KR20120110292A - 메티실린 내성 황색포도상구균에 대해 유효한 항생물질을 생산하는 슈도모나스 애루기노사 ｋａｃｃ９１５９２ｐ 균주 - Google Patents

메티실린 내성 황색포도상구균에 대해 유효한 항생물질을 생산하는 슈도모나스 애루기노사 ｋａｃｃ９１５９２ｐ 균주 Download PDF

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김동완
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Abstract

본 발명은 메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA: methicillin resistance Staphylococcus aureus)에 유효한 항생물질을 생산하는 신규 미생물 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) KACC 91592P 균주에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규한 균주, 이의 배 양상등액 및 이의 추출물은 메티실린 내성 황색포도상구균의 생장을 효과적으로 억제하여 항균 능력을 보이므로. 항생제 내성 병원성 미생물 생장 저해용 조성물, 항생제 내성 병원성 미생물 생장 억제용 건강식품, 항생제 내성 병원성 미생물 생장 억제용 사료 첨가제로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

메티실린 내성 황색포도상구균에 대해 유효한 항생물질을 생산하는 슈도모나스 애루기노사 ＫＡＣＣ９１５９２Ｐ 균주 {Microorganism, Pseudomonas aeruginosa. KACC 91592P, producing antibiotics against methicillin resistance Staphylococcus aureus}
본 발명은 메티실린 내성 황색포도상구균 (MRSA: methicillin resistance Staphylococcus aureus)에 유효한 항생물질을 생산하는 신규 미생물 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) KACC 91592P 균주에 관한 것이다.
병원성 세균 중 현재 전 세계적으로 가장 문제시되고 있는 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus)은 전체 인구의 약 30 %에서 검출되는 그람양성균으로, 병원 내 감염증을 유발하는 병원체로 널리 알려져 있다 (Isabel C.V, Robert S.K., Francisco A.K., J. Am. Acad. Dermatol. 50:845-849, 2004). 상기 세균은 일차적으로 피부와 연부조직에 감염을 일으켜 농피증 (pyoderma)의 원인이 되고, 골수염, 심내막염, 패혈증과 균혈증 등 생명을 위협하는 중한 전신 감염증을 유발하는 것으로 보고되고 있다 (Henry Shinefield, M.D. et al., The New England J. of Med. 346:491-496, 2002). 페니실린 (Penicilin), 메티실린 (methicillin) 등 포도상구균 항균제는 그 효과가 우수하여 지난 수십 년간 본 감염증의 주요 치료약제로 사용되어 왔으나, 1961년 영국에서 메티실린에 내성을 보이는 균주 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus: MRSA)가 처음 보고된 이후 전 세계적으로 지속적인 증가 추세를 보이고 있다 (Standing Medical Advisory Committee, Department of Health, 1998).
MRSA는 1961년 영국에서 Jevons에 의해 처음 발견된 후 세계 각처에서 보고되기 시작했고, 이후로 20년 동안 MRSA의 비율은 유럽 여러 나라에서 1-2 %비율로 증가하였으며, 북유럽의 스페인, 프랑스, 이탈리아에서는 30-40 % 까지 나타났다 (Voss et al., 1994). 일본에서는 1990년 초에 59.1-67.3 %가 분리되었다고 보고된바 있으며 국내에서도 MRSA의 분리율이 점차 증가하여 1995년에 50 %를 넘어 평균 62.1 %로 나타났으며 최근 종합병원 환자에게서 76 % 이상의 분리율을 보이고 있다 (Patel et al., 1989 ; 이 등, 1993 ; 김 등, 1993). MRSA 분리율의 증가원인은 병원 내 감염뿐만 아니라 교통의 발달과 무분별한 항균제 사용에 있다. 지난 20년간 축산분야와 양식분야가 큰 시설에 집중적으로 이루어지면서 이미 많은 항균제가 사료와 질병의 예방을 목적으로 무분별하게 사용되었고 지속적인 항균제의 노출은 내성세균의 확산을 야기시켰다. 때문에 지역사회에서도 MRSA 감염 환자가 증가하고 있어 이에 대한 대책이 시급한 실정이다 (Murakami et al., 1991 ; Voss et al., 1994).
