CN107406867B

CN107406867B - 鼠李糖脂组合物的制备

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Publication number: CN107406867B
Application number: CN201680014963.4A
Authority: CN
Inventors: N·洛希塔恩; D·德尔
Original assignee: Stepan Co
Current assignee: Stepan Co
Priority date: 2015-01-12
Filing date: 2016-01-11
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2036-01-11
Also published as: BR112017014710B1; US20160272667A1; AU2016207008B2; HK1247249A1; AU2016207008A1; JP6866301B2; JP2018504140A; MX2017009126A; KR20170102903A; JP7074899B2; KR102557083B1; CN113368777A; CA2973183A1; JP2021098700A; CA2973183C; EP3245293A1; EP3245293A4; CN107406867A; BR112017014710A2; CN113368777B

Abstract

提供了用于获得包含一或多种鼠李糖脂的组合物的无有机溶剂的方法，以及可以从所述方法获得的组合物。

Description

鼠李糖脂组合物的制备

技术领域

提供了用于获得包含鼠李糖脂的组合物的无有机溶剂的工艺，以及所述组合物。

发明背景

鼠李糖脂(RL)是由各种细菌物种所产生的界面活性糖脂。RL由一个(单鼠李糖基脂质或单鼠李糖脂)或两个鼠李糖单元(二鼠李糖基脂质或二鼠李糖脂)以及一个或两个(主要是两个)3-羟基脂肪酸残基所组成。鼠李糖脂具有特定的表面活性性质(例如强发泡能力)，并且由于高度多样化的技术应用(特别是作为表面活性剂)而引起兴趣(在下列文献中综述：Randhawa等人(2014)“Rhamnolipid biosurfactants—past,present,and futurescenario of global market”,Frontiers in Microbiology 5:1-7；Muller等人(2012)“Rhamnolipids—Next generation surfactants？”,J Biotechnol 162(4):366-80；Banat等人(2010)“Microbial biosurfactants production,applications and futurepotential”Appl Microbiol Biotechnol 87:427-444)。潜在应用的实例包括：(1)生物修复和提高油回收(EOR)，因为它们由于其乳化性质而从污染的土壤中有效去除原油和重金属并促进油泄露的生物修复；(2)化妆品：包括药用化妆品(例如用于伤口愈合、烧伤、牛皮癣和皱纹)；(3)洗涤剂和清洁剂：特别是用于洗衣用品、洗发水和肥皂(由于其表面活性和乳化性质)；以及(4)农业。鼠李糖脂目前可用于以ZONIX^TM(Proptera LLC)上市的农业抗真菌产品。

对于RL的兴趣增加，因为它们可以通过基于发酵可再生原料的方法来制备。然而，仅有少量鼠李糖脂在市场上销售且价格高，这部分是由于冗长的下游加工方法。已经描述了用于制备鼠李糖脂的多种方法(在例如下列文献中综述：Heyd等人(2008)“Developmentand trends of biosurfactant analysis and purification using rhamnolipids asan example”,Anal Bioanal Chem 391:1579–1590和Smyth等人(2010)“Isolation andAnalysis of Low Molecular Weight Microbial Glycolipids”,in Handbook ofHydrocarbon and Lipid Microbiology,K.N.Timmis(ed.),Springer-Verlag,Berlin,pp.3705-3724；Desai等人(1997)“Microbial Production of Surfactants and TheirCommercial Potential”,Microbiol.Mol.Biol.Rev.61：47–64以及还在例如以下中有公开：US 5656747,US4628030,US20140148588,CN102796781,CN102766172,CN101787057,CN101845468,CN102432643,CN1908180,KR1020060018783)。

目前，对鼠李糖脂最常见的分离程序涉及：在发酵完成后立刻对发酵液进行高压灭菌，随后进行酸化将鼠李糖脂沉淀出来。如此获得的固体鼠李糖脂具有来自用于发酵的生物体的固体细胞材料的污染。通过将RL萃取至有机溶剂(如乙酸乙酯)而将其从这些细胞固体中分离。在除去乙酸乙酯之后，得到了浓缩的油状形式的产物。然而，溶剂萃取工艺带来了少许疏水性杂质，可能会包括未耗尽的三酰基甘油酯油和来自发酵工艺的消泡剂。其它已公开的方法的实例包括：(1)发酵液的硫酸铝沉淀，随后用有机溶剂萃取；(2)连续性超滤；(3)柱层析(参见例如：Lebrón-Paler A(2008)“Solution and interfacialcharacterization of rhamnolipid biosurfactant from P.aeruginosa ATCC 9027”PhDDissertation University of Arizona,CN101787057,CN101407831,CN1908180)，其中使用吸附、离子交换、反相或正相柱，其可以与沉淀步骤组合进行；(4)逆流层析(Zhang等人“Separation and purification of six biosurfactant rhamnolipids by high-speedcountercurrent chromatography utilizing novel solvent selection method”,Separation Science and Technology,in press(posted Nov.24,2015))；(5)选择性结晶随后萃取；或(6)泡沫分馏/吸附(参见例如：US 2015/0011741；Sarachat等人,(2010)“Purification and concentration of a rhamnolipid biosurfactant produced byPseudomonas aeruginosa SP4using foam fractionation”,Bioresource Technology101:324-330)。然而，所有这些方法也都具有各种缺陷(例如昂贵、规模化不佳(do notscale well)、资源密集型等)。

