CN103202295B - 一种鼠李糖脂作为生物农药和生物杀虫剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鼠李糖脂作为生物农药和生物杀虫剂的应用；含20-500mg/L鼠李糖脂溶液处理植物病害菌，对病害真菌菌丝体生长和孢子萌发的抑制率达40-90%，有效抑制植物真菌病害。含20-500mg/L鼠李糖脂溶液对蟑螂和蚜虫的杀虫效果明显。

Description

一种鼠李糖脂作为生物农药和生物杀虫剂的应用

本申请是申请日为2010年3月30日、申请号为201010136140.3、发明名称为《一种鼠李糖脂的制备方法及其应用》的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物表面活性剂技术领域，尤其涉及一种鼠李糖脂作为生物农药和生物杀虫剂的应用。

背景技术

生物表面活性剂是一类由微生物、动物或植物产生在性能上与化学合成的表面活性剂非常相似，即分子由极性亲水基团和非极性亲油基团两部分组成，可以在相界面上形成分子层，降低界面能量的物质，具有好的表面活性作用，如乳化、分散、润湿和渗透等功能。与化学合成表面活性剂相比，生物表面活性剂由于化学基团复杂且数目也多，使其表面活性更强，乳化能力也更强；本身无毒，使用量更少，易被微生物降解，具有很好的环境友好特性；还具有抗菌，抗病毒等药理作用，辅助和提高产品的总体质量。而目前普遍使用的化学表面活性剂因难被土壤微生物降解而破坏生态系统和污染地表地下水等，且本身（如Toximul系列）往往有毒。

鼠李糖脂作为一种生物表面活性剂，具有较强的表面和界面活性，低毒、可生物降解性，被广泛用于石油开采、环境保护、医药化工、食品以及农业上。这类生物表面活性剂基本是由碳水化合物和长链脂肪酸或羟基脂肪酸以共价键形式结合而成，以糖为亲水集团，以脂肪酸为憎水基团。其化学结构一般都是由极性基和非极性基构成。极性基易溶于水，具有亲水性质，非极性基易溶于水。其具体作用如下：（1）乳化：类似于双甘油月桂酸钠、蓖麻油聚氧乙基醚等表面活性剂，可促使不相溶的两相液体形成不透明或半透明乳浊液，当表面活性剂浓度大于临界胶束浓度（CMC）时，还能形成中间携带有机药物的胶束，增加有机物的表观溶解度。（2）分散：阻止分散体系中固体或液体粒子的聚并和保持其处于分散的稳定状态；（3）润湿：由于作物叶表覆盖有不同厚度的蜡质层，使其成为疏水低能的表面，不利于液体对其表面的润湿，进而影响养分的吸收；（4）跨膜渗透：由于具有表面活性和生物相容的双重作用，可以增加动植物细胞膜的能力。

虽然鼠李糖脂潜在的广泛用途，但其组成成分多样且随具体的培养条件变化，发酵过程中易产生泡沫，生产成本也高，目前实际进入工业化生产且产品质量稳定的报道较少。鼠李糖脂的发酵一般采用各类植物油或正己烷作为碳源，发酵周期较长，也因发酵原料成本较高，制约了鼠李糖脂的大规模工业化生产。利用各种废弃油脂发酵生产鼠李糖脂，不仅节约了生产成本，而且保护了环境，达到“以废治废”的目的。

真菌感染在农业生产中是最常见的病害之一。近年来，番茄晚疫病、辣椒疫霉病和葡萄霜霉病等真菌病虫害的发生流行面积和防治难度不断加大，对农业生产造成严重损失。目前，对感染农作物的植物病害真菌，常规的化学农药防治效果不好，且使用剂量逐年上升，常常造成农药残留超标，且具有严重的生物和环境毒性。因此开发具有高效、安全和环保型的表面活性剂类抑菌剂具有十分重要的意义。鼠李糖脂作为一种环境友好的生物表面活性剂，可在早期破坏真菌的游动孢子膜，有效阻断各种真菌病害的发展。

