CN101550405B

CN101550405B - 防治水稻干尖线虫病或蔬菜线虫病的菌株tx-4及制剂

Info

Publication number: CN101550405B
Application number: CN2009100300325A
Authority: CN
Inventors: 杨敬辉; 朱桂梅; 潘以楼; 陈宏州
Original assignee: Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences Jiangsu Hilly Area
Current assignee: Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences Jiangsu Hilly Area
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2009-03-31
Publication date: 2010-12-08
Anticipated expiration: 2029-03-31
Also published as: CN101550405A

Abstract

本发明公开了一种防治水稻干尖线虫或蔬菜根结线虫病的菌株TX-4及其制剂，属于农作物防病治病技术领域，专用农作物的生物防治。大田示范防治结果表明，该菌剂对水稻干尖线虫病防治效果达90％以上，对蔬菜根结线虫的防治效果在70％以上。本发明的防治水稻干尖线虫病或蔬菜线虫病的菌株TX-4为类芽孢杆菌属，拉丁文学名为Paenibacillus spp.，该菌种已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M209038。

Description

防治水稻干尖线虫病或蔬菜线虫病的菌株TX-4及制剂

技术领域

本发明涉及一种菌株及其制剂，更具体地说涉及一种防治水稻干尖线虫或蔬菜根结线虫病的菌株TX-4及其制剂，属于农作物防病治病技术领域，专用农作物的生物防治。

背景技术

水稻干尖线虫(Aphelechoides besseyi Christie，1942)隶属于线虫门-侧尾腺纲--滑刃目--滑刃总科--滑刃科--滑刃属线虫(Aphelenchoides Fuscher，1894)--贝西滑刃线虫(A.besseyi)引起水稻的干尖线虫病、谷子不捻线虫病。近年来，研究证明其也是引起水稻“小穗头”的病原菌。我国每年因水稻干尖线虫病而损失的水稻约达20亿公斤。对于水稻干尖线虫病的防治目前主要还是用化学杀线剂如：巴丹、杀线酯(醋酸乙酯)、呋喃丹、杀螟丹、二硫氰基甲烷和强氯精等浸种处理。国、内外鲜有用微生物防治该病的报道。

蔬菜根结线虫(Meloidogyne spp.)隶属于线虫门-侧尾腺纲--垫刃目--垫刃总科--异皮科--根结属(Meloidogyne Goeldi，1887)。通常在寄主植物根部形成瘿瘤或根结，因此称为根结线虫。根结线虫是世界性分布的威胁农业生产的主要病原物。它不仅使作物产量减少，品质降低，而且可与其他病原物一起造成复合侵染。迄今已记载的根结线虫约有70种，其中南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)和花生根结线虫(M.arenaria)因其广分布性和多寄主性，是最重要的植物寄生线虫种类。在中国，这三种根结线虫在大多数省(区)均有发生，侵染农作物达百种以上，致使寄主常年减产15-25％，有时达70％以上，严重地制约了大棚蔬菜作物的生产和出口创汇。据估计，我国农作物的生产每年因根结线虫的为害而遭受的经济损失达数十亿元。

长期以来，对蔬菜根结虫病的防治主要采取化学杀线虫剂、选种抗病品种、实施轮作、建立无病种苗基地和对进出口农作物进行严格的检疫来控制根结线虫病害的发生和缦延。部分高毒性、灭生性化学杀线虫剂虽有一定防效，但其选择性差，极易破坏农作物的生态环境，不易降解，高残留，对人畜极不安全；破坏土壤结构，造成土壤沙化，抗药性问题日益突出，这些因素使得化学杀线虫剂的使用范围已受到严格的限制。目前，熏蒸性杀线虫剂二溴氯丙烷和二溴乙烷等卤代烃品种因毒性等问题先后禁用。高纯度1，3-二氯丙烯以及剧毒农药涕灭威、克百威等在发达国家已全面禁用。我国也将上述化学药剂列为限制或控用化学农药品种。