发明概述

提供了用于获得包含鼠李糖脂的组合物的无有机溶剂的工艺，该工艺包括：

(a)提供包含至少一种鼠李糖脂(RL)的水性(aqueous)介质；

(b)对于(a)中提供的所述介质进行非基于过滤的除菌；

(c)将(b)中的所述经除菌的介质中的含有RL的相与废物分离，以获得所述组合物。

使用上文所示方法的最终产物来自天然工艺，未经化学修饰，且并未与任何基于石油的有机溶解接触。上文所示的工艺或方法排除了使用石油衍生的化学溶剂来从水性介质(例如发酵介质或发酵液)提取鼠李糖脂，因而，其显著降低了生产成本。另外，最终的鼠李糖脂溶液是自然来源的。

在特定的实施方案中，包含鼠李糖脂的组合物是包含至少约5％、6％、7％、8％、9％或10％重量的鼠李糖脂的澄清液，其中所述方法在步骤(a)之后步骤(b)之前还包括：(1)将步骤(a)中提供的所述介质陈化以获得经陈化的和经除菌的介质。还提供了组合物，其包含能够从上文所示的工艺获得的所述经陈化的且经除菌的介质。所述方法还可以包括在步骤(a)之后且在步骤(b)之前从步骤(a)中提供的所述介质中去除固体废物。在上述具体实施方案中的组合物可包含介于约5％至约10％之间的RL。

在另一实施方案中，所述方法还可以包括在除菌步骤(b)之后且在分离步骤(c)之前将步骤(a)的所述除菌的介质陈化。在另一实施方案中，在步骤(a)之后且在(1)中在所述介质陈化之前，可以从所提供的介质中去除固体废物。

在另一实施方案中，所述方法包括两个陈化步骤并且可以包括以下步骤：

(a)提供包含至少一种鼠李糖脂的水性介质(例如，发酵介质)；

(b)将所提供的所述水性介质(例如，发酵介质)陈化；

(c)对(b)中提供的所述介质进行非基于过滤的除菌；

(d)将(c)中所述经除菌的介质陈化；和

(e)将(d)中所述经陈化的且经除菌的介质中的含RL的液相与废物分离，以获得所述组合物。

在另一实施方案中，包含鼠李糖脂的组合物可以是澄清液，其包含至少约5％、6％、7％、8％、9％或10％重量的鼠李糖脂。在特定的实施方案中，用于获得包含RL的组合物(特别是澄清液)的方法，可以包括在步骤(b)之前将步骤(a)提供的所述介质陈化；继而随后是(b)将所述经陈化的介质经化学处理(特别是经过氧化物处理，例如，过氧化氢，和有机过氧化物如过氧化苯甲酰和过氧乙酸，以及无机过氧化物如过氧化锂、过氧化钠、过氧化钡)和/或经紫外光辐射处理除菌；(c)将所述经除菌的介质中的含RL的相与固体废物分离，以及任选还包括(c)(1)另外将所述含RL的相除菌和(c)(2)将所述经除菌的含RL的相中的含RL的相与固体废物分离以获得所述澄清液。在特定的实施方案中，步骤(b)中的所述除菌步骤经化学处理和/或紫外辐射处理进行，并且步骤(c)(2)中的除菌步骤经过加热进行。

还提供了在将所述陈化的介质除菌后能够获得的组合物。还提供了使用上文所示步骤(b)和/或(c)(1)能够获得的经除菌的组合物。

上文所示的方法还可以包括脱色和/或除臭步骤。所述脱色和/或除臭处理可以在除菌步骤之前和/或之后进行。还提供了组合物，其包含使用上文所示的方法能够获得的经脱色和/或经除臭的介质。

在另一实施方案中，在步骤(c)之后，可以从经分离的含RL的相去除流体或液体，以获得固体组合物，例如通过蒸发。在特定的实施方案中，所述组合物例如是粉末形式或颗粒形式。

在另一实施方案中，所述包含鼠李糖脂的组合物是浓缩的澄清液，其包含至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％或至少约60％重量的鼠李糖脂。在更特定的实施方案中，所述浓缩的澄清液可以包含重量约30-60％的RL、重量约30-40％的RL或重量约50-60％的RL。