基于可持续性发展新型农业的目的，随着日益增加的对农业可持续性发展的重视，要求使用高效、低毒和环境友好的水剂型农药，和发展叶面施肥（即现代集约化农业中一项有效的营养调控技术）及开发安全且被小肠吸收利用的饲料。尤其是农药，占农药总量50％左右的乳油每年要消耗大约25万吨的工业级二甲苯等有机溶剂对多种组织器官产生强烈的毒性作用，破坏造血功能，给水体和大气带来严重污染，因此，农药剂型正朝着以水为介质的微乳剂、水乳剂和悬乳剂等剂型发展，力求发展高效、安全、经济和环境相容的新剂型，这将是21世纪农药剂型发展的主流。在这些新型农药、肥料及饲料新剂型中，共同存在的助剂是表面活性剂，其作用主要是分散、渗透、润湿和促吸收等。

蚜虫对于农作物危害很大，蟑螂也经常出没于家庭居室。常规的杀昆虫剂多数毒性较大，经常使用不利于人体健康和环境保护，鼠李糖脂作为一种生物杀虫剂，杀虫效果显著，国内外还未见将鼠李糖脂用作生物杀虫剂的相关报道。

另外，石化企业含油污泥中有机物复杂且成分各异，气味难闻，易污染环境，易和泥沙等多种杂质形成悬浮乳浊液，粘度很大，难以沉降，造成处理工作量极大。现有的废水和污泥处理方法无法有效处理含油污泥，使之环境造成严重污染。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种鼠李糖脂作为生物农药和生物杀虫剂的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种鼠李糖脂发酵液作为生物农药的应用，所述鼠李糖脂作为抑制或杀灭植物真菌病害的生物农药。

一种鼠李糖脂作为生物杀虫剂的应用，所述虫为蟑螂、蚜虫等。

1、本发明以油脂加工下脚料或餐饮废油等废弃油脂为碳源，利用铜绿假单胞菌发酵生产鼠李糖脂，变废为宝，保护了环境，降低了鼠李糖脂的生产成本；结合乙醇的消泡和同时易被作为碳源利用的双重作用，产量可达35-50g/L，使得成本比传统方法低25-40%左右。

2、本发明利用含20-500mg/L鼠李糖脂溶液处理植物中常见真菌孢子，使菌丝体生长的抑制率和孢子萌发率达40-90%，有效抑制植物真菌病害。鼠李糖脂作为生物农药，减轻了化学农药对于环境的危害。

3、本发明利用去菌体的鼠李糖脂作为生物杀虫剂，大大降低了常规化学杀虫剂对于人体和环境的危害，含20-500mg/L鼠李糖脂溶液对于蟑螂和蚜虫等昆虫的杀虫效果明显。

4、将鼠李糖脂作为农药、肥料和饲料助剂，其表面活性比化学表面活性剂更好且具有多种表面活性剂合用才有的综合效果，并具有环境和生物友好特性。

5、鼠李糖脂用于含油污泥脱水，大幅度降低污泥处理量，效果显著。

Pseudomonas aeruginosa ZJU-211菌种已于2009年10月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M209237；分类命名为铜绿假单胞菌ZJU-211，拉丁文学名为：Pseudomonas aeruginosa ZJU-211。中国典型培养物保藏中心的地址为武汉大学生命科学学院，邮编为430072。

附图说明

图1是鼠李糖脂发酵装置流程图；

图2是鼠李糖脂对疫霉的菌落生长抑制效果图；

图3是鼠李糖脂对疫霉的菌丝体生长抑制效果图；

图4是鼠李糖脂对灰霉的菌落生长抑制效果图。

具体实施方式

本发明提供了一种以鼠李糖脂为主要成分的去菌体发酵液或酸沉浓缩液，其中，去菌体发酵液中含鼠李糖脂35～50g/L，余量为盐分、海藻酸钠、蛋白和大量的水；浓缩鼠李糖脂含700～900g/L鼠李糖脂，余量为少量的盐分、海藻酸钠、蛋白和水。

该鼠李糖脂的制备方法，具体步骤如下：

1.菌种培养：将Pseudomonas aeruginosa ZJU-211菌种接种到摇瓶种子培养基培养，温度为32～38℃，摇床转速120～200rpm，培养24～48h得到摇瓶菌种。

所述摇瓶种子培养基组成（g/L）：废弃油脂，30～40：NaNO₃，2～4；NaCl，0.5～1.5；KCl，0.5～1.5；CaCl₂·2H₂O，0.05～0.2；KH₂PO₄，2～4；Na₂HPO₄·12H₂O，2～4；MgSO₄，0.1～0.3；微量元素，1.5～2.5mL/L，余量为水。