최근 출원된 항생제 내성균 억제 관련 특허로는 토양에서 분리한 스텝토마이세스 레이드로진스 (Streptomyces laidlogenes) DS684 (대한민국 특허출원 제 2004-55648)는 메티실린과 반코마이신 내성균주의 억제효능이 있다고 보고되었으며, 락토바실러스 루미니스 (Lactobacillus ruminus) SPM0211 (대한민국 제 654370호)균주가 반코마이신 내성균주의 억제효능이 있는 것으로 보고되었다.
MRSA에 대한 치료제의 개발에 관한 연구는 새로운 항MRSA 항균물질의 개발 (Yasuhiro et al., 1993 ;Kimito et al., 1990 ; Harold et al., 1989 ; Atsushi et al., 1988 ; Matsuo et al., 1994)에 관한 연구와 기존의 항균제들의 병용 투여 등에 관한 연구 (Ishii et al., 1994 ; Yamaguchi et al., 1994)가 주로 이루어지고 있으나 큰 성과를 거두지는 못하였다. 그러므로 MRSA에 선택적이고 강한 항균활성을 가지는 새로운 항균물질의 개발이 시급한 과제라고 할 수 있다.
따라서 본 발명자들은 천연 항생물질 연구의 일환으로 다양한 미생물을 탐색하였고 이를 기초로 독성이 없으며 항생제 내성 균주에 항균효과가 뛰어난 새로운 항생물질을 개발하고자 하였다. 항균물질을 생산하는 균주를 토양 시료에서 분리하였으며 이 분리 균주들로 항균활성 검사를 시행하여 비교적 항균스펙트럼이 넓게 나타나며 특히 항생제 내성 균주에 항균활성을 나타내는 신규 미생물 슈도모나스 애루기노사 BCNU 7090 (수탁번호 KACC 91592P)을 동정하고 항MRSA 치료제로서 개발 가능성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 항생제 내성 미생물의 생장을 억제하는 신규한 균주와 이의 배양 상등액 및 이의 추출물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항생제 내성 미생물의 생장을 억제하는 신규한 균주 또는 이의 배양 상등액 및 이의 추출물을 유효성분으로 하는 프로바이오틱스, 항생제 내성 병원성 미생물 생장 억제용 약학적 조성물, 항생제 내성 병원성 미생물 생장 억제용 건강식품, 항생제 내성 병원성 미생물 생장 억제용 사료 첨가제를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 항생제 내성 병원성 미생물의 생장을 억제하고 수탁번호 KACC 91592P로 기탁된 것을 특징으로 하는 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주의 배양 상등액 및 이의 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명은 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주 또는 이의 배양 상등액 및 이의 추출물을 유효성분으로 하는 프로바이오틱스 (probiotics)를 제공한다.
또한, 본 발명은 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주 또는 이의 배양 상등액 및 이의 추출물을 유효성분으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물 생장 억제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주 또는 이의 배양 상등액 및 이의 추출물을 유효성분으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물 생장 억제용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주 또는 이의 배양 상등액 및 이의 추출물을 유효성분으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물 생장 억제용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P는 신규한 미생물로써 독성이 없으며 MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus)에 대해 강한 항균활성을 나타낸다. 따라서 이를 통해 메티실린계 항생제 내성 균주들에 대해 치료 효과를 가지는 새로운 항생 물질을 제공할 수 있다.
도 1은 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주의 16S 리보좀 DNA 분석을 통해 계통수를 분석한 그림이다.
도 2는 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주의 그람 양성세균, 그람 음성세균, 진균 및 항생제 내성균주 등 총 14종의 균주에 대한 항균 활성을 분석한 그림이다. (A, B. cereus B. B. subtilis C. S. aureus D. E. coli E. P. milabilis F. P. vulgaris G, C. albicans H, F. neoformans I, Sa . cerevisiae J, A. niger K, Staphylococcus aureus CCARM 3089 L, Staphylococcus aureus CCARM 3090 M, Staphylococcus aureus CCARM 3091 N, Staphylococcus aureus CCARM 3095)
도 3은 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주의 그람 양성세균 및 그람 음성세균에 대한 항균 활성을 분석한 그림이다.
