CN1891831A - 一种鼠李糖脂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鼠李糖脂的制备方法。它包括以下步骤：菌种筛选，对取自油田污水或油泥的样品浸泡预处理后接入增殖培养基，划线法接种于血液琼脂平板上培养，挑取单菌落，并接种于蓝色琼脂平板上培养，挑取出现蓝色晕圈的菌落接入斜面作菌种保藏；将初筛菌株接入发酵培养基中发酵后测定其排油活性、乳化性能及发酵液表面张力，然后选取目的菌株；发酵工艺优化，将经筛选的菌株进行发酵，在发酵过程中进行发酵培养基优化、发酵条件优化、菌种优化得到鼠李糖脂发酵液；对鼠李糖脂发酵液进行提取得到鼠李糖脂粗产品。本发明具有所筛选菌株的产量高、重烃降解效果明显、克服仅依靠生物表面活性剂溶血性进行判断的缺点、提高了筛选准确度等显著优点。
Description
一、技术领域
本发明公开了一种糖脂类生物表面活性剂的制备方法，特别是一种鼠李糖脂的制备方法。
二、背景技术
鼠李糖脂属于一种糖脂类生物表面活性剂，除具有降低表面张力、稳定乳化液和增加泡沫等作用外，还具有一般化学合成表面活性剂所不具备的无毒、能生物降解等优点。因此，可广泛应用于工业、农业、医药及日常生活的各个领域，尤其适合于石油工业和环境工程领域，如石油的生物降粘、提高原油采收率、重油污染土壤的生物修复等。另外，作为天然添加剂，鼠李糖脂在食品工业、精细化工、医药和农业等工业方面也愈来愈受到人们的青睐。
现有技术中，已有采用微生物法合成鼠李糖脂的报道。在鼠李糖脂的制备过程中，菌种的筛选最为重要，目前广泛使用的方法是血液琼脂平板法，它通过对原样中产生菌的培养，使血液琼脂培养基中的红细胞发生溶血现象，再通过比较菌落周围形成的溶血圈直径的大小进行快速筛选，得到可以制备高产量鼠李糖脂的优质菌种，然后将优质菌种在不同的时间内接入含不同碳源的发酵培养基内，以促进菌体的代谢，从而得到鼠李糖脂。Biotechnol.Prog.2002，18，1277～1281“RhamnolipidBiosurfactant Production by Strains of Pseudomonas aeruginosa Using Low-CostRaw Materials”公开了一种鼠李糖脂的制备方法，它是在汽油、柴油污染的土壤中，通过血液琼脂平板的稀释涂布方法，筛选产生鼠李糖脂的产生菌，得到以原油为唯一碳源生长的两株优质菌株，并进一步分析得出DS10-129菌株为制备鼠李糖脂的高产菌。在以DS10-129菌株为产生菌生产鼠李糖脂的过程中，要在不同的时间内接入含不同碳源的培养基进行发酵培养，约培养288小时后，可得到4.31g/L的高产量鼠李糖脂。上述制备鼠李糖脂的方法存在有以下不足：1、采用血液琼脂平板的稀释涂布方法进行产鼠李糖脂菌株筛选，虽然可直观的看到溶血圈的产生，但溶血圈不规则，血液中的一些成份或杂菌常常也会产生类似的溶血圈，实际操作中很难通过溶血圈的大小判断产表面活性剂的多少，而且在培养过程中，血液中的一些成份或杂菌常常也会产生类似的溶血圈，对培养基的配制和使用过程造成杂菌污染；2、这种筛选方法在稀释涂布时工作量大，以原油为唯一碳源时菌株的生长缓慢，因而造成筛选的周期较长；3、该方法在发酵培养过程中需要使用不同的碳源，即需要补料，因此增加了操作工序，同时该菌株的产量仍然过低，不利于工业化应用。
三、发明内容
本发明的目的在于提供一种菌种筛选工艺简单、质量好、发酵周期短、得产率高且生产成本低的鼠李糖脂的制备方法。
实现本发明目的的技术方案为：一种鼠李糖脂的制备方法，包括以下步骤：
