CN103146742A - 利用RhlA和RhlB转基因植物修复环境污染的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种根据偏爱密码子优化合成并构建了鼠李糖脂转移酶(RhlA和RhlB)序列植物载体，进行了农杆菌转化植物，转化的拟南芥植物能持续表达鼠李糖脂生物活化剂，并促使植物对烷烃类物质和重金属污染的降解，从而可以为植物修复烷烃类物质和有毒金属污染的环境提供有益的帮助。

Description

利用RhlA和RhlB转基因植物修复环境污染的方法

技术领域

本发明涉及生物修复领域，涉及来自于铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)中的鼠李糖脂转移酶RhlA和RhlB基因序列表达载体的构建，尤其涉及利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)将RhlA和RhlB基因转化到植物中，从而促使植物对烷烃类有机物和有毒金属污染的环境修复能力。 

背景技术

随着工农业的迅速发展和城市人口的剧增，环境污染问题日益突出。污染环境的修复已经成为全球关注的热点问题。在各种各样的环境污染治理技术中，生物修复以其处理费用低、操作简单、处理效果，并且不易造成二次污染等特点而受到越来越多的关注。生物修复至今仅有30多年的研究历史，但是20世纪80年代以后，一些生物修复技术已经开始在污染环境治理中推广应用并取得了良好的效果。近年来，利用微生物、植物修复污染环境的生物修复技术成为研究的热点。 

在利用微生物催化降解有机污染物，从而修复被污染环境的过程中，由于所使用的生物表面活性剂可以直接使用发酵液，能节省表面活性剂的分离提取和产品纯化成本，因此，生物表面活性剂在现场生物修复有机污染场地的应用潜力很大。国外对生物修复的研究大约起始于20世纪80年代初期，至今已有大量成功的工程实例。如Harvey等将铜绿假单胞菌生产的海藻糖脂，加入Exxon Valdez号油轮在阿拉斯加威廉王子海湾造成的原油泄漏污染的海水中，大大提高了原油的降解速度。这也是目前为止规模最大的实际应用中最成功的现场生物修复。而在国内还未见有将生物表面活性剂成功用于环境污染物治理方面的报道。 

许多化学合成表面活性剂由于难降解、有毒及在生态系统中的积累等性质而破坏生态环境，相比之下，生物表面活性剂则由于易生物降解、对生态环境无毒等特性而更适合于环境工程中污染治理。如：在废水处理工艺中可作为浮选捕收剂与带电胶粒相吸以除去有毒金属离子，修复受有机物和重金属污染的场地等。 

生物表面活性剂是微生物在一定条件下培养时，在代谢过程中分泌的具有表面活性的代谢产物。与化学合成表面活性剂相比，生物表面活性剂具有许多独特的属性，如：结构的多样性、生物可降解性、广泛的生物活性及对环境的温和性等。由于化学合成表面活性剂受原材料、价格和产品性能等因素的影响，且在生产和使用过程中常会严重污染环境及危害人类健康。因此，随着人类环保和健康意识的增强，近二十多年来，对生物表面活性剂的研究日益增多，发展很快，国外已就多种生物表面活性剂及其生产工艺申请了专利。 

植物修复技术以其安全、廉价等特点而成为国际环保产业的生长点。未来五年中，国际植物修复市场可以达到20多亿美元。发达国家的植物修复技术已开始进入商业化初期阶段，已有近100家企业开始涉足植物修复技术领域。如美国已有10多项植物修复技术方面的专利，且已经开始进行工程化应用。目前，全国重金属污染的耕地面积达2000万hm2，约占耕地总面积的1/5，导致每年有1000万t粮食的重金属含量超标，而且减产粮食1000万t，两者直接经济损失达200多亿元。此外，我国还有大量工矿区土地和城市土地等非耕地受重金属的污染。这些污染直接影响农产品的卫生品质和地下水、地表水、大气等环境质量，对工农业生产、居民生活和人类健康已造成巨大的危害。尤其是中国加入WTO之后，农产品的重金属超标问题对为我国农业的冲击更大。因此，土壤重金属污染的治理是我国当前急需解决的任务。与传统的化学和物理治理技术相比，植物修复技术具有经济、简便和无二次污染等优点，不仅可以修复污染土壤，而且有可能通过资源化利用而取得一定经济效益因此是一项非常适合国情的实用技术，具有广阔的应用前景。 