因此，非化学性防治措施目前已成为农作物根结线虫病害治理的主流研究方向，而微生物防治则为其中最有前途的方法。研制与开发具有杀线虫活性的微生物及其代谢产物，主要是从细菌、真菌和杀线植物中获得。国内、外目前报道用于防治蔬菜根结线虫的真菌属(种) 主要有(1)节丛孢属(Arthrobotrys spp)主要种有：A.robusta Duddington、A.irregularis(Matruchot)；(2)不规则节丛孢属(Mekhtieva spp)报道的种有：A.conoides Drechsler、A.oligospora Fresenius、A.dactyloides Drechsler；(3)单顶孢霉属(Monacrosporium spp)报道的有：M.ellisosporum(Grove)Cooke et Dickinson；(4)小指孢霉属(Dactylella spp)报道的种有：D.oviparasitica Stirling et Mankau；(5)轮枝霉属(Verticillium spp)报道的种有：V.catenulatum(Kamyschko ex Barron et Onions)W. Gams、V.chlamydosporium Goddard(厚垣轮枝孢)、V.sinensis Wang(中国轮枝孢)、V.lamellicola(FEV Smith)W.Gams(菌褶轮枝霉)、V.lecanii(Zimmermann)Viegas(蜡蚧轮枝菌)、V.leptobactrum W.Gams、V.psalliotae Treschow(蘑菇轮枝霉)、V.insectorum(Petch)W. Gams；(6)掘氏梅里属(Drechmeria)的圆锥掘氏梅里霉(Drechmeria coniospora)；(7)半知菌类侧耳属(Pleurotus)的糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)；(8)雅致小克银汉霉(Cuninghamella elegans Lendner)。

国内、外报道用生防细菌防治蔬菜根结线虫的有：巴氏杆菌(Pasteuria Metchnikoff)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens Migula)，球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus Meyer etNeide)、枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis(Ehrenberg)Cohn]、放射性土壤杆菌[Agrobacteriumradiobacter(Beijerinck et van Delden)Conn]、致金色假单胞菌(P.aureofaciens Kluyver)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis Kim et Goodfellow)等细菌，其大部分菌株的防治效果超过40％。

国内、外报道对蔬菜根结线虫有杀虫活性的杀线植物：印楝树(Azadirachta indica deJussieu)、万寿菊属(Tagetes Linnaeus)、马缨丹(Lantana cam ara Linn.)、日本(柳)杉[Cryptomeriajaponica(Thunberg ex Linnaeus f.)D.Don]、蒜(薹)(Allium sativum Linn.)、洋葱(Alliumfistulosum Linn.)、莴苣(Lactuca sativa L.var.capitata L.)、毛鱼藤(Derris elliptica(Roxburgh)Bentham]、三尖杉(Cephalotaxus fortunei Hooker f.)茎叶、粗榧[Cephalotaxus sinensis(Rehder etWilson)Li]、狼牙刺(Sophora viciifolia Hance)种子、紫斑牡丹(Paeonia suffruticosa Andrews)[var.papaveracea(Andrews)Kerner]。迄今为止，国外利用植物防治蔬菜根结线虫已有几十年的历史，但有效地从杀线植物中分离、提纯杀线虫化合物，并鉴定其化学结构，国内外还处在初步探索阶段。

目前，国外已登记防治蔬菜根结线虫的商品化的制剂有Biocon、Royal 300、Royal 350、DiTera和Deny等。而在我国登记的只有“线虫必克”(Verticillum chamydosporium)和“灭线宁”(Paecilomyces lilacinus)。到目前为止没有报道用于同时防治蔬菜根结线虫和水稻干尖线虫病的生防微生物及其制剂。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术中存在的不足和问题，提供一种兼具治水稻干尖线虫病和蔬菜根结线虫病的菌株TX-4及其制剂，专用于防治水稻干尖线虫病(水稻“小穗头”)、辣椒、番茄、茄子等温室蔬菜根结线虫病。

同时本发明还提供由菌株TX-4制成的菌剂及其制备方法，该菌剂具有货架期长、防效高、防治谱广和增产的性能。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的防治水稻干尖线虫病或蔬菜线虫病的菌株TX-4为类芽孢杆菌属，拉丁文学名为Paenibacillus spp.，该菌种已于2009年3月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M209038。所述菌种具有如下特征：细胞呈杆状，中生，有芽孢，孢囊稍膨大，椭圆形，G+，鞭毛周生。菌落淡黄色，圆形，边缘整齐，菌落隆起。发酵液能产生多种抗菌活性物质，能分泌胞外蛋白酶和纤维素酶。

