KR100940231B1 - 람노리피드를 생성하는 슈도모나스속 ｅｐ-3와 이를 이용한 진딧물 방제법 - Google Patents

람노리피드를 생성하는 슈도모나스속 ｅｐ-3와 이를 이용한 진딧물 방제법 Download PDF

Info

Publication number
KR100940231B1
KR100940231B1 KR1020090067054A KR20090067054A KR100940231B1 KR 100940231 B1 KR100940231 B1 KR 100940231B1 KR 1020090067054 A KR1020090067054 A KR 1020090067054A KR 20090067054 A KR20090067054 A KR 20090067054A KR 100940231 B1 KR100940231 B1 KR 100940231B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pseudomonas
strain
aphid
aphids
culture
Prior art date
Application number
KR1020090067054A
Other languages
English (en)
Inventor
김인선
채동현
김슬기
Original Assignee
전남대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전남대학교산학협력단 filed Critical 전남대학교산학협력단
Priority to KR1020090067054A priority Critical patent/KR100940231B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100940231B1 publication Critical patent/KR100940231B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/02—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
    • A01N43/14—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings
    • A01N43/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings with oxygen as the ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 신규한 비병원성 슈도모나스 속 미생물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 국내토착 미생물로서 람노리피드를 생산하고, 계면활성 및 살충활성을 가지는 슈도모나스 속(pseudomonas sp.) EP-3 균주 및 이를 이용한 진딧물 방제제 및 방제방법에 관한 것으로, 이는 시설재배 온실 및 농가포장에 적용시 우수한 방제효과를 나타내어 기존에 알려진 진딧물 방제용 미생물 균주와 더불어 친환경농업에서 진딧물 방제제로 효과적으로 사용될 수 있어 농작물의 생산성을 높이는데 크게 기여할 것이다.
슈도모나스, 계면활성, 진딧물