鼠李糖脂是铜绿假单胞菌代谢的一种生物表面活性剂。研究表明，鼠李糖脂在环境污染修复中有着巨大的应用潜力。(1)如促进烷烃类物质的降解。烷烃是石油的主要组成成分。在石油勘探、开采、运输、 

加工及储存过程中，不可避免地会有石油排入环境中而对土壤、地下水造成污染。为了提高烷烃的降解速率，加入生物表面活性剂能够增强疏水性化合物的亲水性和生物可降解性，增加微生物的数量，继而提高烷烃的降解速率。Noordman等研究了不同类型表面活性剂对十六烷的降解作用，结果表明生物表面活性剂鼠李糖脂对十六烷的降解作用明显优于其他十四种化学合成表面活性剂。Rahman等发现分别添加0.1％和1％鼠李糖脂的堆制系统中，汽油污染土壤中碳氢化合物的降解率分别提高了11.9％～45.2％和20.2％～48.3％。最近Rahman等在研究储油罐底部泥状沉积物与土壤混合堆制过程中正构烷烃的降解情况时，也发现添加鼠李糖脂能显著增加烷烃的降解率。(2)同时，鼠李糖脂也可以用于除去有毒金属。由于有毒金属在土壤环境中的污染过程具有隐蔽性、稳定性及不可逆性等特点，因此，土壤中有毒金属污染的修复一直是学术界的热点研究课题。目前可以用玻璃化、固定化/稳定化、热处理等技术除去土壤中的重金属。玻璃化处理技术可行，但是工程量大，费用高；固定化过程具有可逆性，因此处理后还需要不间断地监测处理效果；而热处理技术则只适用于除去易挥发的重金属如Hg等。因此，低成本的生物学处理方法发展很快。近年来，人们开始利用对生态环境无毒的生物表面活性剂修复受重金属污染土壤。Torrens等的实验结果表明，添加鼠李糖脂使Cd的去除率提高了8％～54％。Mulligan等分别使用三种不同的生物表面活性剂冲洗受重金属Cu、Zn污染的沉积物。三种生物表面活性剂对重金属的去除效果都不同：0.5％的鼠李糖脂对Cu的去除效果较好，去除率为65％；4％的槐糖脂则对Zn的去除效果较好，为60％；而莎梵婷对两者均无多大效果，去除率仅为15％和6％。并研究了重金属在沉积物中赋存形态量的变化，其中，鼠李糖脂和莎梵婷主要除去了有机结合态的Cu，槐糖脂主要除去了氧化物结合态和碳酸盐结合态的Zn。这一研究结果也证实了用生物表面活性剂冲洗沉积物除去其中有毒金属的方法是可行的。 

本项发明利用基因工程技术培育高效安全修复各种环境污染如有毒金属及有机物污染的植物。本发明将来自于铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)中的鼠李糖脂转移酶基因(RhlA和RhlB)转化到植物中，提供植物对环境污染的修复能力，为烷烃类有机物和有毒金属的环境污染修复提供了广阔的应用前景。 

发明内容

为了解决上述利用植物修复环境污染(烷烃类物质和有毒金属)污染物(烷烃类物质和重金属)的问题，促使植物对其的降解，本发明的一个目的在于公开一种带有微生物鼠李糖脂转移酶(RhlA和RhlB)基因序列的载体。 

本发明又一个目的在于公开一种带有微生物鼠李糖脂转移酶(RhlA和RhlB)基因序列的载体构建方法。 

本发明再一个目的在于公开一种利用农杆菌将鼠李糖脂转移酶(RhlA和RHlB)基因转入植物并促使降解烷烃类物质和有毒金属污染。 

本发明所述的带有微生物鼠李糖脂转移酶(RhlA和RHlB)基因序列的载体通过以下方法构建： 

1、鼠李糖脂转移酶(RhlA和RhlB)基因的合成 

根据Genbank登录的铜绿假单胞菌鼠李糖基转移酶RhlA和RhlB亚基基因序列(Genbank No.PSERHTR)，具体合成方法参考：Ai-Sheng Xiong，Quan-Hong Yao，Ri-He Peng，Xian Li，Hui-Qin Fan，Zong-Ming Cheng and Yi Li，Nucleic AcidResearch，2004，32(12)，98：1-10。化学合成的RhlA基因和RhlB基因表达盒的核苷酸及编码的氨基酸序列见图1和图2。 

