CN101787057B - 一种鼠李糖脂的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鼠李糖脂的分离纯化方法，该方法包括以下步骤：采用混合有机溶剂溶解鼠李糖脂粗品，得到的溶解样品加到硅胶柱中，利用混合有机溶剂洗脱溶解样品，收集洗脱液并分离色素得到鼠李糖脂的溶液，最后经减压蒸馏浓缩得到纯化的鼠李糖脂。与现有技术相比，本发明克服了现有技术缺陷，具有操作简单，载样量大，分离效率高的特点，是一种工艺简单，适合工业化批量生产的简便、经济、高效的提取方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种分离纯化方法，尤其是涉及一种鼠李糖脂的分离纯化方法。
背景技术
鼠李糖脂是微生物在一定条件下代谢产生的一些具有一定表面活性、集亲水基和疏水基结构于一体的两亲化合物分子。与化学表面活性剂相比鼠李糖脂具有无毒、无害、可降解、生物相容性好、耐极端苛刻条件、选择性和专一性良好等特点，因此在石油开采、环境治理、食品工业、造纸工业、化妆品，生物医药等领域具有潜在的应用价值。然而，由于鼠李糖脂生产成本比化学表面活性剂的成本高3-6倍(中下游分离提取浓缩费用占生产成本的60％-70％)，目前鼠李糖脂一直都处于室内研究阶段，还没有形成工业化生产规模。
目前对鼠李糖脂的研究大多集中在提高其产率及其应用效果，在提取工艺方面的研究较少。现有的提取工艺主要包括萃取、TLC和酸沉-冷冻干燥法等，这些提取方法都不同程度地存在着一些缺陷。专利CN200710192452.4、CN200510040858.1和一些文献报导采用萃取法分离鼠李糖脂：梁生康等采用乙酸乙酯提取鼠李糖脂(梁生康，王修林，单宝田，汪卫东。假单胞菌0-2-2利用油脂废水生产鼠李糖脂研究。现代化工，2005，25(7)：192-196)，Juan等在提取鼠李糖脂过程中采用氯仿/甲醇(Juan C，effery K，Alba T.High-performance liquid chromatography method forthe characterization of rhamnolipid mixtures produced by Pseusomonas aeruginosa UG2on corn oil.Journal of Chromatography A，1999，864：211-220)萃取，Marias.Kuyukina等用甲基-叔丁基醚萃取鼠李糖脂(Marias.Kuyukina，Kuyukina MS，Ivshina IB，et al.Recovery of Rhodococcus biosurfactants using methyl tertiary-butylether extraction.Journal of Microbiological Methods，2001，46：149-156)。萃取方法的主要缺陷是萃取次多，容易产生乳化，进一步分离的难度大，同时，萃取过程成分的交叉很难避免，产品纯度受到了影响。Arino S(Arino S，Marchal R，Vandecasteele J P.Identification and production of a rhamnolipidic biosurfactant by aPseudomonas species.Appl Microbiol Biotechnol，1996，45：162-168)，MansoPajarron(A.Manso Pajarron，C.G.De Koster，W.Heerma，M.Schmidt，J.Haverkamp，Glycoconjugate Journal，Structure identification of natural rhamnolipidmixtures by fast atom bombardment tandem mass spectrometry 1993，10：219-226.)，Rendell(Rendell，N.B.，Taylor，G.W.，Somerville，M.，Todd，H.，Wilson，R.and Cole，P.J.Characterization of Pseudomonas rhamnolipids.Biochim.Biophys.Acta，1990，1045，189-193)报导了用TLC分离鼠李糖脂的方法，该方法可以将色素分离出去，但由于TLC载样量小，无法实现大批量生产。专利CN200610136880.0采用冷冻干燥法，根据温度和pH值对鼠李糖脂溶解度的影响进行分离纯化，但随着PH值和温度的降低，一些杂质的溶解度也会降低而和鼠李糖脂一起分离出来，获得的鼠李糖脂纯度较低。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种简便、经济、高效的鼠李糖脂的分离纯化方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种鼠李糖脂的分离纯化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)采用混合有机溶剂溶解鼠李糖脂粗品，得到溶解样品；
