CN106794200A

CN106794200A - 包含具有抗菌及防腐活性的绿脓杆菌培养液提取物的组合物及其的用途

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Publication number: CN106794200A
Application number: CN201580033165.1A
Authority: CN
Inventors: 崔承贤; 朴佳仁
Original assignee: Biotechnology Joint Center
Current assignee: Biotechnology Joint Center; JOINT CENTER FOR BIOSCIENCES
Priority date: 2014-06-20
Filing date: 2015-06-02
Publication date: 2017-05-31
Also published as: US20170143771A1; EP3192519A2; WO2015194772A3; WO2015194772A2; EP3192519A4

Abstract

本发明提供包含绿脓杆菌培养液提取物作为有效成分的防腐用组合物及抗生组合物。本发明提供包含绿脓杆菌培养液提取物作为有效成分的痤疮预防或治疗用组合物。本发明的包含绿脓杆菌培养液提取物的组合物对多种菌表现出广域的抗菌谱及高的抗氧化效果，这种组合物能够适用于如化妆品等化妆品组合物等，除此之外，能够在食品、医药品、农药及生活用品等多种领域中作为抗菌、杀菌及防腐目的有效地利用。本发明提出引起绿脓杆菌培养液提取物的抗菌效果的特定有效成分，并提供其结构。

Description

包含具有抗菌及防腐活性的绿脓杆菌培养液提取物的组合物及其的用途

技术领域

本申请对2014年6月20日提出于韩国专利局的韩国专利申请第10-2014-0075507号主张优先权，上述申请的公开内容作为参照插入于本说明书。

本发明涉及包含具有抗菌及防腐活性的绿脓杆菌培养液提取物的组合物及其的用途。

背景技术

众所周知，对羟基苯甲酸酯作为主要例用于在化妆品、食品、药品等中抑制微生物的生长且增加保存期间的杀菌防腐剂，一般不具有毒性，来从1920年中期第一次适用于药品以来很长时间使用。对羟基苯甲酸酯的使用广泛，并且在多种产品中长时间使用，相反，随着报告对对羟基苯甲酸酯的雌激素性的研究，并提出对对羟基苯甲酸酯类的稳定性问题。

基于将实验动物作为对象的多种分析结果进行对对羟基苯甲酸酯的急性、亚急性及慢性毒性的研究，从而报告羟苯甲酯的皮肤炎症反应、对羟基苯甲酸甲基酯和对羟基苯甲酸丙基酯的延迟性、接触性、过敏性诱发等致敏反应，针对于对羟基苯甲酸酯的致癌性对羟基苯甲酸酯具有雌激素性，因此提出通过使用化妆品的对羟基苯甲酸酯和乳腺癌的关联性。众所周知，对羟基苯甲酸酯的抗雌激素性还妨碍雄性生殖类的功能，并且作为污水放出的对羟基苯甲酸酯对包括生态系统的环境产生的内分泌障碍影响也讨论过。虽然具有潜在性的有害性，但是在多种领域中持续使用对羟基苯甲酸酯，对上述问题分析为，原因在于天然成分的防腐力没有现有化学合成防腐剂优秀。但是，随着报告在上述中涉及的对羟基苯甲酸酯的危险性，消费者对使用对羟基苯甲酸酯防腐剂表示反感，当前对替代天然保存剂的需求正增加。

生物表面活性剂(biosurfactant)作为从如动物、植物等生物原材料取得的表面活性剂是低毒性，并且由生态系统分解容易，因此受到瞩目。生物表面活性剂对化学合成表面活性剂具有的优点如下：第一.无毒性且生物降解容易，因此在使用生物表面活性剂的情况下不成为二次污染源，第二.因利用现有方法难以合成的复杂的结构，可作为特殊的目的使用，第三.对表面张力、降低能力、温度、pH的稳定性等表面活性剂的物理·化学性能方面上，表现出与现有的化学合成表面活性剂几乎相等的结果。

实际生物表面活性剂在使用化学合成表面活性剂的食品、化妆品、洗涤剂、原油的二次回收、纸浆和造纸产业、陆上和海上的油类污染净化、处理槽的乳脂肪分解等但部分的产业领域中使用，并且还发表如下：从假单胞菌(Pseudomonas sp.)生产的鼠李糖脂-生物表面活性剂通过改变细胞表面形态来发挥对病原菌的抑制效果，因此作为生物医学的新的领域具有被嫁接的可能性。因此，在全世界上正活跃地进行对具有如上所述的优点的生物表面活性剂的研究，来报告多种类的生物表面活性剂。

在本发明之前，从假单胞菌培养液提取包含鼠李糖脂的混合物状态的生物表面活性剂，来测定对多种病原菌的抑制效果，其结果，确认了与现有的抗生素相比，对特定病原菌(痤疮诱发菌：痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))具有卓越的抑制效果。并且，确认了与多种病原菌相比，在低浓度下具有杀菌效果，基于这种结果研究可替代现有的虽然作为化妆品防腐剂使用，但是报告对人体的的危险性的羟苯甲酯的环保且生物相容性的保存剂的开发，同时研究了通过抑制具有抗生素的耐性的痤疮诱发菌来可缓和痤疮的原料的开发，以下实验结果可成为用于实施本发明的具体内容及根据。

本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的技术领域的水平及本发明的内容。

发明内容

本发明人为了开发通过有效地抑制微生物的生长，来可增加化妆品或食品的储存期间的来源于天然物质的防腐用组合物而付出努力。其结果，提出绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)培养液提取物对各种细菌表现出抗菌效果，并确认了本发明的绿脓杆菌培养液提取物可替代合成对羟基苯甲酸酯类的化妆品防腐剂来用作化妆品防腐剂及食品防腐剂，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供包含绿脓杆菌培养液提取物作为有效成分的防腐用组合物。