도 4는 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주의 효모 및 곰팡이에 대한 항균 활성을 분석한 그림이다.
도 5는 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주의 항생제 내성 균주에 대한 항균 활성을 분석한 그림이다.
도 6은 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주의 배양 상등액의 추출물 (PP: 펩타이드 추출물, HX: 헥산 추출물, DCM: 다이클로로메탄 추출물, EA: 에틸아세테이트 추출물)의 항균활성을 분석한 그림이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 항생제 내성 병원성 미생물의 생장을 억제하고 수탁번호 KACC 91592P로 기탁된 것을 특징으로 하는 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주를 제공한다.
본 발명자들은 항생제 내성 병원성 미생물인 MRSA (methicillin-resistant Stapylococcus aureus)에 항균 활성을 나타내는 미생물을 선별하기 위하여 MRSA 균주가 도발된 플레이트에 토양시료를 희석하고 함께 배양하여 투명환을 나타내는 콜로니 (colony)를 선별하였다. 이 후 선별된 집락을 순수 분리하였으며, 최종 선별된 균주를 동정하여 “슈도모나스 애루기노사 BCNU 7090"이라 명명하였고, 대한민국에 위치한 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2010년 11월 03일 기탁하였다 (수탁번호 : KACC 91592P).
또한, 본 발명은 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주의 배양 상등액 및 이의 추출물을 제공한다.
본 발명자들은 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주의 배양 상등액을 희석하여 병원성 미생물을 대상으로 생장 억제 능력을 조사하였다. 대상 균주는 그람양성 세균 3종 (바실러스 세레우스 (Bacillus cereus KCTC 3624), 바실러스 서브틸리스 (고초균, Bacillus subtilis KCTC 10111 (ATCC 465)), 스타필로코코크스 아우레우스 (황색포도상구균, Staphylococcus aureus IMSNU 11088 (ATCC 6538))), 그람음성 세균 3종 (에스케리시아 콜라이 (대장균, Escherichia coli IMSNU 10080 (ATCC 10798)), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis IMSNU 20367 (ATCC 29906)), 프로테우스 불가리스 (Proteus vulgaris IMSNU 13025 (ATCC 13315))), 효모 3종 (칸디다알비칸스 (Candida albicans KCTC 7270 (ATCC 10231)), 피로바시디움 네오포만스 (Filobasidium neoformans KCTC 7902 (IFO 0545)), 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae (KCTC 7968))), 곰팡이 1종 (아르페르질루스니게르 (Aspergillus niger KACC 40280 (ATCC 4695))), 그리고 항생제 내성균주 4종 (스타필로코코크스 아우레우스 ( Staphylococcus aureus ) CCARM 3089, Staphylococcus aureus CCARM 3090, Staphylococcus aureus CCARM 3091, Staphylococcus aureus CCARM 3095) 등 총 14종이었다.
그 결과, 그람양성 세균, 그람음성 세균, 진균 그리고 MRSA에 대한 항균활성이 모두 우수하게 나타났으며 특히 항생제 내성 균주의 생장을 효과적으로 억제함을 관찰하였다 (도 2 참조). 이를 통해 본 발명의 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주의 배양 상등액은 항생제 내성 병원성 미생물인 MRSA 균주의 생장을 효과적으로 억제함을 알 수 있다.
또한 본 발명자들은 KACC 91592P 균주의 배양 상등액의 추출물을 이용하여 병원성 미생물을 대상으로 생장 억제 능력을 조사하였다. 상기 추출물 중 펩타이드 추출물은 균주의 배양 상등액을 필터 후 원심 분리하여 모인 펠렛을 메탄올로 추출하여 수득하였으며, 유기용매 추출물은 배양 상등액을 원심 분리한 후, 상등액만을 헥산, 다이클로로메탄, 에틸아세테이트 순으로 차례로 추출하여 헥산 추출물 (HX), 다이클로로메탄 추출물 (DCM), 에틸아세테이트 추출물 (EA)을 수득하였다.