1.1在25～35℃的环境温度下菌种的筛选：对取自油田污水或油泥的样品浸泡预处理后接入增殖培养基培养22～24小时，经增殖培养的培养液采用划线法接种于血液琼脂平板上培养24～72小时，挑取溶血圈的单菌落，并接种于蓝色琼脂平板上培养24～120小时，挑取出现蓝色晕圈的菌落接入斜面作菌种保藏；将保藏在斜面培养基中的初筛菌株接入发酵培养基中发酵72～120小时后测定其排油活性、乳化性能及发酵液表面张力，然后选取目的菌株，并存种；
1.2发酵工艺的优化：将经筛选选取的菌株进行发酵，在发酵过程中首先进行发酵培养基优化，对发酵过程的碳源、氮源、无机盐及各基质用量进行优化选择，通过考察菌株在各条件下的鼠李糖脂产量、发酵液表面张力变化、发酵周期长短、发酵成本和发酵过程控制难易度确定最优发酵培养基；其次，进行发酵条件优化，对发酵温度在20～50℃、pH值为3～11、溶解氧、搅拌速度和生物反应器装液量以及种子培养、接种量1％～10％的条件进行优化；最后进行菌种优化得到鼠李糖脂发酵液；
1.3对鼠李糖脂发酵液的提取：将发酵液经离心除菌体后，过滤除去不溶性杂质和剩余液蜡，溶液pH＝6.0～6.5，加入萃取溶剂，搅拌、萃取分液，合并有机相，用等体积水洗，用旋转蒸发仪减压蒸除溶剂，得到鼠李糖脂粗样品。
本发明鼠李糖脂的制备方法中，将经筛选选取的菌株接入到液化甘油为唯一碳源中进行发酵工艺优化。
本发明鼠李糖脂的制备方法中，对鼠李糖脂粗样品进行柱层析纯化：首先用湿法装柱，用氯仿将鼠李糖脂粗样品溶解，然后缓慢加入溶于氯仿中的硅胶，边加入边轻振动硅胶柱，硅胶柱装好后加盖砂芯，并用氯仿进行平衡；然后慢而连续地上样，用氯仿冲洗至色带出现，用氯仿/甲醇展开，从底部放出液体，直到黄色色带完全展开开始向下移动到接近柱底部；再用氯仿洗脱，从黄色色带开始，收集从下方被洗脱出来的物质，蒸去溶剂；重复上述的柱层析纯化过程，获取较纯的鼠李糖脂样品。
本发明鼠李糖脂的制备方法中，对较纯的鼠李糖脂样品进一步纯化：将较纯的鼠李糖脂样品用少量水溶解，以氯仿/甲醇萃取，减压蒸除溶剂后，用丙酮将产物再溶解，减压浓缩，进行重结晶。
与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)本发明筛选菌株Pseudomonassp.L-21具有较强降解原油的能力，对原油的降解率可达到59％，降解后原油被很好的分散、乳化或变为水不溶物沉降；(2)本发明采用血液琼脂—蓝色琼脂平板筛选方法，克服以往仅依靠生物表面活性剂溶血性进行判断的缺点，提高了筛选准确度，节省了筛选时间；(3)本发明产量高，最高产量可达到23g/L，25℃能使发酵液表面张力降低至25.7mN/m；(4)所筛选菌株的重烃降解效果十分明显，产物鼠李糖脂具有显著的乳化作用，因而，用于油类污染土壤的环境修复效果明显。
四、附图说明
图1是本发明鼠李糖脂的制备方法的流程图。
图2是本发明鼠李糖脂的制备方法菌种筛选的流程图。
五、具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
实施例1：结合附图，本发明鼠李糖脂的制备方法，包括以下步骤：
