CN101011069A

CN101011069A - 一种微生物杀线虫剂及其应用

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Publication number: CN101011069A
Application number: CN 200710034428
Authority: CN
Inventors: 成飞雪; 刘勇; 张德咏; 罗源华; 程菊娥; 何明远; 张战泓; 戴建平; 朱春晖
Original assignee: HUNAN PLANT PROTECTION INSTITUTE; HUNAN PLANT PROT INST
Current assignee: HUNAN PLANT PROTECTION INSTITUTE; HUNAN PLANT PROT INST
Priority date: 2007-02-13
Filing date: 2007-02-13
Publication date: 2007-08-08
Anticipated expiration: 2027-02-13
Also published as: CN100546482C

Abstract

本发明涉及一种微生物杀线虫剂。微生物杀线虫剂是光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB－1(Rhodoblastus acidophilus CCTCC M 206124)的发酵产物，该发酵产物中具有杀线虫活性的物质5－氨基乙酰丙酸(5－Aminolevulinic acid或δ－Aminolevulinic acid，简称为ALA)。本发明的生物杀线虫剂为纯生物制剂，可用于对松材线虫、根结线虫、大豆孢囊线虫、甘薯茎线虫等植物寄生线虫的生物防治。本发明的杀线虫剂对于环境及植物、人、动物等所有生物无不良影响，而且生产成本低，生产过程简单，不污染环境。微生物杀线虫剂在试验浓度范围内对烟草、辣椒、黄瓜和苎麻没有药害，反而可以促进和刺激这些作物的生长，没有残留，安全性好。本发明对于植物线虫的生物防治、微生物杀线剂的开发应用和农产品的无公害生产，将具有极其重要的意义。

Description

一种微生物杀线虫剂及其应用

技术领域

本发明涉及微生物代谢产物，具体涉及一种微生物杀线虫剂。

背景技术

植物寄生线虫是一种危害严重的植物病害，每年对农作物造成的损失高达1044亿美元。目前生产上应用普遍的防治策略是化学防治，但由于化学杀线剂多数是高毒、高残留农药，长期使用会污染环境及地下水源，最终通过食物链危害人类健康。因此，研究开发高效低毒及生物杀线虫剂已经成为农业可持续发展中的重要问题。

在多年的线虫生防研究中，人们开发了直接利用线虫的天敌(如真菌、细菌、病毒、立克氏体、放线菌、捕食性线虫、涡虫和原生动物)及一些产毒菌来防治植物线虫病害，目前已有商品化的生防制剂问世。但这些产品一定程度上依赖于土壤的理化性质生态环境，导致产品使用效果不稳定和不一致。为克服这一弊病，研究者目前更加关注菌株次生代谢产物的研究与开发。

我们在研究工作中发现了5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid或δ-Aminolevulinic acid，以下简称ALA)对线虫有很强的杀灭活性。国内外文献检索表明，目前均没有将ALA或者其衍生物(如5-氨基乙酰丙酸盐酸盐等)作为线虫防治药剂的报道。ALA及其衍生物可以利用化学合成的方法生产(刘海灵等，有机化学，2005，25：1431-1433)。但是，化学法合成ALA过程复杂、产量低、费用高、对环境污染大，在生产实际中很少采用，从而也限制了它的广泛应用。而光合细菌嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)的发酵产物中含有ALA，因此利用嗜酸柏拉红菌的代谢产物制备杀线虫剂是一条值得探索的途径。

发明内容

本发明的目的是利用微生物生产出一种对植物线虫防效显著、性能稳定、综合性状好，且易于规模化生产的杀线虫剂。

实现上述发明目的的技术方案为微生物杀线虫剂是光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1(Rhodoblastus acidophilus CCTCC M 206124)的发酵产物-5-氨基乙酰丙酸制剂。将该微生物杀线虫剂按ALA的含量1.8g～9.0g/hm²，稀释50～200倍后灌根或移栽时在离根5～10厘米处穴施根际土壤，用于松材线虫、根结线虫、大豆孢囊线虫、甘薯茎线虫等植物寄生线虫的生物防治，防治率达60～100％。

下面结合附图进一步详述本发明。

本发明的微嗜酸柏拉红菌PSB-1(Rhodoblastus acidophilus)已递交武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为2006年11月16日；保藏登记号为CCTCC M 206124。