用本发明的防治水稻干尖线虫病或蔬菜线虫病的菌株TX-4制备的生防菌剂，其制备方法包括以下步骤：

(A)一级种子培养液的培养

用无菌接种环挑取事先在NA固体培养基上划线培养好的TX-4菌株单菌落斑，接种于装有5ml NA液体培养液的容积为20ml的三角瓶中，于30℃、200rpm条件下振荡培养16h-24h；

(B)二级种子培养液的培养

将上步(A)所得培养液5ml接种于装有400ml NA培养液的容积为1000ml的三角瓶中，200rpm、30℃条件下振荡培养16h-24h；

(C)上罐发酵

把上步(B)所得的400ml培养液接种于装有20L发酵培养液的容积为30L的发酵罐中，其中发酵培养液成份：重量百分浓度5％(W/W)干豆腐渣和水，设置发酵条件为：溶氧100％，消泡剂50ml，搅拌速度为350rpm，30℃，72h，pH 7.0-7.2；其中所述的消泡剂优选为无菌菜子油；

(D)菌剂加工工艺

将发酵好的发酵液按如下方法加工成菌剂：在每升发酵液中添加玉米淀粉400g，橄榄油25ml，蔗糖25g，混合搅拌均匀，55℃烘箱中铺开间隔烘，实时测定水份含量，使水份含量控制在3-5％之间，烘48h，磨碎得粉末，过200目筛，无菌铝箔袋密封保装，制剂成品TX-4菌剂；其中所述的TX-4菌剂中活菌总浓度优选为1×10¹¹～1×10¹²cfug。

本发明的有益效果是：

(1)本发明所得菌剂剂型稳定，可适温保存2-3年，菌剂防治谱广可以防治多种类型线虫病害，物别是首次运用在水稻干尖线虫病害的防治，对由干尖线虫引起的“小穗头”有很好的防治效果。大田示范防治结果表明，该菌剂对水稻干尖线虫病防治效果达90％以上，对蔬菜根结线虫的防治效果在70％以上。

(2)由于本发明的活菌制剂是生物制剂，没有因化学农药的使用所带来的一系列环境和安全问题。该制剂的使用可保证水稻干尖线虫病害的防治和蔬菜根结虫病害的无公害防治，极大的减少水稻生产和蔬菜生产中化学农药的施用量，为农民节本增收。

(3)菌剂大量发酵所用的培养基原料为豆腐渣，所以菌剂的生产成本十分低廉，企业获取的利润空间极大。

具体实施方式

实施例

本实施例的防治水稻干尖线虫病或蔬菜线虫病的菌株TX-4可提取于2009年3月16日在中国典型培养物保藏中心保藏、保藏号为：CCTCC NO：M209038。拉丁学名为Paenibacillus spp.的菌种，该菌种具有如下特征：细胞呈杆状，中生，有芽孢，孢囊稍膨大，椭圆形，G+，鞭毛周生。菌落淡黄色，圆形，边缘整齐，菌落隆起。发酵液能产生多种抗菌活性物质，能分泌胞外蛋白酶和纤维素酶。

本实施例的防治水稻干尖线虫病或蔬菜线虫病的菌株TX-4制备的生防菌剂，其制备方法包括以下步骤：

(A)一级种子培养液的培养

用无菌接种环挑取事先在NA固体培养基上划线培养好的TX-4菌株单菌落斑，接种于装有5ml NA液体培养液的容积为20ml的三角瓶中，于30℃、200rpm条件下振荡培养16h，过夜；

(B)二级种子培养液的培养

将上步(B)所得培养液5ml全部接种于装有400ml NA培养液的容积为1000ml的三角瓶中，200rpm、30℃条件下振荡培养16h；

(3)上罐发酵

把上步(B)所得的400ml培养液接种于装有20L发酵培养液(培养液成份：5％干豆腐渣和水)的容积为30L的发酵罐(型号：镇江东方生工GUS-30)中，设置发酵条件为：溶氧100％，消泡剂(无菌菜子油)50ml，搅拌速度为350rpm，30℃，72h，pH 7.0-7.2(酸、碱流加用1M HCl、1M NaOH调节pH)；

