KR101757350B1 - 식물 병원균에 대해 방제활성을 가지는 내생세균인 바실러스 튜린지엔시스 kb1 균주 및 이의 용도 - Google Patents

식물 병원균에 대해 방제활성을 가지는 내생세균인 바실러스 튜린지엔시스 kb1 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물병을 발생시키는 식물 병원균에 대해 방제활성을 가지는 내생세균인 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 균주, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물의 제조 방법 및 상기 균주 또는 이의 배양액의 유효량을 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 식물 병원균을 방제하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 바실러스 튜린지엔시스 KB1 균주는 식물과의 공생을 통해 식물과 상호작용하는 과정에서 끊임없이 식물에게 유용한 영향을 끼칠 수 있는 장점이 있는 균주로, 특히 식물병 발병시, 식물 병원균의 성장을 저해하는 길항효과를 보다 효과적으로 나타낼 수 있어, 생물학적 방제를 위한 미생물 제제로 매우 유용한 균주임을 확인한 내용에 관한 것이다.

Description

식물 병원균에 대해 방제활성을 가지는 내생세균인 바실러스 튜린지엔시스 KB1 균주 및 이의 용도{Endophytic Bacillus thuringiensis KB1 strain having controlling activity against plant pathogen and uses thereof}
본 발명은 식물 병원균에 대해 방제활성을 가지는 내생세균인 바실러스 튜린지엔시스 KB1 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 식물병을 발생시키는 식물 병원균에 대해 방제활성을 가지는 내생세균인 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 균주, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물의 제조 방법 및 상기 균주 또는 이의 배양액의 유효량을 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 식물 병원균을 방제하는 방법을 제공한다.
생물은 생태계에서 다른 많은 생물들과 공생관계를 이룬다. 식물 또한 토양과 대기 중에서 다양한 균들과 공생하게 되는데, 그 중 하나가 식물의 조직 안에서 존재하는 내생균(Endophytes)이다. 내생균은 식물의 조직 내에서 식물에게 아무런 부정적인 증상 없이 생활사를 함께 하며, 식물과 상호작용하는 과정에서 식물에게 유용한 영향을 주기도 한다. 지금까지 많은 종류의 식물 내에서 다양한 내생균류가 자라고 있는 것이 발견되었고, 그 중에는 자체적인 물질대사를 통해 식물에 특별한 물질을 제공하거나 식물이 특정한 물질대사를 할 수 있도록 유도하는 역할을 하여 식물의 성장을 증가시키는 균도 있다. 또한 식물과의 상호작용하는 과정에서 생산되는 다양한 물질들과 그 자체로의 효능을 통해 항균성을 나타내기도 한다. 일부 초본류에서 발견되는 내생균은 잡초와 병원균으로부터 식물을 보호하는 역할을 하며, 어떤 내생균은 병과 환경 스트레스에 대한 식물의 저항성을 증가시킨다고 한다. 또한 내생균은 항미생물, 항산화성 물질을 생산하는데, 최근 연구에서는 새로 보고된 생물활성 물질의 51%가 내생균에서 분리되었다고 하고, 이를 통해 신규물질탐색의 어려움을 해결할 기대주로 각광받고 있다. 이렇듯 내생균은 유전적 벡터, 이차대사산물 생산자, 생물적 방제 인자로서 다양한 잠재적 유용성을 지니고 있으며 그 중요성이 점차 증가하고 있다.
이러한 내생균에 대한 다양성을 조사하고 식물체 내부, 외부에서 이들의 역할을 연구하는 것은 각종 병에 대한 생물학적 방제의 가능성을 제시하며 미생물 제제로서의 개발과 사용에 활용할 수 있는 좋은 방법이 된다. 또한 생체 활성물질, 동식물용 생육 조절물질, 정밀 생화학물질 등 많은 유용물질들을 미생물로부터 탐색하여 의약품, 식량 및 농업, 환경, 자원 및 에너지 등의 산업 분야에 활용하고, 의약용 및 각종 고부가가치 생산물을 얻기 위하여 발전 폭이 넓어지고 있다.
