BR112017014710B1

BR112017014710B1 - Processo livre de solvente orgânico para a obtenção de uma composição compreendendo um ou mais ramnolipídeos (rls) e composições

Info

Publication number: BR112017014710B1
Application number: BR112017014710-6A
Authority: BR
Inventors: Nattaporn Lohitharn; Daniel Derr
Original assignee: Stepan Company
Priority date: 2015-01-12
Filing date: 2016-01-11
Publication date: 2022-06-14
Also published as: US20160272667A1; BR112017014710A2; JP7074899B2; EP3245293A1; CN107406867A; CA2973183A1; CN107406867B; MX2017009126A; JP2021098700A; CA2973183C; CN113368777B; KR102557083B1; AU2016207008A1; AU2016207008B2; JP6866301B2; CN113368777A; KR20170102903A; HK1247249A1; US9884883B2; EP3245293A4

Abstract

São fornecidos métodos livres de solvente orgânico para a obtenção de composições compreendendo um ou mais ramnolipídeos, assim como composições obtidas a partir dos referidos métodos.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] São fornecidos processos livres de solvente orgânico para a ob tenção de composição que compreende ramnolipídeos assim como ditas composições.

ANTECEDENTES

[0002] Ramnolipídeos (RLs) são glicolipídeos ativos de interface pro duzidos por várias espécies bacterianas. Os RLs consistem de um (monor- ramnosilipídeos ou monorramnolipídeos) ou duas unidades de ramnose (dirramnosilipídeos ou dirramnolipídeos) e um ou dois (predominantemente dois) resíduos de ácido graxo 3-hidróxi. Os ramnolipídeos possuem propri-edades tensoativas particulares tais como, por exemplo, uma forte capacidade de formação de espuma, e são de interesse para aplicações altamente técnicas diversas, particularmente como tensoativos (revisados em Randhawa et al. (2014) "Rhamnolipid biosurfactants—past, present, and future scenario of global market", Frontiers in Microbiology 5:1-7; Muller et al. (2012) "Rhamnolipids—Next generation surfactants?", J Biotechnol 162(4):366-80; Banat et al. (2010) "Microbial biosurfactants production, applications and future potential" Appl Microbiol Biotechnol 87:427-444). Exemplos de aplicações potenciais incluem: (1) biorrecuperação e recuperação melhorada de óleo (EOR), visto que removem eficientemente o óleo bruto e metais pesados do solo contaminado e facilitam a biorrecuperação dos vazamentos de óleo devido às suas propriedades de emulsificação; (2) cosméticos: incluindo cosmecêuticos, por exemplo, para cicatrização de feridas, queimaduras, psoríase e rugas; (3) detergentes e produtos de limpeza: particularmente para produtos de lavanderia, xampus e sabonetes, dadas às suas propriedades tensoativas e emulsificantes e (4) agricultura. Os ramnolipídeos estão atualmente disponíveis em um produto antifúngico agrícola comercializado como ZONIX® (Proptera LLC).

[0003] O interesse nos RLs aumentou visto que eles podem ser preparados por meio de fermentação com base em matérias-primas renováveis. No entanto, os ramnolipídeos só foram disponíveis no mercado em pequenas quantidades e a preços elevados, em parte devido aos métodos de processamento pesados a jusante. Vários métodos foram divulgados para a produção de ramnolipídeos (revisados, por exemplo, em Heyd et al. (2008) "Development and trends of biosurfactant analysis and purification using rhamnolipids as an example", Anal Bioanal Chem 391:1579-1590 and Smyth et al. (2010) "Isolation and Analysis of Low Molecular Weight Microbial Glycolipids", in Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology, K. N. Timmis (ed.), Springer-Verlag, Berlin, pp. 3705-3724; Desai et al. (1997) "Microbial Production of Surfactants and Their Commercial Potential", Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61: 47-64 e também divulgados, por exemplo, nas US 5656747, US4628030, US20140148588, CN102796781, CN102766172, CN101787057, CN101845468, CN102432643, CN1908180, KR1020060018783).

[0004] Atualmente, o procedimento de isolamento mais comum para os ramnolipídeos envolve o caldo de fermentação em autoclave logo após a conclusão da fermentação, seguido de acidificação para precipitar os ramnolipídeos. Os ramnolipídeos sólidos que resultam estão contaminados com matéria celular sólida do organismo utilizado na fermentação. Os RLs são isolados destes sólidos celulares através da sua extração em um solvente orgânico tal como acetato de etila. Após a remoção do acetato de etilo, uma forma oleosa concentrada do produto se origina. No entanto, o processo de extração de solvente traz consigo qualquer impureza hidrofóbica, potencialmente incluindo o óleo de triacil glicerídeo não consumido e o antiespumante do proces- so de fermentação. Exemplos de outros métodos divulgados incluem (1) precipitação de sulfato de alumínio do caldo de fermentação seguido pela extração com solvente orgânico; (2) ultrafiltração contínua; (3) cromatografia de coluna (ver, por exemplo, Lebrón-Paler A (2008) "Solution and interfacial characterization of rhamnolipid biosurfactant from P. aeruginosa ATCC 9027" PhD Dissertation University of Arizona, CN101787057, CN101407831, CN1908180) utilizando adsorção, troca iônica, colunas de fase reversa ou de fase normal que podem ser executadas em combinação com a etapa de precipitação; (4) cromatogra- fia em contracorrente (Zhang et al. "Separation and purification of six biosurfactant rhamnolipids by high-speed countercurrent chromatography utilizing novel solvent selection method", Separation Science and Technology, in press (posted Nov. 24, 2015)); (5) cristalização seletiva seguida pela extração ou (6) fracionamento / adsorção de espuma (ver, por exemplo, US 2015/0011741; Sarachat et al., (2010) "Purification and concentration of a rhamnolipid biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa SP4 using foam fractionation", Bioresource Technology 101: 324-330). No entanto, todos estes métodos também possuem várias desvantagens (por exemplo, oneroso, não se adaptam bem, recurso intensivo, etc.).