本发明的再一目的在于，提供包含绿脓杆菌培养液提取物作为有效成分的抗生组合物。

本发明的再一目的在于，提供包含绿脓杆菌培养液提取物作为有效成分的痤疮预防或治疗用组合物。

本发明的另一目的在于，提供包含绿脓杆菌培养液提取物作为有效成分的抗氧化用组合物。

本发明的再一目的在于，揭示绿脓杆菌培养液提取物的引起抗菌效果的有效成分。

根据以下发明的详细说明及发明要求保护范围更加明确本发明的其他目的及优点。

根据本发明的一实施方式，本发明提供包含绿脓杆菌培养液提取物作为有效成分的防腐用组合物。

根据本发明的再一实施方式，本发明提供包含绿脓杆菌培养液提取物作为有效成分的抗生组合物。

根据本发明的再一实施方式，本发明提供包含绿脓杆菌培养液提取物作为有效成分的痤疮预防或治疗用组合物。

根据本发明的再一实施方式，本发明提供包含绿脓杆菌培养液提取物作为有效成分的抗氧化用组合物。

本发明人为了开发有效抑制微生物的生长来可增减化妆品或食品的储存期间的来源于天然物质的防腐用组合物而付出了努力。其结果，提出了对包含绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)培养液提取物的皮肤正常菌群及包含痤疮诱发菌的各种细菌表现出抗菌效果，并确认了本发明的绿脓杆菌培养液提取物可替代合成对羟基苯甲酸酯类的化妆品防腐剂来用作化妆品防腐剂及食品防腐剂。

本发明的组合物包含绿脓杆菌培养液提取物作为有效成分。

在本说明书中，术语“绿脓杆菌培养液提取物”是指从培养绿脓杆菌的培养液提取而取得的绿脓杆菌培养液提取物。

根据本发明，本发明的绿脓杆菌培养液提取物包含作为生物表面活性剂的鼠李糖脂(rhamnolipid)。

根据本发明的一实例，包含于本发明的组合物的鼠李糖脂为由以下化学式1表示的双-鼠李糖脂或由化学式2表示的单-鼠李糖脂。

化学式1

化学式2

根据本发明，在绿脓杆菌培养液提取物中存在多种结构的鼠李糖脂，其中，上述化学式1或化学式2的鼠李糖脂与在绿脓杆菌培养液提取物中提取的其他鼠李糖脂相比具有显著高的抗菌活性。

根据本发明的一实例，本发明的绿脓杆菌培养液提取物如下获取：将绿脓杆菌接种于培养基来培养之后，对培养液进行离心分离来获取上清液，在上清液中添加盐酸溶液来进行沉淀，然后重新进行离心分离来仅获取沉淀物，在其沉淀物中添加乙醚之后仅分离乙醚层进行浓缩。

本发明的提取物不仅包含利用上述的溶剂而取得的提取物，而且还包含在其中追加适用纯化过程来取得的提取物。例如，使上述提取物通过具有规定的分子量截留值的超滤膜，来取得的分馏物，基于多种色谱法(为了基于大小、电荷、疏水性、亲水性的分离而制作的)的分离等，通过追加进行的多种纯化方法取得的分馏物也包含于本发明的提取物。

本发明的提取物可通过减压蒸馏及冷冻干燥或喷雾干燥等追加过程制备成粉末状态。

根据本发明的一实例，在本发明的组合物中，相对于100重量份的总组合物，包含0.005～1.0重量份的上述绿脓杆菌培养液提取物。

根据本发明的再一实例，在本发明的组合物中，相对于100重量份的总组合物，包含0.01～0.5重量份的上述绿脓杆菌培养液提取物。

根据本发明的特定实例，在本发明的组合物中，相对于100重量份的总组合物，包含0.02～10.1重量份的上述绿脓杆菌培养液提取物。

根据本发明的一实例，本发明的组合物具有抗细菌和/或抗真菌活性。本发明的组合物对多种微生物，尤其，对细菌、真菌及酵母表现出广泛的抗生活性。

根据本发明的再一实例，本发明的组合物对选自由葡萄球菌(Staphylococcus)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、绿脓杆菌(Pseudomonas)属、念珠菌(Candida)属、丙酸杆菌(Propionibacterium)属、链球菌(Streptococcus)属、变形杆菌(Proteus)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、肠球菌(Enterococcus)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属及大肠菌(Escherichia coli)组成的一种以上的细菌表现出抗菌活性。

根据本发明的再一实例，本发明的组合物具有与在0.5％以上的浓度下具有抗氧化效果的作为代表成分的抗坏血酸(AA)相同的水平的高的抗氧化效果。

如上所示，具有广泛的抗生谱及抗氧化效果的本发明的防腐/抗生组合物不仅在化妆品，而且在食品、生活用品、农药、医药等中为了实现抗菌、杀菌、消毒、防腐等的目的可广泛地使用。

根据本发明，本发明的防腐用组合物可制备成化妆品组合物。在本发明的组合物制备成化妆品组合物的情况下，绿脓杆菌培养液提取物预防由细菌化妆品组合物变质，因此可替代化妆品防腐剂来使用。在本发明的组合物制备成化妆品组合物的情况下，本发明的组合物不仅包含作为上述有效成分的绿脓杆菌培养液提取物、其的盐或它们的溶剂化物或水化物，而且还可包括通常利用于化妆品组合物的成分，例如可包含抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料及香料等的通常的助剂及载体。

根据本发明，本发明的防腐用组合物可制备成食品组合物。在本发明的组合物制备成食品组合物的情况下，绿脓杆菌培养液提取物预防由细菌食品变质，因此可替代食品防腐剂来使用。

在本发明的组合物制备成食品组合物的情况下，作为有效成分不仅包含绿脓杆菌培养液提取物，还包含制备食品时通常所添加的成分，例如，包含蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素、调味剂及香味剂。作为上述碳水化合物，例如有作为单糖的葡萄糖、果糖等、作为二糖的麦芽糖、蔗糖、寡糖等以及作为多糖的糊精、环糊精等的普通的糖及木糖醇、山梨糖醇及赤藓糖醇等的糖醇。作为香味剂，可使用天然香味剂(索马甜、甜叶菊提取物(例如，莱鲍迪苷A、甘草甜素等))及合成香味剂(糖精、阿斯巴甜等)。例如，在本发明的食品组合物制备成提神饮料的情况下，除了本发明的绿脓杆菌培养液提取物之外，还可包含柠檬酸、液相果糖、食糖、葡萄糖、醋酸、苹果酸、果汁、杜仲提取液、大枣提取液、甘草提取。