(2)将步骤(1)得到的溶解样品加到硅胶柱中，利用第一有机溶剂及第二有机溶剂洗脱溶解样品，收集洗脱液；
(3)识别收集洗脱液，通过紫外吸光度法来判断鼠李糖脂粗品中色素洗脱情况，然后通过苯酚硫酸法来确定鼠李糖脂洗脱情况，得到鼠李糖脂的溶液；
(4)将鼠李糖脂的溶液通过旋转蒸发仪，在70-90℃下减压蒸馏进行浓缩，得到纯化的鼠李糖脂。
所述步骤(1)中的混合有机溶剂为三氯甲烷及甲醇按体积比为(20-30)∶1混合而成。
所述步骤(1)中的鼠李糖脂粗品是将含鼠李糖脂的发酵液于5000r/min离心30min，得到的上清液用6mol/L的盐酸调节pH至1.5-2.0，4℃放置过夜后于5000r/min离心30min，收集的沉淀利用乙醚萃取，合并有机相后再经吹干、冷冻干燥即可。
所述步骤(1)中鼠李糖脂粗品与混合有机溶剂的重量(g)体积(mL)比为1∶2，利用混合有机溶剂溶解鼠李糖脂粗品。
所述步骤(2)中的硅胶柱中的硅胶粒的粒径为200-300目。
所述步骤(2)中的硅胶柱的直径为3-30cm；硅胶柱的长度与直径之比为(5-10)∶1。
所述步骤(2)中混合有机溶剂洗脱溶解样品包括以下步骤：将三氯甲烷及甲醇按体积比为(20-30)∶1混合得到的第一有机溶剂加入到硅胶柱中洗脱溶解样品，然后将三氯甲烷及甲醇按体积比为(8-12)∶1混合得到的第二有机溶剂加入到硅胶柱中再次洗脱溶解样品。
所述的溶解样品用量为柱体积的2％，第一有机溶剂体积为柱体积的2倍，第二有机溶剂体积为柱体积的6-8倍。
所述的有机溶剂的洗脱速度为每小时3-5个柱体积。
所述步骤(3)包括以下步骤：将洗脱液置于紫外分光光度计中，控制紫外光波长为340nm，利用紫外吸光度仪测试洗脱液的吸光度，判断色素的洗脱情况；用苯酚-硫酸法显色，并置于分光光度计中，控制波长为480nm，测试洗脱液的吸光度，判断糖脂的洗脱情况。
与现有技术相比，本发明采用分段洗脱方法，可以将色素和糖脂分开，重复性良好。该方法克服了现有技术中存在的分离鼠李糖脂纯度低、载样量小、分离困难等缺陷，是一种工艺简单，适合工业化批量生产的简便、经济、高效的提取方法。
附图说明
图1为实施例1中的分析结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种鼠李糖脂的分离纯化方法，该方法包括以下步骤：
(1)将含鼠李糖脂的发酵液于5000r/min离心30min，得到的上清液用6mol/L的盐酸调节pH至2.0，4℃放置过夜后于5000r/min离心30min，收集的沉淀利用乙醚萃取，合并有机相后再经吹干、冷冻干燥得到鼠李糖脂粗品0.5g，采用三氯甲烷及甲醇按体积比为25∶1混合得到的混合有机溶剂，取该混合有机溶剂1.0mL溶解鼠李糖脂粗品，得到溶解样品；
(2)将步骤(1)得到的溶解样品加到200目硅胶柱
中，将三氯甲烷及甲醇按体积比为25∶1混合得到的第一有机溶剂200mL加入到硅胶柱中洗脱溶解样品，然后将三氯甲烷及甲醇按体积比为10∶1混合得到的第二有机溶剂700mL加入到硅胶柱中再次洗脱溶解样品，洗脱速度为6mL/min，用自动收集器收集洗脱液，每收集管装样20mL收集洗脱液；
(3)识别收集洗脱液，将洗脱液置于紫外吸光度仪中，控制紫外光波长为340nm，利用紫外吸光度仪测试洗脱液的吸光度，判断色素的洗脱情况，然后通过苯酚硫酸法来确定鼠李糖脂洗脱情况，得到鼠李糖脂的溶液，分析结果如图1所示。该苯酚硫酸法是采用杜比斯等于1956年在化学期刊中发表的《比色度法测定糖类及相关物质》(Colorimetric method for determination of sugar and related substances.Anal Chem，1956，28：350-356)(Dubis，etc.Colorimetric method for determination ofsugar and related substances.Anal Chem，1956，28：350-356)公开的方法测定出的。第11-37收集管苯酚硫酸反应后在480nm处有吸收峰说明其中含有鼠李糖脂，而其余收集管中的洗脱液无鼠李糖脂。在480nm处的吸光度曲线中有两个吸收峰(分别为11-19管和26-37管)，说明此比例的洗脱液可得到鼠李糖脂的两个主要成分。第1-7收集管中的洗脱液在340nm处吸光度值很高，说明其含有色素。用此分段洗脱方法，可以将鼠李糖脂和色素分开；