SUMÁRIO

[0005] É fornecido um processo livre de solvente orgânico para a obtenção de composição compreendendo ramnolipídeos que compreende: (a) fornecer um meio aquoso compreendendo pelo menos um ramnolipídeo (RL); (b) esterilização à base de não filtração de dito meio fornecido em (a); (c) separar uma fase contendo RL de resíduos em dito meio esterilizado em (b) para obter dita composição.

[0006] O produto final que utiliza o método apresentado acima vem de um processo natural, não foi modificado quimicamente e não entrou em contato com nenhum solvente orgânico à base de petróleo. O processo ou método apresentado acima elimina o uso de solventes químicos derivados de petróleo para extrair os ramnolipídeos do meio aquoso (por exemplo, meio ou caldo fermentado) e assim significativamente reduz o custo de produção. Além disso, a solução final de ramnolipídeo é naturalmente derivada.

[0007] Em uma modalidade particular, a composição compreendendo ramnolipídeos é um caldo clarificado compreendendo pelo menos cerca de 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 % ou 10 % de ramnolipídeos em peso, em que dito método ainda compreende após a etapa (a) e antes da etapa (b), (1) o amadurecimento de dito meio fornecido na etapa (a) para obter meio amadurecido e esterilizado. Também é fornecida uma composição compreendendo dito meio amadurecido e esterilizado que pode ser obtido a partir do processo apresentado acima. O método pode ainda compreender após a etapa (a) e antes da etapa (b) a remoção dos resíduos sólidos de dito meio fornecido na etapa (a). A composição nas modalidades específicas acima pode compreender entre cerca de 5 % a cerca de 10 % de RL.

[0008] Em mais outra modalidade, o método pode ainda compreender após a etapa de esterilização (b) e antes da etapa de separação (c) o amadurecimento de dito meio esterilizado da etapa (a). Em mais outra modalidade, após a etapa (a) e antes de dito meio ser amadurecido em (1), os resíduos sólidos podem ser removidos do meio fornecido.

[0009] Em mais outra modalidade, o método compreende duas etapas de amadurecimento e pode compreender as seguintes etapas: (a) fornecer um meio aquoso (por exemplo, meio de fermentação) compreendendo pelo menos um ramnolipídeo; (b) amadurecer dito meio aquoso (por exemplo, meio de fermentação) fornecido; (c) esterilização à base de não filtração de dito meio fornecido em (b); (d) amadurecer dito meio esterilizado de (c) e (e) separar uma fase líquida contendo RL dos resíduos em dito meio envelhecido e esterilizado em (d) para obter dita composição.

[0010] Em ainda outra modalidade, uma composição compreendendo ramnolipídeos pode ser um caldo clarificado que compreende pelo menos cerca de 5 %, 6 %, 7 %, 8 % 9 % ou 10 % de ramnolipí- deos em peso. Em uma modalidade particular, o método para a obtenção da composição compreendendo RLs, particularmente um caldo clarificado, pode compreender antes da etapa (b) o amadurecimento de dito meio fornecido na etapa (a), depois subsequentemente (b) a esterilização de dito meio amadurecido por meio do tratamento químico, em particular, tratamento com peróxido (por exemplo, peróxido de hidrogênio e peróxidos orgânicos tais como peróxido de benzoíla e ácido peroxiacético e peróxidos inorgânicos tais como peróxido de lítio, peróxido de sódio, peróxido de bário) e/ou tratamento de radiação com luz ultravioleta; (c) a separação de uma fase contendo RL dos resíduos sólidos em dito meio esterilizado e opcionalmente ainda compreendendo (c)(1) a esterilização adicional de dita fase contendo RL e (c)(2) a separação de uma fase contendo RL dos resíduos sólidos em dita fase contendo RL esterilizado para obter dito caldo clarificado. Em uma modalidade particular, a dita etapa de esterilização na etapa (b) é através de tratamento químico e/ou tratamento com radiação ultravioleta e a etapa de esterilização na etapa (c)(2) é através de calor.

[0011] Também é fornecida uma composição obtida após a esterilização de dito meio amadurecido. Ainda são fornecidas as composi- ções esterilizadas obtidas utilizando as etapas (b) e/ou (c)(1) apresentadas acima.

[0012] Os métodos apresentados acima podem ainda compreender uma etapa de descoloração e/ou desodorização. O tratamento de descoloração e/ou desodorização pode ser executado antes e/ou após a etapa de esterilização. Também uma composição é fornecida compreendendo meio descolorido e/ou desodorizado que pode ser obtido utilizando os métodos apresentados acima.

[0013] Em mais outra modalidade, após a etapa (c), o fluido ou o líquido pode ser removido da fase contendo RL separada para obter uma composição sólida, por exemplo, através da evaporação. Em uma modalidade particular, dita composição está, por exemplo, na forma de pó ou na forma granular.

[0014] Em ainda outra modalidade, dita composição que compreende os ramnolipídeos é um caldo clarificado concentrado que compreende pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 35 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 45 %, pelo menos cerca de 50 % ou pelo menos cerca de 60 % de ramnolipídeos em peso. Ainda mais uma modalidade particular, dito caldo clarificado concentrado pode compreender entre cerca de 30 a 60 % de RL, cerca de 30 a 40 % de RL ou cerca de 50 a 60 % de RL em peso.

[0015] Em uma modalidade particular, dito meio fornecido na etapa (a) no método apresentado acima é esterilizado na etapa (b) mediante o tratamento de dito meio com ácido e dito meio acídico obtido compreende uma fase sólida, líquida e oleosa e pelo menos a fase líquida é removida e antes da etapa (c), as fases sólidas e opcionalmente oleosas são neutralizadas para obter uma solução e na etapa (c) o material de resíduos insolúvel é removido de dita solução para obter dita composição compreendendo dito caldo clarificado concentrado apresentado acima. Assim, um método para obter caldo clarifi- cado concentrado pode compreender: (a) fornecer um meio aquoso (por exemplo, meio de fermentação) compreendendo ramnolipídeos (RLs); (b) esterilizar dito meio de fermentação ou cultura fornecido em (a) por meio do tratamento com ácido para obter uma fase líquida, oleosa e sólida acidificada; (c) remover dita fase líquida obtida em (b) e tratar dita fase sólida e opcionalmente oleosa com base para obter uma solução neutralizada; (d) remover o material insolúvel da referida solução obtida em (c) para obter uma composição compreendendo caldo clarificado concentrado que compreende um ou mais ramnolipídeos.

