KR102557083B1 - 람노리피드 조성물의 제조 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하나 이상의 람노리피드를 포함하는 조성물의 유기용매-비사용 제조방법 및 상기 방법으로부터 얻을 수 있는 조성물을 제공한다.

Description

람노리피드 조성물의 제조{PRODUCTION OF RHAMNOLIPID COMPOSITIONS}

본 발명은 람노리피드를 함유하는 조성물 및 상기 조성물을 수득하기 위한 유기용매-비사용 공정(제조방법)을 제공한다.

람노리피드(Rhamnolipids; RLs)는 다양한 박테리아 종에 의해 생성된 계면-활성 당지질이다. RL은 하나의 (단일람노실리피드(monorhamnosylipids) 또는 단일-람노리피드(mono-rhamnolipids)) 또는 두 개의 람노오즈(rhamnose) 단위체(디람노실리피드 또는 디-람노리피드)와 하나 또는 두개의(주로 두개의) 3-히드록시 지방산 잔기로 구성된다. 람노리피드는 예를 들어 강한 발포 능력과 같은 특별한 계면-활성 특성을 가지며, 특히 계면 활성제로, 매우 다양한 기술적 응용 분야에 사용된다(Randhawa et al. (2014) "Rhamnolipid biosurfactants-past, present, and future 15 scenario of global market", Frontiers in Microbiology 5:1-7; Muller et al. (2012) "Rhamnolipids-Next generation surfactants?", J Biotechnol 162(4):366-80; Banat et al. (2010) "Microbial biosurfactants production, applications and future potential" Appl Micro biol Biotechnol 87:427-444.).

잠재적 응용 분야의 예로는, (1) 유화 특성으로부터 오염된 토양에서 원유 및 중금속을 효율적으로 제거하고, 오일 유출의 생물학적 복원을 촉진하기 때문에 생물학적 정화 및 향상된 오일 회수(EOR)에 적용되고; (2) 화장품: 예를 들어 상처 치유, 화상, 건선 및 주름에 대한 기능성화장품(cosmeceuticals)과 같은 화장품; (3) 세제 및 세정제 : 표면 활성 및 유화 특성을 사용한 특히 세탁 제품, 샴푸 및 비누용 및 (4) 농업 등을 포함한다. 람노리피드는 현재 ZONIX^TM (Proptera LLC)로 판매되는 농업용 항균 제품으로 사용할 수 있다.

RL이 재생 가능한 원재료에 기초한 발효를 통해 제조될 수 있기 때문에, RL에 대한 관심이 증가되었다. 그러나, 람노리피드는 성가신 하류 처리 방법에 인하여 시장에서 소량 및 고가로 부분적으로만 이용 가능하다. 람노리피드를 생산하기 위한 다양한 방법이 개시되어있다(reviewed in, for example, Heyd et al. (2008) “Development and trends of biosurfactant analysis and purification using rhamnolipids as an example”, Anal Bioanal Chem 391:1579?1590 and Smyth et al. (2010) “Isolation and Analysis of Low Molecular Weight Microbial Glycolipids”, in Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, K. N. Timmis (ed.), Springer-Verlag, Berlin, pp. 3705-3724; Desai et al. (1997) “Microbial Production of Surfactants and Their Commercial Potential”, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61: 47?64 and also disclosed in for example US 5656747, US4628030, US20140148588, CN102796781, CN102766172, CN101787057, CN101845468, CN102432643, CN1908180, KR1020060018783).

현재, 람노리피드에 대한 가장 보편적인 분리 공정은 발효가 완료된 직후에 발효 부용(broth)을 고압 증기 멸균한 다음, 산성화하여 람노리피드를 침전시키는 단계를 포함한다. 그 결과로 생긴 고체 람노리피드는 발효에 사용된 유기체로부터의 고체 세포 물질로 오염된다. RL은 이들 세포 고체로부터 에틸 아세테이트와 같은 유기 용매로 추출함으로써 분리된다. 에틸 아세테이트를 스트리핑한 후, 농축 오일 형태의 생성물이 수득된다. 그러나, 용매 추출 공정은 비소모된 트리아실 글리세라이드 오일 및 발효 공정의 소포를 잠재적으로 포함하여 소수성 불순물을 가져온다. 개시된 다른 방법의 예는 (1) 발효 부용(fermentation broth)의 알루미늄 설페이트 침전 후 유기 용매로 추출; (2) 연속 한외 여과; (3) 침전 단계와 조합하여 수행 될 수 있는 흡착, 이온 교환, 역상 또는 정상상 컬럼을 사용하는 컬럼 크로마토그래피(see, for example, Lebron-Paler A (2008) “Solution and interfacial characterization of rhamnolipid biosurfactant from P. aeruginosa ATCC 9027” PhD Dissertation University of Arizona, CN101787057, CN101407831, CN1908180); (4) 역류 크로마토그래피(countercurrent chromatography)(Zhang et al. “Separation and purification of six biosurfactant rhamnolipids by high-speed countercurrent chromatography utilizing novel solvent selection method”, Separation Science and Technology, in press (posted Nov. 24, 2015)); (5) 선택적 결정화에 이은 추출 또는 (6) 발포 분별/흡착(see, for example, US 2015/0011741; Sarachat et al., (2010) “Purification and concentration of a rhamnolipid biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa SP4 using foam fractionation”, Bioresource Technology 101: 324-330). 그러나, 이들 방법 모두는 여러 가지 단점을 가지고있다(예를 들어, 과다한 비용, 스케일링의 어려움, 자원 집약의 어려움, 등).

본 발명의 목적은 여러 가지 단점(예를 들어, 과다한 비용, 스케일링의 어려움, 자원 집약의 어려움, 등)을 가지는 종래의 람노리피드 수득 방법을 개선할 수 있는 신규한 람노리피드 함유 조성물의 제조방법 및 이로부터 수득되는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는, 람노리피드를 포함하는 조성물의 유기 용매-비사용 제조방법을 제공한다:

(a) 적어도 하나의 람노리피드(RL)를 포함하는 수성 매질을 제공하는 단계;

(b) 상기 단계 (a)에서 제공된 상기 매질의 비-여과 기반의 멸균 단계;

(c) 상기 단계 (b)에서 상기 멸균된 매질에서 RL 함유 상을 폐기물로부터 분리하여 상기 조성물을 수득하는 단계.

위에서 언급한 방법을 사용하는 최종 제품은 자연 공정에서 비롯되며, 화학적으로 변형되지 않으며, 임의의 석유 기반 유기 용매와 접촉하지 않습니다. 전술한 공정 또는 방법은 수성 매질(예를 들어, 발효 매질(medium) 또는 부용(broth))로부터 람노리피드를 추출하기 위해 석유 유래 화학 용매의 사용을 제외하고, 따라서 제조 비용을 상당히 감소시킨다. 또한, 최종 람노리피드 용액은 자연적으로 유도된다.