微量元素组成（g/L）:FeCl₃·6H₂O 0.01～0.08，ZnSO₄·7H₂O 0.1～0.75，CuSO₄·5H₂O 0.01～0.075，MnSO₄·H₂O 0.1～0.75，H₃BO₃，0.01～0.15，余量为水。

2.发酵：将摇瓶菌种接种到10L或其整数倍的发酵罐中，利用发酵培养基培养，接种量3～10%（v/v），发酵过程温度控制在32～38℃，通气量为0.2～1.5vvm，搅拌转速200～500rpm，发酵周期3～5天。发酵装置如图1所示，其主体为发酵罐，由于表面活性剂中期以后发酵过程中产生大量的泡沫，发酵罐（反应器）还需连接一个泡沫回收器。一般，在发酵过程的中后期（2～5天），溢出发酵罐的泡沫收集在泡沫回收器中，当泡沫又溢到回收器顶部而接触到泡沫感应喷雾装置时，由泡沫感应产生的电信号随即打开电动乙醇喷雾器，喷出的体积浓度为75%～99.5%的乙醇雾沫迅即消除泡沫，沉降下来的发酵液通过蠕动泵被循环回发酵罐。每次乙醇体积加量不会超过泡沫体积的1%，乙醇随沉降发酵液返回发酵罐中并可被微生物作为底物利用。发酵终点时，得到含鼠李糖脂35～50g/L的带菌体发酵液。

所述发酵培养基组成（g/L）：废弃油脂，30～100：NaNO₃，4～8；NaCl，0.5～1.5；KCl，0.5～1.5；CaCl₂·2H₂O，0.05～0.2；KH₂PO₄，2～4；Na₂HPO₄·12H₂O，2～4；MgSO₄，0.1～0.3；微量元素，1.5～2.5mL/L，余量为水。

组成（g/L）:FeCl₃·6H₂O 0.01～0.08，ZnSO₄·7H₂O 0.1～0.75，CuSO₄·5H₂O 0.01～0.075，MnSO₄·H₂O 0.1～0.75，H₃BO₃ 0.01～0.15，余量为水。

3.膜分离除菌体：步骤2得到的含菌体发酵液通过中空纤维膜过滤去除菌体，得到去菌体发酵液，其含鼠李糖脂35-50g/L。含菌体发酵液通过截留分子量30kDa以上的超滤膜到0.22微米下的微滤膜去除菌体，膜材料为聚砜、丙烯腈、尼龙、聚丙烯、醋酸纤维或无机类材料。

4.酸沉浓缩糖脂：在步骤3得到的去菌体发酵液中加入酸（如盐酸或硫酸），调节溶液pH至3.0～4.0，静置1～12h，倾去上清液，收集底部酸沉降物，得到含糖脂70～90％的浓缩鼠李糖脂产品。

下面介绍几个实验过程：

1、菌落生长抑制实验：将不同稀释度的鼠李糖脂发酵液与马铃薯琼脂培养基（PDA）混合均匀后，在其中央接入培养5天的番茄疫霉/赤霉/灰霉菌块，25-28℃，恒定湿度，黑暗培养，2天后测定各组菌落半径，计算抑制率。所述马铃薯琼脂培养基（PDA）组成（g/L）：马铃薯，200；蔗糖，20；琼脂，17。

2、液体培养抑菌实验：将不同稀释度的鼠李糖脂发酵液与马铃薯培养液（PDB）混合均匀后，接入一定浓度的真菌孢子（番茄疫霉/赤霉/灰霉）悬浮液，25-28℃，摇床培养，转速120rpm，2天后测定各组菌丝体增重。所述马铃薯培养液（PDB）组成（g/L）：马铃薯，200；蔗糖，20。

3、番茄植株体内实验：选取健康的生长30天的番茄苗，喷洒不同稀释度的鼠李糖脂发酵液后接种疫霉孢子悬浮液，10天后，观察各组抑菌效果。

4、农药评价方法（以水悬浮剂为例）

分散性的测定：于25mL量筒中，装入249mL水，用注射器取1mL待测悬浮剂，从距量筒水面5cm处滴入水中，观察其分散状况。按其分散状况的好坏分为优、良、劣三级。