在特定的实施方案中，上文所述方法的步骤(a)中提供的所述介质，在步骤(b)中通过使用酸处理所述介质来进行除菌，并且所获得的所述酸性介质包含固相、液相和油相，且至少将所述液相去除，以及在步骤(c)之前中和固相和，任选地，中和油相以获得溶液，并且在步骤步骤(c)中从所述溶液去除不可溶废物材料以获得包含上文所示的所述浓缩澄清液的所述组合物。因而用于获得浓缩澄清液的方法可包括：

(a)提供包含鼠李糖脂(RL)的水性介质(例如，发酵介质)；

(b)经酸处理来将(a)中提供的所述发酵介质或培养介质除菌，以获得酸化的液相、油相和固相；

(c)去除(b)中获得的所述液相，并用碱来处理所述固相和，任选地，处理油相以获得中和的溶液；

(d)从(c)中获得的所述溶液去除不可溶材料以获得包含浓缩的澄清液的组合物，所述浓缩的澄清液包含一或多种鼠李糖脂。

在另一实施方案中，用于获得包含浓缩的澄清液的组合物的方法，还可以包括另外的除菌步骤和，任选地，另外的分离步骤，以从所述溶液去除不可溶废物。另外，所述方法还可以包括，在除菌之后将所述经除菌的浓缩的澄清液脱色和/或除臭。所述方法还可以包括通过蒸发从步骤(c)中获得的所述溶液去除液体或流体，以获得固体组合物。可以用酸处理所述介质，并继而在所述另外的除菌步骤之前或之后进行中和。

在上文所述的方法中，所述固相和油相可以分开进行中和以获得分离的溶液。或者，可以将所述固相和油相组合并将所述组合的固相和油相中和以获得中和的溶液。另外，在另一实施方案中，仅有固相经中和。

上文所示的方法还可以包括将所述组合物脱色和/或除臭。另外，所述组合物可以经干燥。

在另一实施方案中，用于获得包含鼠李糖脂的组合物(其是包含至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、或至少约60％重量的鼠李糖脂的浓缩澄清液)的方法，还可以包括在所述另外的除菌步骤之前和/或之后将所提供的介质陈化。

具体而言，所述方法包括：

(a)提供包含一或多种鼠李糖脂的水性(例如，发酵)介质；

(b)任选从所提供的所述介质去除不可溶废物；

(c)将所提供的所述介质除菌；

(d)将(c)的所述经除菌的介质陈化；

(e)从所述经陈化的且经除菌的介质去除废物；

(f)用酸处理(e)中所获得的介质，其中所获得的所述酸性介质包含固相、液相和油相，并且至少将所述液相去除，以及中和所述固相和，任选地，中和油相以获得中和的溶液；

(g)从(f)的所述经中和的溶液去除固体废物，以获得包含所述浓缩澄清液的所述组合物。

还提供了组合物，其包含能够根据上文所示的方法获得的中和的溶液。还提供了经脱色和/或经除臭的组合物，其包含至少约30％重量的RL(使用或可得自上文所示的方法)。

所获得的组合物可以在以下用途中用作表面活性剂：肥皂、沐浴露、洁面乳、牙膏、洗发水、护发素、护发洗发水、化妆品、洗洁精、洗衣清洁剂、洗衣预处理喷雾剂、硬表面清洁剂、多孔表面清洁剂、地板清洁剂、汽车清洁剂、提高原油回收、创伤敷料、农业抗菌剂、抗腐蚀处理、生物修复、防粘连膜、抗生物淤积应用、灭火介质、抗病毒剂、抗霉菌剂和抗游动孢子剂。在一个实施方案中，使用上文所示方法获得的含有较高量的(>30％wt/vol)或更特别是大约(>50％wt/vol)的RL的组合物，可用于制备基于鼠李糖脂的产品，该产品可以在个人护理和家庭清洁剂市场中取代阴离子表面活性剂如十二烷基硫酸钠(SLS)，因为某些阴离子表面活性剂对于一些应用经常会以大约30％的浓度销售。

附图简述

图1示意性地显示了用于获得富含鼠李糖脂的澄清液(CB)的无有机溶剂方法。

图2示意性地显示了通过酸/碱处理来浓缩所述CB以获得浓缩的澄清液(CCB)。

图3示意性地显示了从过氧化氢处理的CB获得CCB。

图4示意性地显示了过氧化氢处理的经除菌的发酵介质获得CCB。

图5示意性地显示了通过首先在发酵液上进行分离步骤以及进行工艺中随后的除菌步骤，来获得CCB。

图6示意性地显示了用于通过进行分离、除菌、陈化和酸化步骤来获得CCB的方法。

定义

当提供值的范围时，应理解为该范围上限和下限之间的每个居间值(至下限的单位的十分之一，除非上下文另有明示)、以及该所述范围中任何其它提及的或居间的值，都涵盖在本发明的范围内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围内并且也涵盖在本发明的范围内，服从在该所述范围内任何明确排除的边界值。当所述范围包括一个或两个边界值时，排除任何一个或两个那些包括在内的边界值的范围也包括在本发明之内。