상기 네 가지 추출물을 이용하여 그람양성 세균 3종, 그람음성 세균 3종, 진균 1종, 항생제 내성 세균 2종에 대한 항균활성 실험을 수행한 결과, 생장 억제 효능이 있음을 확인하였으며, 특히 펩타이드 추출물의 항균 활성이 가장 뛰어남을 확인하였다 (도 7 참조)
또한, 본 발명은 상기 균주, 배양 상등액 및 이의 추출물을 유효성분으로 하는 프로바이오틱스를 제공한다.
프로바이오틱스 (probiotics)란 사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 유해 미생물에 대한 저항성 증진을 통한 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물로 의미 된다. 프로바이오틱스는 단일 또는 복합 균주 형태로 사람이나 동물에 건조된 세포 형태나 발효 산물 형태로 급여될 수 있다. 본 발명의 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주, 이의 배양 상등액 및 이의 추출물은 모두 인체에 질환을 야기할 수 있는 병원성 균주 14 종에 대하여 항균 능력을 보유하고 있어, 안전하고 독성 없는 프로바이오틱스로서 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명의 프로바이오틱스는 가축을 비롯한 동물을 대상으로 사용될 수 있으며 식품 또는 동물 사료에 첨가할 수 있다. 또한 동물 의약품 및 의약품에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주, 이의 배양 상등액 및 이의 추출물을 유효성분으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물의 생장 저해용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 유효성분은 전체 조성물에 대하여 0.001 내지 90 %를 사용할 수 있으며, 본 발명에 따른 균주 배양액을 2 내지 500 배 희석하여 사용할 수 있다.
상기 항생제 내성 병원성 미생물로는 메티실린 내성 황색포도구균 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus:MRSA)인 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물은 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주, 배양 상등액 및 이의 추출물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1 종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 실제 임상투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주, 이의 배양 상등액 및 이의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 젤라틴 등을 섞어 제조된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주, 배양 상등액 및 이의 추출물이 약 0.001 ~ 100 ㎎/kg이고, 바람직하게는 5 ~ 50 ㎎/kg이며, 하루 1 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물은 병원성 미생물 즉 MRSA 균주가 유발시킬 수 있는 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주, 이의 배양 상등액 및 이의 추출물을 유효성분으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물의 생장 억제용 건강식품을 제공한다.
상기 항생제 내성 병원성 미생물로는 메티실린 내성 황색포도구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus :MRSA)인 것이 바람직하다.
본 발명의 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주, 이의 배양 상등액 및 이의 추출물을 함유하는 건강식품으로는 상기 균주, 이의 배양 상등액을 유효성분으로 하는 차, 젤리, 즙, 엑기스, 음료 등의 병원성 미생물 생장 억제를 목적으로 하는 민간요법제를 들 수 있다. 이와 같이 다양한 형태로 가공된 본 발명의 항생제 내성 병원성 미생물의 생장 억제용 건강식품은 인체에 부작용이 없으면서 병원성 미생물의 생장 억제에 우수할 뿐 아니라 복용이 용이하고 장기간 보관이 가능하다.
본 발명의 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주, 이의 배양 상등액 및 이의 추출물은 병원성 미생물의 생장 억제를 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주, 이의 배양 상등액을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 각각을 그대로 참가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명의 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주, 이의 배양 상등액이 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없으므로 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주, 이의 배양 상등액을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸컬릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주, 이의 배양 상등액 100 g당 일반적으로 0.01 내지 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 내지 0.03 g이다.
상기 외의 본 발명의 혼합 생약 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주, 이의 배양 상등액을 함유하는 건강식품은 천연 과일 주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하지 않지만 본 발명의 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주, 이의 배양상등액 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 배양 상등액 및 이의 추출물을 유효성분으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물의 생장 억제용 사료 첨가제를 제공한다.
상기 항생제 내성 병원성 미생물로는 메티실린 내성 황색포도구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus:MRSA)인 것이 바람직하다.