Description

람노리피드를 생성하는 슈도모나스속 ＥＰ-3와 이를 이용한 진딧물 방제법{Rhamnolipids-producing Pseudomonas sp. EP-3, and its use for control of aphids}
본 발명은 신규한 비병원성 슈도모나스 속 미생물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 국내토착 미생물로서 람노리피드를 생산하고, 계면활성 및 살충활성을 가지는 슈도모나스 속(pseudomonas sp.) EP-3 균주 및 이를 이용한 진딧물 방제제 및 방제방법에 관한 것이다.
진딧물은 시설재배지에서 연중 지속적으로 발생하는 농업의 주요한 해충 중 하나로서 세대의 반복이 짧아 약제에 대한 저항성이 높다. 진딧물이 매개하는 식물성 바이러스와 이 해충이 분비한 감로로 인하여 발생되는 식물병은 작물의 생산량을 현저하게 감소시킨다. 이에 농가에서는 진딧물을 방제하기 위하여 많은 노력을 기울이고 있으며, 대표적인 방제법으로 합성농약을 사용하고 있다. 하지만 합성농약의 사용은 환경과 인축에 부작용을 가져올 수 있기 때문에 우리나라는 합성농약의 사용량을 줄이거나 다른 방제법에 대한 연구를 추진하고 있다. 합성농약의 대체 방안으로는 천연물이나 미생물을 이용한 해충방제를 들 수 있는데, 천연식물제제의 개발에 대한 연구는 활발하게 진행되고 있으나 미생물제제에 대한 연구는 매우 미비한 실정이다. 따라서 진딧물 방제용 미생물 자원의 확보와 더불어 이를 농가현장에 직접 적용할 수 있는 진딧물 방제법 개발에 대한 연구가 필요하다.
이에 본 발명자들은 시설재배지에서 복숭아혹진딧물의 효과적인 방제를 위하여, 농가현장에 살포시 환경오염의 폐해 및 생태계 악영향의 가능성이 낮고, 이 진딧물에 대한 저항성 발현이 적으며, 농가현장에서도 복숭아혹진딧물 방제효율이 우수한 미생물의 확보와 더불어, 이를 이용한 복숭아혹진딧물 방제제 및 방제방법을 개발하고자 지속적인 연구를 수행하였다.
그 결과, 기존에 보고된 미생물을 이용한 진딧물 방제 기술과는 다른 것으로 신규한 미생물인 슈도모나스 속 EP-3이 복숭아혹진딧물에 대한 우수한 살충력 및 계면활성능이 있어, 시설재배지에서 직접 이 균주가 복숭아혹진딧물 방제용 미생물 제제로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서 본 발명의 목적은 복숭아혹진딧물에 대해 살충력을 갖는 슈도모나스 속(pseudomonas sp .) EP-3을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주의 배양방법 및 이의 배양액을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유효성분으로서, 상기 균주, 또는 이의 배양액을 포함하는 진딧물 방제제를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방제제를 식물 또는 그의 서식지에 적용하는 단계를 포함하는, 진딧물 방제방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 국내토착 미생물로서 하기 화학식 1의 물질을 생산하고, 계면활성 및 살충활성을 가지는 슈도모나스 속(pseudomonas sp.) EP-3 균주(기탁번호 KACC 91475P)를 제공한다.
Figure 112009044825679-pat00001
이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 슈도모나스 속 EP-3 균주는 시설재배지 토양으로부터 분리된 국내토착 미생물로서, 질소고정 미생물에 속하며, 진딧물에 대한 살충물질을 생산하며 슈도모나스 속 ISSDS-402(EF620441) 균주와 유전자 분석을 기초로한 계통학적 분류상에서는 유사하나, 아직 슈도모나스 속 ISSDS-402(EF620441) 균주에서는 보고된 바가 없는 계면활성 및 진딧물 살충활성 모두를 가지는 특징이 있다.
보다 구체적인 예로 농가현장 시설재배지에서 채취한 토양 1 g을 1% 경유를 함유한 무기염류 배지에 넣고 5일 동안 배양 후 진딧물에 대한 살충율을 조사하여 가장 활성이 높은 균주를 선발하였으며, 균주의 구조를 투과전자현미경으로 관찰한 결과 크기가 2 내지 3(길이)×1 ㎛(폭)이었으며 짧은 막대모양을 하고 있고, 4 ㎛ 크기의 편모를 가지고 있었다. 도 1을 참조한다.
상기 선발된 균주를 동정하기 위하여 16S 리보솜 유전자(서열번호 1)를 분석 하였으며 그 분석 결과, 비병원성 슈도모나스 속(pseudomonas sp .) 그람 음성세균으로 계통학적 분석을 통해 대기 중 질소를 고정하는 능력이 있는 것으로 보고된 슈도모나스 속 ISSDS-402(EF620441) 균주와 분류학적으로 99.6% 수준으로 유사한 것을 확인되었다, 도 3을 참조한다.
그러나 기존에 보고된 바 있는 슈도모나스 속 ISSDS-402(EF620441) 균주에서는 아직 보고된 바가 없는 계면활성 및 진딧물 살충활성 모두를 가지는 신규한 균주임을 확인하였고, 이를 슈도모나스 속 EP-3이라고 명명하여, 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하고 2009년 6월 17일 기탁번호 KACC 91475P를 부여받았다.
본 발명은 슈도모나스 속(pseudomonas sp .) EP-3 균주(기탁번호 KACC 91475P)의 배양액을 제공한다.
또한, 본 발명은 슈도모나스 속(pseudomonas sp .) EP-3 균주(기탁번호 KACC 91475P)의 배양방법에 있어서, 상기 균주를 식물성 오일을 함유하는 배지에서 23 내지 28℃, 100 내지 200 rpm, 3 내지 5일 동안 진탕 배양하는 단계를 포함하는, 배양방법을 제공하며, 상기 식물성 오일은 대두유인 것을 특징으로 한다.
