８］または［９］に記載の方法。
［１１］培養するステップが、請求項１に記載の半連続発酵法を使用して実施される、前記［１０］に記載の方法。
［１２］前記ラムノリピド産生微生物が、シュードモナス属（Pseudomonas）微生物である、前記［８］から［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］前記培養培地が、約０．１～約２．０重量％ｗ／ｖの各甘味剤を前記培養培地中に含み、および／または約３～１５重量％の各油を前記培養培地中に含む、前記［１０］に記載の方法。
［１４］前記甘味剤が未精製甘味剤であり、および／または前記油が植物油である、前記［１］または［８］に記載の方法。
［１５］前記未精製甘味剤が、樹液、１種もしくは複数種の根、果実、１種もしくは複数種の種子、１種もしくは複数種の木、または１種もしくは複数種の動物に由来する、前記［１４］に記載の方法。
［１６］前記甘味剤が、糖蜜、米もしくは大麦麦芽シロップ、花蜜、ヤーコンシロップ、テンサイシロップ、ソルガムシロップのうちの少なくとも１種であり、および／または前記油が、ダイズ油、ベニハナ油、ラッカセイ油、ヘンプシード油、ジャトロファ油、ココナッツ脂肪、カラバッシュ油、アマニ油、コーン油、ポピーシード油、イブニングプリムローズ油、オリーブ油、パーム核油、ヤシ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマワリ油、グレープシード油、クルミ油、小麦胚芽油、ココナッツ油もしくは中鎖トリグリセリド油のうちの少なくとも１種である、前記［１］または［８］に記載の方法。
［１７］前記ラムノリピド産生微生物が、少なくとも３種の炭素源を含む培養培地中で培養され、少なくとも２種の炭素源が甘味剤であり、少なくとも１種の炭素源が中鎖または長鎖トリグリセリド含有油である、前記［１］または［８］に記載の方法。
［１８］前記ラムノリピド産生微生物が、少なくとも３種の炭素源を含む培養培地中で培養され、少なくとも２種の炭素源が未精製甘味剤であり、少なくとも１種の炭素源が中鎖トリグリセリド含有油である、前記［１］または［８］に記載の方法。
［１９］前記ラムノリピド産生微生物が、少なくとも４種の炭素源を含む培養培地中で培養され、少なくとも２種の炭素源が中鎖または長鎖トリグリセリド含有油であり、少なくとも２種の炭素源が甘味剤である、前記［１］または［８］に記載の方法。
［２０］前記ラムノリピド産生微生物が、少なくとも４種の炭素源を含む培養培地中で培養され、少なくとも１種の炭素源が中鎖トリグリセリド含有油であり、１種の炭素源が長鎖トリグリセリド含有油であり、少なくとも２種の炭素源が未精製甘味剤である、前記［１］または［８］に記載の方法。

Claims

１種または複数種のラムノリピド（ＲＬ）を含む複数の発酵物を生産する半連続方法であって、
（ａ）ラムノリピド産生微生物を培養培地中で培養するステップであって、前記ラムノリピド産生微生物が、シュードモナス属（Pseudomonas）微生物であり、前記１種または複数種のラムノリピドが、少なくとも１．７ｇＲＬ／Ｌ／時の速度で得られ、前記培養培地が、
ｉ．少なくとも２種の炭素源であって、第１の炭素源が、糖蜜、米シロップ、大麦麦芽シロップ、花蜜、ヤーコンシロップ、テンサイシロップ、およびソルガムシロップからなる群より選ばれる未精製甘味剤であり、第２の炭素源が中鎖または長鎖トリグリセリド含有植物油であり、前記培養培地中の前記未精製甘味剤の含有量が０．１～２．０重量％であり、前記培養培地中の前記植物油の含有量が３～１５重量％である、少なくとも２種の炭素源；
ｉｉ．少なくとも１種の窒素源；
ｉｉｉ．少なくとも１種のリン源；
ｉｖ．少なくとも１種のマグネシウム源；
ｖ．少なくとも１種のカリウム源；
ｖｉ．少なくとも１種の硫黄源；
ｖｉｉ．少なくとも１種の塩化物源；および
ｖｉｉｉ．少なくとも１種のナトリウム源
を含み、
前記培養培地中で、前記ラムノリピド産生微生物が、少なくとも１日にわたり培養されて、前記１種または複数種のラムノリピドと前記ラムノリピド産生微生物とを含む第１の発酵培地を得るステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記第１の発酵培地の少なくとも７０％を除去するステップと、
（ｃ）（ｂ）で除去した前記第１の発酵培地を、ステップ（ａ）に示される組成を有する培養培地と交換するステップと、
（ｄ）ステップ（ａ）～（ｃ）を少なくとも１回繰り返して、前記１種または複数種のラムノリピドと前記ラムノリピド産生微生物とを含む次の発酵培地を得るステップと
を含み、
前記方法により少なくとも６０ｇＲＬ／Ｌの力価が得られる、方法。
前記ラムノリピド産生微生物が、ステップ（ａ）で１日～４日にわたり培養される、請求項１に記載の方法。
２０ｍｇ／Ｌ以下の濃度の微量栄養素組成物を、ステップ（ａ）の前記培養培地に、１日あたりの総発酵容量の０．１％ｖ／ｖで添加するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