특정 실시 양태에서, 람노리피드를 포함하는 조성물은 중량으로 적어도 약 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % 또는 10 % 람노리피드를 포함하는 정화된 부용(broth)이며, 여기서 상기 방법은 단계 (a) 이후 및 단계 (b) 전에, (1) 단계 (a)에서 제공된 상기 매질을 숙성시켜, 숙성되고 멸균된 매질을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 개시된 방법으로부터 수득할 수 있는 숙성되고 멸균된 매질을 포함하는 조성물이 제공된다. 상기 방법은 단계 (a) 이후 및 단계 (b) 전에 단계 (a)에서 제공된 상기 매질로부터 고형 폐기물을 제거하는 단계를 더 포함 할 수 있다. 상기 특정 구체 예에서의 조성물은 약 5 % 내지 약 10 % RL을 포함 할 수 있다.

또 다른 실시 양태에서, 상기 방법은 멸균 단계 (b) 이후 및 분리 단계 (c) 전에 단계 (a)의 멸균된 매질을 숙성시키는 단계를 더 포함 할 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 단계 (a) 이후 및 (1)에서 상기 매질이 숙성되기 전에, 제공된 매질로부터 고형 폐기물을 제거 할 수 있다.

또 다른 실시 예에서, 상기 방법은 2 개의 숙성 단계를 포함하며, 다음의 단계들을 포함 할 수 있다:

(a) 하나 이상의 람노리피드를 포함하는 수성 매질(예를 들어, 발효 매질(medium))을 제공하는 단계;

(b) 제공되는 상기 수성 매질(예를 들어, 발효 매질(medium))을 숙성시키는 단계;

(c) (b)에서 제공된 상기 매질의 비-여과 기반의 멸균 단계;

(d) (c)의 멸균된 매질을 숙성시키는 단계; 및

(e) (d)에서 상기 숙성되고 멸균된 매질에서 폐기물로부터 RL 함유 액상을 분리하여 상기 조성물을 수득하는 단계.

또 다른 실시 양태에서, 람노리피드를 포함하는 조성물은 중량으로 적어도 약 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % 또는 10 %의 람노리피드를 포함하는 정화된 부용(broth)일 수 있다. 특정 구체 예에서, RL을 포함하는 조성물, 특히 정화된 부용(broth)을 얻는 방법은, 단계 (b) 이전에 단계 (a)에서 제공된 상기 매질을 숙성시키는 단계 후, 이어서 (b) 화학 처리, 특히, 과산화수소 처리 (예컨대, 과산화수소 및 벤조일 퍼옥사이드 및 퍼옥시 아세트산과 같은 유기 과산화물 및 과산화 리튬, 과산화 나트륨, 과산화 바륨과 같은 무기 과산화물) 및 / 또는 자외선 조사 처리를 통해 상기 숙성된 매질을 멸균하는 단계; (c) 상기 멸균된 매질에서 고체 폐기물로부터 RL 함유 상을 분리하는 단계이되, 선택적으로 다음을 포함할 수 있는 단계: (c) (1) 추가적으로 상기 RL 함유 상을 멸균하는 단계 및 (c) (2) 상기 멸균된 RL 함유 상에서 고체 폐기물로부터 RL 함유 상을 분리하여 상기 정화된 부용(broth)을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다. 특정 실시 태양에서, 단계 (b)의 상기 멸균 단계는 화학적 처리 및 / 또는 자외선 조사를 통한 것이며, 단계 (c) (2)의 멸균 단계는 열을 통한 것이다.

또한, 상기 숙성된 매질을 멸균한 후에 수득 가능한 조성물이 제공된다. 상기 단계 (b) 및 / 또는 (c) (1)을 사용하여 수득 할 수 있는 멸균된 조성물이 또한 제공된다.

상기 개시된 방법은 탈색 및 / 또는 탈취 단계를 더 포함 할 수 있다. 상기 탈색 및 / 또는 탈취 처리는 상기 멸균 단계 전 및 / 또는 후에 수행 될 수 있다. 또한, 상기 기재된 방법을 사용하여 수득 가능한 탈색 및 / 또는 탈취된 매질을 포함하는 조성물이 제공된다.

심지어 또 다른 실시 양태에서, 단계 (c) 후에, 유체 또는 액체는 예를 들어 증발에 의해 고체 조성물을 수득하기 위해 상기 분리된 RL 함유상에서 제거 될 수 있다. 특정 구현 예에서, 상기 조성물은 예를 들어 분말 형태 또는 과립 형태이다.

심지어 또 다른 구체 예에서, 람노리피드를 포함하는 상기 조성물은 중량으로 적어도 약 30 %, 적어도 약 35 %, 적어도 약 40 %, 적어도 약 45 %, 적어도 약 50 % 또는 적어도 약 60 % 람노리피드를 포함하는 농축된 정제 부용(broth)이다. 더욱 특별한 구현 예에서, 상기 농축된 정제 부용은 중량으로 약 30-60 % RL, 약 30-40 % RL 또는 약 50-60 % RL을 포함 할 수 있다.

특정 구체 예에서, 상기 기재된 방법에서 단계 (a)에서 제공된 상기 매질은 산을 사용하여 상기 매질을 처리함으로써 단계 (b)에서 멸균되며, 수득된 상기 산성 매질은 고체, 액체 및 유성 상을 포함하고, 적어도 상기 액체 상은 제거되고, 단계 (c) 전에 상기 고체 및 선택적으로 유성 상은 중화시켜 용액을 얻고, 단계 (c)에서 불용성 폐기물 물질을 상기 용액으로부터 제거하여 전술한 농축된 정제 부용(broth)을 포함하는 조성물을 수득한다. 따라서, 농축 정제 부용 제조 방법은 하기를 포함할 수 있다:

(a) 람노리피드(RLs)를 포함하는 수성 매질(예를 들면, 발효 매질)을 제공하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 제공된 상기 발효 또는 배양 매질을 산 처리로 멸균하여 산성화된 액상, 유성 및 고체 상을 수득하는 단계;

(c) 상기 단계 (b)에서 수득한 상기 액상을 제거하고 상기 고체 및 선택적으로 유성 상을 염기로 처리하여 중화된 용액을 수득하는 단계;

(d) 상기 단계 (c)에서 수득한 상기 용액으로부터 불용성 물질을 제거하여 하나 이상의 람노리피드를 포함하는 농축 정제된 부용(broth)을 포함하는 조성물을 수득하는 단계.