보다 구체적인 예로, 슈도모나스 속 EP-3 균주를 LB 배지에 하룻밤 배양한 다음 배양액 일부(1%, v/v)를 0.2% 콩기름을 탄소원으로 함유한 무기염류 배지에 접종하고 25℃, 150 rpm에서 4일 동안 진탕 배양하여 배양액을 수득하였다.
상기 수득된 슈도모나스 속 EP-3 배양액은 살충성 곰팡이 포자현탁액을 이용하는 기존의 진딧물 방제 방법과는 전혀 다른 것으로, 본 발명의 슈도모나스 속 EP-3 배양액은 아직까지 진딧물에 대한 살충물질로서 어디에서도 보고된 바 없는 세균배양액을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 유효성분으로서, 슈도모나스 속(pseudomonas sp .) EP-3 균주(기탁번호 KACC 91475P), 또는 슈도모나스 속(pseudomonas sp .) EP-3 균주(기탁번호 KACC 91475P)의 배양액을 포함하는 진딧물 방제제를 제공하며, 시설재배지에서 실제로 진딧물, 특히 복숭아혹진딧물에 대해 우수한 살충력을 나타내는 것을 특징으로 한다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 슈도모나스 속 EP-3 균주를 LB 배지 혹은 0.2% 콩기름을 탄소원으로 함유한 무기염류 배지에서 진탕 액체 배양한 후 수득된 균주의 배양액을 진딧물 방제용으로 사용한다.
상기 본 발명에 따른 슈도모나스 속 EP-3 균주의 배양액은 슈도모나스 속 EP-3 균주가 생산하는 살충물질을 함유하고 있는 것으로, 이는 하기 식 1의 생물학적 계면활성제인 람노리피드 일종으로서 이 물질을 함유한 슈도모나스속 EP-3의 배양액을 이용한 진딧물방제에 사용하는 것을 특징으로 한다.
Figure 112009044825679-pat00002
상기 화학식 1의 살충물질은 2개의 람노스(rhamnose)와 서로 다른 2개의 지방산이 연결된 다이람노리피드(dirhamnolipid)인 것으로, 보다 구체적인 예로, 다이람노리피드를 복숭아혹진딧물 2령 약충이 이식된 배추 잎면에 농도별로 살포한 후 진딧물 살충율을 조사한 결과 10 ㎍ 이상 처리 시 100%에 가까운 진딧물 살충율을 보였으며, 반수치사량은 0.4 ㎍ 수준인 것을 확인하였다. 이는 다이람노리피드가 진딧물 살충력을 가지고 있다는 것으로, 본 발명에서 다이람노리피드의 살충력을 최초로 확인한 결과이다. 도 9를 참조한다.
상기 본 발명에 따른 방제제를 식물 또는 그의 서식지에 적용하는 단계를 포함하는, 진딧물 방제방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방제제는 슈도모나스 속 EP-3 및 이의 배양액으로, 상기 배양된 배양배지에서는 슈도모나스 속 EP-3 균주를 106 내지 1010/㎖의 수준의 CFU(coloning forming unit)를 얻을 수 있으며, 이 배양액을 이용한 진딧물의 방제는 배양액의 원액 또는 일정 희석액을 살포함으로써 살충효과를 얻을 수 있다.
상기 본 발명에 따른 방제제 및 방제방법은 국내토착 신규 미생물을 이용한 것이기 때문에 국내포장에 적용하는데 용이한 점이 많으며, 균주 자체를 사용하는데 있어서 검역의 문제가 전혀 없는 장점이 있으며, 또한 시설재배 농가포장에 적용한 경우에도 진딧물에 대한 살충력이 우수한 효과가 있어, 시설재배지에서 실제로 진딧물, 특히 복숭아혹진딧물에 대해 우수한 살충력을 나타내어 화학농약을 대체할 수 있는 기능적 장점을 확인하였다.
본 발명에 따른 슈도모나스 속 EP-3은 농기계 기름에 오염된 시설재배지 토양으로부터 분리된 것으로, 이는 국내토착 신규 미생물이기 때문에 슈도모나스 속 EP-3을 이용한 진딧물 방제는 국내포장에 적용하는데 용이한 점이 많으며, 균주 자체를 사용하는데 있어서 검역의 문제가 전혀 없는 장점이 있다.
본 발명에 따른 슈도모나스 속 EP-3 균주 및 이의 배양물은 식물 예를 들어, 고추에 발생한 복숭아혹진딧물을 우수한 살충력을 가지며, 시설재배 온실 및 농가포장에 적용시 우수한 방제효과를 나타내어 기존에 알려진 진딧물 방제용 미생물 균주와 더불어 진딧물 방제제로 효과적으로 사용될 수 있어 농작물 재배에 적용 시 농작물의 생산성을 높일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 살충물질은 화학적으로 합성된 것이 아닌 생물학적으로 얻어진 것으로서, 친환경농업 예를 들어, 무농약 작물 시설재배에서 진딧물 방 제에 적용될 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에 종사하는 업자에게는 명백한 것이다.
이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다. 또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.
[실시예 1] 진딧물 살충활성 미생물의 분리 및 배양
농가현장 시설재배지에서 채취한 토양 1 g을 1% 경유를 함유한 무기염류 배지에 넣고 5일 동안 배양하였다. 배양액을 1%(v/v) 수준으로 접종하면서 5회 계대배양 한 후 배양액 일부를 LB 한천배지에 도말하여 25℃에서 배양하였다.
상기 3일 후 LB 한천배지에 생성된 콜로니들을 각각 LB 액체 배지에 24 시간 배양 후 진딧물에 대한 살충율을 조사한 다음 가장 활성이 높은 균주를 선발하였다. 상기 선발된 진딧물 활성이 가장 높은 균주를 LB 한천배지에서 반복적인 계대배양을 통해 순수 분리하여 얻은 다음 그의 구조를 투과전자현미경으로 관찰한 결과 도 1에서도 확인할 수 있듯이, 균주의 크기는 2 내지 3(길이)×1 ㎛ (폭)이었으며 짧은 막대모양을 하고 있고, 4 ㎛ 크기의 편모를 가지고 있었다. 순수 분리된 미생물은 16S 리보솜 유전자 분석상 비병원성 슈도모나스 속(pseudomonas sp.) 그람음성세균으로 동정되었다.