除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域技术人员通常所理解的相同含义。虽然与本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试，但现将对优选的方法和材料进行描述。

本公开中所引用的所有出版物和专利都以其整体援引加入本文。本文中没有内容应理解为是承认本发明由于现有技术而不早于这些公开。若援引加入的材料与本说明书有冲突或不一致，则本说明书将替代任何此类材料。

必须要注意的是，如本文中以及在所附的权利要求中所用，单数形式的“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数形式，除非上下文另有明示。

除非另有指明，在一系列要素之前的术语“至少”应理解为是指此系列中的每个要素。本领域技术人员会认识到、或者使用不超过常规实验就能够确认，本文所描述方法的具体实施方案的许多等同。此类等同是要涵盖在本发明之内的。在遍及本说明书以及随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”、以及其变体如“comprises”和“comprising”，将理解为意指包括所提到的整数或步骤或者整数或步骤的组，但却并不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。因而术语“包含”、“包括”、“含有”、“具有”等应当扩展性地或开放式地进行解读而并不加以限制。当用于本文时，术语“包含”可以用术语“含有”替代，或者有时当用于本发明时用术语“具有”来替代。

如本文所定义，“鼠李糖脂”是指具有脂质部分和一或多个鼠李糖单元的糖部分的糖脂，所述脂质部分包括一个或多个、通常线性的、饱和或不饱和的β-羟基羧酸部分。

所述糖部分和脂质部分经糖部分中鼠李糖部分的1-OH基团与脂质部分中β-羟基羧酸的3-OH基团之间的β-糖苷键连接。因而一个羧酸部分的羧基基团定义鼠李糖脂的末端。当鼠李糖脂中包括超过一个鼠李糖部分时，未连接至脂质部分的每个鼠李糖部分经1,4β-糖苷键而连接至另一个鼠李糖。在鼠李糖脂中存在两个或更多个β-羟基羧酸的实施方案中，β-羟基羧酸部分彼此独立进行选择。在一些实施方案中，各自的多个β-羟基羧酸部分中的β-羟基羧酸部分可以是相同的。在一些实施方案中，它们彼此不同。

如本文所定义，术语“水性介质”是在水中包含至少约5％重量的鼠李糖脂或鼠李糖脂的盐的组合物。在特定的实施方案中，其包含能够在本领域已知的发酵条件下从至少一种碳源产生一或多种鼠李糖脂的发酵的产物。

术语“发酵液”和“发酵介质”是同义词并且可互换使用。

发明详述

本文提供了用于获得包含一或多种鼠李糖脂的组合物的无有机溶剂的方法。在特定的实施方案中，所述鼠李糖脂可以具有结构(I)：

在此式中，R⁹是氢原子(H)或具有1至约46个碳原子(如1至约42个碳原子、1至约40个碳原子、1至约38个碳原子、1至约36个碳原子、1至约34个碳原子、1至约30个碳原子、1至约28个碳原子，包括例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳原子)以及1至约3个(包括2个)氧原子的主链的脂肪族基团。在一些实施方案中，各脂肪族基团的主链携带有末端羧酸基团和/或内部酯基团。作为就此而言的说明性实例，R⁹可以是式-CH(R⁵)-CH₂-COOR⁶。在这些说明性的部分中，R⁵可以是脂肪族部分，其主链长度1至约19个碳原子，如1至约17个碳原子、1至约15个碳原子、1至约13个碳原子、约2至约13个碳原子、约3至约13个碳原子、或约4至约13个碳原子，包括例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12个碳原子。式(I)中的R⁴是氢原子(H)或者吡喃鼠李糖基部分。R⁶是氢原子。

除非另有明示，术语“脂肪族”是指直链的或分枝的烃链，其可以是饱和的或单不饱和或多不饱和的，并且包括杂原子。术语“杂原子”如本文所用是指碳或氢之外任何元素的原子。在本文中，不饱和的脂肪族基团含有一个或多个双键(烯烃基部分)。烃链的分支可以包括线性链以及非芳香族环状元件。除非另有明示，烃链可以是任何长度，并且含有任意数目的分支。通常，烃链(主链)包括1至约5个、至约10个、至约15个或至约20个碳原子。烯烃基部分的实例有含有一或多个双键的直链的或分支的烃部分。烯烃基部分一般含有约2个至约20个碳原子以及一个或多个(例如2个)双键，如约2个至约10个碳原子和1个双键。烃基基团的实例有甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基，这些自由基的n异构体异丙基、异丁基、异戊基、仲丁基、叔丁基、新戊基、3,3-二甲基丁基。主链以及分支都可以还含有杂原子，例如N、O、S、Se或Si，或者碳原子可以由这些杂原子所取代。脂肪烃部分可以是由一个或多个官能团取代的或者未取代的。取代基可以是任何官能团，例如但不限于氨基、酰氨基、羰基、羧基、羟基、硝基、硫代(thio)和磺酰基。