热贮稳定性：将待测悬浮剂每只安瓿瓶分装10g，密封后放入恒温（54±2）℃的烘箱中，静止热贮30天后取出，分别检测记录外观、流动性、分散性、粒径、有效含量、悬浮率等各项指标有无变化。然后判断是否合格。

冷贮稳定性：将待测悬浮剂每只安瓿瓶分装10g，密封后在-25℃低温下冷贮24h后取出，取出观察结冻情况。然后置于室温条件下静止融化，并分别检测记录外观、流动性、分散性、粒径、有效含量、悬浮率等各项指标有无变化。然后判断是否合格。

下面结合附图和具体实施例详述本发明具体内容及其所带来的显著效果。

实施例1：去菌体鼠李糖脂的制备

1、菌种：发酵菌种为铜绿假单胞菌ZJU-211（Pseudomonas aeruginosaZJU-211）

2、将菌种接种于种子培养基，温度为35℃，摇床转速180rpm，培养48h得到摇瓶菌种。

种子培养基组成如下（g/L）：

麦当劳废弃油脂，30：NaNO₃，2；NaCl，0.5；KCl，0.5；CaCl₂·2H₂O，0.05；KH₂PO₄，2；Na₂HPO₄·12H₂O，2；MgSO₄，0.1；微量元素，1.5mL/L，余量为水。所述微量元素组成如下:FeCl₃·6H₂O 0.01，ZnSO₄·7H₂O 0.1，CuSO₄·5H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.1g/L，H₃BO₃，0.01，余量为水。

3、10L发酵罐发酵生产鼠李糖脂

将摇瓶菌种接种到10L发酵罐中，接种量5%（v/v），发酵过程温度控制在32℃，通气量为1.0vvm，搅拌转速300rpm，发酵周期4天。

发酵培养基组成如下（g/L）：麦当劳废弃油脂，60：NaNO₃，4NaCl，0.5；KCl，0.5；CaCl₂·2H₂O，0.05；KH₂PO₄，2；Na₂HPO₄·12H₂O，2；MgSO₄，0.1；微量元素，1.5，余量为水。所述微量元素组成如下:FeCl₃·6H₂O 0.01，ZnSO₄·7H₂O 0.1，CuSO₄·5H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.1，H₃BO₃ 0.01，余量为水。

发酵罐培养约3天时，泡沫开始溢满回收器顶部而触发泡沫感应喷雾装置，通过75%的乙醇雾沫进行高效消泡，至发酵结束时（5天），乙醇累计使用量是发酵液体积的5.2%。

4、将发酵液灭菌后，通过30kDa的聚砜中空纤维超滤组件去除菌体，获得去菌体鼠李糖脂。

用本实施例得到发酵液中鼠李糖脂的产量达到31.8g/L。据估计，由于采用价格低廉的废弃油脂为主要碳源和同时可作为底物利用的乙醇为高效消泡，降低了发酵的原料成本，又克服了发酵中大量形成泡沫的问题，提高了产量，使鼠李糖脂的生产成本比传统方法低25-40%左右。

实施例2：鼠李糖脂浓缩液的制备

1、菌种：发酵菌种为铜绿假单胞菌ZJU-211（Pseudomonas aeruginosaZJU-211）

2、将菌种接种于种子培养基，温度为38℃，摇床转速200rpm，培养48h得到摇瓶菌种。

种子培养基组成如下：

菜籽油加工下脚油料，40g/L：NaNO₃，4g/L；NaCl，1.5g/L；KCl，1.5g/L；CaCl₂·2H₂O，0.2g/L；KHxPO₄，4g/L；Na₂HPO₄·12H₂O，4g/L；MgSO₄，0.3g/L；微量元素，2.5mL/L，余量为水。所述微量元素组成如下:FeCl₃·6H₂O 0.08g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.75g/L，CuSO₄·5H₂O 0.075g/L，MnSO₄·H₂O 0.75g/L，H₃BO₃，0.15g/L，余量为水。