또 다른 구체 예에서, 농축 정제된 부용을 포함하는 조성물을 수득하는 방법은 부가적인 멸균 단계 및 선택적으로 상기 용액으로부터 불용성 폐기물을 제거하기 위한 추가의 분리 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 상기 멸균 농축 정제 부용을 멸균 후에, 탈색 및 / 또는 탈취하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 단계 (c)에서 수득된 용액을 증발에 의해 상기 용액으로부터 액체 또는 유체를 제거하여 고체 조성물을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 매질은 산으로 처리될 수 있고, 이후 상기 추가적인 멸균 단계 전 또는 후에 중화시킬 수 있다.

전술한 방법에서, 상기 고체 및 유성 상을 개별적으로 중화시켜 별도의 용액을 수득 할 수 있다. 다르게는, 상기 고체 및 유성 상을 배합하고, 상기 결합된 고체 및 유성 상을 중화시켜 중화된 용액을 수득한다. 또한, 또 다른 구체 예에서, 고체 상만 중화할 수 있다.

상기 개시된 방법은 상기 조성물을 탈색 및 / 또는 탈취하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 건조될 수 있다.

또 다른 구현 예에서, 중량으로 적어도 약 30 % 이상, 적어도 약 35 % 이상, 적어도 약 40 % 이상, 적어도 약 45 % 이상, 적어도 약 50 % 이상 또는 적어도 약 60 % 이상의 람노리피드를 함유하는 농축 정제 부용을 포함하는 조성물의 제조 방법은 상기 추가적인 멸균 단계 전 및 / 또는 후에 제공되는 상기 매질을 숙성하는 단계를 더 포함할 수 있다.

특히, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

(a) 하나 이상의 람노리피드를 포함하는 수성 (예를 들어, 발효) 매질을 제공하는 단계;

(b) 상기 제공된 매질로부터 불용성 폐기물을 선택적으로 제거하는 단계;

(c) 제공된 상기 매질을 멸균하는 단계;

(d) (c)의 멸균된 매질을 숙성시키는 단계;

(e) 상기 숙성되고 멸균된 매질로부터 폐기물을 제거하는 단계;

(f) (e)에서 수득한 매질을 산으로 처리하고, 여기서 상기 얻어진 산성 매질은 고체, 액상 및 유성 상을 포함하고, 적어도 상기 액상을 제거하고, 상기 고체 및 선택적으로 유성 상을 중화시켜 중화된 용액을 수득하는 단계; 및

(g) (f)의 상기 중화된 용액으로부터 고체 폐기물을 제거하여 상기 농축 정제된 부용(broth)을 포함하는 상기 조성물을 수득하는 단계.

또한, 상기 제시된 방법에 따라 수득 가능한 상기 중화된 용액을 포함하는 조성물이 제공된다. 또한, 상기 기재된 방법을 사용하거나 상기 방법으로부터 수득 가능한 적어도 약 30 %의 RL을 포함하는 탈색 및 / 또는 탈취된 조성물이 제공된다.

상기 수득된 조성물은 손 비누, 바디 워시, 페이셜 클렌져, 치약, 샴푸, 컨디셔너, 컨디셔닝 샴푸, 화장품, 접시 비누, 세탁 세제, 세탁 전처리 스프레이, 경질 표면 세정제, 다공성 표면 세정제, 바닥 세정제, 차 세제, 강화 오일 회수제, 상처 드레싱, 농업용 향균제, 부식-방지 처리제, 바이오리메디에이션, 안티-스틱 필름, 항-생물오손 도포제, 소화 매체, 항 바이러스제, 항 곰팡이제, 및 항 유주제(anti-zoosporics)에서의 계면활성제로 사용될 수 있다. 일 구체 예에서, 상기 제시된 방법을 사용하여 수득된 더 많은 양의 RL(> 30 % wt/vol) 또는 보다 특히 약 (> 50 % wt/vol)를 함유하는 조성물을은 몇몇 용도에서 약 30 %의 농도로 판매되는 특정 음이온성 계면활성제인, 가정용 세정제 및 개인 케어 시장에서의 소듐 라우릴 설페이트(SLS)와 같은 음이온성 계면활성제를 대체할 수 있는 람노리피드 기반의 제품을 제조하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 하나 이상의 람노리피드를 포함하는 조성물의 유기용매-비사용 제조방법 및 상기 방법으로부터 얻을 수 있는 조성물을 제공한다.

본 발명의 제조방법은 람노리피드를 과다한 비용 소모 없이, 용이하게 수득할 수 있는 바, 산업적으로 유용하다.

또한, 상기 수득된 조성물은 손 비누, 바디 워시, 페이셜 클렌져, 치약, 샴푸, 컨디셔너, 컨디셔닝 샴푸, 화장품, 접시 비누, 세탁 세제, 세탁 전처리 스프레이, 경질 표면 세정제, 다공성 표면 세정제, 바닥 세정제, 차 세제, 강화 오일 회수제, 상처 드레싱, 농업용 향균제, 부식-방지 처리제, 바이오리메디에이션, 안티-스틱 필름, 항-생물오손 도포제, 소화 매체, 항 바이러스제, 항 곰팡이제, 및 항 유주제(anti-zoosporics)에서의 계면활성제로 사용될 수 있다. 일 구체 예에서, 상기 제시된 방법을 사용하여 수득된 더 많은 양의 RL(> 30 % wt/vol) 또는 보다 특히 약 (> 50 % wt/vol)를 함유하는 조성물을은 몇몇 용도에서 약 30 %의 농도로 판매되는 특정 음이온성 계면활성제인, 가정용 세정제 및 개인 케어 시장에서의 소듐 라우릴 설페이트(SLS)와 같은 음이온성 계면활성제를 대체할 수 있는 람노리피드 기반의 제품을 제조하는데 사용될 수 있다.

도 1은 람노리피드가 농후한 정제 부용(CB)의 유기 용매-비사용 제조방법을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 상기 CB를 농축 정제된 부용(CCB)으로 얻기 위해 산 / 염기 처리에 의한 농축 단계를 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 과산화수소 처리된 CB로부터 CCB를 얻는 단계를 개략적으로 도시한 것이다.
도 4는 과산화수소 처리된 멸균 발효 매질로부터 CCB를 얻는 단계를 개략적으로 도시한 것이다.
도 5는 먼저 발효 부용에서 분리 단계를 수행하고, 이후 공정에서 멸균 단계를 수행하여 CCB를 얻는 단계를 개략적으로 도시한 것이다.
도 6은 분리, 멸균, 숙성 및 산성화 단계를 수행함으로써 CCB를 수득하는 방법을 개략적으로 도시한 것이다.