1.1菌种筛选：对取自油田污水或油泥的样品浸泡预处理后接入增殖培养基，经增殖培养的培养液采用划线法接种于血液琼脂平板上培养，挑取溶血圈的单菌落，并接种于蓝色琼脂平板上培养，挑取出现蓝色晕圈的菌落接入斜面作菌种保藏；将保藏在斜面培养基中的初筛菌株接入发酵培养基中发酵后测定其排油活性、乳化性能及发酵液表面张力，然后选取目的菌株，并存种；即从油田污水或油泥中选取样品，通过无菌水浸泡2小时预处理后，取出浸初液接入增殖培养基后，在30℃温度环境培养24小时后划线培养于血液琼脂平板30小时，将出现溶血圈的单菌落，将出现的单菌落再接于蓝色琼脂平板在30℃温度环境培养48小时，然后出现较大蓝圈的菌落保藏于斜面培养基上在30℃温度环境培养保藏12小时。然后接入种子培养基中进行培养后，5％接种于发酵培养基进行在30℃温度环境发酵培养48小时，然后进行排油活性测试、乳化性能测试及表面张力的测定，得到排油圈最大，表面张力最低的菌株Pseudomonas sp.L-21。
其中的培养基如下：细菌、放线菌富集培养基(Bacteria and ActinomyceteEnriched Media)：十六烷基三甲基溴化铵2g，(NH4)2SO4 2g，Na2HPO4·2H2O 2g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.005g液化石蜡20mL，去离子水定容至1L，pH＝7～7.5。121℃，灭菌20min后，冷却至约50℃，加入无菌制霉菌素0.05g/L水溶液。
霉菌和酵母富集培养基(Mold and Yeast Enrichment Media)：十六烷基三甲基溴化铵2g，(NH4)2SO4 2g，Na2HPO4 2g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.005g，酵母粉0.1g，液化石蜡20mL，去离子水定容至1L，pH＝5.1～5.4。121℃灭菌20min，冷却至约50℃，加入无菌四环素0.035g/L水溶液。
血液琼脂培养基：脱纤维绵羊血50mL，牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，酵母粉0.01g，用去离子水定溶至1L。首先称取除羊血外其它成份，加热使溶于950mL水中，121℃灭菌20min，取出，待冷至60℃左右，加入经微孔滤膜过滤后的脱纤维绵羊血50mL，倾倒平板待用，倾倒过程要防止气泡产生和琼脂凝固。
蓝色琼脂培养基：十六烷基三甲基溴化铵5g，亚甲基蓝0.02g，牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，酵母粉0.01g，用去离子水定溶至1L。首先称取十六烷基三甲基溴化铵和亚甲基蓝以外其它成份，加热使溶于去离子水中。然后称取5g十六烷基三甲基溴化铵、0.02g亚甲基蓝溶于少量水中。待前者冷却至60℃～70℃左右，加入后者，补足去离子水，缓慢搅拌均匀，无须灭菌，将培养皿洗净并烘干，直接倾倒平板，待用。
1.2发酵工艺的优化：将筛选得到的菌株接入到液化甘油为唯一碳源进行发酵，得到鼠李糖脂发酵液，即发酵工艺优化包括菌种优化、发酵培养基优化、发酵条件优化三部分进行。首先进行发酵培养基优化，对发酵过程的碳源、氮源、无机盐及各基质用量进行优化选择，通过考察菌株在各条件下的鼠李糖脂产量、发酵液表面张力变化、发酵周期长短、发酵成本和发酵过程控制难易度确定最优发酵培养基；其次，进行发酵条件优化，对发酵温度在20～50℃、pH值3～11、溶解氧、搅拌速度和生物反应器装液量以及种子培养、接种量1％～10％的条件进行优化；最后进行菌种优化，菌种优化采用诱变育种方法改良菌种，使产量、菌株生长和代谢状态适合工业化生产需要。
将Pseudomonas sp.L-21接种于种子培养基中，种子培养基：液化石蜡20mL，(NH4)2SO4 2g，Na2HPO4·2H2O 2g，KH2PO4 2g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.005g，牛肉膏1g，用去离子水定容至1L，调pH为7.0～7.2，121℃高压灭菌20min。30℃，200r/min摇床振荡培养24h。然后将种子培养基以5％接种量接入发酵培养基，30℃，200r/min连续培养84h。