在本说明书中，术语“抗生组合物(antibiotic composition)”是指包含使病毒、菌类(fungi)、原生动物(protozoa)及细菌的微生物失望或抑制生长的抗生物质(antibiotics)的组合物。因此，上述抗生物质具有抗生活性，即，抗细菌活性(antibacteriaLactivity)、抗真菌活性(antifungaLactivity)或抗病毒活性(antiviraLactivity)。

本发明的组合物对由上述细菌诱发的皮肤感染或痤疮的预防及治疗表现出显著效果。如在以下一实施例中证明，本发明的组合物显著抑制如作为痤疮诱发菌公知的痤疮丙酸杆菌(propionibacterium acnes)及作为革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌(Staphylococus aureus)及作为革兰氏阴性菌的绿脓杆菌(pseudomonas aeroginosa)、白色念珠菌(candida albicans)等多种细菌的生长。

本发明的痤疮预防或治疗用组合物可包含作为上述的本发明的有效成分的绿脓杆菌培养液提取物的化妆品学上有效剂量(cosmetically effective amount)及在化妆品学上接受的载体来制备。

在本说明书中，术语“化妆品学上有效剂量”是指对本发明的组合物的微生物的实现抗生功效的充分的量。

本发明的皮肤外用剂组合物可制备成本发明所属领域中通常制备的任何剂型，例如，可剂型化成溶液、悬浮液、乳浊液、糊剂、凝胶、乳霜、乳液、粉、肥皂、含表面活性剂的洁面剂、油、粉状粉底、乳浊液粉底、蜡粉底及喷雾剂等，但不局限于此。更详细地，可制备成柔肤化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华素、眼霜、洁面霜、洗面奶、卸妆水、面膜、喷雾剂或粉的剂型。

在本发明的剂型为糊剂、乳霜或凝胶的情况下，可利用动物性油、植物性油、蜡、石蜡、淀粉、胺黄树胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等作为载体成分。

在本发明的剂型为粉或喷雾剂的情况下，可利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉作为载体成分，尤其，在喷雾剂的情况下，还可包含氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚等的推进剂。

在本发明的剂型为溶液或乳浊液的情况下，利用溶剂、增溶剂或乳化剂作为载体成分，例如有水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或山梨糖醇的脂肪酸酯。

在本发明的剂型为悬浮液的情况下，可利用如水、乙醇或丙二醇等液体稀释剂、乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯及聚氧乙烯山梨糖醇酐酯等悬浮剂、微晶纤维素、甲基氢氧化铝、膨润土、琼脂或胺黄树胶等。

在本发明的剂型为含表面活性剂的洁面剂的情况下，可利用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物性油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等作为载体成分。

包含于本发明的皮肤外用剂组合物的成分除了上述有效成分及载体成分之外，包含通常利用于皮肤外用剂组合物多种成分，例如，可包含抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料及香料等的通常的助剂。

对本发明的特征及优点进行归纳如下：

(ⅰ)本发明提供包含绿脓杆菌培养液提取物作为有效成分的防腐用及抗生组合物。

(ⅱ)本发明提供包含绿脓杆菌培养液提取物作为有效成分的痤疮预防或治疗用组合物。

(ⅲ)包含本发明的绿脓杆菌培养液提取物的组合物对多种菌表现出广域的抗菌谱及高的抗氧化效果，这种组合物可适用于如化妆品等化妆品组合物，除此之外，可在食品、医药品、农药及生活用品等多种领域中作为抗菌、杀菌及防腐目的有效地利用。

(ⅳ)提出了引起本发明的绿脓杆菌培养液提取物的引起高的抗菌效果的有效成分在多种鼠李糖脂也是特定结构(Rha C10 C10、Rha Rha C10 C10)的鼠李糖脂，通过上述提高了对鼠李糖脂的产业适用的效率性。

附图说明

图1为执行纸片扩散法(paper disk diffusion test)来确认绿脓杆菌培养液提取物(R1)的抗菌效果的结果。

图2作为对包含绿脓杆菌培养液提取物的爽肤水剂型的产品的防腐力试验(challenge test)结果，是表示菌落形成单位(cfu)的曲线图。

图3为当对包含绿脓杆菌培养液提取物的爽肤水剂型的产品进行防腐力试验时，表示涂抹于板之后的形状的照片。

图4为测定根据绿脓杆菌培养液提取物的含有浓度的与痤疮相关的过敏改善率的结果(红色杆意味着膏剂型、紫色杆意味着乳霜剂型)。

图5为通过照片确认将包含绿脓杆菌培养液提取物的本发明的组合物涂敷于被验者的皮肤之后，与痤疮相关的过敏改善的结果。

图6为表示鼠李糖及鼠李糖脂的结构的图。

图7为通过1D 1H-核磁共振(NMR)谱来分析鼠李糖脂的结果。

图8为鼠李糖质子分析结果。

图9为二维核磁共振(2D-NMR)分析结果。

图10为二维核磁共振ROESY实验结果。

图11为通过1D 1H-核磁共振谱预分析的测定样品内鼠李糖的相对密度的结果。

图12为绿脓杆菌培养液提取物R1的抗氧化效果试验结果。

图13为对R1和从R1分离的分馏物的对金黄色葡萄球菌(S.aureus)的抗菌活性的试验结果。

图14为R1和从R1分离的分馏物的液相色谱(LC)分析结果。

图15为利用液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)、液相二级质谱(LC-MS/MS)的有效成分峰1、峰2的结构分析结果。

图16为R1的液相色谱分析结果。

具体实施方式

以下，通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例只用于更详细地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并不限制于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。