[실시예 2] 염기서열 분석에 의한 진딧물 살충활성 미생물의 동정
상기 실시예 1에서 순수 분리된 진딧물 살충활성 미생물의 동정을 위해 염색체 DNA(chromosome DNA)를 추출한 후 16S 리보솜의 유전자 서열을 분석한 결과 도 2의 염기서열(서열번호 1)을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 순수 분리된 진딧물 살충활성 미생물은 네이버-조이닝(Neighbor-joining)법에 의한 계통학적 분석을 통해 확인한 결과 도 3에서도 확인할 수 있듯이, 대기 중 질소를 고정하는 능력이 있는 것으로 보고된 슈도모나스 속 ISSDS-402(EF620441) 균주와 분류학적으로 99.6% 수준으로 유사하였다.
상기 실시예1에서 순수 분리된 진딧물 살충활성 미생물은 슈도모나스 속 ISSDS-402(EF620441) 균주와 유전자 분석을 기초로한 계통학적 분류상에서는 유사하였으나, 아직 슈도모나스 속 ISSDS-402(EF620441) 균주에서는 보고된 바가 없는 계면활성 및 진딧물 살충활성 모두를 가지는 신규한 미생물임을 확인하고, 이를 슈도모나스 속 EP-3이라고 명명하고, 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 2009년 6월 17일 기탁번호 KACC 91475P를 부여받았다.
또한, 본 발명의 슈도모나스 속 EP-3는 항생제 앰피실린(ampicillin)과 카나마이신(kanamycin)에 대해 각각 100 ㎍/㎖ 수준에서 내성을 보이는 것을 확인하였다.
[ 실시예 3] 슈도모나스 속 EP -3의 계면활성능
상기 실시예 1의 신규 미생물 슈도모나스 속 EP-3의 계면활성능을 조사하기 위해 LB 액체배지에 배양한 후 시간별 균주의 생장에 따른 흡광도와 Du Nouy tensionmeter(Du Nouy 氏, Model No. 3010, Japan)를 이용하여 실온에서 표면장력을 측정하였다.
그 결과 도 4에서도 확인할 수 있듯이, 배양시간이 지남에 따라 슈도모나스 속 EP-3 배양액의 표면장력이 배양 72 시간 이후에는 37 mN/m 수준으로 점차적으로 감소하는 것을 확인하였으며, 이를 통하여 슈도모나스 속 EP-3가 생물학적 계면활성제를 생산하는 능력을 보유하고 있음을 알 수 있었다.
[ 실시예 4] 슈도모나스 속 EP -3의 살충활성 및 살충물질 분리
상기 실시예 1의 신규 미생물 슈도모나스 속 EP-3을 LB 배지에 하룻밤 배양한 다음 배양액 일부(1%, v/v)를 0.2% 콩기름을 탄소원으로 함유한 무기염류 배지에 접종하고 25℃, 150 rpm에서 4일 동안 진탕 배양하였다. 이때 무기염류 배지의 조성은 리터당 2.0 g KH2PO4, 2.0 g Na2HPO4, 0.4 g (NH4)2SO4, 0.4 g MgSO4ㆍ7H2O, 그리고 리터당 미량원소 용액 10%(v/v)로 구성하였다. 미량원소 용액은 리터당 0.1 g Al(OH)3, 0.05 g SnCl2ㆍ2H2O, 0.05 g KI, 0.05 g LiCl, 0.08 g MnSO4ㆍ4H2O, 0.05 g H3BO3, 0.1 g ZnSO4ㆍ7H2O, 0.1 g CoCl2ㆍ6H2O, 0.1 g NiSO4ㆍ6H2O, 0.05 g BaCl2, 0.05 g (NH4)6Mo7Oㆍ4H2O로 구성되었다.
상기 진탕 배양된 배양원액을 진딧물에 살포하여 24 시간 후 살충율을 조사하였다. 살충율은 무처리구 복숭아혹진딧물 생충수에 대한 처리구 복숭아혹진딧물 생충수 비율를 기준으로 하는 Abbott's 식, 살충율={[(무처리구 진딧물 생충수 - 처리구 진딧물 생충수)] / 무처리구 진딧물 생충수}×100에 의해 계산하였다. 그 결과를 도 5와 6에 나타내었다.
도 5에서 보여준 바와 같이, LB와 0.2% 콩기름 함유 무기염류에서 배양한 EP-3 균주 배양액의 진딧물 살충율이 각각 90% 이상의 수준으로 조사되어 본 발명의 균주 배양액 역시 살충효과가 있는 것을 확인하였으며, 이는 배양액에 살충물질이 함유되어 있음을 알 수 있었다.
이에 상기 살충물질을 조사하기 위해 EP-3 균주 배양액을 원심분리 한 후 상징액을 헥산, 에틸아세테이트, pH 2 조건 에틸아세테이트로 추출하였으며, 상기 추출액들의 진딧물 살충율을 조사한 결과 에틸아세테이트 추출물에서 가장 높은 활성이 조사되었다.
상기 가장 높은 활성을 가지는 에틸아세테이트 추출물을 실리카겔 크로마토그래피 정제를 실시하였다. 실리카겔 정제는 실리카겔 50 g을 유리컬럼(지름 3.5×길이 21 cm)에 100% 클로르포름으로 습식 충진한 다음 상기에서 얻은 에틸아세테이트 추출물을 칼럼에 넣고 클로르포름(CHCl3),에틸아세테이트(EtOAC),메탄올(MeOH) 용매계를 용출하여 실시하였다. 정제에 사용된 용매계는 CHCl3-EtOAc=10:0(v:v)→9:1(v:v)→4:1(v:v)→7:3(v:v)→3:2(v:v)→1:1(v:v)→2:3(v:v)→3:7(v:v)→1:4(v:v)→1:9(v:v) 그리고 EtOAc-MeOH=10:0(v:v)→9:1(v:v)→4:1(v:v)→7:3(v:v)→3:2(v:v)→1:1(v:v)→2:3(v:v)→3:7(v:v)의 순서로 용출하였다. 각각의 용출액을 수득하여 복숭아혹진딧물에 대한 살충력을 조사한 결과 EtOAc-MeOH=4:1(v:v)→7:3(v:v) 분획에서 높은 살충활성이 있는 것을 확인하였다.
이에 실리카겔 정제에서 얻은 활성분획을 Sephadex-LH20 칼럼을 이용하여 다시 정제하였다. Sephadex-LH20 100 g을 100% 메탄올로 유리컬럼(지름 3.5×길이 21 cm)에 충진한 후, 상기의 활성 분획물을 컬럼에 넣고 메탄올을 용출하면서 10 ㎖씩 분취하였다. 분취된 용출액을 각각 농축하여 진딧물 살충활성을 조사하여 살충활성 분획을 얻은 다음, 대전 에어로졸 탐지기(charged aerosol detector)가 구비된 액체크로마토그래피로 분석하여 단일피크 화합물을 모았다. 이때 사용된 칼럼은 ODS(지름 7.0 mm×길이 30 cm)로서 용매는 40%(v/v) 아세토나이트릴이 함유된 수용액을 이용하였다.