2、鼠李糖脂生物合成中2个基因的改造及融合基因构建 

基因合成设计原则包括：按植物偏爱密码子，避免基因中出现ATTTA等PolyA加尾信号，避免6个或更多的连续的A+T序列，避免5个或更多的G+C序列，G+C的比例40～60％，防止内含子切割序列，减少基因内部的两级结构hairpins，避免2、3位用CG和TA双寡核苷酸(CG在植物中易造成甲基化)。合成基因所需要的引物见表1和表2，内侧的引物1.5pmol，外侧的两个引物浓度为30pmol。PCR反应产物电泳，产物经回收，克隆和测序。 

3、RhlA和RhlB亚基基因表达盒植物双元载体构建 

先将SRhlA表达单元的EcoRI+BamHI酶切片段插入到pcamBIA1301载体的相应酶切点间，构成载体 pcamBIA1310(SRhlA)。随后再将SRhlB表达单元的BamHI+HindIII酶切片段插入到pcamBIA1310(SRhlA)载体的相应酶切点间，最终构成双价基因植物表达载体pcamBIA1310(SRhlA+SRhlB)(见图3)获得RhlA和RhlB亚基基因表达盒植物双元载体构建。 

4、表达载体 

在上述步骤2之后，通过质粒纯化得到该表达载体。 

5、转化植物 

本发明所述的利用农杆菌将鼠李糖脂转移酶(RhlA和RhlB)表达载体转化到植物中方法的具体步骤为： 

本发明所述的利用农杆菌将三苯甲烷还原酶表达载体转化到植物中方法的具体步骤为： 

(1)载体的导入 

农杆菌感受态细胞的制备-电击法导入载体-培养 

(2)转化植物 

农杆菌蘸花法转化将鼠李糖脂转移酶(RhlA和RhlB)基因转化到拟南芥中的具体方法参考：Plant J.1998，16，735-743 

农杆菌介导将鼠李糖脂转移酶(RhlA和RhlB)转化到水稻中的具体方法参考：刘巧全，植物生理学报，1998，24(3)，259-271 

通过上述方法转化的携带有鼠李糖脂转移酶(RhlA和RhlB)的植物能持续表达产生生物活化剂鼠李糖脂，并能促使植物参与烷烃类物质和重金属污染的降解，验证了转基因植物对烷烃类物质和有毒金属污染的降解功能。从而可以为植物修复烷烃类有机物物质和有毒金属环境污染提供有益的帮助。 

附图说明

图1扩增得到目的基因的片段(A)RhlA(B)RhlB 

图2RhlA和RhlB双价基因植物表达载体1301(SRhlA+SRhlB) 

图3转基因拟南芥Gus染色图片 

图4转基因拟南芥DNA抽提后的PCR电泳图 

图5转基因拟南芥的RNA水平的鉴定 

图6转基因水稻Gus染色图片 

图7转基因水稻DNA抽提后的PCR电泳图 

图8转基因水稻的RNA水平的鉴定 

图9转基因和野生型拟南芥在不同铝离子浓度下的生长情况 

图10转基因水稻和对照中花水稻与300μmol/L铝离子胁迫下的生长情况 

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。 

本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。 

本发明中常规的分子生物学操作具体参见《分子克隆》(Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989) 