材料及方法

1.生物表面活性剂的生产

进行实验之前，筛选了菌株(CJM01).鉴定结果确定为绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)，并将菌株接种于M9培养基(0.015g/L的CaCl₂、6g/L的Na₂HPO₄、3g/L的KH2PO₄、0.5g/L的NaCl、1g/L的NH₄Cl、0.0625g/L的MgSO₄、20g/L的葡萄糖)来在37℃温度下培养了72小时。培养之后对培养液进行离心分离来取得了完全去除细胞的培养液。对去除细胞的培养液利用HCl降低为pH2之后，在4℃温度下进行沉淀。沉淀之后再次进行离心分离来去除上清液，并仅取得了沉淀物。利用乙醚提取其沉淀物之后，仅分离乙醚层，来利用旋转蒸发浓缩器进行浓缩来使乙醚全部蒸发而取得的提取物(biosurfactants crude)命名为R1。

2.提取的生物表面活性剂的抗菌力试验(paper disk diffusion test)

将从微生物(绿脓杆菌)培养液提取的混合物状态的生物表面活性剂命名为R1，并针对革兰氏阳性病原性菌(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus))、革兰氏阴性病原性菌(绿脓杆菌、大肠杆菌(Escherichia coli))施行了纸片扩散法(paper disk diffusion test)。

将金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌及绿脓杆菌和大肠杆菌(E.coli)分别接种于LB(Luria-Bertani)培养基(胰蛋白胨10g/L、NaCL10g/L、酵母提取物5g/L)来在37℃的好氧性条件下，液体培养了18小时。培养之后在LB琼脂板上涂抹了各个200μl的菌培养液。在甲醇中以2mg/ml的浓度溶解从微生物(绿脓杆菌)培养液提取的R1，并在甲醇中以10mg/ml的浓度溶解作为对照区使用的羟苯甲酯(Methyl Paraben)、苯氧基乙醇(Phenoxy Ethanol)、Naturotics。在甲醇中以2mg/ml的浓度溶解从微生物(绿脓杆菌)培养液提取的R1，以10mg/ml的浓度溶解作为对照区使用的羟苯甲酯(MethyLParaben)、苯氧基乙醇(PhenoxyEthanol)及Naturotics。以每次20μl的方式将溶解的R1、羟苯甲酯、苯氧基乙醇、Naturotics溶液分别沾于纸片(直径：6mm)之后，将纸片放置于涂抹有金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、绿脓杆菌及大肠杆菌的琼脂板上。在37℃的好氧性条件下，将各个琼脂板培养了18小时。18小时之后对向纸片周围生成的清除区进行了观察。

3.提取的生物表面活性剂的防腐力试验(challenge test)

与羟苯甲酯进行比较，来为了确认R1作为保存剂的可能性而施行了在爽肤水剂型和乳液剂型中，测定对革兰氏阳性病原性菌(金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌)、革兰氏阴性病原性菌(绿脓杆菌)、真菌类(白色念珠菌)的杀菌力的防腐力试验。以美国化妆品协会、即，美国化妆品协会(CTFA，The cosmetics、Toiletry and Fragrance Association)的法为基准施行防腐力试验，其基准为若特定物质在爽肤水剂型和乳液剂型中使在7天之内接种的菌数的99.9％凋亡，则具有作为保存剂的可能性。进行实验之前，制备爽肤水剂型和乳液剂型，其组成如表1及表2。

表1

爽肤水的组成

表2

乳液的组成

4.对在爽肤水剂型中的革兰氏阳性病原性菌(金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌)的实验

在制备的爽肤水剂型中添加溶解于甲醇的R1，来使R1的最终浓度成为0％、0.01％、0.05％及0.1％，并将金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的培养液接种于各个容器。并且，向爽肤水剂型添加溶解于甲醇的羟苯甲酯来使羟苯甲酯的最终弄额度成为0％、0.1％、0.5％及1％，并将金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌培养液接种于各个容器。使接种菌数成为106-107cfu(集落形成单位(colony forming unit))/ml。在常温条件下，储存接种有菌的爽肤水，并菌接种直后，1天、3天、5天、7天之后，对各个爽肤水进行稀释，来在LB琼脂板涂敷200μl而计算细胞数之后，与初期接种菌数进行比较来掌握了是否凋亡。作为对照区，在爽肤水剂型中仅添加甲醇，来接种菌培养液之后进行了反复试验。

5.对在爽肤水剂型中的革兰氏阴性病原性菌(绿脓杆菌)、真菌类(白色念珠菌)的实验

在制备的爽肤水剂型中分别添加溶解于甲醇的R1和羟苯甲酯，来使R1的最终浓度成为0％、0.1％、0.5％及1％，并将绿脓杆菌、白色念珠菌的培养液接种于各个容器。使接种菌数成为106-107cfu(集落形成单位)/ml。在常温条件下，储存接种有菌的爽肤水，并菌接种直后，1天、3天、5天、7天之后，对各个爽肤水进行稀释，来在LB琼脂板涂抹200μl的接种有绿脓杆菌的爽肤水，在酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)琼脂板涂抹200μl的接种有白色念珠菌的爽肤水来计算细胞数之后，与初期接种菌数进行比较来掌握了是否凋亡。作为对照区，在爽肤水剂型中仅添加甲醇，来接种菌培养液之后进行了反复试验。

酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂(5g/L的蛋白胨、5g/L的酵母提取物、5g/L的葡萄糖及15g/L的琼脂)

6.对在爽肤水剂型中的革兰氏阴性病原性菌(金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌)、革兰氏阴性病原性菌(绿脓杆菌)及真菌类(白色念珠菌)的实验