(4)将鼠李糖脂的溶液通过旋转蒸发仪在80℃下减压蒸馏，进行浓缩，最终得到纯化的鼠李糖脂。
实施例2
一种鼠李糖脂的分离纯化方法，该方法包括以下步骤：
(1)将含鼠李糖脂的发酵液于5000r/min离心30min，得到的上清液用6mol/L的盐酸调节pH至1.5，4℃放置过夜后于5000r/min离心30min，收集的沉淀利用乙醚萃取，合并有机相后再经吹干、干燥得到鼠李糖脂粗品6.0g，采用三氯甲烷及甲醇按体积比为20∶1混合得到的混合有机溶剂，取该混合有机溶剂12.0mL溶解鼠李糖脂粗品，得到溶解样品，溶解样品用量为硅胶柱的柱体积的2％；
(2)将步骤(1)得到的溶解样品加到300目硅胶柱中，该硅胶柱的直径为3cm，硅胶柱的长度与直径径比为5∶1，将三氯甲烷及甲醇按体积比为20∶1混合得到的第一有机溶剂210mL加入到硅胶柱中洗脱溶解样品，然后将三氯甲烷及甲醇按体积比为8∶1混合得到的第二有机溶剂640mL加入到硅胶柱中再次洗脱溶解样品，第一有机溶剂体积为柱体积的2倍，第二有机溶剂体积为柱体积的6倍，洗脱速度为每小时3个柱体积，用自动收集器收集洗脱液，每收集管装样20mL收集洗脱液；
(3)识别收集洗脱液，将洗脱液置于紫外吸光度仪中，控制紫外光波长为340nm，利用紫外吸光度仪测试洗脱液的吸光度，判断色素的洗脱情况，然后通过苯酚硫酸法来确定鼠李糖脂洗脱情况，得到鼠李糖脂的溶液，收集管苯酚硫酸反应后在480nm处有吸收峰说明其中含有鼠李糖脂，而其余收集管中的洗脱液无鼠李糖脂。在480nm处的吸光度曲线中有两个吸收峰说明此比例的洗脱液可得到鼠李糖脂的两个主要成分。收集管中的洗脱液在340nm处吸光度值很高，说明其含有色素。用此分段洗脱方法，可以将鼠李糖脂和色素分开；
(4)将鼠李糖脂的溶液通过旋转蒸发仪在70℃下减压蒸馏，进行浓缩，最终得到纯化的鼠李糖脂。
实施例3
一种鼠李糖脂的分离纯化方法，该方法包括以下步骤：
(1)将含鼠李糖脂的发酵液于5000r/min离心30min，得到的上清液用6mol/L的盐酸调节pH至1.8，4℃放置过夜后于5000r/min离心30min，收集的沉淀利用乙醚萃取，合并有机相后再经吹干、冷冻干燥得到鼠李糖脂粗品2.0Kg，采用三氯甲烷及甲醇按体积比为30∶1混合得到的混合有机溶剂，取该混合有机溶剂4.0L溶解鼠李糖脂粗品，得到溶解样品，溶解样品用量为硅胶柱的柱体积的2％；
(2)将步骤(1)得到的溶解样品加到300目硅胶柱中，该硅胶柱的直径为30cm，长径比为10∶1，将三氯甲烷及甲醇按体积比为30∶1混合得到的第一有机溶剂425L加入到硅胶柱中洗脱样品，然后将三氯甲烷及甲醇按体积比为12∶1混合得到的第二有机溶剂1700L加入到硅胶柱中再次洗脱溶解样品，第一有机溶剂体积为柱体积的2倍，第二有机溶剂体积为柱体积的8倍，洗脱速度为每小时5个柱体积，收集洗脱液，每收集瓶装样20L收集洗脱液；
(3)识别收集洗脱液，将洗脱液置于紫外吸光度仪中，控制紫外光波长为340nm，利用紫外吸光度仪测试洗脱液的吸光度，判断色素的洗脱情况，然后通过苯酚硫酸法来确定鼠李糖脂洗脱情况，得到鼠李糖脂的溶液，收集管苯酚硫酸反应后在480nm处有吸收峰说明其中含有鼠李糖脂，而其余收集管中的洗脱液无鼠李糖脂。在480nm处的吸光度曲线中有两个吸收峰说明此比例的洗脱液可得到鼠李糖脂的两个主要成分。收集管中的洗脱液在340nm处吸光度值很高，说明其含有色素。用此分段洗脱方法，可以将鼠李糖脂和色素分开；
(4)将鼠李糖脂的溶液通过旋转蒸发仪在90℃下减压蒸馏，进行浓缩，最终得到纯化的鼠李糖脂。
实施例4
一种鼠李糖脂的分离纯化方法，该方法包括以下步骤：
(1)将含鼠李糖脂的发酵液于5000r/min离心30min，得到的上清液用6mol/L的盐酸调节pH至1.8，4℃放置过夜后于5000r/min离心30min，收集的沉淀利用乙醚萃取，合并有机相后再经吹干、冷冻干燥得到鼠李糖脂粗品260g，采用三氯甲烷及甲醇按体积比为25∶1混合得到的混合有机溶剂，取该混合有机溶剂520mL溶解鼠李糖脂粗品，得到溶解样品，溶解样品用量为硅胶柱的柱体积的2％；