[0016] Em mais outra modalidade, o método para a obtenção de uma composição compreendendo caldo clarificado concentrado pode ainda compreender uma etapa de esterilização adicional e opcionalmente uma outra etapa de separação para remover os resíduos insolúveis da referida solução. Além disso, dito método pode ainda compreender após a esterilização, descoloração e/ou desodorização o referido caldo clarificado concentrado esterilizado. O método também pode ainda compreender a remoção de líquido ou fluido de dita solução através da evaporação obtida na etapa (c) para obter uma composição sólida. O meio pode ser tratado com ácido e depois neutralizado antes ou depois da etapa de esterilização adicional.

[0017] Nos métodos apresentados acima, as referidas fases sólidas e oleosas podem ser neutralizadas separadamente para obter soluções separadas. Alternativamente, ditas fases sólidas e oleosas são combinadas e as referidas fases sólidas e oleosas combinadas são neutralizadas para se obter uma solução neutralizada. Além disso, em mais outra modalidade, apenas a fase sólida é neutralizada.

[0018] Os métodos apresentados acima podem ainda compreen- der a descoloração e/ou desodorização de dita composição. Adicionalmente, dita composição pode ser seca.

[0019] Em outra modalidade, um método para a obtenção de uma composição compreendendo ramnolipídeos que é um caldo clarificado concentrado que compreende pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 35 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 45 %, pelo menos cerca de 50 % ou pelo menos cerca de 60 % de ramnoli- pídeos em peso, pode ainda compreender antes e/ou após dita etapa de esterilização adicional que amadurece o referido meio fornecido.

[0020] Em particular, dito método compreende: (a) fornecer um meio aquoso (por exemplo, fermentação) compreendendo um ou mais ramnolipídeos; (b) opcionalmente remover os resíduos insolúveis de dito meio fornecido; (c) esterilizar o referido meio fornecido; (d) amadurecer dito meio esterilizado de (c); (e) remover os resíduos de dito meio amadurecido e esterilizado; (f) tratar o meio obtido em (e) com ácido, em que o referido meio acídico obtido compreende uma fase sólida, líquida e oleosa e pelo menos a fase líquida é removida e as fases sólida e opcionalmente oleosas são neutralizadas para se obter uma solução neutralizada; (g) remover os resíduos sólidos da referida solução neutralizada de (f) para se obter dita composição compreendendo o referido caldo clarificado concentrado.

[0021] Também são fornecidas as composições compreendendo a solução neutralizada obtida de acordo com os métodos apresentados acima. Ainda são fornecidas as composições descoloridas e/ou desodorizadas compreendendo pelo menos cerca de 30% de RLs utilizando ou obtendo os métodos apresentados acima.

[0022] As composições obtidas podem ser utilizadas como um tensoativo em sabão para mãos, lavagens corporais, limpadores faciais, pasta de dente, xampus, condicionadores, xampus condicionadores, cosméticos, sabão para pratos, detergentes para lavagem de roupa, pulverizadores de pré-tratamento de roupa, produtos de limpeza de superfícies sólidas, limpadores de superfícies porosas, produtos de limpeza de piso, limpadores de automóveis, recuperação melhorada de óleo, curativos para feridas, antibacterianos agrícolas, tratamentos anticorrosão, biorrecuperação, películas anticolagem, aplicações an- tissujeira, meios de extinção de incêndio, antivirais, antimofos e anti- zoósporos. Em uma modalidade, as composições contendo quantidades mais elevadas de RL (> 30 % em peso / volume) ou mais particularmente cerca de (> 50 % em peso / volume) obtidas utilizando os métodos apresentados acima podem ser utilizadas para produzir um produto à base de ramnolipídeo que pode deslocar um tensoativo aniôni- co tal como lauril sulfato de sódio (SLS) nos mercados de higiene pessoal e de limpeza doméstica, dado que determinados tensoativos aniônicos são vendidos com freqüência em uma concentração ao redor de 30 % para alguma aplicação.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0023] A Figura 1 mostra esquematicamente um método livre de solvente orgânico para a obtenção de caldo clarificado rico em ram- nolipídeos (CB).

[0024] A Figura 2 mostra esquematicamente se o CB é concentrado por tratamento ácido/base para obter caldo clarificado concentrado (CCB).

[0025] A Figura 3 mostra esquematicamente a obtenção de CCB a partir do CB tratado com peróxido de hidrogênio.

[0026] A Figura 4 mostra esquematicamente a obtenção de CCB a partir do meio de fermentação esterilizado tratado com peróxido de hidrogênio.

[0027] A Figura 5 mostra esquematicamente a obtenção de CCB através da execução em primeiro lugar de uma etapa de separação no caldo de fermentação e execução da etapa de esterilização mais tarde no processo.

[0028] A Figura 6 mostra esquematicamente um método para a obtenção de CCB através da execução de etapas de separação, esterilização, amadurecimento e acidificação.

DEFINIÇÕES

[0029] Onde uma faixa de valores é fornecida, entende-se que cada valor interveniente, até o décimo da unidade do limite inferior, a não ser que o contexto dite claramente de outra maneira, entre o limite superior e o limite inferior dessa faixa e qualquer outro valor mencionado ou interveniente nessa faixa declarada, é incluído dentro da invenção. Os limites superiores e inferiores destas faixas menores podem ser incluídos de forma independente nas faixas menores e também são incluídos dentro da invenção, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído na faixa mencionada. Onde a faixa indicada inclui um ou ambos os limites, as faixas que excluem cada um ou ambos desses limites incluídos também são incluídas na invenção.

[0030] A menos que seja definido o contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa de habilidade prática na técnica à qual pertence esta invenção. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos também possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos.

[0031] Todas as publicações e patentes citadas nesta divulgação são incorporadas por referência na sua totalidade. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não tem o direito de antedatar tal divulgação em virtude de invenção anterior. Na medida em que o material incorporado por referência contradiz ou é inconsistente com este relatório descritivo, o relatório descritivo substituirá qualquer material desse tipo.

[0032] Deve ser observado que como aqui utilizado e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem as referências plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário.