在制备的爽肤水剂型中分别添加溶解于甲醇的R1和羟苯甲酯，来使R1的最终浓度成为0％、0.5％，并将金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、绿脓杆菌及白色念珠菌的培养液接种于各个容器。使接种菌数成为106-107cfu(集落形成单位)/ml。在常温条件下，储存接种有菌的乳液，并菌接种直后，1天、3天、5天、7天之后，对各个乳液进行稀释，来在LB琼脂板涂抹200μl的接种有金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌及绿脓杆菌的乳液，在酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)琼脂板涂抹200μl的接种有白色念珠菌的乳液来计算细胞数之后，与初期接种菌数进行比较来掌握了是否凋亡。作为对照区，在爽肤水剂型中仅添加甲醇，来接种菌培养液之后进行了反复试验。

7.含有提取的生物表面活性剂的产品的与痤疮相关的过敏改善效果

7-1.产品的种类、产品的分量及剂型

制备从微生物(绿脓杆菌)培养液提取的含有生物表面活性剂R1的天然化妆品，来适用(5g/1人/2周)于具有与痤疮相关的过敏症状(化脓性、小米粒痤疮、痤疮疤痕、疖子)的被验者，来观察了改善效果。

表3

产品的种类

表4

含有0.5％的R1混合物的膏剂型产品的组成

表5

含有0.1％的R1混合物的膏剂型产品的组成

表6

含有0.02％的R1混合物的膏剂型产品的组成

表7

含有0％的R1混合物的膏剂型产品的组成

表8

含有0％的R1混合物的乳霜剂型产品的组成

表9

含有0.02％的R1混合物的乳霜剂型产品的组成

表10

含有0.1％的R1混合物的乳霜剂型产品的组成

7-2.被验者

本研究为在单一机关中，作为对照组、实验组的观察研究临床试验、当对具有与痤疮相关的过敏的被验者涂抹产品时，评价与痤疮相关的过敏的症状改善等有效性及稳定性

一次结果变数(主要终点(Primary end point))为使用产品之后两周后的与痤疮相关的过敏的症状改善率，并评价了试验之前和试验之后的与痤疮相关的过敏的症状的改善率是否有差异。基于过去执行的临床试验考虑约10％的淘汰率，来将总被验者数确定为30名，由个人原因未同意临床试验同意书的3名未参加临床试验，参与临床试验的被验者为共27名，中途淘汰率为0％，从而可进行最终评价的被验者数为27名。

7-3.试验方法

2周使用5g的试验产品，一天2次以上(早晨、晚上、常时)，在试验者指定的皮肤病变部位将乳霜或膏形态的产品涂敷2周。

将仁荷大学和仁川大学的学生为对象，招募与痤疮相关过敏化妆品功效评价临床试验参与人员，在自愿申请的申请人员中将适合于选定基准，且未相当于排除标准的申请人员为对象进行了临床研究。通过筛选来筛选被验者，共27名的被验者同意参与试验，男性为16名、女性为11名，被验者的年龄分布在从20周岁至28周岁之间。淘汰及中途放弃的被验者为0名结束评价的最终被验者为27名。

为了进行对与痤疮相关的过敏改善效果的评价，每次进行访问时，进行肉眼评价及图像拍摄，并进行了具有每天对本人的变化程度(感到变化的程度及是否存在异常反应)进行直接检查的被验者的主观意志的问卷调查。作为肉眼评价，在临床试验开始第0天的时间点上，将涂敷产品之前存在于试验者规定的病变部位的进行状态的痤疮数量规定为始发点，在此部位中，试验经过2周后对利用眼睛观察得到改善的程度进行数值化，对参与临床研究的研究对象的病变部位，每次进行试验之前和临床试验测定访问时拍摄的图像。并且，进行了被验者主观意见的问卷调查。

7-4.效果评价记住、评价方法及解析方法

将适合于选定基准的被验者及将提供的铲平使用2周的被验者选定为有效性评价对象，在第0周、第1周及第2周施行对进行中的痤疮数量的了解及图像拍摄等对与痤疮相关的过敏改善的肉眼性评价，并进行了具有被验者的主观意见的问卷调查。根据统计学推定分析了试验的结果整理及分析。

8.核磁共振分析

对与从微生物(绿脓杆菌)培养液提取的生物表面活性剂R1相同的绿脓杆菌变更培养及提取方式二取得的R2、R3及含有90％的鼠李糖脂(生物表面活性剂的一个种类)的从西格玛奥德里奇(SIGMA-ALDRICH)公司购买的R90进行了核磁共振分析。

鼠李糖脂的结构由包含一个或两个鼠李糖(糖)部分(图6的左侧)和两个脂肪族链(aliphatic chains)的脂质部分形成(图6的右侧)。鼠李糖脂结构的多样性基于一个或两个鼠李糖环的数和脂质部分的两个脂肪族链的结构(长度及饱和度)。在氯仿-甲醇(2：1)混合物中溶解4个不同的生物表面活性剂提取物(样品0、样品1、样品2及样品3)和在商业上销售(西格玛(Sigma))的鼠李糖脂(样品90)之后进行了核磁共振分析。

9.绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)培养液提取物的抗氧化效果

为了绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)培养液提取物的作为防腐剂的适用进行了对抗氧化效果的实验。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基呈现紫色，若上述1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基与抗氧化剂进行反应则呈现黄色。与抗氧化能力越优秀的试样进行反应，就1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的颜色的变化也明显。以分别不同的浓度在甲醇中溶解R1、抗坏血酸(Ascorbic acid、AA)及羟苯甲酯(MTP)溶解。将像这样取得的试样(100μl)混合于100μl的在甲醇中分别以0.006％的浓度溶解的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基，来制备共200μl之后，在阻隔光的空间下反应了30分钟。反应结束之后在517nm条件下，对各个混合液测定吸光度值来测定了各试样的抗氧化能力。

10.引起绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)培养液提取物的抗氧化效果的有效成分的探索

绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)培养液提取物是不是单一成分，而是由多种成分混合而成的状态。探索在包含于绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)培养液提取物的多种成分中引起抗菌效果的有效成分是什么，并进行了明确其结构的实验。