3、50L发酵罐发酵生产鼠李糖脂

将摇瓶菌种接种到50L发酵罐中，接种量5%（v/v），碳源浓度为5%，发酵过程温度控制在38℃，通气量为1.0vvm，搅拌转速300rpm，发酵周期4天。

发酵培养基组成如下：菜籽油加工下脚油料，70g/L；NaNO₃，8g/L；NaCl，1.5g/L；KCl，1.5g/L；CaCl₂·2H₂O，0.2g/L；KH₂PO₄，4g/L；Na₂HPO₄·12H₂O，4g/L；MgSO₄，0.3g/L；微量元素，2.5mL/L，余量为水。

发酵罐培养2天多时，泡沫开始溢满回收器顶部而触发泡沫感应喷雾装置，通过95%的乙醇雾沫进行高效消泡，至发酵结束时（3.5天），每次喷雾所用乙醇体积用量小于发酵液体积的0.5%，累计用量不超过4.5%。

4、将发酵液灭菌后，通过30kDa的聚砜中空纤维超滤组件去除菌体，获得去菌体鼠李糖脂发酵液。

5、浓缩鼠李糖脂的制备：在去菌体发酵液中加入酸（盐酸或硫酸），调节溶液Ｐｈ至3.5，静置4ｈ，倾去上清液，收集底部酸沉降物，得到含糖脂78％的浓缩鼠李糖脂产品。

6、用本实施例得到的浓缩产品的鼠李糖脂含量达到780g/L。

实施例3：鼠李糖脂作为生物农药的应用

1、鼠李糖脂对番茄疫霉的菌落与菌丝体生长具有抑制效果

所用的真菌孢子为番茄晚疫病疫霉菌，所用的鼠李糖脂发酵液经300～1000倍数稀释后成为含20～200ppm（mg/L）的鼠李糖脂溶液。将浓度为0～200ppm的鼠李糖脂发酵液配制马铃薯琼脂培养基（PDA），并在75mm培养皿内混合均匀、凝固后，在其中央接入培养5天的番茄疫霉菌饼，25～27℃，恒定湿度，黑暗培养，2天后测定各组菌落半径，计算抑制率。如附图1所示，浓度为150ppm的鼠李糖脂发酵液对于疫霉孢子的菌落生长抑制率达到54%。

将去菌体鼠李糖脂发酵液配制马铃薯液体培养液（PDB），并接入一定浓度的番茄疫霉孢子悬浮液，25～27℃，摇床培养，转速120rpm，2天后测定各组菌丝体增重。如附图2所示，浓度为150ppm的鼠李糖脂发酵液对于疫霉的菌丝生长抑制率达到78%。

2：鼠李糖脂发酵液对灰霉的菌落与菌丝体生长抑制效果

所用的真菌孢子为灰霉菌，采用配制马铃薯琼脂培养基（PDA）中添加浓缩鼠李糖脂，使鼠李糖脂有效浓度达50-150ppm，两者在75mm培养皿内混合均匀、凝固后，在其中央接入培养5天的灰霉菌饼，25～28℃，恒定湿度，黑暗培养，2天后测定各组菌落半径，计算抑制率。如附图3所示，浓度为150ppm的鼠李糖脂发酵液对于灰霉孢子的菌落生长抑制率达到49%。

将马铃薯培养液（PDB）加入不同量的浓缩鼠李糖脂，混合均匀后，接入一定浓度的灰霉孢子悬浮液，25～28℃，摇床培养，转速120rpm，2天后测定各组菌丝体增重。如附图4所示，浓度为150ppm的鼠李糖脂发酵液对于灰霉的菌丝生长抑制率达到90%。

3、鼠李糖脂发酵液对于感染晚疫病的番茄植株抑菌效果

选取健康生长30天的番茄苗，喷洒不同稀释度的去菌体鼠李糖脂发酵液（50～150ppm）后接种番茄晚疫霉孢子悬浮液，10天后，观察到150ppm用量下能够明显抑制番茄晚疫病菌的发生。

实施例4：鼠李糖脂作为农药助剂

发酵得到的鼠李糖脂兼有分散、润湿、增溶和乳化性，表面活性明显好于化学表面活性剂，且在亲水性方面显著改善，温度与化学环境稳定性也较好。该助剂完全符合绿色化学品标准，可广泛应用于各种农药助剂，例如草甘膦、麦草畏、阿维菌素、甲维盐和莠去津等。其中具体例子如下：