정의

값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 중간 값 및 임의의 여타 명시된 또는 중간 값은, 문맥 상 명확하게 달리 지시않는 한, 하한 단위의 1/10까지, 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 작은 범위의 상한값 및 하한값은 독립적으로 작은 범위에 포함될 수 있으며 명시된 범위에서 특별히 배제된 한도를 조건으로하여 본 발명에 포함된다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.

다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술 된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 또한 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 여기서 기술된다.

본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 그 전체가 참고 문헌으로 인용된다. 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 개시 보다 시기 적절할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 참고 문헌에 수록된 내용이 본 명세서와 모순되거나 불일치하는 경우, 본 명세서는 이러한 임의의 내용을 대신할 것이다.

본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용되는 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 다르게 지시하지 않는 한 복수의 것을 포함한다는 것으로 이해되어야 한다.

달리 지시되지 않는 한, 일련의 요소들에 선행하는 "적어도"라는 용어는 해당 시리즈의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야한다. 당업자는 일상적인 실험만을 사용하여 본원에 기술 된 본 발명의 특정 실시 양태에 대한 다수의 균등물을 인식할 수 있거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 본 명세서 및 후속하는 청구 범위 전반에 걸쳐, 문맥 상 달리 요구하지 않는 한, "포함하다"라는 단어 및 "포함하는"및 "함유하는"과 같은 변형은 명시된 수 또는 단계 또는 정수 그룹을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해 될 것이고, 또는 임의의 여타 수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계의 그룹을 제외하지는 않습니다. 따라서 "포함하다", "함유하다", "가지고 있다"등의 용어는 광범위하게 또는 제한없이 해석되어야 한다. 본원에서 사용된 용어 "포함하는"은 용어 "함유하는"또는 때로는 용어 "갖는"과 함께 사용될 때 대체될 수 있다.

본원에서 정의된 바와 같이, "람노리피드"는 하나 이상의, 전형적으로 선형, 포화 또는 불포화 β-히드록시-카복실산 잔기 및 람노즈의 하나 이상의 단위의 사카라이드 부분을 포함하는 지질 부분을 가지는 글리코리피드를 지칭한다.

상기 사카라이드(당) 부분과 지질 부분은 사카라이드 부분의 람노즈 부분의 1-OH 기와 지질 부분의 β-히드록시-카복실산의 3-0H 기 사이의 β-글리코시드 결합을 통해 연결된다. 따라서, 상기 하나의 카르복실 산 잔기의 카르복실기는 람노리피드의 말단으로 정의된다. 하나 이상의 람노즈-잔기가 람노리피드에 포함되는 경우, 지질 부분에 연결되지 않은 람노즈 잔기 각각은 1,4 β-글리코시드 결합을 통해 또 다른 람노즈 잔기에 연결된다. 2 개 이상의 β-히드록시-카복실산이 람노리피드에 존재하는 구체 예에서, 상기 β-히드록시-카복실산 잔기는 서로 독립적으로 선택된다. 각각의 복수의 β-히드록시-카복실산 잔기의 β-히드록시-카복실산 잔기는 일부 실시 양태에서 동일할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 이들은 서로 상이하다.

본원에 정의 된 바와 같이, 용어 "수성 매질"은 중량으로 적어도 약 5 중량 %의 람노리피드 또는 람노리피드의 염을 물에 포함하는 조성물이다. 특정 실시 양태에서, 상기 수성 매질은 당 업계에 공지된 발효 조건하에 적어도 하나 이상의 탄소원으로부터 하나 이상의 람노리피드를 생산하는 능력을 갖는 발효 산물을 포함한다.

"발효 부용(fermentation broth)"및 "발효액(fermentation medium)"이라는 용어는 동의어이며 서로 교환하여 사용할 수 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 하나 이상의 람노리피드를 포함하는 조성물을 얻기 위한 유기용매-비사용 제조방법을 제공한다. 특정 실시 양태에서, 람노리피드는 하기 구조 (I)을 가질 수 있다.

(I)

이 화학식에서, R⁹는 수소 원자 (H) 또는 1 내지 약 46, 예컨대 1 내지 약 42, 1 내지 약 40, 1 내지 약 38, 1 내지 약 36, 1 내지 약 34, 1 내지 약 30, 1 내지 약 28의 주쇄를 가지는 지방족 기이고, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28 개의 탄소 원자 및 1개 내지 약 3개, 2 개의 산소 원자를 포함한다. 일부 구체 예에서, 각각의 지방족 기의 주쇄는 말단 카복실산 기 및 / 또는 내부 에스테르기를 갖는다. 이와 관련하여 예시적으로서, R⁹는 화학식 -CH(R⁵)-CH₂-COOR⁶일 수 있다. 이러한 예시적인 잔기에서, R⁵는 1 내지 약 19, 예컨대 1 내지 약 17, 1 내지 약 15, 1 내지 약 13, 약 2 내지 약 13, 약 3 내지 약 13 또는 약 4 내지 약 13 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 개의 탄소 원자를 갖는) 등의 길이를 갖는 주쇄를 갖는 지방족 잔기일 수 있다. 식 (I)의 R⁴는 수소 원자 (H) 또는 람노피라노실 잔기이다. R⁶은 수소 원자이다.

용어 "지방족"은 달리 언급하지 않는 한, 포화되거나 모노- 또는 폴리- 불포화될 수 있고 헤테로 원자를 포함할 수 있는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 사슬을 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "헤테로원자"는 탄소 또는 수소 이외의 임의의 원소의 원자를 의미한다. 여기서, 불포화 지방족 기는 하나 이상의 이중 결합(알케닐 잔기)을 함유한다. 탄화수소 사슬의 분지는 비 방향족 고리 성분뿐만 아니라 선형 사슬을 포함할 수 있다. 상기 탄화수소 사슬은 달리 명시되지 않는 한 임의의 길이이며 임의의 수의 가지를 함유 할 수 있다. 전형적으로, 탄화수소 (주)사슬은 1 내지 약 5, 내지 약 10, 내지 약 15 또는 내지 약 20 개의 탄소 원자를 포함한다. 알 케닐 잔기의 예는 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 잔기이다. 알케닐 잔기는 일반적으로 약 2 내지 약 20 개의 탄소 원자 및 하나 이상의, 예를 들어 2 개의 이중 결합, 예컨대 약 2 내지 약 10 개의 탄소 원자 및 하나 이상의 이중 결합을 함유한다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 이들 라디칼의 n-이성질체, 이소 프로필, 이소 부틸, 이소 펜틸, sec-부틸, tert-부틸, 네오펜틸, 3-,3디메틸 부틸이다. 주쇄뿐만 아니라 분지쇄는 모두 예를 들어 N, O, S, Se 또는 Si와 같은 헤테로 원자를 함유 할 수 있거나 탄소 원자가 이들 헤테로 원자 중 하나에 의해 대체될 수 있다. 지방족 잔기는 하나 이상의 관능기로 치환되거나 비치환될 수 있다. 치환체는 예를 들어 이에 제한되지는 않으나, 아미노, 아미도, 카보닐, 카복실, 히드록실, 니트로, 티오 및 설포닐과 같은 임의의 관능기(작용기)일 수 있다.