从微生物(绿脓杆菌)培养液提取的混合物状态的R1的分离

在甲醇中溶解1mg的从微生物(绿脓杆菌)培养液提取的混合物状态的R1之后注入于sep-Pak vac 1cc tc18药筒柱。其后，利用溶剂A洗涤柱，并注入了作为展开溶剂的溶剂B。以分别不同的浓度向柱注入溶剂B之后分别收集通过柱的分馏物(fraction)来分别命名为分馏物1、分馏物2、分馏物3、分馏物4、分馏物5及分馏物6。以50％、55％、60％、65％、70％及75％分别不同的浓度向柱注入溶剂B，溶剂A和溶剂B的组成如表11。

表11

溶剂A和溶剂B的组成

从R1分离的分馏物的抗菌活性分析

干燥取得的各分馏物之后，以10mg/ml的浓度在甲醇溶液中溶解。将20μl的溶解于甲醇的各个分馏物滴落于涂抹有金黄色葡萄球菌培养液的琼脂板上后，在37℃温度下，培养18小时，18小时之后观察了生成于琼脂板上的清除区。

通过从R1分离的分馏物的液相色谱/MS的结构分析

为了分离的分馏物的结构分析执行的液相色谱–MS在阴性模式的离子极性下，使用1.8μm的2.1*100mm的SB-Aq RRHD(分析柱)和2.1*5mm的1.8μm的Zorbax SB-C8(引导柱)来进行。在甲醇中溶解经分离的分馏物来准备了样品。将20μl的样品注入于安装有柱的高效液相色谱法，还连接质量分析仪来进行了分析。在高效液相色谱法中使用溶剂A和溶剂B的混合液作为展开溶剂，初期的溶剂A和溶剂B的混合比率为50％，其之后的顺序如下。以100％的溶剂B(19分钟)、100％的溶剂B(20.5分钟)、50％的溶剂B(21分钟)、50％的溶剂B(25分钟)、高效液相色谱法流速：0.15ml/分钟及扫描质量范围为75～1000m/z来准备。对引起抗菌效果的特定成分进行了MS/MS。

实验结果

1.提取的生物表面活性剂的抗菌力试验

将从微生物(绿脓杆菌)培养液提取的混合物状态的生物表面活性剂命名为R1，并对革兰氏阳性病原性菌(金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌)、革兰氏阴性病原性菌(绿脓杆菌绿脓杆菌、大肠杆菌)施行了抗菌力试验。进行纸片扩散法(paper disk diffusion test)，最终R1与作为现有的化妆品保存剂使用的羟苯甲酯、苯氧基乙醇、Naturotics相比，在低于5倍的浓度下生成了明显大的清除区(图1)。

2.提取的生物表面活性剂的防腐力试验

进行防腐力试验，最终在爽肤水剂型中，R1对所接种的全部菌7天之内使接种菌数的99.9％凋亡，尤其，R1在作为比羟苯甲酯少10倍的0.01％下，对革兰氏阳性病原性菌放入金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌1天使接种菌数的99.9％凋亡。对于革兰氏阴性病原性菌(绿脓杆菌)和真菌类(白色念珠菌)，在作为与羟苯甲酯相同的浓度的0.5％下，5天使接种菌数的99.9％凋亡(图2-3)。并且，在乳液剂型中，对于接种的全部菌，R1在作为与羟苯甲酯相同的浓度的0.5％下，7天之内使接种菌数的99.9％凋亡(表12)。这种结果表示R1具有作为保存剂的可能性。

表12

在乳液剂型中R1的防腐力试验(％-接种菌数的生存率)

3.含有提取的生物表面活性剂的产品的与痤疮相关的过敏改善效果

制备从微生物(绿脓杆菌)培养液提取的含有生物表面活性剂R1的天然化妆品，来适用于具有与痤疮相关的过敏症状的被验者，最终，与未含有R1的产品相比，在使用含有R1的产品的被验者中与痤疮相关的过敏改善率明显增加，在全部被验者中未观察到皮肤异常反应(瘙痒、烧灼感、红斑、红肿、疖子、热等)。

表13

痤疮相关过敏改善率

在临床试验开始第0天的时间点上，将涂敷产品之前存在于试验者规定的病变部位的进行状态的痤疮数量规定为始发点，在此部位中，试验经过2周后对利用眼睛观察得到改善的程度进行数值化，与不含有微生物培养液提取物的产品相比，在使用含有微生物培养液提取物的产品的被验者中确认了更高的改善率。尤其，在使用含有0.02％的微生物培养液提取物的乳霜形态的产品的被验者中确认了最高的改善率，其次，在使用含有0.1％的微生物培养液提取物的乳霜形态的产品的被验者中确认了高的改善率(图4)。据此，可判断含有本发明人制备的微生物培养液提取物的天然化妆品有助于痤疮改善。被验者的图像拍摄结果如图5a～图5i。

表14

概括的有效性评价

被验者号	评价	被验者号	评价
				1	4	15	4
2	3	16	4
				3	4	17	3
4	5	18	4
				5	4	19	4
6	3	20	4
				7	3	21	3
8	3	22	3
				9	3	23	4
10	5	24	4
				11	3	25	4
12	3	26	5
				13	4	27	4
14	4	平均	3.7

5：症状消失，4：整体上症状明显变好

3：整体上症状明略变好，2：与试验之前无症状的变化

1：与试验之前症状变坏

表15

使用之后对产品的满足度评价结果

被验者号	评价	被验者号	评价
				1	3	15	5
2	4	16	3
				3	4	17	4
4	5	18	5
				5	4	19	4
6	4	20	4
				7	4	21	4
8	3	22	4
				9	3	23	4
10	5	24	4
				11	2	25	3
12	4.5	26	5
				13	4	27	4
14	4	平均	3.9

1：不清楚、2：不满足、3：普通、4：满足、5：非常满足

临床试验2周之后，对被验者的与痤疮相关的过敏的改善效果的整体满足度评价得高。在问卷评价和肉眼评价中呈现最明显的变化的部分为化脓性痤疮和一时发生的如疖子等皮肤过敏。相反，对小米粒痤疮和痤疮痤疮疤痕改善相对地变化少。并且，确认如下：与膏剂型相比，在使用乳霜剂型的产品的被验者的改善效果和满足度更高。