사료 첨가제로서 이용될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립형태로 제조될 수 있다. 상기 사료첨가제는 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주, 이의 배양 상등액, 또는 상기 항균 대사물질을 통상의 동물 사료 100 중량부에 대하여 1 ~ 20 중량부로 첨가하는 것이 바람직하며, 10 ~ 20 중량부로 첨가하는 것이 보다 바람직하다. 상기 사료 첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화될 수 있으며, 통상의 사료 성분을 함께 포함할 수 있다.
상기 사료 첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성장 촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
상기 사료 첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료 첨가제는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구 제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료 첨가제를 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토오스, 수크로오스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료 첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다. 상기 사료는 동물의 식이 욕구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분을 포함할 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분, 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.
본 발명의 사료 첨가제는 MESA 균주에 대한 항균 효과 및 생장억제 효과를 가짐을 기대할 수 있다.
이하 본 발명의 내용을 실시예 및 제제예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 항생물질을 생산하는 균주의 분리
토양시료 1 g을 10 ml의 멸균수에 현탁한 후, 현탁액 1 ml를 LB 미디어 (Luria-Bertani medium, 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) 평판배지, Nutrient broth (NA, 0.1% beef extract, 0.2% yeast extract, 0.5% peptone, 0.5% NaCl) 평판배지 등 분리 배지에 도말 하였다. 이를 25 ℃ 배양기에서 24~48 시간 동안 배 양하여 세균 및 곰팡이에 대하여 항균활성물질을 생산하는 균주를 분리하였다. 분리된 균주들 중 항균활성이 우수하며 특히 MRSA에 대한 항균력이 강한 신규한 균주 1종 (BCNU 7090이라 명명)을 선택하여 농업유전자원정보센터에 2010년 11월 3일 기탁하였으며 이 균주의 수탁번호는 KACC 91592P이다.
실험예 1. KACC 91592P 16S 리보좀 DNA 조사
분리균주 BCNU 7090의 유전학적인 동정과 계통학적 유연관계를 분석하기 위해 16S 리보좀 DNA 염기서열을 분석하였다. 27F (5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)와 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) 프라이머를 사용하여 DNA 중합효소 연쇄반응을 통하여 16S 리보좀 DNA를 증폭하여 염기서열을 분석하여 이를 바탕으로 미국 국립보건원 생물공학정보센터 (National Center for Biotechnology Information, NCBI) 에 등록된 균주들의 16S 리보좀 유전자들과 비교하여 ClustalW를 사용하여 정렬하였다. 1000 bootstrap neighbor-joining replications 법으로 계통수를 완성하고, BLAST를 이용하여 상동성 분석을 하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이 KACC 91592P는 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa )와 97 % 상동성이 있다고 확인되었다.
실험예 2. KACC 91592P의 생리 생화학적 특성조사
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology의 방법에 준하여 분리 균주인 KACC 91592P의 그람염색, 형태, NaCl의 농도 및 pH에서의 생존력 등의 생리 생화학적 특성을 분석하였다.
표 1에 나타낸 바와 같이 분리 균주 KACC 91592P은 형태학적으로 그람음성 세균, 간균임을 확인하였다. 또한 분리 균주의 생리생화학적 특성 조사 결과 NB 배지에서 배양하였을 때 25 ℃부터 45 ℃사이에서 생육하였으며 NaCl 농도는 7 %의 NaCl 농도까지 생장하였고 생육 pH범위는 pH 6에서 pH 9까지의 범위에서 생장하였다.
Growth characteristic KACC 91592P
Colony morphology
Margin Undulate
Elevation Flat
Surface Smooth
Pigment brown
Gram's reaction -
Shape Rods
Growth at temperature (°C)
25 +
45 +
Growth at pH
4 -
5 -
6 +
7 +
8 +
9 +
10 -
Growth on NaCl (%)
2 +
5 +
7 +
8 -
Production of Amylase +
Protease +
Oxidase +
Gelatinase +
Catalase -
Urease +
Egg-yolk lecithinase +
H2S production -
Methyl red test -
Growth on MacConkey agar +
Utilization of Dextrose +
Maltose +
Mannose -
Lactose -
Mannitol +
Sucrose -
Xylose -
Fructose +
Glycerol +
Galactose -
Starch -
+, enzyme or (metabolic) reaction present; -, enzyme or (metabolic) reaction
실험예 　3． 그람 양성세균, 그람 음성세균, 진균 및 항생제 내성균주에 대한 항균 활성 조사
그람양성 세균 3 종, 그람음성 세균 3 종, 효모 및 곰팡이 4 종과 항생제 내성균주 3 종에 대하여 분리균주 KACC 91592P의 항균활성을 조사하였다.