[0033] A não ser que de outra maneira indicada, o termo "pelo menos" que precede uma série de elementos deve ser entendido de se referir a cada elemento da série. Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar utilizando não mais do que a experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção aqui descritas. Tais equivalentes se destinam a serem incluídos pela presente invenção. Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações que se seguem, a menos que o contexto exija de outra maneira, a palavra "compreender" e as variações tais como "compreende" e "compreendendo", serão compreendidas de implicar a inclusão de um número inteiro declarado ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de número inteiro ou etapa. Assim, os termos "compreendendo", "incluindo", "contendo", "tendo" etc. serão lidos de forma expansiva ou abertos e sem limitação. Quando aqui utilizado, o termo "compreendendo" pode ser substituído pelo termo "contendo" ou às vezes quando aqui utilizado com o termo "tendo".

[0034] Como aqui definido, um "ramnolipídeo" refere-se a um gli- colipídeo que possui uma parte lipídica que inclui um ou mais componentes de ácido e-hidróxi-carboxílico tipicamente linear, saturado ou insaturado e uma parte de sacarídeo de uma ou mais unidades de ramnose.

[0035] A parte de sacarídeo e a parte de lipídeo estão ligadas através de uma ligação β - glicosídica entre o grupo de 1-OH de um componente de ramnose da parte de sacarídeo e o grupo de 3-OH de um ácido β -hidróxi-carboxílico da parte lipídica. Assim, o grupo carbo- xílico de um componente de ácido carboxílico define o fim do ramnoli- pídeo. Onde mais do que um componente de ramnose estiver incluído em um ramnolipídeo, cada uma dos componentes de ramnose não ligado à parte lipídica está ligado a outro componente de ramnose através de uma ligação 1,4 e-glicosídica. Nas modalidades onde dois ou mais ácidos β -hidróxi-carboxílicos estão presentes em um ram- nolipídeo, os componentes de ácido e—hidróxi—carboxílico são selecionados independentemente um do outro. Os componentes de ácido β- hidróxi carboxílico de uma respectiva pluralidade de componentes de ácido e-hidróxi-carboxílico podem ser idênticos em algumas modalidades. Em algumas modalidades, eles são diferentes entre si.

[0036] Como aqui definido, a expressão "um meio aquoso" é uma composição que compreende pelo menos cerca de 5 % em peso de ramnolipídeos ou sais de ramnolipídeos em água. Em uma modalidade particular, ela compreende o produto de uma fermentação que tem a capacidade de produzir um ou mais ramnolipídeos de pelo menos uma fonte de carbono sob condições de fermentação conhecidas na técnica.

[0037] Os termos "caldo de fermentação" e "meio de fermentação" são sinônimos e podem ser utilizados de modo trocável.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0038] É aqui fornecido um método livre de solvente orgânico para a obtenção de uma composição compreendendo um ou mais ramnoli- pídeos. Em uma modalidade particular, o ramnolipídeo pode ter a estrutura (I)

[0039] Nesta fórmula, R9 é um átomo de hidrogénio (H) ou um grupo alifático que possui uma cadeia principal de um a cerca de 46, tal como de um a cerca de 42, de um a cerca de 40, de um a cerca de 38, de um a cerca de 36, de um a cerca de 34, de um a cerca de 30, de um a cerca de 28, incluindo, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 átomos de carbono e um a cerca de três, incluindo dois, átomos de oxigênio. Em algumas modalidades, a cadeia principal do respectivo grupo alifático carrega um grupo ácido carboxílico terminal e/ou um grupo éster interno. Como um exemplo ilustrativo a este respeito, R9 pode ser da fórmula -CH(R5)-CH2-COOR6. Nestes partes ilustrativos, R5 pode ser um componente alifático com uma cadeia principal que possui um comprimento de 1 a cerca de 19, tal como de 1 a cerca de 17, de 1 a cerca de 15, de 1 a cerca de 13, de cerca de 2 a cerca de 13, de cerca de 3 a cerca de 13 ou de cerca de 4 a cerca de 13, incluindo, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 átomos de carbono. R4 na fórmula (I) é um átomo de hidrogénio (H), ou um componente de ramnopiranosila. R6 é um átomo de hidrogênio.

[0040] O termo "alifático" significa, a não ser que de outra maneira mencionada, uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada, que pode ser saturada ou mono- ou poli-insaturada e incluir heteroátomos. O termo "heteroátomo" como aqui utilizado significa um átomo de qualquer elemento diferente de carbono ou hidrogênio. Aqui, um grupo alifático não saturado contém uma ou mais ligações duplas (componentes de alquenila). As ramificações da cadeia de hidrocarboneto podem incluir cadeias lineares, assim como elementos cíclicos não aro máticos. A cadeia de hidrocarboneto pode ser, a não ser que de outra maneira mencionada, de qualquer comprimento e conter qualquer número de ramificações. Tipicamente, a cadeia de hidrocarboneto (principal) inclui de 1 a cerca de 5, a cerca de 10, a cerca de 15 ou a cerca de 20 átomos de carbono. Exemplos de componentes de alquenila são componentes de hidrocarboneto de cadeia reta ou ramificada que contêm uma ou mais ligações duplas. Os componentes de alquenila geralmente contêm cerca de dois a cerca de vinte átomos de carbono e uma ou mais, por exemplo, duas, ligações duplas, tais como de cerca de dois a cerca de dez átomos de carbono e uma ligação dupla. Exemplos de grupos de alquila são metila, etila, propila, butila, pentila, hexila, heptila, octila, nonila, decila, os isômeros n destes radicais, iso- propila, isobutila, isopentila, sec-butila, terc-butila, neopentila, 3,3- dimetilbutila. Tanto a cadeia principal quanto as ramificações podem conter além do mais heteroátomos como, por exemplo, N, O, S, Se ou Si ou um átomo de carbono pode ser substituído por um destes hete- roátomos. Um componente alifático pode ser substituído ou não substituído por um ou mais grupos funcionais. Os substituintes podem ser qualquer grupo funcional como, por exemplo, mas não limitado a estes, amino, amido, carbonila, carboxila, hidroxila, nitro, tio e sulfonila.