在更具体的实施方案中，所述结构中的鼠李糖脂或鼠李糖脂盐具有结构(II)：

其中x是1或2，y是4、6或8并且M是H或金属如碱金属Li、Na、或K，碱土金属Mg或Ca，或者过渡金属Mn、Fe、Cu或Zn。在碱土金属和过渡金属的情形中，多个鼠李糖脂盐部分可以与每个金属相关联。在具体的实施方案中，所述组合物包含单鼠李糖脂(其中x＝1)和二鼠李糖脂(其中x＝2)的混合物，其中y和z是6而M是H或Na。所述单鼠李糖脂可以命名为Rha-C10-C10，且具有式C₂₆H₄₈O₉。IUPAC名称为3-[3-[(2R,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-三羟基-6-甲基氧杂环己-2-基]氧基癸酰氧基]癸酸。所述二鼠李糖脂可以是指RhaRha-C10-C10，且具有式C₃₂H₅₈O₁₃。IUPAC名称为3-[3-[4,5-二羟基-6-甲基-3-(3,4,5-三羟基-6-甲基氧杂环己-2-基)氧基氧杂环己-2-基]氧基癸酰氧基]癸酸。在更具体的实施方案中，单鼠李糖脂可以大约30％的总鼠李糖脂至大约50％的总鼠李糖脂的量存在，而二鼠李糖脂可以大约50％的总鼠李糖脂的量至二鼠李糖脂为大约70％的量存在。所述组合物在另一实施方案中包含单鼠李糖脂和二鼠李糖脂，其中单鼠李糖脂:二鼠李糖脂的比例为从约35:65至约55:45。

在最具体的实施方案中，所述组合物包含表1中所列化合物。

表1

如上文所示，所述方法包括：(a)提供包含至少一种鼠李糖脂的水性介质(RL)；(b)对(a)中提供的所述介质进行非机械除菌；和(c)将(b)的经除菌介质中的含RL的相与废物分离以获得所述组合物。另外，在具体的实施方案中，也可以使用陈化、酸化、中和、干燥、脱色和/或除臭步骤。

介质来源

所提供的包含一或多种鼠李糖脂的水性介质可以得自发酵液，所述发酵液来源于产鼠李糖脂的重组宿主细胞(特别是所述重组细胞使用现有技术中已知的方法的结果)或者是来源于产鼠李糖脂的微生物的结果。产鼠李糖脂重组宿主细胞可以是表达RhlA基因或其直系同源物，和/或RhlB基因或其直系同源物，和/或RhlC基因或其直系同源物，和/或RhlR基因或其直系同源物，和/或RhlI基因或其直系同源物，和/或RhlG基因或其直系同源物以及其它的宿主细胞(如细菌细胞)。

如本文所用，术语“产鼠李糖脂的微生物”是指具有在适宜条件下合成/产生鼠李糖脂的能力任何微生物(如细菌)，其包括但不限于放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Fimicutes)和变形菌门(Proteobacteria)的细菌。在特定的实施方案中，产鼠李糖脂的微生物是γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)的细菌。在另外的实施方案中，产鼠李糖脂的微生物是假单胞菌目(Pseudomonadales)的细菌。在另外的实施方案中，产鼠李糖脂微生物是假单胞菌科(Pseudomonadacae)的细菌。在另外的实施方案中，产鼠李糖脂微生物是假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌，如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)、绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)、绿针假单胞菌(P.chlororaphis)、P.clemancea、P.collierea、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、浅黄假单胞菌(P.luteola)、恶臭假单胞菌(P.putida)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)、和P.teessidea。在另外的实施方案中，产鼠李糖脂微生物是绿脓假单胞菌。

所述宿主细胞在允许产RL的条件下进行培养。可以使用许多碳源如单糖(例如葡萄糖)、二糖(例如蔗糖)、醇(例如甘油)、烷(例如，正十六烷)、脂肪酸(如辛酸(caprylicacid)(也称作辛酸(octanoate))、植物油(新鲜的或者废植物油；例如，大豆油)或其混合物、有机酸(例如乳酸、乙酸、柠檬酸、丙酸)、醇(例如乙醇、甘油)，以及这些的混合物；氮源如硫酸铵、磷酸铵、尿素、酵母提取物、肉类提取物、蛋白胨和玉米浆；以及其它营养物来源如矿物质盐和维生素。细菌宿主细胞通常会用于发酵工艺。例如，细菌宿主细胞可以处于指数生长期或者处于静止期。