대상 균주는 그람양성 세균인 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus KCTC 3624), 바실러스 서브틸리스 (고초균, Bacillus subtilis KCTC 10111 (ATCC 465)), 스타필로코코크스 아우레우스 (황색포도상구균, Staphylococcus aureus IMSNU 11088 (ATCC 6538))로 3종, 그람음성 세균인 에스케리시아 콜리 (대장균, Escherichia coli IMSNU 10080 (ATCC 10798)), 프로테우스 미라비리스 (Proteus mirabilis IMSNU 20367 (ATCC 29906)), 프로테우스 불가리스 (Proteus vulgaris IMSNU 13025 (ATCC 13315))로 3종, 효모인 칸디다알비칸스 (Candida albicans KCTC 7270 (ATCC 10231)), 피로바시디움 네오포만스 (Filobasidium neoformans KCTC 7902 (IFO 0545)), 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae KCTC 7968)로 3종, 곰팡이인 아르페르질루스니게르 (Aspergillus niger KACC 40280 (ATCC 4695))로 1종, 그리고 항생제 내성균주인 스타필로코코크스 아우레우스 ( Staphylococcus aureus ) CCARM 3089, Staphylococcus aureus CCARM 3090, Staphylococcus aureus CCARM 3091, Staphylococcus aureus CCARM 3095로 4종 등 총 14종이었으며, 각 한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC), 한국농업미생물자원센터 (KACC), 서울대학교 미생물연구소 (IMSNU) 및 항생제 내성 균주은행 (CCARM)에서 분양받아 사용하였다.
본 실험의 항균활성은 paper diffusion (paper disc 직경 6mm) 방법을 이용하여 측정하였다. 테스트 균주의 탁도가 McFarland number 1이 되도록 배양하여 각 테스트 균주의 최적 배지에 0.1 ml 도말한 후, KACC 91592P 균주의 배양 상등액 10 μl 를 테스트 균주가 도말된 평판 배지에 분주하였다. 배양 상등액은 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P을 KMB 액체 배지 (Peptone 20g, Glycerol 15mL, Potassium phosphate 0.392g, Magnesium sulfate 0.732, D.W 1L)에서 6 일동안 37℃에서 진탕배양한 후, 배양액을 8000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다.
각 테스트 균주를 최적온도에서 24 시간 배양 후 배양된 KACC 91592P의 직경 크기를 약 10mm로 측정하였으며 여기에 clear zone의 크기를 더하여 항균활성을 측정하였다. 곰팡이인 A. niger 의 경우는 25 ℃에서 2~3 일간 배양하여 곰팡이가 충분히 배양될 수 있도록 한 후 세균과 같은 방법으로 항균활성을 측정하였다 (도 2).
도 3에 나타낸 바와 같이 그람 양성세균에 대한 항균활성은 생육억제대로 보면 B. subtilis에서 20.0 mm로 측정되어 가장 항균활성이 컸으며, S. aureus에서 18 mm 그리고 B. cereus에서 15 mm로 측정되었다. 3종의 테스트 균주에 따른 차이는 있었으나 실험에 사용된 3종의 그람 양성세균에 대하여 항균력이 있음이 확인되었다.
또한, 도 3에 나타낸 바와 같이 그람 음성세균에 대한 항균활성은 P. miravilis에 대하여 생육억제대가 24.0 mm, P. vulgaris에서 16.0 mm 그리고 E. coli에 대하여는 12.0 mm로 측정되어 E. coli에 비해 나머지 2종의 음성 세균에서 항균활성이 더 크게 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이 효모균에 대한 항균활성은 C. albicans에서 14 mm, F. neoformas에서 26 mm 그리고 Sa . cerevisiae에서 12 mm로 F. neoformas에 대해서 항균활성이 가장 우수하였다. 그리고 곰팡이인 A. niger에 대한 항균활성 검사결과 14.0 mm의 생육억제대를 생성하였다.