보다 특정한 양태에서, 상기 구조에서 람노리피드(들) 또는 람노리피드 염은 하기 구조 (II)를 갖는다 :

(II)

여기서, X는 1 또는 2이고, y는 4, 6 또는 8이고, M은 H이거나 금속, 알칼리 금속 Li, Na 또는 K, 알칼리 토금속 Mg 또는 Ca, 또는 전이금속 Mn, Fe, Cu, 또는 Zn이다. 알칼리 토금속 및 전이금속의 경우, 다수의 람노리피드 염 부분이 각각의 금속과 결합할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 조성물은 모노(여기서 x = 1) 및 디(x = 2 인) 람노리피리드의 혼합물을 포함하며, 여기서 y 및 z는 6이고 M은 H 또는 Na이다. 상기 모노-람노리피드는 C₂₆H₄₈O₉의 화학식을 갖는 Rha-C10-C10으로 지칭될 수 있다. IUPAC 명칭은 3-[3-[(2R, 3R, 4R, 5R, 6S)-3,4,5- 트리히드록시-6-메틸옥산-2-일]옥시데카노일옥시]데칸 산이다. 상기 디-람노리피드는 RhaRha-C10-C10으로 지칭될 수 있으며, 화학식은 C₃₂H₅₈O₁₃일 수 있다. IUPAC 명칭은 3-[3-[4,5-디히드록시-6-메틸-3-(3,4,5-트리히드록시-6-메틸옥산-2-일)옥시옥산-2-일]옥시데카노일옥시]데칸 산이다. 보다 특정한 양태에서, 모노-람노리피드는 전체 람노리피드의 약 30 % 내지 총 50 %의 양으로 존재할 수 있고, 디-람노리피드는 총 람노리피드의 약 50 % 내지 약 70 %의 양의 디-람노리피드로 존재할 수 있다. 다른 실시 양태에서 상기 조성물은 모노-람노리피드 : 디- 람노리피드의 비가 약 35 : 65 내지 약 55 : 45 인 모노 및 디-람노리피드를 포함한다.

가장 구체적인 양태로, 상기 조성물은 하기 표 1에 기재된 화합물을 포함한다.

지방산 쇄	단일-[x=1]	이중-[x=2]	y 및 z
C10-C10	28-40%	42-60%	6
이외	0-12%	0-18%	y 및/또는 z = 4 또는 8 (8 인 경우, 불포화 점이있을 수 있다)

전술 한 바와 같이, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다: (a) 적어도 하나 이상의 람노리피드(RL)를 포함하는 수성 매질을 제공하는 단계; (b) (a)에서 제공된 상기 매질의 비-기계적 멸균 단계, 및 (c) (b)의 멸균된 매질에서 RL 함유 상을 폐기물로부터 분리하여 상기 조성물을 얻는 단계.

나아가, 특정 구체 예에서, 숙성, 산성화, 중화, 건조, 탈색 및 / 또는 탈취 단계가 또한 사용될 수 있다.

매질의 원료(Source of medium)

하나 이상의 람노리피드를 포함하는 제공되는 상기 수성 매질은 특히 또는 람노리피드 생산 미생물로부터, 또는 당 분야에 알려진 방법을 사용하여 재조합 숙주 세포 생산 람노리피드의 결과물일 수 있고, 이로부터 유래된 발효 부용으로부터 수득될 수 있다. 람노리피드 생산 재조합 숙주 세포는 RhlA 유전자 또는 이의 오르토로그 및/ 또는 RhlB 유전자 또는 이의 오르토로그, 및 / 또는 RhlC 유전자 또는 이의 오르토로그, 및 / 또는 RhlR 유전자 또는 이의 오르토로그, 및 / 또는 RhlI 유전자 또는 이의 오르토로그, 및 / 또는 RhlG 유전자 또는 이의 오르토로그 등을 발현하는 박테리아 세포와 같은, 숙주 세포일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "람노리피드-생성 미생물"은 박테리아와 같은 임의의 미생물을 말하고, 이는 적절한 조건에서 람노리피드를 합성/생산할 수 있는 능력을 갖는데, 이는 이에 제한되지는 않으나, 필라 액티노박테리아(phyla Actinobacteria), 퍼미큐테스(Fimicutes) 및 프로테오박테리아(Proteobacteria)의 박테리아를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 람노리피드-생산 미생물은 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria) 부류의 박테리아이다. 추가의 실시 양태에서, 람노리피드-생산 미생물은 슈도모나딘 계(Pseudomonadales order)의 박테리아이다. 또 다른 추가의 실시 양태에서, 람노리피드-생산 미생물은 슈도모나딘 (Pseudomonadacae) 과의 박테리아이다. 추가의 실시 양태에서, 람노리피드-생산 미생물은 P. 알칼리게네스(alcaligenes), P. 녹농균(aeruginosa), P. 클로라피스(chlororaphis), P. 클리멘시아(clemencia), P. 콜리에리아(collierea), P. 플루오레스센스(fluorescens), P. 루테올라(luteola), P. 퓨티다(putida), P. 스트투제리(stutzeri) 및 P. 티시디아(teessidea)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속에 속하는 박테리아이다. 추가의 실시 양태에서, 람노리피드-생산 미생물은 P. 녹농균(aeruginosa)이다.

숙주 세포는 RL 생성을 허용하는 조건하에 배양된다. 모노사카라이드(monosaccharide)와 같은 다양한 탄소원이 사용될 수 있다. 예를 들어, 글루코오스, 디사카라이드, 수크로스, 알콜, 글리세롤, 알칸, 예를 들면, n-헥사데칸, 예컨대 카프릴 산(일명, 옥타노에이트)와 같은 지방산, 식물성 오일(신선한 또는 폐기유; 예컨대, 대두유) 등의 지방산 또는 그의 혼합물, 유기산(예를 들면 락트산, 아세트산, 시트르산, 프로피온산), 알콜(예: 에탄올, 글리세린) 및 이들의 혼합물; 황산 암모늄, 인산 암모늄, 요소, 효모 추출물, 고기 추출물, 펩톤, 옥수수 침지 액 등의 질소원; 미네랄 소금 및 비타민과 같은 다른 영양 공급원이 포함된다. 박테리아 숙주 세포는 전형적으로 발효 공정에 노출될 것이다. 박테리아 숙주 세포는 예를 들어 대수 증식 단계 또는 정지 단계일 수 있다.