[0041] Em uma modalidade mais particular, os ramnolipídeos ou sais de ramnolipídeo em dita estrutura possuem a estrutura (II):

em que x é 1 ou 2, y é 4, 6 ou 8 e M é H, ou um metal, tal como metais alcalinos Li, Na ou K, metais terrosos alcalinos Mg ou Ca, ou metais de transição Mn, Fe, Cu, ou Zn. Nos casos de metais terrosos alcalinos e de transição, múltiplos componentes de sal de ramnolipídeo podem se associar a cada metal. Em uma modalidade específica, a composição compreende uma mistura de mono (onde x = 1) e di (onde x = 2) ram- nolipídeos onde y e z são 6 e M é H ou Na. O monorramnolipídeo pode ser referido como Rha-C10-C10, com uma fórmula de C26H48O9. O nome IUPAC é ácido 3-[3-[(2R,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-tri-hidróxi-6- metiloxan-2-il]oxidecanoilóxi]decanoico. O dirramnolipídeo pode ser referido como RhaRha-C10-C10, com uma fórmula de C32H58O13. O nome IUPAC é ácido 3-[3-[4,5-di-hidróxi-6-metil-3-(3,4,5-tri-hidróxi-6- metiloxano-2-il)oxioxan-2-il]óxi decanoilóxi]decanoico. Em uma modalidade mais específica, o monorramnolipídeo pode estar presente na quantidade de cerca de 30 % do ramnolipídeo total a cerca de 50 % do total e o dirramnolipídeo pode estar presente na quantidade de cerca de 50 % do ramnolipídeo total a cerca de 70 % do di-ramnolipídeo. A composição em outra modalidade compreende mono e dirramnolipídeos em que a relação de mo- norramnolipídeos:dirramnolipídeos é de cerca de 35:65 a cerca de 55:45.

[0042] Em uma modalidade mais específica, a composição compreende os compostos apresentados na Tabela 1.

[0043] Conforme apresentado acima, o método compreende: (a) fornecer um meio aquoso compreendendo pelo menos um ramnolipí- deo (RL); (b) a esterilização não mecânica de dito meio fornecido em (a) e (c) separar uma fase contendo RL no meio esterilizado de (b) a partir dos resíduos para obter dita composição. Além disso, nas modalidades específicas, as etapas de amadurecimento, acidificação, neutralização, secagem, descoloração e/ou desodorização também podem ser utilizadas.

Fonte do meio

[0044] O meio aquoso fornecido que compreende um ou mais ramnolipídeos pode ser obtido a partir de um caldo de fermentação derivado da origem e em particular, pode ser o resultado de uma célula hospedeira recombinante que produz ramnolipídeos utilizando métodos conhecidos na técnica ou de um microorganismo produtor de ramnolipídeos. Uma célula hospedeira recombinante que produz ram- nolipídeos pode ser uma célula hospedeira, tal como uma célula bacte- riana que expressa um gene RhlA ou seu ortográfico, e/ou um gene RhlB ou seu ortólogo, e/ou um gene RhlC ou seu ortográfico, e/ou o gene RhlR ou seu ortólogo, e/ou o gene RhlI ou seu ortólogo, e/ou o gene RhlG ou seu ortólogo e outros.

[0045] O termo "micro-organismo produtor de ramnolipídeo" como aqui utilizado refere-se a qualquer microorganismo, tal como bactérias, que possui a capacidade de sintetizar/produzir ramnolipídeos sob condições adequadas que inclui, mas não é limitado a estes, bactéria dos filos Actinobacteria, Fimicutes e Proteobacteria. Em uma modalidade particular, o microorganismo produtor de ramnolipídeo é uma bactéria da classe Gammaproteobacteria. Em uma outra modalidade, o microorganismo produtor de ramnolipídeo é uma bactéria da ordem Pseudomonadales. Em mais outra modalidade, o microorganismo produtor de ramnolipídeo é uma bactéria da família Pseudomonadacae. Em uma outra modalidade, o microorganismo produtor de ramnolipídeo é uma bactéria do gênero Pseudomonas, tal como P. alcaligenes, P. aeruginosa, P. chlororaphis, P. c1emancea, P. collierea, P. fluorescens, P. luteola, P. putida, P. stutzeri e P. teessidea. Em uma outra modalidade, o micro-organismo produtor de ramnolipídeo é P. aeruginosa.

[0046] A célula hospedeira é cultivada sob condições que permitem a produção de RL. Uma variedade de fontes de carbono pode ser utilizada tal como um monossacarídeo, por exemplo, glicose, um dis- sacarídeo, por exemplo, sacarose, um álcool, por exemplo, glicerol, um alcano, por exemplo, n-hexadecano, um ácido graxo tal como ácido caprílico (também denominado octanoato), óleos vegetais (frescos ou resíduos, por exemplo, óleo de soja) ou suas misturas, ácidos orgânicos (por exemplo, ácido láctico, ácido acético, ácido cítrico, ácido propiônico), álcoois (por exemplo, etanol, glicerina), e misturas destes; fontes de nitrogênio tais como sulfato de amônio, fosfato de amônio, uréia, extrato de levedura, extrato de carne, peptona e substância lí-quida de milho; e outras fontes nutricionais tais como sais minerais e vitaminas. A célula hospedeira bacteriana será tipicamente exposta a um processo de fermentação. A célula hospedeira bacteriana pode, por exemplo, estar na fase de crescimento logarítmico ou na fase estacionária.

Esterilização

[0047] O meio aquoso (por exemplo, fermentação) fornecido é esterilizado. Em particular, o meio nos métodos apresentados acima pode ser esterilizado por métodos de não filtração utilizando métodos conhecidos na técnica. Esses métodos podem ser baseados em calor, à base de química ou à base de radiação ultravioleta. Em uma modalidade particular, o tratamento à base de calor pode ser por meio de esterilização por calor úmido, particularmente em autoclave.

[0048] Alternativamente, o meio de fermentação pode ser tratado quimicamente. Em uma modalidade particular, o tratamento químico pode ser através da acidificação, remoção de resíduos sólidos e neutralização utilizando os procedimentos apresentados abaixo.