实施例1：铜绿假单胞菌鼠李糖基转移酶RhlA和RhlB亚基基因植物表达盒的化学合成 

根据Genbank登录的铜绿假单胞菌鼠李糖基转移酶RhlA和RhlB亚基基因序列(Genbank No.PSERHTR)，用本实验室建立的基因化学合成技术(Xiong 2004)，在不改变RhlA和RhlB亚基基因编码的氨基酸序列的前提下，按以下原则进行合成基因编码区的设计：(一)优化基因密码子，提高基因翻译效率。(二)消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建。(三)消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性。(四)使基因编码蛋白符合N端原则(Tobias 1991)，以提高翻译蛋白的稳定性。(五)设计提高基因5’端的自由能，以提高基因翻译 起始效率。同时，分别在RhlA和RhlB亚基基因编码区的上下游添加CAMV 35S+TMV Omega leader sequence和Nos终止子序列。最终设计并合成的RhlA基因植物表达盒(SRhlA)的长度为1639bp，其中CAMV 35S+TMV Omega leader sequence的长度为498bp，RhlA基因编码区的长度为888bp，Nos终止子的长度253bp，为了便于随后的遗传操作，在SRhlA表达盒的两侧分别引入了EcoRI和BamHI酶切点；RhlB基因植物表达盒(SRhlB)的长度为2032bp，其中CAMV 35S+TMV Omega leader sequence的长度为498bp，RhlB基因编码区的长度为1281bp，Nos终止子的长度253bp，在SRhlB表达盒的两侧分别引入了BamHI和HindIII酶切点。两个合成的基因表达盒的序列分别见表1和表2。 

实施例2：鼠李糖脂生物合成中2个基因的改造及融合基因构建 

鼠李糖脂合成系统的2个基因的全合成设计及化学合成。序列的合成见表3和表4。 

表3合成RhlA基因需要的引物，红色表示正向引物，蓝色表示反向引物，阴影部分表示的是BamHI和SacI位点 

表4合成RhlB基因需要的引物，红色表示正向引物，蓝色表示反向引物，阴影部分表示的是BamHI和SacI位点 

基因合成设计原则包括：按植物偏爱密码子，避免基因中出现ATTTA等PolyA加尾信号，避免6个或更多的连续的A+T序列，避免5个或更多的G+C序列，G+C的比例40～60％，防止内含子切割序列，减少基因内部的两级结构hairpins，避免2、3位用CG和TA双寡核苷酸(CG在植物中易造成甲基化)。合成基因所需要的引物见表1和表2，内侧的引物1.5pmol，外侧的两个引物浓度为30pmol。PCR反应产物电泳结果如图1，产物经回收，克隆和测序。序列经BLAST比对分析表明PCR法合成的RhlA和RhlB基因与来源于假绿单胞菌中的RhlA和RhlB基因的核苷酸序列完全一致。 

实施例3：带有RhlA和RHlB亚基基因表达盒植物双元载体构建及植物遗传转化 

(1)RhlA和RhlB亚基基因表达盒植物双元载体构建 

先将SRhlA表达单元的EcoRI+BamHI酶切片段插入到pcamBIA1301载体的相应酶切点间，构成载体pcamBIA1310(SRhlA)。随后再将SRhlB表达单元的BamHI+HindIII酶切片段插入到pcamBIA1310(SRhlA)载体的相应酶切点间，最终构成双价基因植物表达载体pcamBIA1310(SRhlA+SRhlB)(见图2)。通过电击方法将pcamBIA1310(SRhlA+SRhlB)载体转化入根癌农杆菌EHA105，构成菌株EHA105[pcamBIA1310(SRhlA+SRhlB)]。通过农杆菌感染法分别对拟南芥和水稻进行遗传转化，获得一批独立转化的转基因植株。 

(2)通过电击方法分别将植物表达载体导入根癌农杆菌LBA4404；遗传转化拟南芥和水稻，获得一批独立转化植株；通过RT-PCR检测合成基因的转录效率；通过转基因植株的自交及后代鉴定，最终分别获得一批遗传稳定的转基因株系。 