멸균

제공된 수성(예를 들어, 발효) 매질은 멸균된다. 특히, 상기 기재된 방법에서의 매질은 당 업계에 공지된 방법을 사용하는 비-여과 방법에 의해 멸균될 수 있다. 이러한 방법은 열 기반, 화학 기반 또는 자외선 기반 방사선 기반 일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 열에 의한 처리는 습열 멸균, 특히 고압 증기 멸균을 통한 것일 수 있다.

대안적으로, 발효 매질은 화학적으로 처리될 수 있다. 하나의 특정 양태에서, 화학적 처리는 산성화, 고형 폐기물의 제거 및 하기 제시된 방법을 이용한 중화를 통해 이루어질 수 있다.

또 다른 특정 실시 양태에서, 수성(예, 발효) 매질은 과산화수소, 과산화 리튬, 과산화 나트륨, 과산화 바륨, 및 과산화 아세트산, 과산화 벤조일, 특히 과산화수소와 같은 과산화물로 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 하기에 설명된 바와 같이 처리 할 수 있다.

또 다른 구현 예에서, 상기 수성 매질은 예를 들어 자외선 조사로 조사될 수 있다.

한 실시 양태에서, 상기 수성 매질(예 : 발효 매질 또는 부용)은 상기 방법 중 하나에 의해 멸균될 수 있다. 또 다른 구현 예에서, 상기 발효 매질은 상기 제시된 하나 이상의 방법에 의해 멸균될 수 있고, 이러한 멸균은 임의의 순서로 이루어질 수 있다.

폐기물의 분리/제거 (고체/액체 (S / L) 분리)@@

본원에 기재된 매질을 사용하여 수득된 조성물 및 / 또는 매질로부터의 폐기물은 당 업계에 공지된 분리 방법을 사용하여 조성물로부터 제거되거나 분리될 수 있다. 이러한 방법은 정착 배치 또는 연속 원심 분리 또는 초원심 분리를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 경사 분리 또는 여과를 수행할 수 있다. 폐기물은 공정에서 분리가 일어나는 곳에 따라 고상 또는 액상일 수 있다.

숙성

상기 배양 또는 발효 매질은 약 0 내지 30℃에서 적어도 약 1 일 및 약 24-72 시간 동안 배양함으로써 숙성될 수 있다. 이 숙성 단계는 상기 설명한 하나 이상의 멸균 단계의 전 및 / 또는 후에 발생할 수 있다.

산성화 / 중화

수성(예를 들어, 발효) 매질은 산으로 처리하고, 액상 폐기물을 제거한 다음 잔류 고형물 및 선택적으로 유성 상 또는 층을 중화시킴으로써 농축되거나 멸균될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 수성 매질을 산으로 처리하여 배양 매질을 약 1.5 내지 2.5, 바람직하게는 약 2.05 내지 약 2.15의 pH로 조정할 수 있다. 산은 아세트산과 같은 유기산 또는 무기산 일 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 산은 무기산, 예를 들어 인산이고, HCl, H₂SO₄, HNO₃ 또는 H₃ClO₄과 같은 무기산이다. 결과적으로 액체, 유성 및 고체 상이 생성된다. 액체(액상)은 당 업계에 공지된 방법 및 상기한 방법(예를 들어, 여과 또는 원심 분리 또는 디캔팅과 결합된 침강)을 사용하여 특정 실시 태양에서 제거된다.

고체 및 선택적으로 유성 상은 약 5.5 초과, 바람직하게는 약 6.5-7.5,보다 바람직하게는 약 6.9-7.1의 pH로 중화된다. 특정 실시 양태에서, 고체 및 임의로 유성 상을 고체의 건조 무기 염기(예 : NaOH, KOH, LiOH, NaHCO₃)로 처리한다. 고체 및 유성 상 둘 다 중화되는 경우, 이들 상을 조합하고 중화 시키거나 또는 별도로 중화시킬 수 있다. 중화 후, 고체(고형) 폐기물은 여과, 침강 또는 원심 분리 및 경사 분리를 포함하여 실시하지만 이에 한정되지 않고, 또는 상술한 방법에 의해 제거된다. 중화된 물질은 또한 전술한 바와 같이 추가의 멸균 단계를 거칠 수 있다.

탈색 / 탈취

수성 매질(예를 들어, 발효 매질 또는 부용)은 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 탈색 및 / 또는 탈취될 수 있다. 특정 실시 예에서, 화학적 및 / 또는 자외선 또는 가시광선 처리가 사용된다.

특정 구현 예에서, 상기 탈색 및 / 또는 탈취 단계는 과산화수소 또는 유기 과산화물(예, 벤조일 퍼 옥사이드 또는 퍼 옥시 아세트산) 또는 무기 과산화물(예컨대, 과산화 리튬, 과산화 나트륨, 과산화 바륨)을 사용하는 과산화물 처리를 통해 수행 될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 수성 매질(예를 들어, 발효 매질 또는 부용)은 과산화물, 특히 과산화수소로 약 48 내지 120 시간 동안 약 1-5 % v / v의 농도로, 보다 바람직하게 특히 약 72-96 시간 동안 3-4 % v / v의 농도로 처리된다.

대안적으로, 상기 수성 매질은 350 내지 550 nm, 바람직하게는 400 내지 450 nm의 자외선 또는 가시 광선을 통해 탈색 및 / 또는 탈취될 수 있다. 방사선의 투여량은 적어도 약 100 J / g의 람노리피드, 바람직하게는 약 1 kJ / g 이상, 보다 바람직하게는 약 10 kJ / g 이상일 필요가 있다.

이 수성 매질은 멸균 전 및 / 또는 후에 그리고 전술한 산성화 및 중화 공정 전 및 /또는 후에 탈색 및 / 또는 탈취 될 수 있다.

액체(액상 또는 유체) 제거

다른 구체 예에서, 상기 액체는 과산화물 처리에 의한 탈색 및 / 또는 탈취를 따르지 않는 것을 제외하고는, 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 고체 폐기물을 제거한 후에 제거될 수 있다. 여기에는 열, 증발, 동결 건조, 드럼 건조가 포함 된다.

실시예 1: 유기 용매-비사용의 발효 부용으로부터 람노리피드(RL) 농후 용액(정제 부용)의 회수 공정

본원은 유기 용매를 사용하지 않고 적어도 50 g / L의 디- 및 모노-람노리피드의 혼합물을 함유하는 희석 용액에서 발효 부용으로부터 람노리피드를 회수하는 방법을 제공한다. 사용되는 방법(공정)의 개략적인 스킴(개략도)이 도 1에 묘사되어 있다.