通过2周的临床试验结果，肉眼评价及问卷评价、图像拍摄，来可知含有本发明人制作的微生物培养液提取物的天然化妆品是有助于与痤疮相关过敏改善的产品。

4.核磁共振分析

一般观测

所有样品包括由4种主要成分(两种类型的双-鼠李糖脂和两种类型的单-鼠李糖脂)形成地相似的鼠李糖脂系列。在各样品中，双-鼠李糖脂的A分馏物的含有率均不同(在样品90的情况下，含有至35％，样品2和样品3含有65％以上)(表17)。并且，样品0、样品1、样品2、样品3还含有预计可对抗菌活性产生影响的芳香族成分。

1D-核磁共振分析

在图7中示出，在对样品1的1D 1H-核磁共振谱中相当于鼠李糖脂的部分。在谱下面示出信号强度(integrals)。根据在0.82ppm中的甲基峰进行标准化，其峰相当于6个质子(proton)(2甲基)。因此，预计单一质子(proton)峰示出大致100单位程度的信号强度。例如，在1.4-1.5ppm和2.4～2.6ppm中示出的两组的峰呈现～400程度的信号强度，分别与在C2H2/C5H2及C7H2/C10H2组中呈现的4个质子信号一致。通过比较从脂质和鼠李糖组取得的单-鼠李糖脂及双-鼠李糖脂的信号的强度，来可测定单-鼠李糖脂及双-鼠李糖脂的质量比。

若样品仅包含单-鼠李糖脂，则仅来自鼠李糖的一个质子与位于脂质部分的一个质子一致。并且，若样品仅包含双-鼠李糖脂，则与“2-to-1”一致。如在图8中得到证明，H1和H4的脂质质子(暗橙色箱体)呈现相同类型的信号，其强度的之合围大致100左右，这是说明位于混合物的各个鼠李糖脂分子准确地具有一个上述类型的质子。

最终，从H1’/1”、H2’/2”、H3’/3”及H5’/5”鼠李糖质子(图8的蓝色箱体)取得的信号强度的之和高于在单-鼠李糖脂混合物中预计的信号强度。位于单-鼠李糖脂混合物里的每一个分子一个的H1’质子应得出具有100值的信号。三个H2’、H3’、H5’的质子应呈现具有300值的信号。但是，在样品1中的这种信号强度测定为大致150～480左右。从这种信号强度数值可推定为在样品1中双-鼠李糖脂大致存在60％左右。通过1D 1H-核磁共振谱，来执行了作为相似的分析的样品0、样品2、样品3及样品90。

二维核磁共振分析

通过2D 1H-13C-HSQC实验确认了样品中双-鼠李糖脂的存在。β-L-Rhap(1″→2′)-β-L-Rhap键的形成引起了通过氧相连结的双-鼠李糖的C2’和C1’原子的强的核磁共振信号移动(图6的结构)。在图9中示出HSQC谱的C^1’/1”H及C^2’/2”H区域。在102ppm中呈现的交叉峰(¹³C标尺、红色箱体)与在双-鼠李糖脂中的H1”/C1”的相关系数一致。相反，在95-96ppm中呈现的交叉峰与单-鼠李糖脂的H1’/C1’的相关系数一致(图6的结构)。在～79ppm中呈现的两个交叉峰(图9蓝色箱体)与双-鼠李糖脂部分的两个C2’原子一致。

自旋系统分配

为了测定样品里的其他鼠李糖脂的相对密度和数，利用二维核磁共振谱(异核单量子相关谱(HSQC)、总相关谱(TOCSY)、COSY-DQF)分离自旋系统，这是与鼠李糖脂分子的鼠李糖环结构的脂肪酸尾部结构一致。并且，这是可证明鼠李糖部分(系统1-系统6)的未知的系统和脂肪酸尾部的8个系统。以鼠李糖部分的类型预先分配其系统(双-鼠李糖的第一(’)或第二(”)单一环结构，羟基脂肪酸的位置(直接或间接地与鼠李糖相连接，图6)基于公知的化学移动(部分3，二维核磁共振分析，图9的例示)。系统1和系统2分配于双-鼠李糖的第二个鼠李糖结构，系统3和系统4分配于双-鼠李糖的第一个鼠李糖环结构。系统5和系统6与单-鼠李糖脂中的鼠李糖环结构一致。不仅是它们的最少成分9和最少成分10，而且系统8和系统9分配于脂质里的第二个脂肪酸(未与鼠李糖部分直接相连接)。最终，分配于系统11～系统14的第一个脂肪酸链，直接与鼠李糖部分相连接。

自旋系统连接

分配用于鼠李糖脂分子的结构性部分的自旋系统之后，执行了将其与鼠李糖脂内部相连接的几种可能的方法。为了检测存在于鼠李糖环的通过质子和脂肪酸的质子表面的偶极-偶极相互作用，利用了二维核磁共振ROESY实验。如预计，鼠李糖系统3-鼠李糖系统6的H1质子和脂肪酸系统11-脂肪酸系统14的H1质子之间的交叉峰(图10)。这实验可实现使分配于鼠李糖第一个环结构或单一结构的自旋系统与分配于脂肪酸的自旋系统相连接。

在双-鼠李糖里的第二环结构和分配于脂肪酸质子的系统1和系统2的H1质子之间未观察到任何交叉峰。最终，自旋系统整理成4个鼠李糖脂分子I～IV(表16)。

表16

核磁共振样品中I-IV分子的相度密度

1D 1H-核磁共振谱的预分析明确地示出样品中鼠李糖的相对密度(图11)。在脂肪酸系统中，还观察到了相同的结果。利用I-IV分子的相对密度推定信号强度，为了取得在H1/H1”、H2/H2”鼠李糖质子及H1和H4脂肪酸质子中分离得均匀的信号，利用1D 1H核磁共振谱测定信号强度。在表16种提出分析的概要。