除菌

所提供的水性(例如，发酵)介质经除菌。具体而言，上文所示的方法中的介质可以使用本领域已知的方法通过非过滤方法来进行除菌。这些方法可以是基于加热的、基于化学品的或基于紫外光辐射的。在特定的实施方案中，基于加热的处理可以通过湿热除菌，特别是高压灭菌进行。

或者，所述发酵介质可以经化学处理。在一个特定的实施方案中，所述化学处理可以通过使用下文所示过程酸化、去除固体废物以及中和来进行。

在另一特定实施方案中，所述水性(例如发酵)介质可以用过氧化物使用本领域中已知的以及在下文中所示的方法进行处理，所述过氧化物如过氧化氢、过氧化锂、过氧化钠、过氧化钡、过氧乙酸、过氧化苯甲酰，特别是过氧化氢。

在另一实施方案中，水性介质可以用例如紫外观照射来进行照射。

在一个实施方案中，水性介质(例如，发酵介质或发酵液)可以通过上述过程之一来进行除菌。在另一实施方案中，发酵介质可以通过超过一个上文所示过程来进行除菌，并且这些除菌可以是任何顺序。

分离/去除固体产物(固/液(S/L)分离)

来自使用本文所示介质而获得的组合物和/或介质的废物，可以使用本领域已知的分离过程来从所述组合物中去除或分离。这些过程包括但不限于，分批沉淀或连续离心或超离心，随后可以使用本领域已知的过程倾析或过滤。所述废物可以是固相或液相，取决于分离在工艺中的何处发生。

陈化(Aging)

培养或发酵介质可以通过在大约0-30℃之间温育至少约1天以及在约24-72小时之间来进行陈化。此陈化步骤可以在上文所示的一或多个除菌步骤之前和/或之后发生。

酸化/中和

水性(例如发酵)介质可以通过用酸处理，去除液体废物，然后中和剩余的固相和，任选地，中和油相(或层)来进行浓缩或除菌。在特定的实施方案中，水性介质可以用酸进行处理，从而将培养介质的pH调节至约1.5至2.5之间(优选约2.05至约2.15)。所述酸可以是有机酸如乙酸，或无机酸。在优选的实施方案中，所述酸是无机酸，例如HCl、H₂SO₄、HNO₃或H₃ClO₄。结果，生成了液相、油相和固相。使用本领域已知的过程(在具体的实施方案中使用上文所示方法(例如过滤、或离心或沉淀与倾析组合))来去除液相。

中和固相以及，任选地，中和油相至pH大于约5.5，优选约6.5-7.5之间，更优选约6.8-7.1之间。在具体的实施方案中，用固态、干燥的无机碱(例如，NaOH、KOH、LiOH、NaHCO₃)来处理所述固相和，任选地，处理油相。在固相和油相都被中和的情形中，这些相可以组合并进行中和，或者可以分开进行中和。在中和之后，通过上文所示的方法去除固体废物，包括但不限于过滤、沉淀或离心以及倾析。还可以对经中和的材料进行另外的除菌步骤，如上文所示。

脱色/除臭

水性介质(例如，发酵介质或发酵液)可以使用本领域已知的程序来进行脱色和/或除臭。在特定的实施方案中，使用化学和/或紫外或可见光辐射处理。

在具体的实施方案中，所述脱色和/或除臭步骤可以经过氧化物处理来实现，所述处理使用过氧化氢或有机过氧化物(例如，过氧化苯甲酰或过氧乙酸)或无机过氧化物(例如，过氧化锂、过氧化钠、过氧化钡)。在特定的实施方案中，水性介质(例如，发酵介质或发酵液)可以用过氧化物(特别是过氧化氢)以约1-5％v/v的浓度处理大约48-120小时，以及更特别是以约3-4％v/v之间的浓度处理大约72-96小时。

或者，水性介质可以经紫外或可见光辐射(50-550nm、优选400-450nm)来进行脱色和/或除臭。辐射的剂量需要是最少大约100J/g鼠李糖脂、优选至少大约1kJ/g、更优选至少大约10kJ/g。

此水性介质可以在除菌之前和/或之后，以及在上文所述的酸化和中和工艺之前或之后来进行脱色和/或除臭。

去除液体

在另一实施方案中，在去除固体废物之后可以使用本领域已知的方法来去除液体，前提是不在通过过氧化物处理来脱色和/或除臭之后进行。这些包括但不限于加热、蒸发、冷冻干燥(冻干)、转鼓式干燥。