1.阿维菌素水乳剂的助剂

阿维菌素是一种大环内酯抗生素类杀虫螨剂，生物活性较高，具有触杀和胃毒作用，杀虫谱广。目前国内大部分产品都是原药含量很低的乳油，使用了大量的甲苯、二甲苯有机溶剂助剂，挥发性极强，污染环境，对人的健康有害。将乳油配成水乳剂可以不用或减少这类溶剂用量。本发明将20%阿维菌素原油（即阿维菌素的二甲苯溶液）、占3%体积分率的食用油、大量的水及鼠李糖脂（2g/L）在搅拌下进行混合，形成均匀呈乳状的1.8％阿维菌素水乳剂。其外观为乳白色溶液，乳化分散性和稳定性试验按GB/1603进行，该水乳剂入水后能迅速、均匀分散于水中，上无浮油，下无沉淀，乳液稳定性合格。该剂型以水作主要溶剂，有机溶剂含量不超过8％，与同类阿维菌素乳油相比，具有不燃不爆、对人畜及环境温和的优点，是无公害瓜果蔬菜生产的首选用药。

2.用作除草剂莠去津水悬浮制剂的助剂

采用含45g/L鼠李糖脂去菌体发酵液作为生物表面活性剂助剂添加到莠去津原药中，当鼠李糖脂含量为1g/L时，可以制备得到均匀悬浮的48%莠去净水悬浮剂，该悬浮剂在30min内未出现明显沉降的莠去津水悬浮剂。进一步加入2g/L的甲基纤维素，悬浮性更好，在45分钟内未出现底部沉积，并具有良好的热贮稳定性和冷贮稳定性。

采用上述配制的莠去津水悬浮剂用于玉米地除草，发现除草效果比市场上可售的莠去津水悬浮剂具有更好，可以在降低30%的用量下达到类似的除草效果。

实施例5：鼠李糖脂作为肥料助剂

供试品种为番茄苗。种子播于湖州青铜桥底下的运河边土表，用细砂土覆盖，留苗50株，基肥用量为Ｎ0.15ｇ/ｋｇ、Ｋ₂ＨPO₄ 0.3ｇ/ｋｇ.出苗20天后进行叶面喷施处理，此后每星期喷施1次，共喷施3次，至出苗41天观察番茄苗的表观营养状态及测定每株生物质量。每株喷施混合液10ｍｌ。共设5个处理：1）叶面喷施蒸馏水；2）叶面喷施基肥，3）叶面喷施含鼠李糖脂1g/L的基肥混合液；4）叶面喷施含鼠李糖脂2.5g/L的基肥混合液；5）叶面喷施含鼠李糖脂4g/L的基肥混合液。各处理组设10株作为平行试验。喷施液均稀释300倍。喷施基肥的各组，其叶片数目、面积和光泽度均好于对照组（蒸馏水），而添加了鼠李糖脂的基肥喷施组又明显好于仅喷施基肥组，至于不同鼠李糖脂浓度的各组间无明显差别。通过测定每株生物量可知，喷施叶面肥较对照促进了番茄苗期的生物量提高，而加入表面活性剂后叶面肥的肥效又得到进一步提高。比较有鼠李糖脂的处理组3、处理组4和对照组2，发现前两者的苗重（番茄苗鲜重）分别比后者增加15.2和19.9%，说明加入表面活性剂后的叶面肥具有明显促进养分吸收和植物生长的效果。

实施例6：在饲料添加剂中的应用

饲料工业是利用动物营养技术使粮食及其副产物更有效地转化为畜产品，最大限度地缓解人口、生活质量增长与土地、粮食资源匮乏间的矛盾。鼠李糖脂是一种天然的表面活性剂，能促进食物中各种营养物质的乳化和小肠的营养吸收的双重功能。Caco-2细胞源自人结肠癌细胞,体外培养时能自发地进行类似肠道细胞的形态学和生化学上的分化,具有小肠的形态与吸收特征,如形成微绒毛结构、良好的刷状缘及细胞间紧密连接和具有转运糖和氨基酸等的载体转运系统，因此成为体外评价小肠吸收功能的有效且易于操作的经典实验手段。本发明专利采用该体系评价了鼠李糖脂促小肠吸收的作用。具体实现方法如下所述。Caco-2细胞培养48孔跨膜池的微孔滤膜上，培养条件为：37℃、5% CO2、培养基采用含丁酸、1%非必需氨基酸的DMEM高糖培养基。经培养一周，Caco-2细胞的跨膜电阻（TER）值在500-800Ω/cm²，即已达到体内小肠上皮细胞层的紧密连接，然后更换上下层培养基为基础盐溶液（HBSS）,上层培养基添加2mM谷氨酰胺或10mM葡萄糖，迅速收集下层培养基样品用于高效液相色谱（HPLC）法分析葡萄糖（或谷氨酰胺）用，同时分析溶液中乳酸脱氢酶浓度表征细胞损伤程度。经综合评价发现，小于2g/L的鼠李糖脂加量可以提高19%以上的氨基酸和葡萄糖吸收率且对细胞本身无损伤。