农杆菌培养：农杆菌菌株为根癌农杆菌EHA105，LBA4404，GV3101，AGL-1菌株。质粒经电击法导人农杆菌中。挑取单菌到25ml YEB培养基(50mg/l利福平)培养过夜，取5ml菌液转接到100ml YEB培养基(50mg/l利福平)，培养至OD600＝0.7-0.8，菌液冰上放置10分钟，5000rpm离心10min，4℃，收集菌体，加入100ml无菌双蒸水清洗两次。加入4ml 10％甘油悬浮菌体，转到50ml离心管。5500rpm离心10min，4℃。收集菌体，加入500μl10％甘油悬浮菌体，转到1.5ml离心管。取70μl感受态细胞，加入1μl重组质粒pCAMAP22。用去头的黄枪头混匀，转到0.1cm电击杯中。电击参数：200Ω，1.7KV，2.5F，电击后立即加入800μl SOC培养液。培养1小时后，取100μl涂抗性板筛选转化子，28℃培养。拟南芥粘花法转化：含目的质粒的农杆菌菌株单菌落接菌在5毫升含对应抗生素的LB培养基中28℃培养2天。将5毫升菌液转到500毫升的液体LB培养基中28℃培养16-24小时(OD＝1.5-2.0).液体可以在4℃保存30天。室温下离心收集菌体，4000g离心10分钟。用等体积5％的新鲜蔗糖溶液悬浮。加入0.02％的Silwet-77混匀后转移到烧杯中。每个菌株用300毫升转化，转2-3钵。隔7天后再转化1次。将拟南芥倒置后浸入菌液中10秒钟。莲座和花序都要侵染。侵染后将转化植株菌液空干3-5秒。用保鲜膜将转化植株圈好，平放16-24小时。转化后不要放置在高温和强光下。揭开保鲜膜，保持一定湿度，再生长1个月 后收种子。利用50μg/mL潮霉素进行转化植株筛选。 

水稻转化：N6培养基为基本培养基，去壳的种子，授粉后12-15天的幼胚，经表面消毒后接种到N6D2培养基中诱导愈伤组织(N6培养基，水解乳蛋白500mg/L，蔗糖30g/L，2，4-D 2mg/L，植物凝胶2.5g/L，pH5.8)；培养4-7天后取愈伤组织进行转化。农杆菌培养OD0.8-1.0后离心5000g离心8分钟，DDH2O清洗一次，等体积MS培养液悬浮侵染8分钟后，吸干放置在MSO+NAA1+BA2的培养基中，22度共培养3天。然后转入筛选培养基(加入头孢Cb(500μg/ml)和潮霉素HAT(50μg/ml)，转化后的愈伤在含有和的抗性培养基上培养3～4代，转入分化培养基中(2mg/L KT)；幼芽长至2mm转移到生根培养基(1/2MS+0.5mg/L IBA)。以上培养基中分别加入500mg/L酶水解乳蛋白(CH)，0～700mg/L谷氨酰胺或精氨酸，蔗糖30～80g/L，琼脂6g几。pH 5.8。继代周期为25d。将淡黄色的胚性愈伤组织转入分化培养基中，30d左右分化出芽。光照强度1500～2000lx，12～14h/d。 

实施例4：转基因拟南芥植物的鉴定 

(1)转基因拟南芥植株中GUS报告基因的组织化学染色鉴定； 

将合成的基因通过农杆菌蘸花法转化拟南芥后，获得了T₀代种子。在含有潮霉素的1/2MS培养基中筛选T₀代种子，获得抗性植株。抗性植株通过GUS检测后获得阳性植株，(如图3)。 

(2)转基因水稻植株的PCR扩增鉴定 

对GUS阳性植株进行DNA抽提，PCR检测目的基因是否已经插入到拟南芥的基因组中去。检测结果表明，GUS阳性植株的PCR检测都为阳性，最终获得15个转基因的拟南芥独立株系(如图4所示)。独立的T1代转基因株系的种子在含有卡那霉素抗性基因Km的1/2MS培养基中筛选后，统计表明，成活的植株和死亡植株的比例为3∶1，因此证明，转基因植株均为单拷贝插入。 

通过抽提DNA及检测，已经证明了该融合基因在拟南芥的基因组水平表达了，为了进一步验证该基因在RNA水平是否表达，我们选择了生长1个月左右的生长健壮的转基因的拟南芥小苗和野生型作为对照，抽提RNA，然后去除DNA，反转录合成cDNA，用于目的基因的PCR检测，结果如图5。从图中可看出转基因拟南芥植株的株系和野生型植株的ACTIN基因表达量几乎一致，而RhlA和RhlB基因在野生型拟南芥中没有检测到，而在我们的四个株系上都大量的表达了，这进一步验证了该融合基因已经在RNA水平表达了。 