한편, 한국공개특허 제2003-0063956호에서는 '바실러스 세레우스 Probio-32 및 이를 이용한 선충의 효과적인 방제방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제1996-0701206호에서는 '살충성 단백질 및 균주'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '식물 병원균에 대해 방제활성을 가지는 내생세균인 바실러스 튜린지엔시스 KB1 균주 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 애기장대의 병 발병시, 잎에 존재하는 내생균들로부터 바실러스 튜린지엔시스 KB1 균주를 분리 동정하였고, 상기 균주가 식물 병원균인 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)와 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)의 성장을 저해하는 길항효과를 나타내었고, 식물체 내에서 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)와 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)에 대한 방제 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명을 통해 분리된 바실러스 튜린지엔시스 KB1 균주는 내생균주로, 식물에서 발생하는 식물 병원균의 성장을 저해하는 길항효과를 보다 효과적으로 나타낼 수 있어, 생물학적 미생물 제제로 매우 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물병을 발생시키는 식물 병원균에 대해 방제활성을 가지는 내생세균(Endophytes)인 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 또는 이의 배양액의 유효량을 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 식물 병원균을 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바실러스 튜린지엔시스 KB1 균주는 식물과의 공생을 통해 식물과 상호작용하는 과정에서 끊임없이 식물에게 유용한 영향을 끼칠 수 있는 장점이 있는 내생균주로, 특히, 식물병 발병시 식물 병원균의 성장을 저해하는 길항효과를 보다 효과적으로 나타낼 수 있어, 생물학적 방제를 위한 미생물 제제로 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 균주를 유효성분으로 포함하는 미생물 제제는 농약의 부작용으로 발생하는 환경 오염 및 잔류 농약으로 인한 인체 독성의 위험성이 없는 친환경적인 생물 농약으로 사용될 수 있어, 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 잎에 병원균이 접종된 애기장대(Arabidopsis thaliana) 식물체로부터 접종되지 않은 잎에 존재하는 내생균을 분리하는 과정을 나타낸다.
도 2는 분리된 내생균인 바실러스 튜린지엔시스 KB1(Bacillus thuringiensis KB1)을 다시 애기장대 뿌리에 처리했을 때 잎에서 재분리되는 결과를 나타낸다. (A) 애기장대 뿌리에 증류수(DW) 및 본 발명에서 분리된 내생균인 바실러스 튜린지엔시스 KB1(KB1)를 각각 처리, (B) 상기 (A)의 애기장대 식물체의 잎에서 바실러스 튜린지엔시스 KB1 균주가 재분리되는지 배지 배양을 통해 확인한 결과임.
도 3은 (A) 배지상에서 본 발명의 바실러스 튜린지엔시스 KB1이 식물 병원균인 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)의 성장을 저해하는 것을 붉은색 동그라미 표시 부분에서 확인하였고, (B) 본 발명의 바실러스 튜린지엔시스 KB1이 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)의 성장을 저해하는 효과를 나타내는 것을 GFP 발현양으로 분석한 것이다.
도 4는 본 발명의 바실러스 튜린지엔시스 KB1이 애기장대 뿌리에 전처리 되었을 때 발생하는 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)에 의한 식물 병저항 효과를 질병 발생율(disease incidence, %)로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 바실러스 튜린지엔시스 KB1이 흙에 전처리 되었을 때 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)(A) 및 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)(B)에 의한 토마토 식물 병에 대한 저항성 효과를 사진으로 나타낸 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물병을 발생시키는 식물 병원균에 대해 방제활성을 가지는 내생세균(Endophytes)인 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 균주를 제공한다.
본 발명의 균주는 식물 병원균에 감염된 애기장대의 잎에 존재하는 내생균으로부터 분리되었으며, 분리된 미생물에 대해 단일 콜로니를 취하여 다시 애기장대 뿌리에 처리해 주었고, 다시 잎을 수집하여 LB 아가 플레이트에 도말하였을 때 처리해준 미생물이 재분리되는 것을 확인함으로써 실제 애기장대 내에 존재하는 내생균임을 확인하였다. 분리된 내생균 KB1의 16s rRNA 염기서열의 상동성 분석을 통해 KB1은 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis)와 99% 이상 일치하는 것을 확인하였으며, 이를 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 균주로 명명하였다. 상기 균주는 식물 병원균인 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)와 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)의 성장을 저해하는 길항효과를 나타내었고, 식물체 내에서 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)와 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)에 대한 방제 활성을 나타내었다. 상기 균주는 한국생명공학연구원(KCTC)에 2015년 4월 15일자로 기탁하였다(기탁번호 KCTC18376P).