附图说明

图1 ALA浓度测定标准曲线图。

本发明的杀线虫制剂的生产步骤是：(1)微生物液体种子的培养；(2)发酵罐规模生产；(3)液体或固体杀线虫剂的制备。

微生物液体种子的培养方法是：用液体培养基培养种子，于20～38℃、1000～4000LX灯光照射培养5～7天即可。该液体培养基成分为：乙酸钠1640mg/L，MgSO₄·7H₂O200mg/L，K₂HPO₄900mg/L，KH₂PO₄ 600mg/L，CaCl₂·2H₂O 75mg/L，EDTA 20mg/L，(NH₄)₂SO₄1320mg/L，FeSO₄·7H₂O 11.8mg/L，微量元素溶液1mL/L，pH 6.8(用NaOH调)，微量元素溶液：H₃BO₃ 2800mg/L，MnSO₄·4H₂O 2100mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 750mmg/L，ZnSO₄·7H₂O24Omg/L，Cu(NO₃)₂·3H₂O 40mg/L。

微生物的大规模生产方法是：将培养好的微生物种子按照1∶100的比例接入到透明发酵罐发酵培养，培养条件为：20～38℃、1000～4000LX灯光照射培养，5～7天后检测培养液中ALA的含量，浓度达到20mg/L(即20毫克/升发酵液)即可以用于生产微生物杀线虫产品。大规模生产所用的培养基成分与上述种子培养基成分完全一致。

微生物杀线虫剂的制备：将上述发酵罐获得的微生物发酵液进行高温处理(90℃～100℃处理2～3min)，处理后的发酵液可直接包装，制成液体制剂。或是利用发酵液进行真空抽滤，旋转蒸发，并在其中添加0.5％～2％辅料，辅料包括0.3％～1％活性炭与0.2～1％蟹壳粉或虾壳粉或几丁质；用25％～50％的农作物秸杆糠作承载物吸附并混匀，在40～45℃温度条件下烘干制成粗制粉剂。

ALA含量测定采用分光光度法：取培养好的嗜酸柏拉红菌菌液10ml于13000rpm离心5min收集上清；取上清液1ml加入1ml 2M的醋酸钠(PH 4.6)，混匀后加入300μl乙酰丙酮，混匀后沸水浴15分钟，冷却至室温。加入2.5ml Ehrlich’s试剂(60％的冰醋酸(V/V)，2％对二甲氨基苯甲醛(m/V)，11.2％的高氯酸(V/V))。室温反应15分钟，待显色完全后于556nm测其吸光值，计算ALA含量。ALA浓度参照标准曲线计算。

标准曲线制作方法如下：

精确配制一组浓度为1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L和5mg/L的标准ALA溶液(ALA标准试剂购自Sigma公司，纯度大于98％)，各取1ml分别加入1ml 2M的醋酸钠(PH 4.6)，混匀后加入300μl乙酰丙酮，混匀后沸水浴15分钟，冷却至室温。加入2.5ml Ehrlich’s试剂(60％的冰醋酸(V/V)，2％对二甲氨基苯甲醛(m/V)，11.2％的高氯酸(V/V))。室温反应15分钟后利用分光光度计在556nm测吸光度，得到标准曲线为y(ALA浓度，mg/L)＝-0.121233+14.2588X(OD值)，相关系数R＝0.9980。标准曲线图见图1。

微生物杀线虫剂的室内药效试验：

每个处理选取200条活的供试线虫，加入含一定浓度ALA的发酵液，先放25℃培养箱中12小时，然后置于自然条件下光照12小时后放倒置显微镜下观察并检查线虫的存活情况，对在生理刺激下无反应的确定为死亡线虫，并对死亡线虫进行定时计数。根据死亡率计算微生物杀线虫剂的药效(结果见表1、2、3)。

死亡率(％)＝死亡虫数/试验总虫数×100％，

药效(％)＝处理死亡率-对照死亡率。

供试线虫：

秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)

根结线虫(Meloidogyne incognita)

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)

表1、ALA对秀丽小杆线虫的作用效果

时间	不同浓度药效				对照死亡率(％)
	不同浓度药效					0.005mg/L(％)	0.1mg/L(％)	10mg/L(％)	20mg/L(％)
	24h	20.5	44.5	94.5		0.005mg/L(％)	0.1mg/L(％)	10mg/L(％)	20mg/L(％)	100	0
36h	24h	20.5	44.5	94.5	33.5	53.5	98.5	100	0	100	0
36h	48h	99.5	99.5	99.5	33.5	53.5	98.5	100	0	99.5	0.5

表2、ALA对根结线虫的作用效果

时间	不同浓度药效				对照死亡率(％)
	不同浓度药效					0.005mg/L(％)	0.1mg/L(％)	10mg/L(％)	20mg/L(％)
	24h	39.0	78.0	95.5		0.005mg/L(％)	0.1mg/L(％)	10mg/L(％)	20mg/L(％)	99.0	0.5
36h	24h	39.0	78.0	95.5	42.0	83.5	96.5	97.5	2.5	99.0	0.5
36h	48h	48.0	86.5	97.0	42.0	83.5	96.5	97.5	2.5	97.0	3.0