상기 액체크로마토그래피에서 정제한 활성분획은 농축한 다음 핵자기공명(nuclear magnetic resonance, NMR), 매트릭스 지원 레이저 이탈 이온화 비행시간형 질량분석장치((Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF/MS), 그리고 가스 크로마토그라피-질량분석기(GC/MS)로 분석하여 살충물질의 화학구조를 예측하였다.
MALDI-TOF MS 분석결과 도 6에서도 확인할 수 있듯이, 분자량이 [M+Na]+ 값이 673.2664, [M+Na2]+ 값이 695.2392인 화합물과 [M+Na]+ 값이 701.2792, [M+Na2]+ 값이 723.2468인 화합물이 각각 검출되었으며, 이는 기존에 보고(Price 등, 2009, Carbohydrate Research, 344: 204-209)된 것과 유사한 분자량을 가진 람노리피드 화합물이었다.
또한 이 화합물을 NMR 분석한 결과 하기 표 1에서 제시한 바와 같이 람노리피드 화합물의 전형적인 경향을 가지는 것을 확인하였다.
Figure 112009044825679-pat00003
상기 분리한 람노리피드를 80℃ 수조, pH 9.0 조건에서 가수분해한 다음 가스 크로마토그라피-질량분석기(GC/MS) 분석한 결과 도 7에서 보여준 바와 같이, 3번 탄소에 수산화기를 함유한 C10 지방산과 C12 지방산이 검출되었으며, 이러한 기기분석 결과를 볼 때 분리한 활성물질은 하기 화학식 1에서 보여준 바와 같이 2개 의 람노스(rhamnose)와 서로 다른 2개의 지방산이 연결된 다이람노리피드(dirhamnolipid)임을 알 수 있었다.
Figure 112009044825679-pat00004
[ 실시예 5] 슈도모나스 속 EP -3에서 분리된 다이람노리피드의 진딧물 살충시험
상기 화학식 1의 슈도모나스 속 EP-3 배양액에서 분리한 다이람노리피드를 복숭아혹진딧물 2령 약충이 이식된 배추 잎면에 농도별로 살포한 다음 24시간 후 진딧물 살충율을 조사하였다. 진딧물 살충율을 검정한 결과 도 9에서 보여준 바와 같이, 10 ㎍ 이상 처리 시 100%에 가까운 진딧물 살충율을 보였으며, 반수치사량은 0.4 ㎍ 수준이었다.
이러한 결과는 본 발명 슈도모나스 속 EP-3가 생산하는 다이람노리피드는 진딧물 방제제로서 사용될 수 있음을 확인한 결과이며, 이에 다이람노리피드가 진딧물 살충력을 가지고 있다는 것은 본 발명에서 최초로 확인한 결과이다.
[ 실시예 6] 시설재배 농가포장에서 슈도모나스 속 EP -3에 의한 진딧물 방제시험
농가포장에서 슈도모나스 속 EP-3에 의한 진딧물 살충시험은 복숭아혹진딧물에 감염된 고추시설재배 농가(전남 나주시 남평읍 평산리 492번지 이화철씨 농가)를 선정하여 실시하였다. 시험대상 농가는 시설재배 무농약 고추를 3년 이상 재배해온 농가로서 매년 진딧물에 의한 피해가 매우 심하였다. 이에, 본 발명의 슈도모나스 속 EP-3의 진딧물 살충시험은 복숭아혹진딧물이 발생한 2009년 5월에 실시하였다.
즉, 상기에서와 같이 0.2% 콩기름 무기염류 배지에서 배양한 슈도모나스 속 EP-3의 배양액을 복숭아혹진딧물이 발생한 10개 고추나무 잎 뒷면에 1회 살포한 24 시간 후에 살충력을 조사하였다. 진딧물의 개체 수는 고추나무 당 3개 잎에 붙어있는 진딧물 성충과 약충을 구분하지 않고 조사하였다. 온도는 평균 23 내지 28℃이었다.
살충시험 결과 도 10에서 보는 바와 같이, 슈도모나스 속 EP-3의 배양액이 처리된 진딧물은 고추 잎 뒷면에 붙어서 살충됨을 확인하였으며, 살충효율은 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 70 내지 100% 수준으로서, 자연적인 진딧물 발생이 아니라 인위적으로 진딧물을 식재하여 살충력을 실내 온실에서 시험한 상기 실시예 4 및 5의 결과와 살충력에서 유사한 효과가 있었다.
Figure 112009044825679-pat00005
[실시예 7] 슈도모나스 속 EP-3의 농가현장 배양과 이의 복숭아혹진딧물 살충시험
시판되고 있는 농업해충 방제용 미생물제제는 저장성이 짧고 환경적 영향으로 저장기간 동안 방제 효율이 떨어진다는 단점이 있다. 그 결과 농가에서 미생물을 희석식으로 살포하면 더욱 방제효과가 떨어진다. 그러므로 농가현장에서 미생물을 단시간내에 선택적으로 배양한 다음 직접 배양액의 원액이나 일정 희석액으로 살포하는 방법이 필요하다. 미생물을 선택적으로 배양하기 위해서는 원하는 미생물이 다른 미생물에 우점하여 배양할 수 있는 선택적 기질이 필요하다.
농가에서 사용하는 지하수에는 콩기름을 먹이로 사용하는 미생물이 거의 존재하지 않으므로 본 발명의 슈도모나스 속 EP-3과 같이 기름을 분해하는 미생물은 콩기름을 먹이로 하여 우점하여 배양될 수 있으므로, 농가현장 배양이 쉽게 배양이 가능할 것으로 생각되었다. 이에, 상기에서와 같이 콩기름 0.2%를 탄소원으로 하는 지하수 100 ℓ에 본 발명의 균주를 1%(v/v) 수준으로 접종한 다음 배양하였다.
상기 배양된 균주가 선택적으로 배양되었는지 LB 한천배지와 항생제 앰피실 린(ampicillin)과 카나마이신(kanamycin)을 함유한 LB 한천배지에 각각 평판희석법으로 배양한 결과, 균의 개체수가 LB 배지에서는 3.4×109 CFU/㎖이었으며, 항생제가 포함된 LB 배지에서는 3.9×109 CFU/㎖로 유사하였다.