또한 도 5에 나타낸 바와 같이 항생제 내성 균주에 대한 항균활성테스트를 시행한 결과 Staphylococcus aureus CCARM 3095에서 19.0mm로 가장 우수한 항균활성을 나타내었고 Staphylococcus aureus CCARM 3089에서 18.0 mm, Staphylococcus aureus CCARM 3090에서 16.0 mm 그리고 Staphylococcus aureus CCARM 3091에서 18.0 mm로 나타났다.
테스트에 사용한 진균은 모두 인체에 질환을 야기할 수 있는 병원성 균주이며 그람 양성세균, 음성세균, 진균 그리고 MRSA에 대한 항균활성이 모두 우수하게 나타나, 향균 스펙트럼이 광범위한 것으로 판단되었다.
실험예 　4． 배양상등액의 추출물의 그람 양성세균, 그람 음성세균, 진균 및 항생제 내성균주에 대한 항균 활성 조사
실시예 3과 같은 방법으로 수득한 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P의 배양 상등액을 실린지 필터 (0.45 μm)를 이용하여 균체를 완전히 제거한 후, 6M HCl을 이용하여 상등액의 pH를 2로 조정하고 18~24시간 동안 4℃에서 침전시켰다. 이 후 침전된 상등액을 8500 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하여 펠렛을 모아 메탄올로 추출하여 펩타이드 (peptide) 추출물을 수득하였다.
또한 실시예 3과 같은 방법으로 수득한 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P의 배양 상등액을 8500 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리한 후 균체를 완전히 제거하고 상등액만을 취하였다. 상기 상등액을 헥산(hexane), 다이클로로메탄(dichloromethane), 에틸아세테이트 (ethylacetate) 순으로 추출하여 HX (헥산) 추출물, DCM (다이클로로메탄) 추출물, EA (에틸아세테이트) 추출물을 수득하였다
상기에서 수득한 네 종류의 추출물을 1 mg/10 μL 의 농도로 실시예 3과 같은 방법으로 그람양성세균 3종 (Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus), 그람음성세균 3종 (Escherichia coli , Proteus mirabilis , Proteus vulgaris) 진균 1종 ( Filobasidium neoformans ), 항생제 내성균주 2종 ( Staphylococcus aureus CCARM 3089, Staphylococcus aureus CCARM 3090)에 대한 항균활성 실험을 수행하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, HX (헥산) 추출물은 E. coli에서는 항균활성을 나타내지 않았으나, B. cereus , B. subtilis , P. milabilis , P. vulgaris에서 항균활성이 확인 되었고, 특히 S. aureus에서 항균활성이 가장 뛰어났다. DCM (다이클로로메탄) 추출물은 P. vulgaris에서 약한 항균활성을 나타내었고, EA (에틸아세테이트) 추출물은 B. subtilis에서 약한 항균활성을 나타내었다.
펩타이드 (peptide) 추출물은 모든 테스트 균주에 대하여 다른 용매의 추출물보다 높은 항균활성을 보였으며, 특히 그람양성세균 중 S. aureus , 그람음성세균 중 P. milabilis , MRSA 균주 중 S. aureus CCARM 3089에 대하여 생육억제대가 각각 22 mm, 15 mm 그리고 20 mm로 나타나, 우수한 항균활성을 나타냄을 확인하였다.
진균 (F. neoformans )에 대한 항진균 활성 결과 HX, DCM, 그리고 EA 추출물에서는 항균활성이 나타나지 않았지만 펩타이드 추출물에서는 생육억제대가 7mm로 나타나 항균활성이 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명에 따른 제제예를 예시한다.
제제예 1. 약학적 조성물의 제조
1. 산제의 제조
슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주의 배양 상등액 또는 이의 추출물 2g
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
2. 정제의 제조
슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주의 배양 상등액 또는 이의 추출물 100 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
3. 캡슐제의 제조
슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주의 배양 상등액 또는 이의 추출물 100 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
4. 정장제의 제조
슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주의 건조 균말 20 중량%
올리고당 10 중량%
무수포도당 20 중량%
결정과당 5 중량%
비타민 C 2 중량%
과일분말향 5 중량%
알로에 5 중량%
식이섬유 15 중량%
차전자피 18 중량%
혼합하여 캡슐화 또는 제제화하여 정장제를 제조한다.