发酵培养基：甘油30mL，(NH4)2SO4 2g，Na2HPO4·2H2O 3g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.005g，用去离子水定容至1L，调pH为8。培养温度：30℃，摇床转速：200r/min；摇瓶装液量：30～100mL；接种量：4％；培养时间：72～80h；种子培养时间：21h。
1.3经过菌种筛选和发酵优化得到鼠李糖脂发酵液，现对鼠李糖脂发酵液进行提取，从菌种筛选过程可以初步判断，Pseudomonas sp.L-21在发酵过程中能分泌胞外糖脂类生物表面活性剂。因此将1L发酵液经4000r/min离心30min除菌体后，过滤除去不溶性杂质和剩余液蜡。滤液用10％H2SO4溶液调溶液pH＝6.0～6.5，分两次加入2L体积的氯仿/甲醇(V/V＝2∶1)混合溶剂，磁力搅拌1h，分液漏斗萃取分液，合并有机相，用等体积水洗，在45℃下用旋转蒸发仪减压蒸除溶剂，得到鼠李糖脂粗样品。
对鼠李糖脂粗样品进行柱层析纯化：首先是装柱，采用湿法装柱，用氯仿将粗产品溶解。首先在柱中装入2/3体积的氯仿，然后缓慢加入溶于氯仿中的硅胶，边加入边轻振动硅胶柱。同时，保持溶剂以1滴/s的速度从下方流出。注意装柱过程硅胶柱、硅胶及溶剂中不能有水珠混入。硅胶柱装好后加盖砂芯，并用氯仿进行平衡。然后上样和洗脱，将粗产物A溶于约10mL氯仿中，按上述方法过长径比为60cm×3cm硅胶柱，上样过程要慢而连续，不可扰动液面，否则将影响色带边缘，不利于洗脱和纯化过程的进行，甚至造成层析失败。先用氯仿冲洗至色带出现，然后用氯仿/甲醇(V/V＝8∶1)展开，以1滴/min从底部放出液体，直到黄色色带完全展开开始向下移动到接近柱底部；开始用氯仿洗脱，从黄色色带开始从下方被洗脱出来开始收集，每10mL收集一次，制作洗脱曲线。收集并蒸去溶剂，获取较纯的鼠李糖脂产物。重复上述过程，可得到更纯鼠李糖脂产物样品。
本发明还可以进一步纯化：将经过柱层析纯化的鼠李糖脂样品用少量水溶解，以约2倍体积的氯仿/甲醇(V/V＝8∶1)萃取，减压蒸除溶剂后，用丙酮将产物溶下，减压浓缩，放置使产物重结晶，得更纯产物。
提纯得到的糖脂样品经ESI-MS分析确定，提取物中存在多种不同结构鼠李糖脂组分，主要由Rh2C10C10、RhC10C10两种物质构成，大约占总量的72.3％左右，其余各种鼠李糖脂组分约占27.7％左右；在同分异构体中，对于含有两个不同碳链长度的β-羟基羧酸的鼠李糖脂来说，糖基与短链β-羟基羧酸结合的鼠李糖脂组分含量高于长链与鼠李糖基结合的鼠李糖脂组分。在双鼠李糖脂(dirhamnolipid)结构中，远离脂肪酸长链的吡喃环结构比靠近脂肪酸长链或位于单鼠李糖脂(monorhamnolipid)结构中鼠李糖基稳定。在两种主要鼠李糖脂组分中双鼠李糖脂含量多于单鼠李糖脂。其中Rh2C10C10(MW：650)鼠李糖脂组分含量占总丰度的42.36％，而结构为RhC10C10(MW：504)的鼠李糖脂组分含量占总丰度的29.84％。