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 식물 병원균은 보트리티스 속(Botrytis sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 또는 푸사리움 속(Fusarium sp.) 병원균일 수 있으며, 바람직하게는 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae) 또는 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 보트리티스 시네리아에 의해 야기되는 잿빛곰팡이병, 슈도모나스 시린개에 의해 야기되는 줄기 궤양병, 세균성 마름병, 푸사리움 옥시스포룸에 의해 야기되는 시들음병, 덩굴쪼김병 등을 방제할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식물 병원균에 대한 방제용 조성물은 수화제(wettable powder) 또는 액상수화제(suspension concentrate) 형태의 제형일 수 있다. 본 발명에 의한 방제용 조성물은 액상 살균제 형태로 제조될 수 있으며, 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다. 즉 화학 살균제 공급이 제한된 친환경 유기농업에서 이를 극복하기 위한 생물 살균제로 제형화가 가능하다.
본 발명의 수화제는 유효성분(active ingredient)으로서 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 균주 또는 이의 배양액, 흡습제로서 화이트 카본(white carbon), 습윤제로서 소듐 비스[2-에틸헥실]설포숙시네이트, 분산제로서 소듐 리그노설포네이트 및 증량제로서 카올린으로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 10 중량% 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 균주 또는 이의 배양액, 1 중량% 화이트 카본(white carbon), 1 중량% 소듐 비스[2-에틸헥실]설포숙시네이트, 1 중량% 소듐 리그노설포네이트 및 87 중량% 카올린으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 액상수화제는 유효성분(active ingredient)으로서 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 균주 또는 이의 배양액, 습윤제 및 분산제로서 MBSC(Nonylphenol, ethoxylated, monoether with sulfuric acid, sodium salt, Sodium bis[20 ethylhexyl] sulfosuccinate Polyoxyethylene nonylphenol), 부형제로서 이소프로판올 및 증량제로서 물로 이루어질 수 있다. 상기 액상수화제는 바람직하게는 50 중량% 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 균주 또는 이의 배양액, 4 중량% MBSC, 30 중량% 이소프로판올 및 16 중량% 물로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물의 제조 방법을 제공한다. 상기 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 균주의 배양 방법 및 식물병 병원균 방제용 조성물의 제조 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 또는 이의 배양액의 유효량을 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 식물 병원균을 방제하는 방법을 제공한다.
상기 식물 병원균을 방제하는 방법으로는 상기 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 균주를 배양한 배양액의 유효량을 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 처리하여 수행할 수 있다.
본 발명의 '유효량'은 유익한 또는 원하는 결과를 일으키기에 충분한 양으로, 식물 병원균을 방제하기 위해 방제용 조성물을 물로 균일하게 희석한 후 동력살포기와 같은 적절한 살포장치를 이용하여 식물체 및 경작지에 살포할 수 있다. 본 발명의 수화제 또는 액상수화제를 물에 희석하는 경우 수화제 또는 액상수화제의 농도는 유효성분이 생물학적으로 유효한 범위가 될 수 있도록 105 내지 1010 cfu/㎖, 바람직하게는 108 cfu/㎖ 내외로 조절할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 식물 내생균의 분리 및 염기서열 분석
식물에 병 저항성을 증진시켜 미생물 제제로 사용할 수 있는 식물 내생균을 선발하기 위해 모델 식물로 알려진 애기장대의 잎에 존재하는 내생균을 분리하였다. 애기장대 잎에 식물 병원균인 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)를 접종하고, 접종되지 않은 잎의 아포플라스틱 유체로부터 내생균으로 추정되는 미생물들을 분리하였다(도 1). 분리된 미생물에 대해 단일 콜로니를 취하여 다시 애기장대 뿌리에 처리해 주었고, 다시 잎을 수집하여 LB 아가 플레이트에 도말하였을 때 처리해준 미생물이 재분리되는 것을 확인함으로써 실제 애기장대 내에 존재하는 내생균임을 확인하였다(도 2). 분리된 내생균 KB1의 16s rRNA 염기서열(서열번호 1)의 상동성 분석을 통해 KB1은 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis)와 99% 이상 일치하는 것을 확인하였다(표 1).