表3、ALA对松材线虫的作用效果

时间	不同浓度药效				对照死亡率(％)
	不同浓度药效					0.005mg/L(％)	0.1mg/L(％)	10mg/L(％)	20mg/L(％)
	24h	24.0	49.0	67.5		0.005mg/L(％)	0.1mg/L(％)	10mg/L(％)	20mg/L(％)	69.5	1.5
36h	24h	24.0	49.0	67.5	27.0	59.0	72.0	76.0	1.5	69.5	1.5
36h	48h	29.0	68.7	78.1	27.0	59.0	72.0	76.0	1.5	82.5	3.5

本发明的微生物杀线虫剂对松材线虫、根结线虫、大豆孢囊线虫、甘薯茎线虫等植物寄生线虫的防治效果显著，性能稳定，而且对作物无药害，安全性好。

具体实施方式

实施例1：

1、杀线虫发酵液的制备：

(1)菌种培养：以嗜酸柏拉红菌菌株PSB-1(Rhodoblastus acidophilus，其保藏登记号为CCTCC M 206124)为菌种，将其接入含100ml液体培养基的透明玻璃瓶中，在30℃、2000LX光照下培养5天，每隔8小时摇动一次培养瓶。该液体培养基成分为：乙酸钠1640mg/L，MgSO₄·7H₂O 200mmg/L，K₂HPO₄ 900mg/L，KH₂PO₄ 600mg/L，CaCl₂·2H₂O 75mg/L，EDTA 20mg/L，(NH₄)₂SO₄ 1320mg/L，FeSO₄·7H₂O 11.8mg/L，微量元素溶液1mL/L，pH 6.8(用NaOH调)，微量元素溶液：H₃BO₃ 2800mg/L，MnSO₄·4H₂O 2100mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O750mg/L，ZnSO₄·7H₂O 240mg/L，Cu(NO₃)₂·3H₂O 40mg/L。

(2)液体发酵物的制备：将100ml培养好的种子微生物接入含10000ml液体培养基(培养基成分与上同)的透明玻璃瓶中，在30℃、2000LX光照下培养5天，每隔8小时摇动一次培养瓶。

(3)剂型加工：测定上述液体发酵获得的微生物发酵液中ALA的含量，将此发酵液用水稀释到ALA含量为20mg/L，然后进行高温处理(90℃～100℃处理2～3min)，处理后的发酵液可直接包装，制成液体制剂。

2、2003年5～10月，在某县进行大田防治甘薯茎线虫试验，取得很好的效果。嗜酸柏拉红菌(Rhodoblastus acidophilus)发酵液制成的液体制剂(ALA含量为20mg/L以上)施用量45L/hm²、90L/hm²、180L/hm²，将此制剂稀释50～200倍后浇灌甘薯根际，每株灌药剂300～500mL，间隔10～15天再浇灌一次。防效均为80％以上，其中180L/hm²的防治效果为100％。

以不能合成ALA的大肠杆菌DH5 α发酵液作为对照，结果表明基本无效；而以ALA纯品作为阳性对照，施用浓度为0.1克/L～0.5克/L，施用量90L/hm²，稀释50～200倍进行土壤浇灌处理，每株浇灌300～500mL，间隔10～15天再浇灌一次，防效为65.6％～100％。

实施例2：

1、杀线虫发酵液的制备同实施例1。

2、2004年7～12月，在某保护地大棚进行的番茄根结线虫防治试验，杀线虫剂发酵液(ALA含量为20mg/L以上)施用量90L/hm²，栽苗前一周用水稀释50～200倍进行土壤穴施处理，防治效果达到90％，番茄增产80％以上，增产率高于施用化学农药溴甲烷(增产39％)。

以不能合成ALA的大肠杆菌DH5α发酵液作为对照，结果表明基本无效；而以ALA纯品作为阳性对照，施用浓度为0.1克/L～0.5克/L，施用量90L/hm²，稀释50～200倍于苗移栽前进行土壤穴施处理，防效为70.5％～100％。

实施例3：

2005年5月在某温室进行大豆孢囊线虫的防治试验，将杀线虫剂发酵液稀释50倍后(ALA含量为0.5mg/L以上)浇灌处理土壤，施用量90L/hm²，每株浇灌根际土壤300～500mL，10～15天后再浇灌一次。试验结果显示孢囊减少率为70.9％，高于同期施用的化学农药。

以不能合成ALA的大肠杆菌DH5α发酵液作为对照，结果表明基本无效；以ALA纯品作为阳性对照，施用浓度为0.1克/L～0.5克/L，施用量90L/hm²，同样进行土壤灌根处理2次，防效为60.4％～90％。

实施例4：

2006年4月在某地进行辣椒根结线虫的防治试验，杀线虫剂发酵液(ALA含量为20mg/L以上)施用量90L/hm²，栽苗前一周用水稀释50～200倍，每株300～500mL进行灌根处理，10～15天后再灌根一次，防治效果达到90％，辣椒增产60％以上，增产率高于施用化学农药溴甲烷(增产30％)。