또한, 상기 조건에서 얻은 균주의 배양액을 10일 간격으로 50일 동안 살충율과 개체수를 조사한 결과를 도 10에 나타낸 바와 같이, 살충율은 90% 이상의 수준으로 유지됨을 확인할 수 있었으며, 개체수는 5.5×106 CFU/㎖ 수준이었다. 미생물의 개체수는 시간이 지남에 따라 점점 감소하였으나, 농가현장에서 배양한 미생물 배양액의 살충효율은 50일 동안 일정한 수준으로 유지되었다. 이러한 결과는 본 발명의 균주가 농가현장에서도 직접 배양될 수 있으며, 얻어진 배양액 중 활성물질의 살충력은 50일 동안 유지됨을 의미한 것으로, 슈도모나스 속 EP-3이 진딧물 방제제로서 사용될 수 있음을 확인한 결과이다.
도 1은 본 발명에 따른 슈도모나스 속 EP-3 균주의 크기 및 편모구조를 보여주는 투과전자현미경 사진이고,
도 2는 본 발명에 따른 슈도모나스 속 EP-3 균주의 16S 리보좀 유전자의 염기서열을 나타낸 것이며;
도 3은 본 발명에 따른 슈도모나스 속 EP-3 균주의 16S 유전자 염기서열 분석에 기초한 분자계통분류학적 위치를 보여주는 도면이고;
도 4는 본 발명에 따른 슈도모나스 속 EP-3의 배양시간에 따른 균의 생장 흡광도와 표면장력의 변화를 나타낸 그래프이며;
도 5는 배양 배지에 따른 본 발명의 슈도모나스 속 EP-3 배양액에 의한 복숭아혹진딧물 살충력을 보여주는 그래프이며;
도 6은 본 발명에 따른 슈도모나스 속 EP-3의 복숭아혹진딧물에 대한 살충물질을 MALDI-TOF/MS로 분석한 결과이며;
도 7은 본 발명에 따른 슈도모나스 속 EP-3의 복숭아혹진딧물에 대한 살충물질을 가수분해 한 다음 GC-MS로 분석한 결과이며;
도 8은 본 발명의 슈도모나스 속 EP-3 균주가 생산하는 살충물질의 농도에 따른 복숭아혹진딧물의 살충율을 나타낸 그래프이며;
도 9는 농가포장 조건에서 본 발명에 따른 슈도모나스 속 EP-3 배양액의 진딧물 살충력을 보여주는 사진이며,
(A: 처리 전, B: 처리 후)
도 10은 농가포장 조건에서 본 발명에 따른 슈도모나스 속 EP-3 배양액내 균의 개체수와 배양액의 진딧물 살충율을 경시적으로 보여주는 그래프이다.
<110> Industry Foundation of Chonnam National University <120> Rhamnolipids-producing Pseudomonas sp. EP-3, and its use for control of aphids <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1260 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. <220> <221> gene <222> (1)..(1260) <223> EP-3 <400> 1 ctatcagatg agcctaggtc ggattagcta gttggtgagg taatggctca ccaaggcgac 60 gatccgtaac tggtctgaga ggatgatcag tcacaccgga actgagacac ggtccagact 120 cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg aaagcctgat ccagccatgc 180 cgcgtgtgtg aagaaggtct tcggattgta aagcacttta agttgggagg aagggtactt 240 acctaatacg tgagtatttt gacgttaccg acagaataag caccggctaa ctctgtgcca 300 gcagccgcgg taatacagag ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcgc 360 gtaggtggtt cgttaagttg aatgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa ctgcatccaa 420 aactggcgag ctagagtatg gtagagggtg gtggaatttc ctgtgtagcg gtgaaatgcg 480 tagatatagg aaggaacacc agtggcgaag gcgaccacct ggactgatac tgacactgag 540 gtgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 600 gtcaactagc cgttgggagc cttgagctct tagtggcgca gctaacgcat taagttgacc 660 gcctggggag tacggccgca aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggc ccgcacaagc 720 ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggcc ttgacatcca 780 atgaactttc cagagatgga ttggtgcctt cgggaacatt gagacaggtg ctgcatggct 840 gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgt aacgagcgca acccttgtcc 900 ttagttacca gcacgtaatg gtgggcactc taaggagact gccggtgaca aaccggagga 960 aggtggggat gacgtcaagt catcatggcc cttacggcct gggctacaca cgtgctacaa 1020 tggtcggtac agagggttgc caagccgcga ggtggagcta atcccataaa accgatcgta 1080 gtccggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagtcgga atcgctagta atcgcgaatc 1140 anaatgtcgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag 1200 tgggttgcac cagaagtagc tagtctaacc ttcgggagga cggttaccac ggtgtgattc 1260 1260