(2)将步骤(1)得到的溶解样品加到200目硅胶柱中，该硅胶柱的直径为15cm，长径比为10∶1，将三氯甲烷及甲醇按体积比为25∶1混合得到的第一有机溶剂53L加入到硅胶柱中洗脱溶解样品，然后将三氯甲烷及甲醇按体积比为12∶1混合得到的第二有机溶剂186L加入到硅胶柱中再次洗脱溶解样品，第一有机溶剂体积为柱体积的2倍，第二有机溶剂体积为柱体积的7倍，洗脱速度为1.8L/min，收集器收集洗脱液，每收集瓶装样5.0L收集洗脱液；
(3)识别收集洗脱液，将洗脱液置于紫外吸光度仪中，控制紫外光波长为340nm，利用紫外吸光度仪测试洗脱液的吸光度，判断色素的洗脱情况，然后通过苯酚硫酸法来确定鼠李糖脂洗脱情况，得到鼠李糖脂的溶液，收集管苯酚硫酸反应后在480nm处有吸收峰说明其中含有鼠李糖脂，而其余收集管中的洗脱液无鼠李糖脂。在480nm处的吸光度曲线中有两个吸收峰说明此比例的洗脱液可得到鼠李糖脂的两个主要成分。收集管中的洗脱液在340nm处吸光度值很高，说明其含有色素。用此分段洗脱方法，可以将鼠李糖脂和色素分开；
(4)将鼠李糖脂的溶液通过旋转蒸发仪在80℃下减压蒸馏，进行浓缩，最终得到纯化的鼠李糖脂。
Claims (9)
1.一种鼠李糖脂的分离纯化方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)采用混合有机溶剂溶解鼠李糖脂粗品，得到溶解样品；
(2)将步骤(1)得到的溶解样品加到硅胶柱中，利用第一有机溶剂及第二有机溶剂洗脱溶解样品，收集洗脱液；
(3)识别收集洗脱液，通过紫外吸光度法来判断鼠李糖脂粗品中色素洗脱情况，然后通过苯酚硫酸法来确定鼠李糖脂洗脱情况，得到鼠李糖脂的溶液；
(4)将鼠李糖脂的溶液通过旋转蒸发仪，在70-90℃下减压蒸馏进行浓缩，得到纯化的鼠李糖脂；
其中，步骤(2)中混合有机溶剂洗脱溶解样品包括以下步骤：将三氯甲烷及甲醇按体积比为(20-30)∶1混合得到的第一有机溶剂加入到硅胶柱中洗脱溶解样品，然后将三氯甲烷及甲醇按体积比为(8-12)∶1混合得到的第二有机溶剂加入到硅胶柱中再次洗脱溶解样品。
2.根据权利要求1所述的一种鼠李糖脂的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中的混合有机溶剂为三氯甲烷及甲醇按体积比为(20-30)∶1混合而成。
3.根据权利要求1所述的一种鼠李糖脂的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中的鼠李糖脂粗品是将含鼠李糖脂的发酵液于5000r/min离心30min，得到的上清液用6mol/L的盐酸调节pH至1.5-2.0，4℃放置过夜后于5000r/min离心30min，收集的沉淀利用乙醚萃取，合并有机相后再经吹干、冷冻干燥即可。
4.根据权利要求1所述的一种鼠李糖脂的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(1)中鼠李糖脂粗品与混合有机溶剂的重量(g)体积(mL)比为1∶2，利用混合有机溶剂溶解鼠李糖脂粗品。
5.根据权利要求1所述的一种鼠李糖脂的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中的硅胶柱中的硅胶粒的粒径为200-300目。
6.根据权利要求1所述的一种鼠李糖脂的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中的硅胶柱的直径为3-30cm；硅胶柱的长度与直径之比为(5-10)∶1。
7.根据权利要求1所述的一种鼠李糖脂的分离纯化方法，其特征在于，所述的溶解样品用量为柱体积的2％，第一有机溶剂体积为柱体积的2倍，第二有机溶剂体积为柱体积的6-8倍。
8.根据权利要求1所述的一种鼠李糖脂的分离纯化方法，其特征在于，所述的有机溶剂的洗脱速度为每小时3-5个柱体积。
9.根据权利要求1所述的一种鼠李糖脂的分离纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)包括以下步骤：将洗脱液置于紫外分光光度计中，控制紫外光波长为340nm，利用紫外吸光度仪测试洗脱液的吸光度，判断色素的洗脱情况；用苯酚-硫酸法显色，并置于分光光度计中，控制波长为480nm，测试洗脱液的吸光度，判断糖脂的洗脱情况。
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