(4)菌剂加工工艺

将发酵好的发酵液按如下方法加工成菌剂：在每升发酵液中添加玉米淀粉400g，橄榄油25ml，蔗糖25g，混合搅拌均匀，55℃烘箱中铺开间隔烘，实时测定水份含量，使水份含量控制在3-5％之间，约烘48h，磨碎得粉末，过200目筛，无菌铝箔袋密封保装，制剂成品TX-4菌剂(活菌总浓度约为1×10¹¹～1×10¹²cfu/g)。

本发明活菌制剂的大田施用方法如下：

(1)防治水稻干尖线虫应用方法为，按菌剂与水比例为1∶500-1000(W/V)，先将菌剂与水混合均匀，再将水稻种子倒入，药液没过水稻种子，在30℃-35℃条件下浸种48h，然后再在30℃条件下催芽至种子露白。

(2)防治蔬菜线虫病的应用方法为，菌剂稀释1∶400-800(W/V)倍，在蔬菜苗移栽时灌根、或蘸根使用。

本发明的实施效果

(1)对水稻干尖线虫的室内毒力测定及田间防效试验

实验方法：防治水稻干尖线虫应用方法为，将TX-4菌剂(活菌含量约为1.45×10¹¹cfu/g)与水比例为1∶500、1∶1000和1∶2000(W/V)，空白对照用清水，化学药剂用95％巴丹6000倍液。先将菌剂与水混合均匀，再将水稻(镇稻99)种子倒入，菌液没过水稻种子(400ml菌液浸300g稻种)，在30℃条件下浸种，48h后，捞起稻种沥干菌液，每处理数稻谷50粒，剥开颖壳，将颖壳和米粒一起放入加水10ml的小三角瓶中浸4h，然后用纱网滤掉稻壳和米粒，滤液置离心管中3000rpm离心5min，倒掉上清液，显微镜下检查沉淀中线虫的存活率。

其余种子在30℃条件下催芽至种子露白后播种。育秧方式为旱育秧，秧龄25d，每处理分3个重复移栽到大田，小区面积15m²。水稻成熟时调查每小区水稻干尖线虫的病株数，计算病株率和防效。水稻成熟后测产，计算防病增产效果。

结果：室内毒力测定结果(表1)表明，TX-4菌剂对稻种中带有的干尖线虫有明显的杀灭作用。TX-4菌剂500倍液、1000倍液、2000倍液(W/V)，在30℃条件下，浸种48h，对镇稻99中干尖线虫的杀灭防效分别达94.0％、85.5％和70.8％，与95％巴丹6000倍液浸种48h的毒力(96.4％)相当。

田间试验结果(表1)表明，TX-4菌剂可以有效防止水稻干尖线虫病。从表1可以看出应用TX-4菌剂500倍液，在30℃条件下浸种48h，再催芽至露白，对水稻干尖线虫病的防病保产效果与95％巴丹可溶性粉剂6000倍液相当。

表1TX-4菌剂对水稻干尖线虫的毒力

注：与对照相比不同大写字母表示P＜0.01

(2)对蔬菜根结线虫的室内毒力测定

实验方法：将具有根结的番茄植株洗去根表土，挑取根结外卵囊放在滤纸上，将滤纸置于200目网筛上，再将网筛置于盛有清水的培养皿中，使水略漫过卵块。培养箱中25℃孵化，每24h收集培养皿中的二龄幼虫(J2)。将线虫悬浮液稀释为100条/ml，4℃保存待用。

在室温条件下，将成品TX-4菌剂(活菌含量约为1.45×10¹¹cfu/g)稀释成400、800和1600倍液(W/V)，各吸取2ml，加入无菌培养皿(直径6 cm)中，然后加入100条/ml的上述J2悬浮液2ml。以清水作空白对照，药剂对照为95％巴丹1∶6000倍液(W/V)，重复3次。分别在12、24、36和48h后观察线虫活力。