以不能合成ALA的大肠杆菌DH5α发酵液作为对照，结果表明基本无效；以ALA纯品作为阳性对照，施用浓度为0.1克/L～0.5克/L，施用量90L/hm²，进行土壤浇灌处理2次，防效为85.5％～100％。辣椒增产45％以上，增产率高于施用化学农药溴甲烷(增产30％)。

实施例5：

2006年6月在某地进行辣椒根结线虫防治试验，杀线虫剂发酵液(ALA含量为20mg/L以上)施用量90L/hm²，于栽苗前一周用水稀释50～200倍进行土壤浇灌处理，每株灌根300～500mL稀释液。防治效果达到85％，辣椒增产60％以上，增产率高于施用化学农药溴甲烷(增产30％)。

以不能合成ALA的大肠杆菌DH5α发酵液作为对照，结果表明基本无效；而以ALA纯品作为阳性对照，施用浓度为0.1克/L～0.5克/L，施用量90L/hm²，进行土壤灌根处理，防效为80.5％～100％。辣椒增产45％以上，增产率高于施用化学农药溴甲烷(增产30％)。

实施例6：

2006年7月在某地进行苎麻根腐线虫防治试验，杀线虫剂发酵液(ALA含量为20mg/L以上)施用量90L/hm²，于二麻苗高20cm左右用水稀释50～200倍进行灌根处理，每株淋蔸300～500mL，间隔10～15天后再连续灌根2次。防治效果达到95％以上，苎麻增产65％以上，增产率高于施用化学农药溴甲烷(增产30％)。

以不能合成ALA的大肠杆菌DH5 α发酵液作为对照，结果表明基本无效；而以ALA纯品作为阳性对照，施用浓度为0.1克/L～0.5克/L，施用量90L/hm²，进行灌根处理，每株淋蔸300～500mL，每间隔10～15天后再连续灌根2次。防效为75.5％～100％。苎麻增产45％以上，增产率高于施用化学农药溴甲烷(增产30％)。

实施例7：

2006年4～8月，在某地进行松材线虫防治试验，将发酵液(ALA含量为100mg/L以上)稀释10倍后对6年生的马尾松进行灌根处理，施用量10L/颗松树。试验结果防治效果为68％，高于同期施用的化学农药。

以不能合成ALA的大肠杆菌DH5α发酵液作为对照，结果表明基本无效；以ALA纯品作为阳性对照，施用浓度为0.1g/L～4.5g/L，施用量10L/棵松树，进行土壤浇灌处理，防效为60％～80％。

实施例8：

1、杀线虫固体制剂的制备：菌种培养、液体发酵液制备同实施例1，粉剂的制备是利用发酵液进行真空抽滤，旋转蒸发，并在其中添加1％辅料，辅料包括0.8％活性炭与0.2％蟹壳粉；用40％承载物——农作物秸杆糠吸附并混匀，在40～45℃温度条件下烘干制成粗制粉剂。

2、2006年6月，在某地进行粗制粉剂苎麻根腐线虫防治试验，取得很好的效果。粗制粉剂中ALA含量为10毫克/克干粉。用水稀释成水溶液(剂量以干粉750g/hm²)进行灌根处理，每株淋蔸300～500mL，隔10～15天再浇灌一次，共灌根3次。防效为89％。苎麻增产60％以上。

以不能合成ALA的大肠杆菌DH5α发酵液作为对照，结果表明基本无效；而以ALA纯品作为阳性对照，施用浓度为0.1克/L～0.5克/L，施用量为90L/hm²进行浇灌，每株淋蔸300～500mL，隔10～15天再浇灌一次，共灌根3次。防效为75.5％～100％。苎麻增产45％以上，增产率高于施用化学农药溴甲烷(增产30％)。

应用实验结果表明，嗜酸柏拉红菌PSB-1(Rhodoblastus acidophilus CCTCC M206124)菌种的代谢物ALA对松树、甘薯、番茄、大豆、辣椒等重要植物的寄生线虫均有杀灭作用，表现了其杀线虫的广谱性。

Claims

1、一种微生物杀线虫剂，为光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1(Rhodoblastusacidophilus CCTCC M 206124)的发酵产物-5-氨基乙酰丙酸制剂。

2、一种如权利要求1所述的微生物杀线虫剂的应用，其特征在于将该微生物杀线虫剂按ALA的含量1.8g～9.0g/hm²，稀释50～200倍后灌根或移栽时在离根5～10厘米处穴施根际土壤，用于松材线虫、根结线虫、大豆孢囊线虫、甘薯茎线虫等植物寄生线虫的生物防治，防治率达60～100％。