对与从微生物(绿脓杆菌)培养液提取的生物表面活性剂R1相同的绿脓杆菌变更培养及提取方式来取得的R2、R3及含有90％的鼠李糖脂的从西格玛奥德里奇购买的R90进行核磁共振分析，最终明确各提取物和购入的R90均包含鼠李糖脂。由此，可证明从微生物(绿脓杆菌)培养液提取的R1含有鼠李糖脂系列生物表面活性剂(图11)(表16)。并且，通过核磁共振分析可知5个样品含有鼠李糖脂，其含有率各不同。并且，鼠李糖脂有可能与其他生物学研究相关联。

表17

5.绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)培养液提取物的抗氧化效果

为了调查绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)培养液提取物R1的抗氧化效果，进行1，1-二苯基-2-三硝基苯肼消除活性试验，结果R1在0.5％以上的浓度条件下，表现出与作为具有抗氧化效果的代表成分的抗坏血酸(AA)相同水平的抗氧化效果。相反，羟苯甲酯(MTP)与R1进行比较，在相同的浓度下，表现出显著低的抗氧化效果。基于这种结果具有抗氧化效果的绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)培养液提取物R1可作为防腐剂适用(图12)。

6.引起绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)培养液提取物的抗氧化效果的有效成分的探索

分离从微生物(绿脓杆菌)培养液提取的混合物状态的R1来取得了分馏物1、分馏物2、分馏物3、分馏物4、分馏物5及分馏物6。对取得的各试样进行对金黄色葡萄球菌的抗菌活性的试验，分馏物1、分馏物2、分馏物3表现出与R1相应的抗菌活性，分馏物4、分馏物5表现出较弱于R1的抗菌活性，分馏物6未表现出抗菌活性(图13)。对全部试样进行液相色谱分析，最终，在发现在示出抗菌活性的分馏物1、分馏物2及分馏物3中存在得高，并在分馏物4、分馏物5中逐渐减少的共同的2个峰，并命名为峰1、峰2(图14)。与抗菌活性试验相连接判断时，判断为是否存在峰1、峰2确定抗菌活性，进行峰1、峰2的MS及MS/MS试验，最终，分析为峰1是具有650的分子量、Rha-Rha-C10-C10的结构的双-鼠李糖脂(Di-rhamnolipid)、峰2分析为具有504的分子量、Rha-C10-C10的结构的单-鼠李糖脂(Mono-rhamnolipid)(图15a-d)。在R1中存在具有多种结构的鼠李糖脂(图16、表18)，其中，还确认了具有Rha-C10-C10的结构的鼠李糖脂为具有抗菌活性的有效成分。并且，对从韩国西格玛奥德里奇购入的绿脓杆菌培养液提取的鼠李糖脂(R90、R95)的金黄色葡萄球菌的抗菌活性与R1相比，显著低(图17)。

表18

MS主峰(MS of main peaks(R1))

以上，对本发明内容的特定部分进行了详细说明，这种详细技术只属于优选实例，本发明的范围不局限于此，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。因此，本发明的实质性的范围应根据所附的发明要求保护范围和其的等同技术方案来定义。

Claims

1.一种防腐用组合物，其特征在于，包含绿脓杆菌培养液提取物作为有效成分。

2.一种抗生组合物，其特征在于，包含绿脓杆菌培养液提取物作为有效成分。

3.一种痤疮预防或治疗用组合物，其特征在于，包含绿脓杆菌培养液提取物作为有效成分。

4.一种抗氧化用组合物，其特征在于，包含绿脓杆菌培养液提取物作为有效成分。

5.根据权利要求1至4中的任一项所述的组合物，其特征在于，在绿脓杆菌培养液中添加盐酸溶液来进行沉淀后，在上述沉淀物添加乙醚来获取上述绿脓杆菌培养液提取物。

6.根据权利要求1至4中的任一项所述的组合物，其特征在于，上述绿脓杆菌培养液提取物包含鼠李糖脂。

7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，上述鼠李糖脂为由以下化学式1表示的双-鼠李糖脂或由化学式2表示的单-鼠李糖脂：

化学式1

化学式2

8.根据权利要求1至4中的任一项所述的组合物，其特征在于，相对于总100重量份的组合物，上述组合物包含0.005～1.0重量份的绿脓杆菌培养液提取物。

9.根据权利要求1至4中的任一项所述的组合物，其特征在于，上述组合物对选自由葡萄球菌属、芽孢杆菌属、绿脓杆菌属、念珠菌属、丙酸杆菌属、链球菌属、变形杆菌属、棒状杆菌属、肠球菌属、克雷伯氏菌属及大肠菌组成的一种以上的微生物表现出抗菌活性。

10.根据权利要求1所述的防腐用组合物，其特征在于，上述防腐用组合物为化妆品组合物。

11.根据权利要求2所述的抗生组合物，其特征在于，上述抗生组合物为食品组合物。

12.根据权利要求3所述的痤疮预防或治疗用组合物，其特征在于，上述痤疮预防或治疗用组合物为皮肤外用剂组合物。

13.根据权利要求12所述的痤疮预防或治疗用组合物，其特征在于，上述皮肤外用剂组合物为剂型化为选自溶液、悬浮液、乳浊液、糊剂、凝胶、乳霜、乳液、粉、肥皂、含表面活性剂的洁面剂、油、粉状粉底、乳浊液粉底、蜡粉底及喷雾剂中的一种剂型。

14.一种防腐方法，其特征在于，包括将绿脓杆菌培养液提取物适用于对象的步骤。

15.一种抗生方法，其特征在于，包括将绿脓杆菌培养液提取物适用于对象的步骤。

16.一种痤疮的预防或治疗方法，其特征在于，包括将绿脓杆菌培养液提取物适用于对象的步骤。

17.一种抗氧化方法，其特征在于，包括将绿脓杆菌培养液提取物适用于对象的步骤。