Claims (7)

  1. 하기 화학식 1의 물질을 생산하고, 계면활성 및 복숭아혹진딧물에 대한 살충활성을 가지는 슈도모나스 속(pseudomonas sp.) EP-3 균주(기탁번호 KACC 91475P).
    Figure 112009072335902-pat00006
  2. 제1항에 따른 슈도모나스 속(pseudomonas sp .) EP-3 균주(기탁번호 KACC 91475P)의 배양액.
  3. 유효성분으로서, 제 1항에 따른 슈도모나스 속(pseudomonas sp.) EP-3 균주(기탁번호 KACC 91475P), 또는 제 2항에 따른 슈도모나스 속(pseudomonas sp.) EP-3 균주(기탁번호 KACC 91475P)의 배양액을 포함하는 복숭아혹진딧물 방제제.
  4. 삭제
  5. 제 3항에 따른 방제제를 식물 또는 그의 서식지에 적용하는 단계를 포함하는, 진딧물 방제방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
KR1020090067054A 2009-07-22 2009-07-22 람노리피드를 생성하는 슈도모나스속 ｅｐ-3와 이를 이용한 진딧물 방제법 KR100940231B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090067054A KR100940231B1 (ko) 2009-07-22 2009-07-22 람노리피드를 생성하는 슈도모나스속 ｅｐ-3와 이를 이용한 진딧물 방제법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090067054A KR100940231B1 (ko) 2009-07-22 2009-07-22 람노리피드를 생성하는 슈도모나스속 ｅｐ-3와 이를 이용한 진딧물 방제법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR100940231B1 true KR100940231B1 (ko) 2010-02-04