[0049] Em outra modalidade particular, o meio aquoso (por exemplo, fermentação) pode ser tratado com peróxidos tais como peróxido de hidrogênio, peróxido de lítio, peróxido de sódio, peróxido de bário, ácido peroxiacético, peróxido de benzoíla, em particular, peróxido de hidrogênio utilizando métodos conhecidos na técnica e apresentados abaixo.

[0050] Em mais outra modalidade, o meio aquoso pode ser irradiado com, por exemplo, irradiação de luz ultravioleta.

[0051] Em uma modalidade, o meio aquoso (por exemplo, meio ou caldo de fermentação) pode ser esterilizado por um dos procedimentos acima. Em outra modalidade, o meio de fermentação pode ser esterilizado por mais de um dos procedimentos apresentados acima e estas esterilizações podem ser em qualquer ordem. Separação/Remoção de Produtos Residuais (separação sólido/líquido (S/L))

[0052] O resíduo das composições e/ou do meio obtidos utilizando o meio aqui apresentado pode ser removido ou separado da composição utilizando procedimentos de separação conhecidos na técnica. Estes procedimentos incluem, mas não são limitados a estes, sedimentação por centrifugação ou ultracentrifugação em batelada ou contínua, que pode ser seguida por decantação ou filtração utilizando procedimentos conhecidos na técnica. O resíduo pode ser uma fase sólida ou uma fase líquida, dependendo de onde no processo ocorre a separação.

Amadurecimento

[0053] A cultura ou o meio de fermentação pode ser amadurecido através da incubação durante pelo menos cerca de 1 dia e entre cerca de 24 a 72 horas, entre cerca de 0 a 30 °C. Esta etapa de amadurecimento pode ocorrer antes e/ou após uma ou mais das etapas de esterilização apresentadas acima.

Acidificação/Neutralização

[0054] O meio aquoso (por exemplo, Fermentação) pode ser concentrado ou esterilizado pelo tratamento com ácido, remoção de resíduos líquidos e depois neutralização do sólido remanescente e opcionalmente a fase ou camada oleosa. Em uma modalidade particular, o meio aquoso pode ser tratado com ácido de modo que o meio de cultura seja ajustado para um pH entre cerca de 1,5 a 2,5, preferencialmente, de cerca de 2,05 a cerca de 2,15. O ácido pode ser um ácido orgânico tal como ácido acético, ou um ácido mineral. Em uma modalidade preferida, o ácido é um ácido mineral, por exemplo, HCl, H2SO4, HNO3 ou H3ClO4. Como um resultado, uma fase líquida, oleosa e sólida é gerada. A fase líquida é removida utilizando procedimentos conhecidos na técnica e em uma modalidade específica utilizando métodos apresentados acima (por exemplo, filtração, ou centrifugação ou sedimentação combinada com decantação).

[0055] A fase sólida e opcionalmente oleosa é neutralizada para um pH maior do que cerca de 5,5, de preferência entre cerca de 6,5 a 7,5, mais preferivelmente entre cerca de 6,9 a 7,1. Em uma modalidade específica, a fase sólida e opcionalmente oleosa é tratada com uma base mineral sólida e seca (por exemplo, NaOH, KOH, LiOH, NaHCO3). No caso em que as fases tanto sólidas quanto oleosas são neutralizadas, estas fases podem ser combinadas e neutralizadas ou alternativamente neutralizadas separadamente. Após a neutralização, os resíduos sólidos são removidos pelos métodos estabelecidos acima, incluindo, mas não limitado a estes, filtração, sedimentação ou centrifugação e decantação. O material neutralizado também pode ser submetido a uma outra etapa de esterilização, conforme apresentado acima.

Descoloração/Desodorização

[0056] O meio aquoso (por exemplo, meio de fermentação ou caldo) pode ser descolorido e/ou desodorizado utilizando procedimentos conhecidos na técnica. Em uma modalidade particular, o tratamento químico e/ou de radiação ultravioleta ou visível é utilizado.

[0057] Em uma modalidade específica, dita etapa de descoloração e/ou desodorização pode ser executada por meio do tratamento com peróxido utilizando peróxido de hidrogênio ou peróxido orgânico (por exemplo, peróxido de benzoílo ou ácido peroxiacético) ou inorgânico (por exemplo, peróxido de lítio, peróxido de sódio, peróxido de bário). Em uma modalidade particular, o meio aquoso (por exemplo, meio ou caldo de fermentação) pode ser tratado com peróxido, particularmente, peróxido de hidrogênio, em uma concentração ao redor de 1 a 5 % v/v durante cerca de 48 a 120 horas e mais particularmente entre cerca de 3 a 4 % v/v durante cerca de 72 a 96 horas.

[0058] Alternativamente, o meio aquoso pode ser descolorido e/ou desodorizado através da radiação ultravioleta ou visível de 350 a 550 nm, preferencialmente 400 a 450 nm. A dose de radiação precisa ser de pelo menos cerca de 100 J/g de ramnolipídeos, preferencialmente pelo menos cerca de 1 kJ/g, mais preferencialmente pelo menos cerca de 10 kJ/g.

[0059] Este meio aquoso pode ser descolorido e/ou desodorizado antes e/ou após a esterilização e antes ou depois do processo de aci- dificação e neutralização acima descrito. Remoção de Líquidos

[0060] Em outra modalidade, o líquido pode ser removido após a remoção de resíduos sólidos utilizando métodos conhecidos na técnica, com a condição de não seguir a descoloração e/ou a desodoriza- ção por tratamento com peróxido. Estes incluem, mas não são limita- dos ao calor, evaporação, secagem por congelamento (liofilização), secagem de tambor.

DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES ESPECÍFICAS Exemplo 1: Um processo para recuperar uma solução rica em rham- nolipídeo (RL) (caldo clarificado) a partir do caldo de fermentação sem o uso de solvente orgânico

[0061] É aqui fornecido um processo para recuperar ramnolipídeos do caldo de fermentação em uma solução diluída contendo pelo menos 50 g/L de uma mistura de di e monorramnolipídeos sem o uso de solventes orgânicos. O esquema geral que é utilizado é representado na Figura 1.