제제예 2. 식품의 제조
1. 유제품의 제조
슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주의 배양 상등액 또는 이의 추출물 0.1 ~ 1.0 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 요구르트, 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
제제예 3. 사료의 제조
1. 약 50 kg까지의 비육돈용 순수사료
a) 조단배질 최소 16 중량%,
라이신 최소 0.8 중량%,
조지방 최대 8 중량%,
조섬유 최대 6 중량%,
전분 최소 33 중량%,
칼슘 최소 0.7 중량%,
인 최소 0.5 중량%,
나트륨 최소 0.15 중량%,
b) 구리 최소 20 mg,
아연 최소 50 mg,
비타민 A 최소 4,000 IU,
비타민 D 최소 500 IU,
c) 본 발명의 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주의 배양 상등액 0.02 - 20 ppm.
2. dir 80 kg 이상의 비육 송아지용 우유 대체 사료
a) 조 단백질 최소 17 중량%,
라이신 최소 1.25 중량%,
조지방 15 ~ 30 중량%,
조섬유 최대 2 중량%,
조회분 최대 10 중량%,
칼슘 최소 0.9 중량%,
인 최소 0.7 중량%,
나트륨 최소 0.2 중량%,
마그네슘 최소 0.13 중량%,
분유 최소 25 중량%,
b) 구리 최대 15 mg,
비타민 A 최소 8,000 IU,
비타민 D 최소 1,000 IU,
비타민 E 최소 20 mg,
c) 본 발명의 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주의 배양 상등액 0.02 ~ 20 ppm.
농업생명공학연구원 KACC91592P 20101103

Claims (11)

  1. 항생제 내성 병원성 미생물의 생장을 억제하는, 수탁번호 KACC 91592P로 기탁된 것을 특징으로 하는 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주.
  2. 제 1항에 있어서, 항생제 내성 병원성 미생물은 메티실린 내성 황색포도상구균 (methicillin resistant Staphylococcus aureus)인 것을 특징으로 하는 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주.
  3. 제 1항의 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주의 배양 상등액.
  4. 제 3항의 배양 상등액을 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 헥산, 다이클로로메탄, 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 유기용매로 추출한 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주의 배양 상등액의 추출물.
  5. 제 1항의 슈도모나스 애루기노사 KACC 91592P 균주를 유효성분으로 하는 프로바이오틱스(probiotics).
  6. 제 1항의 균주, 제 3항의 배양 상등액 또는 제 4항의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 병원성 미생물 생장 저해용 약학적 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 항생제 내성 병원성 미생물은 메티실린 내성 황색포도상구균 (methicillin resistant Staphylococcus aureus)인 것을 특징으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물 생장 저해용 약학적 조성물.
  8. 제 1항의 균주, 제 3항의 배양 상등액 또는 제 4항의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 병원성 미생물 생장 억제용 건강식품.
  9. 제 8항에 있어서, 항생제 내성 병원성 미생물은 메티실린 내성 황색포도상구균 (methicillin resistant Staphylococcus aureus)인 것을 특징으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물 생장 억제용 건강식품.
  10. 제 1항의 균주, 제 3항의 배양 상등액 또는 제 4항의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항생제 내성 병원성 미생물 생장 억제용 사료 첨가제.
  11. 제 10항에 있어서, 항생제 내성 병원성 미생물은 메티실린 내성 황색포도상구균 (methicillin resistant Staphylococcus aureus)인 것을 특징으로 하는 항생제 내성 병원성 미생물 생장 억제용 사료 첨가제.
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KR1020110028054A KR20120110292A (ko) 2011-03-29 2011-03-29 메티실린 내성 황색포도상구균에 대해 유효한 항생물질을 생산하는 슈도모나스 애루기노사 ｋａｃｃ９１５９２ｐ 균주

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