前記発酵培地が、ステップ（ｂ）で、撹拌の間に空気流を維持しながら除去される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
前記発酵培地が、ステップ（ｂ）で、撹拌の間に酸素富化空気を用いて空気流を維持しながら除去される、請求項４に記載の方法。
ステップ（ａ）と（ｂ）との間に沈降ステップがない、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
１種または複数種のラムノリピドを生産する方法であって、
ラムノリピド産生微生物を、少なくとも２種の炭素源を含む培養培地中で培養するステップであって、前記ラムノリピド産生微生物が、シュードモナス属（Pseudomonas）微生物であり、前記炭素源が、糖蜜、米シロップ、大麦麦芽シロップ、花蜜、ヤーコンシロップ、テンサイシロップ、およびソルガムシロップからなる群より選ばれる未精製甘味剤および中鎖または長鎖トリグリセリド含有植物油である少なくとも２種の炭素源であり、前記培養培地中の前記未精製甘味剤の含有量が０．１～２．０重量％であり、前記培養培地中の前記植物油の含有量が３～１５重量％である炭素源、少なくとも１種の窒素源、少なくとも１種のリン源、少なくとも１種のマグネシウム源、少なくとも１種のカリウム源、少なくとも１種の硫黄源、少なくとも１種の塩化物源、および少なくとも１種のナトリウム源を含む培養培地中で、少なくとも１日にわたり培養するステップを含み、
前記１種または複数種のラムノリピドが、少なくとも１．７ｇＲＬ／Ｌ／時の速度で得られ、
前記方法により少なくとも６０ｇＲＬ／Ｌの力価が得られる、方法。
前記培養培地が微量栄養素を含まない、請求項７に記載の方法。
前記培養するステップが、半連続発酵法、バッチ発酵法、またはフェドバッチ発酵法を使用して実施される、請求項７または８に記載の方法。
培養するステップが、
（ａ）シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）を培養培地中で培養するステップであって、前記培養培地中で、前記シュードモナス・エルギノーサが、少なくとも１日にわたり培養されて、前記１種または複数種のラムノリピドと前記シュードモナス・エルギノーサとを含む第１の発酵培地を得るステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記第１の発酵培地の少なくとも７０％を除去するステップと、
（ｃ）（ｂ）で除去した前記第１の発酵培地を、請求項７に記載される組成を有する培養培地と交換するステップと、
（ｄ）ステップ（ａ）～（ｃ）を少なくとも１回繰り返して、前記１種または複数種のラムノリピドと前記シュードモナス・エルギノーサとを含む次の発酵培地を得るステップと
を含む、請求項９に記載の方法。
前記植物油が、ダイズ油、ベニハナ油、ラッカセイ油、ヘンプシード油、ジャトロファ油、ココナッツ脂肪、カラバッシュ油、アマニ油、コーン油、ポピーシード油、イブニングプリムローズ油、オリーブ油、パーム核油、ヤシ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマワリ油、グレープシード油、クルミ油、小麦胚芽油、ココナッツ油、および中鎖トリグリセリド油からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１または７に記載の方法。
前記ラムノリピド産生微生物が、少なくとも３種の炭素源を含む培養培地中で培養され、少なくとも２種の炭素源が前記未精製甘味剤であり、少なくとも１種の炭素源が中鎖または長鎖トリグリセリド含有植物油である、請求項１または７に記載の方法。
前記ラムノリピド産生微生物が、少なくとも３種の炭素源を含む培養培地中で培養され、少なくとも２種の炭素源が前記未精製甘味剤であり、少なくとも１種の炭素源が中鎖トリグリセリド含有植物油である、請求項１または７に記載の方法。
前記ラムノリピド産生微生物が、少なくとも４種の炭素源を含む培養培地中で培養され、少なくとも２種の炭素源が中鎖または長鎖トリグリセリド含有植物油であり、少なくとも２種の炭素源が前記未精製甘味剤である、請求項１または７に記載の方法。
前記ラムノリピド産生微生物が、少なくとも４種の炭素源を含む培養培地中で培養され、少なくとも１種の炭素源が中鎖トリグリセリド含有植物油であり、１種の炭素源が長鎖トリグリセリド含有植物油であり、少なくとも２種の炭素源が前記未精製甘味剤である、請求項１または７に記載の方法。
前記培養培地が、
ｉｘ．乳化剤
をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
前記培養培地が、乳化剤をさらに含む、請求項７から１０のいずれか一項に記載の方法。
前記１種または複数種のラムノリピドを前記培養培地から単離するステップをさらに含む、請求項７から１０のいずれか一項に記載の方法。