[0062] O processo utiliza amadurecimento na temperatura ambiente, seguido de autoclave e técnicas padrão de separação sólido/líquido para separar a solução rica em ramnolipídeo clarificada contendo pelo menos 50 g/L de matéria celular bacteriana. Em particular, o caldo contendo ramnolipídeo é gerado a partir da fermentação por Pseudomonas aeruginosa em pH 6,2 a 6,5 a 37 °C durante 48 a 72 horas com óleo de soja como a matéria-prima. O pH final do caldo de fermentação antes do amadurecimento está na faixa de 6,4 a 6,5. Após o amadurecimento durante ~48 horas na temperatura ambiente, o caldo de fermentação é esterilizado através do aquecimento a vapor ou de au-toclave. Após a separação de sólido/líquido, a solução de ramnolipídeo é purificada e pronta para ser usada. A cor castanha escura da solução de ramnolipídeo pode ser reduzida com a adição de peróxido de hidrogênio em 2 a 3 % v/v durante 72 a 96 horas na temperatura ambiente. Outros peróxidos também podem ser utilizados nesta etapa, incluindo peróxido orgânico (por exemplo, peróxido de benzoíla ou ácido peroxiacético) ou inorgânico (por exemplo, peróxido de lítio, pe- róxido de sódio, peróxido de bário). Uma solução rica em ramnolipídeo (> 5 % ativa) é obtida.

[0063] A solução rica em ramnolipídeo clarificada, se não tratada com peróxido, também pode ser liofilizada para produzir um pó ligeiramente colorido. Um pó rico em ramnolipídeo (> 75 % ativo) é obtido. Exemplo 2: Isolamento de uma solução aquosa de ramnolipídeos através da precipitação do caldo de fermentação clarificado e re- dissolução na base e na composição que resulta do processo

[0064] O processo atual começa com o caldo clarificado obtido no Exemplo 1 e é representado esquematicamente na Figura 2. Conforme descrito no Exemplo 1, o caldo clarificado é produzido por deixar o caldo de fermentação que termine em um pH entre 6,0 a 6,5 para amadurecer sob condições ambientais durante aproximadamente 2 dias. A biomassa se sedimenta no fundo do recipiente utilizado para este processo de amadurecimento e o sobrenadante transparente, após a remoção, é o caldo clarificado. A próxima etapa no processo é adicionar ácido, tal como ácido sulfúrico concentrado, até que o pH esteja ao redor de 2,1. Os ramnolipídeos precipitam da solução e formam uma fase sólida e uma fase líquida oleosa no fundo do recipiente utilizado para esta etapa. A separação das fases sólidas e líquidas oleosas pode ser acelerada por centrifugação. As fases sólidas e líquidas oleosas são separadas da fase ou camada superior aquosa, que podem ser descartadas ou recicladas. As fases sólidas e líquidas oleosas combinadas contendo ramnolipídeo são então tratadas com uma base sólida, tal como hidróxido de sódio, até que o pH alcance cerca de 7,0. Isto produz uma solução viscosa de ramnolipídeos em água com uma concentração ao redor de 25 a 30 %. A etapa final é centrifugar a solução de ramnolipídeo em 25 a 30 % e decantar o produto final líquido para longe do grânulo formado a partir de quaisquer sólidos remanescentes. Este líquido pode ser liofilizado (secado por congelamento) para produzir um produto sólido seco.

Exemplo 3: Processo concentrado de solvente não orgânico para pro- duzir uma solução de rhamnolipídeo em 35 a 40 % utilizando uma alteração de pH

[0065] É fornecido um processo para a produção de solução de ramnolipídeo em 30 a 40 % utilizando uma alteração de pH começando com "caldo clarificado de cor e odor reduzidos" como descrito no Exemplo 1 ou "caldo de fermentação esterilizado de cor e odor reduzidos", e é representado esquematicamente nas Figuras 3 e 4.

[0066] O "caldo clarificado de cor e odor reduzidos" e o "caldo de fermentação esterilizado de cor e odor reduzidos" podem ser obtidos através da adição de 3 a 5 % v/v de peróxido de hidrogênio ao caldo clarificado ou ao caldo de fermentação esterilizado, respectivamente. Após 72 a 96 horas na temperatura ambiente, a cor da solução rica em ramnolipídeo clarificada é ligeiramente amarela sem perda de ramnoli- pídeos e o odor é reduzido. Depois disso, o caldo clarificado de cor e odor reduzidos é filtrado em 1 mícron através da filtração de fluxo cruzado ou os sólidos são removidos através da centrifugação seguido de decantação. O ácido concentrado tal como ácido sulfúrico é adicionado ao filtrado (permeado) ou ao sobrenadante até que o pH seja ao redor de 2,1. A mistura é então deixada separar em uma camada rica em ramnolipídeo preparada de uma fase sólida e de uma fase líquida oleosa no fundo do recipiente. As fases sólidas e líquidas oleosas combinadas contendo ramnolipídeo são então separadas da camada superior aquosa e tratadas com uma base sólida, tal como hidróxido de sódio, até que o pH alcance cerca de 7,0. Isso produz uma solução viscosa de ramnolipídeos em água.

[0067] A etapa final é centrifugar a solução de ramnolipídeo resultante e remover o produto final líquido do grânulo formado a partir de quaisquer sólidos remanescentes. O produto líquido final é de 30 a 40 % de ramnolipídeos. Exemplo 4: Processo para isolar os ramnolipídeos do caldo de fermen- tação com esterilização no final do processo e materiais produzidos durante o processo

[0068] O processo, esquematicamente representado na Figura 5, começa pela ação de um processo de separação sólido/líquido tal como centrifugação ou filtração do caldo de fermentação que ainda contém um organismo vivo que produz ramnolipídeos. O produto líquido clarificado é então acidificado para pH 2,1 utilizando ácido sulfúrico concentrado ou outro ácido mineral forte concentrado. Após a sedimentação ou a centrifugação, a camada de água é decantada do produto mais denso, que é uma camada oleosa e uma camada sólida. Esta camada oleosa e/ou sólida é neutralizada para o pH 7 com uma base sólida tal como hidróxido de sódio, resultando em uma solução. Uma etapa final de separação sólido/líquido é realizada para remover quaisquer impurezas não dissolvidas remanescentes. O líquido é então esterilizado, por exemplo, em autoclave.