이 공정은 상온에서 숙성 단계 후, 고압 증기 멸균 단계와 표준 고체/액체 분리 기술을 사용하여 박테리아 세포 물질에서 적어도 50 g / L 함유된 정제 람노리피드 농후 용액을 분리한다. 특히, 람노리피드 함유 부용은 농녹균(Pseudomonas aeruginosa)에 의한 pH 6.2-6.5에서 37℃에서 48-72 시간 동안 발효 시켜서 생성되며, 콩기름이 공급 원료이다. 숙성 전에 발효 부용의 최종 pH는 6.4-6.5 범위이다. 실온에서 약 48 시간 동안 숙성시킨 후, 발효 부용을 증기 가열 또는 고압 증기 멸균으로 멸균시킨다. 고체/액체 분리 후, 람노리피드 용액은 투명하고 사용 준비가 완료된다. 람노피드 용액의 암갈색은 실온에서 72-96 시간에 2-3 % v / v의 과산화수소를 첨가하면 감소될 수 있다. 여타 과산화물 역시 이 단계에 사용될 수 있고, 여기서 여타의 과산화물은 유기(예, 벤조일 과산화물 또는 과산화 아세트산) 또는 무기 과산화물(예, 과산화 리튬, 과산화 나트륨, 과산화 바륨)을 포함한다. 람노리피드 농후 용액(> 5 % 활성)이 수득된다.

정제 람노리피드 농후 용액은, 과산화물로 처리하지 않는 경우, 동결 건조하여 밝은 색상의 파우더로 만들 수도 있다. 람노리피드 농후 분말(> 75 % 활성)이 수득된다.

실시예 2: 정화 된 발효 부용으로부터의 침전 및 염기에서의 재용해에 의한 람노리피드 수용액의 분리 및 상기 공정으로부터 생성된 조성물

본 공정은 실시예 1에서 수득된 정제 부용으로 시작되고, 이는 도 2에 개략적으로 도시되어 있다. 실시예 1에 기술된 바와 같이, 정제 부용은 약 6.0 내지 6.5의 pH에서 종결되는 발효 부용을 약 2일간 대기 조건하에 숙성하는 것으로 제조된다. 바이오매스는 이 숙성 과정에 사용된 용기의 바닥에 침전되고, 제거된 후 맑은 상등액은 정제 부용이 된다. 이 공정의 다음 단계는 pH가 약 2.1이 될 때까지 진한 황산과 같은 산을 첨가하는 단계이다. 상기 람노리피드는 용액으로부터 침전되어 나아고, 이 단계에서 사용되는 용기의 바닥에 고체 상 및 유성 액체 상을 형성한다. 고체 및 유성 액체상의 분리는 원심 분리에 의해 촉진될 수 있다. 상기 고체 및 유성 액체상은 수성 상층 또는 층으로부터 분리되고, 이는 폐기되거나 재사용될 수 있다. 이어서, 결합된 고체 및 유성 액체 람노리피드 함유 상을 pH가 약 7.0에 도달 할 때까지 수산화 나트륨과 같은 고체 염기로 처리한다. 이것은 약 25 내지 30 % 농도의 물에서 람포리피드의 점성 용액을 생성한다. 최종 단계는 25-30 % 람노리피드 용액을 원심 분리하고 남아있는 고체로부터 형성된 펠릿으로부터 액체 최종 생성물을 분리하는 것이다. 이 액체는 동결 건조되어 건조 고체 생성물로 생성될 수 있다.

실시예 3: pH 이동을 이용하여 35-40 % 람노리피드 용액을 생산하는 비-유기 용매 농축 공정

실시예 1에 기재된 "감소된 색 및 냄새 정화 부용" 또는 "감소된 색 및 냄새 멸균 발효 부용"으로 시작하는 pH 시프트를 사용한 30-40 % 람노리피드 용액의 제조 방법이 제공되며, 이는 도 3 및 4에 개략적으로 도시되어 있다.

"감소된 색 및 냄새 정제 부용" 및 "감소된 색 및 냄새 멸균 발효 부용"은 3-5 % v / v 과산화수소를 정제 부용 또는 멸균된 발효 부용에 각각 첨가함으로써 수득할 수 있다. 실온에서 72-96 시간 후, 정제 람노리피드 농후 용액의 색은 람노리피드 손실 없이 약간 노랗게 되고, 냄새가 감소된다. 이 후, 감소된 색상 및 냄새의 정제 부용은 교차류 여과에 의해 1 미크론으로 여과되거나 또는 고체는 원심 분리 및 이어서 디캔팅에 의해 제거된다. 황산과 같은 농축 산은 pH가 약 2.1이 될 때까지 여액(투과액) 또는 상등액에 첨가된다. 그 다음, 상기 혼합물은 용기의 바닥에서 고체 상 및 유성 상으로 구성된 람포리피드 농후 층 및으로 분리되도록 한다. 이어서 상기 결합된 고체 및 유성 액체 람노리피드 함유 상을 수성 상층으로부터 분리하고 pH가 약 7.0에 도달할 때까지 수산화 나트륨과 같은 고체 염기로 처리한다. 이것은 물에서 람노리피드의 점성 용액을 생성한다.

최종 단계는 생성된 람노리피드 용액을 원심 분리하고 남아있는 고체(고형물)로부터 형성된 펠릿으로부터 액체 최종 생성물을 제거하는 것이다. 최종 액체 생성물은 30-40 % 람노리피드이다.

실시예 4: 공정 종료시 멸균 및 공정 중에 생성된 물질을 이용하여 발효 부용으로부터 람노리피드를 분리하는 방법(공정)

본 방법(공정)은 도 5에 개략적으로 도시되고, 람노리피드를 생성하는 살아있는 유기체를 여전히 함유하는 발효 부용의 원심 분리 또는 여과와 같은 고체/액체 분리 공정을 수행함으로써 시작된다. 이어서, 상기 정제 액체 생성물을 진한 황산 또는 여타 농축된 강한 무기산을 사용하여 pH 2.1로 산성화한다. 침전 또는 원심 분리 후, 수층은 유성 층 및 고체 층인 고밀도 생성물로부터 경사 분리된다. 이 유성 및 / 또는 고체 층을 수산화 나트륨과 같은 고체 염기로 pH 7로 중화시켜 용액을 얻는다. 잔류하는 용해되지 않은 불순물을 제거하기 위해 최종 고체 / 액체 분리 단계가 수행된다. 액체는 예를 들어 고압 증기 멸균에 의해 멸균된다.