具体实施方案描述

实施例1：不使用有机溶剂从发酵液回收富含鼠李糖脂(RL)的溶液(澄清液)的工艺

本文提供了不使用有机溶剂，而从发酵液回收鼠李糖脂的工艺，所得到的是含有至少50g/L的二鼠李糖脂和单鼠李糖脂混合物的稀释溶液。所使用的大体方案在图1中示出。

该工艺利用在室温陈化，随后高压灭菌，并以标准的固/液分离技术从细菌细胞物质分离澄清的富含鼠李糖脂的溶液(含有至少50g/L)。具体而言，所述含鼠李糖脂液是由绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)在pH 6.2-6.5于37℃发酵48-72小时产生的(以大豆油作为原料)。陈化之前发酵液的最终pH范围是6.4-6.5。在室温陈化～48小时之后，通过蒸汽加热或高压灭菌来将所述发酵液除菌。在固/液分离之后，鼠李糖脂溶液是清澈的并且准备好待用。所述鼠李糖脂溶液的深褐色颜色可以通过以2-3％v/v添加过氧化氢在室温经72-96小时来减少。在此步骤中也可以使用其它过氧化物，包括有机过氧化物(例如，过氧化苯甲酰或过氧乙酸)或无机过氧化物(例如，过氧化锂、过氧化钠、过氧化钡)。获得了富含鼠李糖脂的溶液(>5％有活性)。

澄清的富含鼠李糖脂的溶液(若未经过氧化物处理)，也可以经冻干以产生浅色的粉末。获得了富含鼠李糖脂的粉末(>75％有活性)。

实施例2：通过从澄清的发酵液沉淀并重新溶解在碱中而分离鼠李糖脂水性溶液以及从该工艺所获得的组合物

用实施例1中获得澄清液来开始本工艺(且在图2中进行示意性图示)。如实施例1中所述，所述澄清液是通过使发酵液(终pH 6.0至6.5)在环境条件(ambient condition)下陈化约2天来制备的。生物质沉淀至用于此陈化工艺的容器底部，并且清澈的上清(在移除后)是澄清液。此工艺中的下个步骤是添加酸，如浓硫酸，直至pH为大约2.1。鼠李糖脂从溶液中沉淀出来，并在用于此步骤的容器底部形成固相和油状液相。所述固相和油状液相的分离可以通过离心来加速。所述固相和油状液相与水性上部相或上层(可以将其丢弃或重复利用)分离。然后用固体碱如氢氧化钠处理含有鼠李糖脂的组合的固相和油状液相，直至pH达到约7.0。这产生了水中的鼠李糖脂粘稠溶液(浓度为大约25-30％)。最终的步骤是将所述25-30％的鼠李糖脂溶液浓缩，并将液体终产物倒离剩余固体所形成的沉淀物。此液体可以经冻干(冷冻干燥)以产生干燥固体产物。

实施例3：使用pH变化来产生35-40％的鼠李糖脂溶液的无有机溶剂的浓缩工艺

提供了用于使用pH变化产生30-40％的鼠李糖脂溶液的工艺，其以实施例1中所述的“颜色和气味减少的澄清液”或者“颜色和气味减少的经除菌发酵液”开始，并且在图3和4中进行示意性的图示。

可以分别通过将3-5％v/v的过氧化氢添加至澄清液或经除菌的发酵液来获得所述“颜色和气味减少的澄清液”和“颜色和气味减少的经除菌发酵液”。在室温72-96小时之后，澄清的富含鼠李糖脂溶液的颜色为淡黄色且没有损失鼠李糖脂，并且气味减少了。这之后，所述颜色和气味减少的澄清液通过错流过滤在1微米进行过滤，或者通过离心随后倾析来将固体去除。将浓酸(如硫酸)添加至过滤物(透过物)或上清直至pH为约2.1。继而使混合物分离为富含鼠李糖脂的层(由容器底部的固相和油状液相构成)。然后将含有鼠李糖脂的组合的固相和油状液与水性上层分离并用固体碱如氢氧化钠进行处理，直至pH达到约7.0。这产生了水中的鼠李糖脂粘稠溶液。

最终步骤是将所得的鼠李糖脂溶液离心，并从任何剩余固体形成的沉淀物移出液体终产物。最终液体产物是30-40％的鼠李糖脂。

实施例4：用于从发酵液分离鼠李糖脂的工艺(在该工艺末尾有除菌)以及该工艺期间所产生的材料

所述工艺(在图5中有示意性图示)，是通过进行固/液分离工艺(如离心或过滤依然含有产鼠李糖脂的活生物体的发酵液)开始的。接着用浓硫酸，或其它浓缩的强无机酸，将澄清的液体产物酸化至pH 2.1。在沉淀或离心之后，将水层从密度更大的产物(其是油状层和固体层)倾倒出去。用固体碱(如氢氧化钠)将此油状和/或固体层中和至pH 7，得到溶液。进行最终的固/液分离步骤，以去除任何剩余的未溶解杂质。接着通过例如高压灭菌来将所述液体除菌。