내생균 KB1의 계통분석
Phylum Strain Bacterial species 16S rRNA(bp)
Firmicutes KB1 Bacillus thuringiensis 989
실시예 2. 내생균의 항균력 검정
식물 내생균인 바실러스 튜린지엔시스 KB1(Bacillus thuringiensis KB1)을 대상으로 균주 배양 여액을 이용하여 식물병원성 곰팡이인 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)에 대한 항균 활성을 조사하였다(도 3A). 그 결과 바실러스 튜린지엔시스 KB1(Bacillus thuringiensis KB1)의 배양 여액을 처리해 주었을 때, 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)의 성장이 강하게 억제되는 것을 확인하였다. 또한 식물 내생균인 바실러스 튜린지엔시스 KB1(Bacillus thuringiensis KB1)을 대상으로 식물 병원성 세균인 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)와의 공동배양을 통해 항균 활성을 조사하였다(도 3B). 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)와 바실러스 튜린지엔시스 KB1(Bacillus thuringiensis KB1)을 각각 같은 농도로 혼합한 현탁액을 LB 아가 플레이트에 배양하였고 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)에 표지된 형광단백질을 통해 성장 정도를 확인하였다. 그 결과 바실러스 튜린지엔시스 KB1(Bacillus thuringiensis KB1)이 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)의 성장을 강하게 저해하는 것을 확인하였다(도 3B).
실시예 3. 내생균의 재배상 방제력 확인
내생균 바실러스 튜린지엔시스 KB1(Bacillus thuringiensis KB1)의 방제력을 실제 식물체 내에서 검정하고자 애기장대와 토마토에서의 재배상 방제력 시험을 실시하였다. 애기장대의 뿌리에 바실러스 튜린지엔시스 KB1(Bacillus thuringiensis KB1)을 각각 처리한 다음, 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)를 처리한 후 병 발생을 유도하고, 5일 후 바실러스 튜린지엔시스 KB1(Bacillus thuringiensis KB1)에 의한 병 발생 억제율을 확인하였다. 그 결과 바실러스 튜린지엔시스 KB1(Bacillus thuringiensis KB1)을 처리하지 않은 대조구에서 약 70%의 발병율을 보인 것에 비해 내생균 처리구에서는 40% 이하의 병 발생율을 보이며 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)에 의한 병 발생을 억제하는 것을 나타내었다(도 4).
또한 토마토가 생육하고 있는 흙에 바실러스 튜린지엔시스 KB1(Bacillus thuringiensis KB1)을 처리한 다음 각각 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)와 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)를 접종하였고 바실러스 튜린지엔시스 KB1(Bacillus thuringiensis KB1)에 의한 병 발생 억제율을 확인하였다(도 5). 그 결과 바실러스 튜린지엔시스 KB1(Bacillus thuringiensis KB1)을 처리한 토마토에서 처리하지 않은 대조군에 비해 3일 후(3 dpi), 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)에 의한 병징이 현저히 감소하는 것을 확인하였고(도 5A), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)에 대한 병징 역시 5일 후(5 dpi) 관찰하였을 때, 바실러스 튜린지엔시스 KB1(Bacillus thuringiensis KB1)을 처리한 토마토에서 대조군에 비해 감소하는 것을 확인하였다(도 5B). 상기 결과를 통해 식물 내생균인 바실러스 튜린지엔시스 KB1(Bacillus thuringiensis KB1)이 식물 병원균에 대하여 우수한 병 발생 억제율을 나타내는 것을 확인하였고, 실제 애기장대와 토마토에서의 방제력 검정을 통해 바실러스 튜린지엔시스 KB1(Bacillus thuringiensis KB1)을 활용한 미생물 제제 개발이 가능할 것으로 판단된다.
한국생명공학연구원 KCTC18376P 20150415
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Claims (7)

  1. 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae) 및 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)의 식물 병원균에 대해 방제활성을 가지는 내생세균(Endophyte)인 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 (KCTC18376P) 균주.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 따른 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae) 또는 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)의 식물 병원균 방제용 조성물.
  6. 제1항에 따른 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 균주를 배양하는 단계를 포함하는 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae) 또는 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)의 식물 병원균 방제용 조성물의 제조 방법.
  7. 제1항에 따른 바실러스 튜린지엔시스(Bacillus thuringiensis) KB1 또는 이의 배양액의 유효량을 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae) 또는 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)의 식물 병원균을 방제하는 방법.
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