실시예 5: pH-시프트(이동)를 사용하여 50-60 % 람노리피드 용액을 생산하기 위한, 비-유기 용매 농축 공정(방법)

실시예 3, "pH 이동을 사용하여 30-40 % 람다 리피드 용액을 생산하는 비 - 유기 용매 농축 공정"에 개시된 공정을 변형시켜 50-60 % 람 놀리 시드 용액을 제조 하였다.

정제 부용의 준비 및 진한 황산 (95-98 중량 %)으로 상기 정제 부용의 pH 2.1 로의 산 침전은 실시예 3에서 개시된 것과 동일하게 유지된다. 95-98 중량 %의 황산을 정제 부용에 pH가 2.1 일 때까지 첨가한 후, 이어 이 혼합물은 용기의 바닥에서 고상 및 유성 액체 상으로 구성된 람노리피드 농후 층 으로 분리되도록 허용된다. 그러나, 50-60 % 람노리피드 용액을 얻기 위해, 유성 물질 및 고체는, 예를 들어 원심 분리를 사용하여 분리된다. 원심 분리 후, 고형물은 바닥에서 얻어지며 유성 물질은 중간에 있고 수성 상층은 용기의 상부에있다. 이어서, 상기 고형물(고체)을 유성 액체 람노리피드 함유 상으로부터 분리하고, pH가 약 7.0에 도달 할 때까지 수산화 나트륨과 같은 고체 염기로 처리하여 생성물을 액화시킨다.

최종 단계는 생성된 람노리피드 용액을 원심 분리하고 남아있는 고형물로부터 형성된 펠릿으로부터 액체 최종 생성물을 제거하는 것이다. 최종 액체 생성물은 50-60 % 람다리피드이며 본 발명의 일부이다. 이 액체는 동결 건조되어 건조한 고체 생성물을 생성 할 수 있으며, 이 또한 본 발명의 일부이다.

실시예 6: 용매 추출없이 고농도의 람노리피드 농도를 얻기 위해 멸균 전 발효 부용으로부터 람노리피드를 분리하는 방법

이 공정은 실시예 5(pH-시프트(이동)를 사용하여 50-60 % 람노리피드 용액을 생산하기 위한, 비-유기 용매 농축 공정(방법))에 기술된 공정의 변형이고, 50-60 % 람노리피드 용액을 생산하나, 산성 침전 후 유성 층을 얻는 것을 포함하기에, 이에 회수되는 람노리피드가 증가하는 바, 놓은 수율이 달성된다.

본 공정(방법)은 도 6에 묘사되어있다. 람노리피드를 생산하는 세포(바람직하게 농녹균(Pseudomonas aeruginosa))의 람노리피드 및 바이오 매스를 함유하는 발효 부용으로 시작된다. 먼저, 적어도 5 분 동안 7500g 이상에서 원심 분리를 수행한다. 이어서 정제 부용(CB)을 미생물 세포(고체)로부터 분리하고 고압 멸균 증기법을 통해 멸균시킨다. 이어서 CB는 원심 분리 또는 여과에 앞서서 바람직하게 밤새도록 방치시키고, 침전되는 임의의 추가적인 고체(고형물)를 제거한다.

이 추가 정제된 CB는 진한 황산 또는 여타 농축된 강한 무기산을 사용하여 pH 2.1로 산성화된다. 산성화된 정제 부용은 본 발명의 일부이다. 침강 또는 원심 분리 후, 수층을 고체 층으로부터 경사 분리시킨다. 이어서, 고체가 수산화 나트륨과 같은 고형 염기로 pH가 약 7.0에 도달 할 때까지 처리된다. 결과는 50-60 %의 람노리피드를 갖는 액체가 수득된다. 이 액체는 동결 건조되어 건조 고체로 생성할 수 있다.

발효가 중지된 직후 원심 분리하고 실시예 1에서 기술 된 바와 같이 생성물을 숙성시킴으로써, 추가 처리될 수 있는 정제 부용(CB)이 생성된다. 이것은 발효액의 고체 / 액체 분리가 어려울 수 있다는 문제점을 해결한다.

전체 공정은 원래 발효 부용에서 약 80 % 이상의 람노리피드의 회수율과 함께 효과적으로 비용이 많이 드는 람노리피드 생체 계면 활성제의 고농도 제품을 생산한다. 본 발명은 람노리피드 발효로부터 생성물을 분리하는 것이 상업적으로 실행하기에는 너무 비싸다는 것으로 인식되는 문제를 해결한다.

Claims (15)

1. 하기 단계들을 포함하는, 하나 이상의 람노리피드(RL; rhamnolipid)를 포함하는 조성물의 유기용매-비사용 제조방법으로서, 상기 조성물이 중량으로 적어도 30% 람노리피드를 포함하는 농축된 정제 부용이고,
   상기 제조방법은 하기 단계를 포함한다:
   (a) 하나 이상의 람노리피드를 포함하는 수성 매질을 제공하는 단계;
   (b) 상기 단계 (a)에서 제공되는 수성 매질로부터 고체 폐기물을 제거하는 단계;
   (c) 상기 단계 (b)에서 얻어지는 수성 매질을 산으로 처리하여 산성 매질을 얻는 단계, 여기서 상기 산성 매질은 고체 상, 수성 액체 상, 및 유성 상을 포함하며;
   (d) 단계 (c)에서 얻어지는 수성 액체 상을 제거하는 단계;
   (e) 단계 (c)에서 얻어지는 고체 상을 중화하여 중화된 용액을 생성하는 단계; 및
   (f) 상기 중화된 용액으로부터 불용성 폐기 물질을 제거하여 상기 조성물을 얻는 단계.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 제조방법은 단계 (c) 전 또는 후에 멸균 단계를 더 포함하는, 제조방법.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 멸균 단계 전 또는 후에 불용성 폐기물을 제거하는 것을 더 포함하는, 제조방법.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 멸균 후에 상기 농축된 정제 부용을 탈색 또는 탈취하는 것을 더 포함하는, 제조방법.
   
5. 제3항에 있어서, 상기 멸균 단계 전 또는 후에 상기 수성 매질을 숙성시키는 것을 더 포함하는, 제조방법.
   
6. 제1항에 있어서, 단계 (e)에서 얻어지는 상기 중화된 용액으로부터 물을 제거하는 것을 더 포함하는, 제조방법.
   
7. 제1항에 있어서, 단계 (e)는 단계 (c)에서 얻어지는 유성 상을 중화하는 것을 더 포함하는, 제조방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 고체 상 및 유성 상은 별도로 중화되어 별도의 중화된 용액을 얻는, 제조방법.
   
9. 제7항에 있어서, 상기 고체 상 및 유성 상은 합쳐져서 함께 중화되어 중화된 용액을 얻는, 제조방법.
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