实施例2：本发明鼠李糖脂的制备方法，从油田油污中采样，通过富集培养、血平板(初筛)和蓝色凝胶平板复合筛选模式(复筛)筛选得到生物表面活性剂产生菌，并经紫外诱变育种改良，得到的优良菌种保藏于PDA斜面。通过发酵培养，即发酵培养基：液体石蜡或葡萄糖或豆油或柴油或甘油15-35mL，(NH4)2SO4 2-2.5g，Na2HPO4·2H2O3-3.8g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.005g，用去离子水定容至1L，调pH为7.5-8。培养条件：温度：26～36℃，摇床转速：14～240r/min；锥形瓶装液量：50-100mL；种子培养时间：21h；接种量：5～10％；培养时间：48～158h，发酵液用氯仿和甲醇萃取，蒸去溶剂后得到初产物混合鼠李糖脂。
经硅胶柱分离后得到一种黄色针状晶体，结合TLC、ESI-MS、FI-IR、1H NMR、13C NMR、GC-MS等技术对晶体进行了鉴定。其主要由Rh2C10C10、RhC10C10两种物质构成，大约占鼠李糖脂混合物总量的72.1-72.3％左右，其余各种鼠李糖脂组分约占27.9-27.7％左右；其中Rh2C10C10鼠李糖脂组分丰度为42.36-42.41％，而结构为RhC10C10的鼠李糖脂组分丰度为29.84-30.15％。
Claims (4)
1、一种鼠李糖脂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1.1在25～35℃的环境温度下菌种的筛选：对取自油田污水或油泥的样品浸泡预处理后接入增殖培养基培养22～24小时，经增殖培养的培养液采用划线法接种于血液琼脂平板上培养24～72小时，挑取溶血圈的单菌落，并接种于蓝色琼脂平板上培养24～120小时，挑取出现蓝色晕圈的菌落接入斜面作菌种保藏；将保藏在斜面培养基中的初筛菌株接入发酵培养基中发酵72～120小时后测定其排油活性、乳化性能及发酵液表面张力，然后选取目的菌株，并存种；
1.2发酵工艺的优化：将经筛选选取的菌株进行发酵，在发酵过程中首先进行发酵培养基优化，对发酵过程的碳源、氮源、无机盐及各基质用量进行优化选择，通过考察菌株在各条件下的鼠李糖脂产量、发酵液表面张力变化、发酵周期长短、发酵成本和发酵过程控制难易度确定最优发酵培养基；其次，进行发酵条件优化，对发酵温度在20～50℃、pH＝3～11、溶解氧、搅拌速度和生物反应器装液量以及种子培养、接种量1％～10％的条件进行优化；最后进行菌种优化得到鼠李糖脂发酵液；
1.3对鼠李糖脂发酵液的提取：将发酵液经离心除菌体后，过滤除去不溶性杂质和剩余液蜡，溶液pH＝6.0～6.5，加入萃取溶剂，搅拌、萃取分液，合并有机相，用等体积水洗，用旋转蒸发仪减压蒸除溶剂，得到鼠李糖脂粗样品。
2、根据权利要求1所述的鼠李糖脂的制备方法，其特征在于将经筛选选取的菌株接入到液化甘油为唯一碳源中进行发酵工艺优化。
3、根据权利要求1或2所述的鼠李糖脂的制备方法，其特征在于对鼠李糖脂粗样品进行柱层析纯化：首先用湿法装柱，用氯仿将鼠李糖脂粗样品溶解，然后缓慢加入溶于氯仿中的硅胶，边加入边轻振动硅胶柱，硅胶柱装好后加盖砂芯，并用氯仿进行平衡；然后慢而连续地上样，用氯仿冲洗至色带出现，用氯仿/甲醇展开，从底部放出液体，直到黄色色带完全展开开始向下移动到接近柱底部；再用氯仿洗脱，从黄色色带开始，收集从下方被洗脱出来的物质，蒸去溶剂；重复上述的柱层析纯化过程，获取较纯的鼠李糖脂样品。
4、根据权利要求3所述的鼠李糖脂的制备方法，其特征在于对较纯的鼠李糖脂样品进一步纯化：将较纯的鼠李糖脂样品用少量水溶解，以氯仿/甲醇萃取，减压蒸除溶剂后，用丙酮将产物再溶解，减压浓缩，进行重结晶。
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