实施例5：转基因水稻植物的鉴定 

(1)转基因水稻植株中GUS报告基因的组织化学染色鉴定；从获得的抗性植株中取一部分叶子，侵入含有X-GLUC的染色液中，筛选叶片变蓝的转基因植株，结果如图6。 

(2)转基因水稻植株的PCR扩增鉴定 

对叶片变蓝的转基因植株进行分子检测，提取叶片总DNA和总RNA，参照《分子克隆》的方法，对转基因植株进行PCR检测。从分子水平上证明目的基因是否导入。检测结果如图7和图8所示，结果表明，RhlA和RhlB融合基因已经成功的转入到水稻中了。 

实施例6：转基因拟南芥植物的功能分析 

为了分析转基因拟南芥在不同浓度的铝(Al³⁺)上的抗性情况，本实验选择了0μmol/L、40μmol/L、60μmol/L和80μmol/L的Al³⁺进行了转基因和野生型拟南芥的对比实验，在生长了20天的瓶皿上我们观察到了它们生长的差异，我们发现在不同的Al³⁺浓度下，转基因和野生型拟南芥的根长有很大的差异(如图9)为了便于比较观察，我们测量了这些小苗的根长，每个株系选择10株小苗测量的，结果在MS0板上转基因和野生型小苗的根长没有差异，几乎都比较一致，随着Al³⁺浓度的增加，它们的差异也逐渐明显了，特别是Al³⁺浓度在50μmol/L以后转基因的三个株系都要比野生型小苗的根长长，当Al³⁺浓度达到了80μmol/L的时候，无论野生型还是转基因小苗的根长都受到了抑制，但是它们受到的毒害还是有差异的，野生型小苗的根长完全受到了抑制，转基因的三个株系还是要好于野生型的。 

实施例7.转基因水稻植物的功能分析 

为了分析转基因水稻在Al³⁺上的抗性情况，本实验选择了0μmol/ L、200μmol/ L、250μmol/L和300μmol/L的Al³⁺进行了转基因和野生型水稻的对比实验，在生长了20天的瓶皿上我们观察到了它们生长的差异，我们发现在不同的Al³⁺浓度下，转基因和野生型水稻的根长有很大的差异(如图10)。图10所示的是转基因水稻株系和作为对照的中花水稻在MS0和300μmol/ L Al³⁺浓度下生长了15天的情况，转基因水稻的根长生长没有受到抑制，地上部分长势也要好于中花品种。而中花品种无论是地上部分还是根的生长都明显的受到了抑制。 

Claims (2)

1.一种鼠李糖脂转移酶(RhlA和RhlB)植物表达载体，其特征在于分别在RhlA和RhlB亚基基因编码区的上下游添加CAMV 35S+TMV Omega leader sequence和Nos终止子序列。最终设计并合成的RhlA基因植物表达盒(SRhlA)的长度为1639bp，其中CAMV 35S+TMV Omega leader sequence的长度为498bp，RhlA基因编码区的长度为888bp，Nos终止子的长度253bp，为了便于随后的遗传操作，在SRhlA表达盒的两侧分别引入了EcoRI和BamHI酶切点；RhlB基因植物表达盒(SRhlB)的长度为2032bp，其中CAMV 35S+TMV Omega leader sequence的长度为498bp，RhlB基因编码区的长度为1281bp，Nos终止子的长度253bp，在SRhlB表达盒的两侧分别引入了BamHI和HindIII酶切点。

2.一种鼠李糖脂转移酶(RhlA和RhlB)基因植物表达载体的用途，其特征在于将如权利要求2所述鼠李糖脂转移酶(RhlA和RhlB)基因植物表达载体转化到植物中，促使了其降解烷烃类物质和有毒金属的污染。本说明书中以酸性土壤中广泛存在的铝离子Al³⁺为功能分析案例。

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