结果：毒力测定结果(表2)表明，TX-4菌悬液的各个处理均对南方根结线虫J2的活性有显著杀灭作用。其中稀释400倍时抑制作用最为明显，在处理12、24、36和48h后，对J2活性抑制率稳定在90％左右，与对照化学药剂巴丹(95％巴丹1∶6000倍)的活力相当。

表2 TX-4对根结线虫二龄幼虫室内毒力测定结果

注：与对照相比不同大写字母表示P＜0.01

(3)对蔬菜根结线虫病的田间防效试验

试验地条件：本试验安排在江苏省汤山镇锁金村蔬菜大棚的日光温室内，土质为沙壤土，土壤有机质含量中等，根结线虫重发田，前茬为黄瓜。采用人工深翻，整平翻晒。番茄于2007 年10月15日播种，11月25日移栽，管理照常规。

试验处理方法：于番茄移栽前，将成品TX-4菌剂(活菌含量约为1.45×10¹¹cfu/g)分别稀释400、800和1600倍(W/V)后，在番茄苗移栽时灌根浇透土壤移栽耕层，每棵苗灌400ml，空白对照用清水代替，对照生防药剂为“线虫必克”，1∶400倍液，每棵苗灌400ml。试验设4重复。处理后50d时调查发病情况，计算病情指数和防效。根结线虫病情指数调查方法及分级：

每个小区每重复随机取15株。危害程度采用分级法记录：即0级：没有根结或卵块；I级：1-2个根结或卵块；II级：3-10个根结或卵块；III级：11-30个根结或卵块；IV级：31-100个根结或卵块；V级：100个以上根结或卵块。病情指数的计算方法，公式为：病情指数＝{∑(各级植株数×级值)/(调查总株数×5)}×100

结果：田间试验结果(表3)表明，TX-4菌剂稀释400、800、1600时的防治效果分别为75.19％、61.83％和51.91％，均高于“线虫必克”400倍液的防效(40.46％)。菌剂产品具有极大的市场开发前景。

表3TX-4菌剂对番茄根结线虫病的田间防治试验结果

注：与对照相比不同大写字母表示P＜0.01

Claims

1.一种防治水稻干尖线虫病或蔬菜线虫病的菌株TX-4，该菌株TX-4为类芽孢杆菌属，拉丁文学名为Paenibacillus spp.，该菌种已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCCNO：M209038。

2.权利要求1所述的防治水稻干尖线虫病或蔬菜线虫病的菌株TX-4在防治水稻干尖线虫病或蔬菜线虫病方面的应用。

3.一种用权利要求1所述的防治水稻干尖线虫病或蔬菜线虫病的菌株TX-4制备的生防菌剂。

4.一种制备权利要求3所述的生防菌剂的方法，其特征在于包括以下步骤：

(A)一级种子培养液的培养

(B)二级种子培养液的培养

将上步(A)所得培养液5ml接种于装有400mlNA培养液的容积为1000ml的三角瓶中，200rpm、30℃条件下振荡培养16h-24h；

(C)上罐发酵

把上步(B)所得的400ml培养液接种于装有20L发酵培养液的容积为30L的发酵罐中，其中发酵培养液成份：重量百分浓度5％干豆腐渣和水，设置发酵条件为：溶氧100％，消泡剂50ml，搅拌速度为350rpm，30℃，72h，pH7.0-7.2；

(D)菌剂加工工艺

将发酵好的发酵液按如下方法加工成菌剂：在每升发酵液中添加玉米淀粉400g，橄榄油25ml，蔗糖25g，混合搅拌均匀，55℃烘箱中铺开间隔烘，实时测定水份含量，使水份含量控制在3-5％之间，烘48h，磨碎得粉末，过200目筛，无菌铝箔袋密封保装，制剂成品TX-4菌剂。

5.根据权利要求4所述的制备生防菌剂的方法，其特征在于步骤(C)中所述的消泡剂为无菌菜子油。

6.根据权利要求4所述的制备生防菌剂的方法，其特征在于步骤(D)中所述的TX-4菌剂中活菌总浓度约为1×10¹¹～1×10¹²cfu/g。