实施例7：在生物杀虫剂方面的应用

市售杀虫剂的刺激性强、毒性大，鼠李糖脂溶液为水基型除虫剂，可以杀灭蟑螂与蚜虫。下面以蟑螂为例介绍其使用效果。

采用含鼠李糖脂31.8g/L的去菌体发酵液为母液与去离子水以1：300的体积比配制灭蟑螂溶液。实验室试验是在变长为5cm的正方体玻璃方箱内进行，内有军事医学科学院提供的敏感品系德国小蠊20只，按1ml/m3剂量直接喷洒，进行三次重复试验。喷洒一次，蟑螂一天后密度下降73％，两天后无蟑螂幸存。

现场杀灭蟑螂分诱捕和直接喷洒两种。在蟑螂较多的底层阴湿实验室地面角落放置装有20ml鼠李糖脂灭蟑螂溶液的250ml烧杯，过夜后在烧杯及附近出现十几个已死亡的蟑螂。或向正跑动的蟑螂直接喷洒鼠李糖脂灭蟑螂溶液，连续喷洒两次，蟑螂迅即停止运动而死亡。

实施例8：作为污泥脱水剂的应用

油泥均匀乳化的泥浆污水取自齐鲁石化。取5个带刻度的50ml试管，分别加入30ml齐鲁石化泥浆污水，然后依次加入40g/L鼠李糖脂去菌体发酵液0、0.25ml、0.5ml、1ml和1.5ml。再置于旋混仪上高速混合2分钟，于室温静置4h，观察上层水自然分层的高度占整个测试高度的分率，即破乳率。对0～1.5ml的去菌体发酵液的加量，破乳率依次从无糖脂对照组的28%增加到75%，脱水效果显著，使污泥处理量可以从72%缩减到25%。可见，鼠李糖脂发酵液对石化企业由油、水和泥乳化较好的泥浆溶液具有较好的破乳作用，通过提高含油污泥的脱水率来显著降低泥浆处理量。

上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种鼠李糖脂发酵液作为生物农药的应用，其特征在于，所述鼠李糖脂通过以下步骤制备得到：

（1）菌种培养：将铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa ZJU-211菌种接种到摇瓶种子培养基培养，温度为32-38 ^oC，摇床转速120-200rpm，培养24-48h得到摇瓶菌种；

（2）发酵：将摇瓶菌种接种到发酵罐中，利用发酵培养基培养，接种体积分率为3-10%，发酵过程温度控制在32-38 ^oC，通气量为0.2-1.5 vvm，搅拌转速200-500rpm，发酵周期3-5天；在发酵的中、后期，溢出泡沫回收器的泡沫采用乙醇消泡后返回发酵罐；发酵结束后得含菌体的发酵液；

（3）超滤除菌体：发酵液通过中空纤维膜过滤去除菌体，得到去菌体发酵液，其含有鼠李糖脂35-50g/L；

（4）浓缩分离：在去菌体发酵液中加入酸，调节溶液pH至3.0～4.0，静置1～12h，倾去上清液，收集底部酸沉降物，得到含糖脂70～90％的浓缩鼠李糖脂产品；

所述步骤（2）中，所述摇瓶种子培养基组成如下：废弃油脂，30～40 g/L；NaNO₃，2～4 g/L；NaCl，0.5～1.5 g/L；KCl，0.5～1.5 g/L；CaCl₂·2H₂O，0.05～0.2 g/L；KH₂PO₄，2～4 g/L；Na₂HPO₄·12H₂O，2～4 g/L；MgSO₄，0.1～0.3 g/L；微量元素，1.5～2.5 mL/L；余量为水；所述微量元素组成如下: FeCl₃·6H₂O，0.01～0.08 g/L； ZnSO₄·7H₂O，0.1～0.75 g/L；CuSO₄·5H₂O，0.01～0.075 g/L；MnSO₄·H₂O，0.1～0.75 g/L；H₃BO₃，0.01～0.15 g/L；余量为水；