Exemplo 5: Processo concentrado de solvente não orgânico para produzir solução de ramnolipídeo em 50 a 60% utilizando uma alteração de pH

[0069] É fornecido uma modificação do processo divulgado no Exemplo 3, "Processo concentrado com solvente não orgânico para produzir solução de ramnolipídeo em 30 a 40 % utilizando uma alteração de pH", para produzir uma solução de ramnolipídeo em 50 a 60 %.

[0070] Uma preparação de caldo clarificado e a precipitação de ácido do caldo clarificado com ácido sulfúrico concentrado (95 a 98 % em peso) para pH 2,1 permanecem iguais como divulgado no Exemplo 3. Após a adição de 95 a 98 % em peso de ácido sulfúrico ao caldo clarificado até que o pH esteja em 2,1, a mistura é então deixada separar em uma camada rica em ramnolipídeo constituída de uma fase sólida e uma fase líquida oleosa no fundo do recipiente. No entanto, para obter a solução de ramnolipídeo em 50 a 60 %, o material oleoso e o sólido são separados utilizando, por exemplo, a centrifugação. Após a centrifugação, o sólido é obtido no fundo e o material oleoso está no meio, enquanto que a camada superior aquosa está na parte de cima do recipiente. Os sólidos são então separados das fases líquidas oleosas contendo ramnolipídeo e são tratados com uma base sólida, tal como hidróxido de sódio até que o pH alcance cerca de 7,0 no qual o produto se liquefaz.

[0071] A etapa final é centrifugar a solução de ramnolipídeo resultante e remover o produto final líquido do grânulo formado a partir de quaisquer sólidos remanescentes. O produto líquido final é de 50 a 60 % de ramnolipídeos e faz parte da invenção. Este líquido pode ser liofi- lizado (secado por congelamento) para produzir um produto sólido seco, que também faz parte da invenção.

Exemplo 6: Processo para isolar o ramnolipídeo do caldo de fermentação antes da esterilização para obter alta concentração de ramnolipí- deo sem extração de solvente

[0072] Este processo é uma modificação do processo descrito no Exemplo 5: "Processo concentrado de solvente não orgânico para produzir solução de ramnolipídeo em 50 a 60 % utilizando uma alteração de pH" para produzir uma solução de ramnolipídeo em 50 a 60 %, mas com um rendimento mais elevado, visto que inclui a camada oleosa obtida após a precipitação de ácido e assim, aumentando a recuperação de ramnolipídeos.

[0073] O processo é representado na Figura 6. Começa com o caldo de fermentação que contém ramnolipídeos e biomassa de células que produziram os ramnolipídeos, preferencialmente Pseudomonas aeruginosa. Em primeiro lugar, a centrifugação é executada em pelo menos 7500 g durante pelo menos 5 min. Um caldo clarificado (CB) é então separado das células microbianas (sólido) e é esterilizado por meio de autoclave em vapor. O CB é então deixado sedimentar, de preferência durante a noite, antes de ser centrifugado ou filtrado para remover quaisquer sólidos adicionais que precipitaram durante a sedimentação.

[0074] Este CB ainda clarificado é então acidificado para pH 2,1 utilizando ácido sulfúrico concentrado, ou outro ácido mineral forte concentrado. O caldo clarificado acidificado é parte da invenção. Após a sedimentação ou centrifugação, a camada aquosa é decantada para fora de uma camada sólida. O sólido é então tratado com uma base sólida, tal como hidróxido de sódio, até que o pH alcance cerca de 7,0. O resultado é um líquido com 50 a 60 % de ramnolipídeos. Este líquido pode ser liofilizado (secado por congelamento) para produzir um produto sólido seco.

[0075] Através da centrifugação imediatamente após a fermentação ser interrompida, e depois amadurecimento do produto como descrito no Exemplo 1, um Caldo Clarificado (CB) é produzido o qual pode ser processado mais adiante. Isso resolve o problema de que a separação de sólido / líquido do caldo de fermentação pode ser difícil.

[0076] O processo global produz um produto que é uma alta concentração de biotensoativo de ramnolipídeo de custo eficaz com uma taxa de recuperação dos ramnolipídeos no caldo de fermentação original ao redor de > 80 %. Isso resolve o problema de que é percebido que isolar produtos a partir de fermentações de ramnolipídeo é muito oneroso para ser comercialmente viável.

Claims

1. Processo livre de solvente orgânico para a obtenção de uma composição compreendendo um ou mais ramnolipídeos (RLs), caracterizado pelo fato de que a composição compreendendo ramnolipí- deos é um caldo clarificado concentrado compreendendo pelo menos cerca de 30% de ramnolipídeos em peso, dito processo compreendendo: (a) fornecer um meio aquoso compreendendo pelo menos um ramnolipídeo; (b) remover os resíduos sólidos do referido meio fornecido na etapa (a); (c) tratar o meio obtido em (b) com ácido para obter um meio acídico, em que dito meio acídico compreende uma fase sólida, líquida e oleosa; (d) remover pelo menos a fase líquida aquosa obtida na etapa (c); (e) neutralizar a fase sólida e opcionalmente a fase oleosa obtidas na etapa (c) para produzir uma solução neutra; e (f) remover o material de resíduos insolúvel da dita solução neutralizada da etapa (e) para obter a referida composição.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito método ainda compreende uma etapa de esterilização antes e/ou depois dito meio ser tratado com ácido na etapa (c), e opcionalmente uma etapa de separação adicional para remover os resíduos insolúveis da referida solução antes e/ou depois dita etapa de esterilização.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que ainda compreende, após a esterilização, descolorar e/ou desodorizar o referido caldo clarificado concentrado esterilizado.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende remover água da dita solução obtida na etapa (f).

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que ditas fases sólidas e oleosas são neutralizadas separadamente para obter soluções separadas.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que ditas fases sólidas e oleosas são combinadas e as referidas fases sólidas e oleosas combinadas são neu-tralizadas para se obter uma solução neutralizada.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que dito processo adicionalmente compreende antes e/ou após dita etapa de esterilização amadurecer o referido meio fornecido.

8. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma solução neutralizada obtida pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um caldo clarificado concentrado descolorido e/ou desodorizado obtido pelo processo como definido na reivindicação 3.

10. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o meio amadurecido obtido pelo processo como definido na reivindicação 7.