Family

ID=42082988

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020090067054A KR100940231B1 (ko) 2009-07-22 2009-07-22 람노리피드를 생성하는 슈도모나스속 ｅｐ-3와 이를 이용한 진딧물 방제법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100940231B1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103202295A (zh) * 2010-03-30 2013-07-17 湖州紫金生物科技有限公司 一种鼠李糖脂作为生物农药和生物杀虫剂的应用
US9884883B2 (en) 2015-01-12 2018-02-06 Logos Technologies, Llc Production of rhamnolipid compositions
US10829507B2 (en) 2017-02-06 2020-11-10 Stepan Company Decolorization of concentrated rhamnolipid composition

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Applied Microbilogy and Biotechnology
논문2;Journal of Microbiology and Biotechnology

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103202295A (zh) * 2010-03-30 2013-07-17 湖州紫金生物科技有限公司 一种鼠李糖脂作为生物农药和生物杀虫剂的应用
US9884883B2 (en) 2015-01-12 2018-02-06 Logos Technologies, Llc Production of rhamnolipid compositions
US10829507B2 (en) 2017-02-06 2020-11-10 Stepan Company Decolorization of concentrated rhamnolipid composition

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sarwar et al. Biocontrol activity of surfactin A purified from Bacillus NH-100 and NH-217 against rice bakanae disease
Pavlova et al. Colonization strategy of the endophytic plant growth‐promoting strains of Pseudomonas fluorescens and Klebsiella oxytoca on the seeds, seedlings and roots of the epiphytic orchid, Dendrobium nobile Lindl
JP5331010B2 (ja) バチルス・ベレツェンシス種の菌株ａｈ２の純粋培養物と、植物病原菌を生物学的に制御する生物学的制御用生物
KR100535912B1 (ko) 신규한 미생물 바실러스 아밀로리쿼페이션스 케이티지비0202 및 이를 이용한 식물병원균의 방제방법
Afzal et al. Managing the root diseases of okra with endo-root plant growth promoting Pseudomonas and Trichoderma viride associated with healthy okra roots
Liu et al. Colonization of soybean roots by Bacillus megaterium B 153-2-2
WO2002072795A2 (en) Isolated bacteria for the protection of plants against phytopathogenic fungi and bacteria
Alemu et al. Pseudomonas fluorescens isolates used as a plant growth promoter of Faba Bean (Vicia faba) in vitro as well as in vivo study in Ethiopia
AU2004284329B2 (en) Fungus capable of controlling poaceous plant disease damage, and utilizing the same, controlling agent, method of controlling and biomaterial
KR100940231B1 (ko) 람노리피드를 생성하는 슈도모나스속 ｅｐ-3와 이를 이용한 진딧물 방제법
Rayavarapu et al. Bacillus sp. as potential plant growth promoting rhizobacteria
KR100747701B1 (ko) 길항균주 바실러스 리케니포르미스 ｋ11 및 이를 이용한식물생장촉진 및 생물학적 방제법
CN107674850B (zh) 一种杀根结线虫的莓实假单孢菌Sneb811、代谢产物及应用
Nosir et al. Impact of biological control agents on fusaric acid secreted from Fusarium oxysporum f. sp. gladioli (Massey) Snyder and Hansen in Gladiolus grandiflorus corms
Moreno Velandia Interactions between Bacillus amyloliquefaciens Bs006, Fusarium oxysporum Map5 and Cape gooseberry (Physalis peruviana)
Ongena et al. Amino acids, iron, and growth rate as key factors influencing production of the Pseudomonas putida BTP1 benzylamine derivative involved in systemic resistance induction in different plants
KR101757350B1 (ko) 식물 병원균에 대해 방제활성을 가지는 내생세균인 바실러스 튜린지엔시스 kb1 균주 및 이의 용도
KR20070080775A (ko) 세라티아 프라이뮤티카 ａ２１-４ 균주, 상기 균주를이용한 식물 역병의 생물적 방제 및 상기 균주가 생산하는항균활성 화합물
KR101952421B1 (ko) 신규한 셀라티아 에스피 im2 균주, 및 이를 함유하는 식물병 방제용 조성물
Encheva-Malinova et al. Antimicrobial activity of Antarctic Streptomycetes against pepper bacterial spot causing agents
KR100403896B1 (ko) 채소류 모잘록병균에 길항하는 바실러스 에히멘시스
WO2015111081A2 (en) An herbicidal composition for controlling parthenium weed and strain thereof
JPH11332556A (ja) 新規微生物及びそれを用いたコガネムシ科昆虫の防除方法
KR20200071452A (ko) 메타리지움 아니소플리애 ft319 균주 또는 이를 함유하는 배추좀나방 유충 방제용 미생물제제
KR20150079323A (ko) 토양근권세균 슈도모나스 오티티디스 균주 yjr27을 포함하는 식물병 방제 및 식물 생장촉진용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
A302 Request for accelerated examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20121210

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20131108

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20141230

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151218

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161228

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180102

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191226

Year of fee payment: 11