所述步骤（3）中，所述发酵培养基组成如下：废弃油脂，30～100 g/L：NaNO₃，4～8 g/L；NaCl，0.5～1.5 g/L；KCl，0.5～1.5 g/L；CaCl₂·2H₂O，0.05～0.2 g/L；KH₂PO₄，2～4 g/L；Na₂HPO₄·12H₂O，2～4 g/L；MgSO₄，0.1～0.3 g/L；微量元素，1.5～2.5 mL/L；余量为水；所述微量元素组成如下: FeCl₃·6H₂O，0.01～0.08 g/L；ZnSO₄·7H₂O，0.1～0.75 g/L；CuSO₄·5H₂O，0.01～0.075 g/L；MnSO₄·H₂O，0.1～0.75 g/L；H₃BO₃，0.01～0.15 g/L；余量为水。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鼠李糖脂作为抑制或杀灭植物真菌病害的生物农药。

3.一种鼠李糖脂作为生物杀虫剂的应用，其特征在于，所述虫为蟑螂、蚜虫，所述鼠李糖脂通过以下步骤制备得到：

（1）菌种培养：将铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa ZJU-211菌种接种到摇瓶种子培养基培养，温度为32-38 ^oC，摇床转速120-200rpm，培养24-48h得到摇瓶菌种；

（2）发酵：将摇瓶菌种接种到发酵罐中，利用发酵培养基培养，接种体积分率为3-10%，发酵过程温度控制在32-38 ^oC，通气量为0.2-1.5 vvm，搅拌转速200-500rpm，发酵周期3-5天；在发酵的中、后期，溢出泡沫回收器的泡沫采用乙醇消泡后返回发酵罐；发酵结束后得含菌体的发酵液；

（3）超滤除菌体：发酵液通过中空纤维膜过滤去除菌体，得到去菌体发酵液，其含有鼠李糖脂35-50g/L；

（4）浓缩分离：在去菌体发酵液中加入酸，调节溶液pH至3.0～4.0，静置1～12h，倾去上清液，收集底部酸沉降物，得到含糖脂70～90％的浓缩鼠李糖脂产品；

所述步骤（2）中，所述摇瓶种子培养基组成如下：废弃油脂，30～40 g/L；NaNO₃，2～4 g/L；NaCl，0.5～1.5 g/L；KCl，0.5～1.5 g/L；CaCl₂·2H₂O，0.05～0.2 g/L；KH₂PO₄，2～4 g/L；Na₂HPO₄·12H₂O，2～4 g/L；MgSO₄，0.1～0.3 g/L；微量元素，1.5～2.5 mL/L；余量为水；所述微量元素组成如下: FeCl₃·6H₂O，0.01～0.08 g/L；ZnSO₄·7H₂O，0.1～0.75 g/L；CuSO₄·5H₂O，0.01～0.075 g/L；MnSO₄·H₂O，0.1～0.75 g/L；H₃BO₃，0.01～0.15 g/L；余量为水；

所述步骤（3）中，所述发酵培养基组成如下：废弃油脂，30～100g/L：NaNO₃，4～8 g/L；NaCl，0.5～1.5 g/L；KCl，0.5～1.5 g/L；CaCl₂·2H₂O，0.05～0.2 g/L；KH₂PO₄，2～4 g/L；Na₂HPO₄·12H₂O，2～4 g/L；MgSO₄，0.1～0.3 g/L；微量元素，1.5～2.5 mL/L；余量为水；所述微量元素组成如下: FeCl₃·6H₂O，0.01～0.08 g/L；ZnSO₄·7H₂O，0.1～0.75 g/L；CuSO₄· 5H₂O，0.01～0.075 g/L；MnSO₄·H₂O，0.1～0.75 g/L；H₃BO₃，0.01～0.15 g/L；余量为水。