实施例5：使用pH改变产生50-60％的鼠李糖脂溶液的无有机溶剂工艺

提供了实施例3“使用pH变化来产生30-40％的鼠李糖脂溶液的无有机溶剂的浓缩工艺”中所公开的工艺的修改，以产生50-60％的鼠李糖脂溶液。

澄清液的分离以及用浓硫酸(95-98wt％)将澄清液的酸沉淀至pH 2.1与实施例3中所公开的保持一致。在将95-98wt％的硫酸添加至澄清液直至pH为2.1之后，接着使混合物分离为富含鼠李糖脂的层(由容器底部的固相和油状液相构成)。然而，为了获得50-60％的鼠李糖脂溶液，例如使用离心将油状材料和固体分离。在离心之后，在底部获得固体，且油状材料在中部，而水性上层在容器的上部。接着将固体从含有油状液体鼠李糖脂的相分离，并用固体碱(如氢氧化钠)处理直至pH达到约7.0(在此pH产物液化)。

最终步骤是将所得的鼠李糖脂溶液离心，并从任何剩余固体形成的沉淀物移出液体终产物。最终液体产物是50-60％的鼠李糖脂并且是本发明的一部分。此液体可以经冻干(冷冻干燥)以产生干燥固体产物，其也是本发明的一部分。

实施例6：用于在除菌之前从发酵液分离鼠李糖脂以获得高鼠李糖脂浓度而无溶剂萃取的工艺

此工艺是实施例5：“使用pH改变产生50-60％的鼠李糖脂溶液的无有机溶剂工艺”中所述工艺的修改，以产生50-60％的鼠李糖脂溶液但却有更高的产率，因为其包括了在酸沉淀之后获得的油状层，因而提高了对鼠李糖脂的回收。

该工艺在图6中示出。其是用含有鼠李糖脂的发酵液和来自产鼠李糖脂的细胞(优选绿脓假单胞菌)的生物质来开始的。首先，在至少7500g进行至少5分钟的离心。继而从微生物细胞(固体)分离澄清液(CB)，并且经过蒸汽高压灭菌来将其除菌。接着使CB沉淀，优选沉淀过夜，之后离心或过滤去除在沉淀期间沉淀出来的任何另外的固体。

接着用浓硫酸或其它浓缩的强无机酸将此进一步澄清的CB酸化至pH2.1。该酸化的澄清液是本发明的一部分。在沉淀或离心之后，将水层从固体层倾倒出去。接着用固体碱(氢氧化钠)处理所述固体，直至pH达到约7.0。所得的是具有50-60％的鼠李糖脂的液体。此液体可以经冻干(冷冻干燥)以产生干燥固体产物。

通过在发酵停止之后立即离心并继而陈化实施例1中所述产物，产生了可以进一步加工的澄清液(CB)。这解决了发酵液固/液分离困难的问题。

整个工艺有成本效率地产生了高浓度鼠李糖脂生物表面活性剂的产物，且原始发酵液中鼠李糖脂的回收率约>80％。这解决了认为从鼠李糖脂发酵物中分离产物太昂贵以至于没有商业利益的问题。

Claims

1.用于获得包含一或多种鼠李糖脂(RL)的组合物的无有机溶剂的方法，其中包含鼠李糖脂的所述组合物是包含至少30重量％的鼠李糖脂的浓缩的澄清液，所述方法包括：

(a)提供包含至少一种鼠李糖脂的水性介质；(b)从步骤(a)中提供的所述水性介质去除固体废物；(c)用酸处理步骤(b)中获得的介质以获得酸性介质，其中所述所获得的酸性介质包含固相、水性液相和油相；(d)去除步骤(c)中获得的至少水性液相；(e)中和步骤(c)中获得的固相和，任选地，油相以产生中和的溶液；(f)从步骤(e)的所述中和的溶液去除不可溶废物材料以获得所述组合物。

2.权利要求1的方法，其中在步骤(c)中用酸处理所述介质之前和/或之后，所述方法还包括除菌步骤，以及任选地，在所述除菌步骤之前或之后，所述方法还包括另外的分离步骤以从溶液去除不可溶废物。

3.权利要求2的方法，其进一步包括，在除菌之后将经除菌的浓缩的澄清液脱色和/或除臭。

4.权利要求1-3任一项的方法，其进一步包括从步骤(f)中获得的所述溶液去除水。

5.权利要求1-3任一项的方法，其中所述固相和油相分开进行中和以获得分离的溶液。

6.权利要求1-3任一项的方法，其中将所述固相和油相组合并将所述组合的固相和油相中和以获得中和的溶液。

7.权利要求2的方法，其中所述方法还包括在所述除菌步骤之前和/或之后将所提供的所述介质陈化。

8.组合物，其包含根据权利要求1的方法能够获得的经中和的溶液。

9.组合物，其包含根据权利要求3的方法能够获得的经脱色的和/或除臭的浓缩的澄清液。

10.组合物，其包含根据权利要求7的方法能够获得的经陈化的介质。