CN104593266A - 一种番茄内生真菌交织枝顶孢及其在番茄根结线虫病生防中的应用 - Google Patents

一种番茄内生真菌交织枝顶孢及其在番茄根结线虫病生防中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种番茄内生真菌交织枝顶孢(Acremonium implicatum)CGMCC NO.8300及其作为番茄根结线虫生防菌的应用，属于生物防治领域。该菌株的发酵液对根结线虫二龄幼虫具有良好的致死活性。菌株孢子悬浮液(浓度为1×106CFU/ml)用灭菌草炭吸附后作为菌剂，比例为1000g草炭吸附500ml孢子悬浮液。移栽番茄前，菌剂沟施或穴施于种植穴。菌剂对番茄根结线虫具有较高的田间防效，达到72.8％。该菌株对于解决番茄根结线虫生物防治具有突出的技术效果，具有广泛的应用领域。

Description

一种番茄内生真菌交织枝顶孢及其在番茄根结线虫病生防中的应用
发明领域
本发明涉及生物防治技术领域，具体的说，本发明涉及一种交织枝顶孢菌及其在番茄根结线虫病生防中的应用技术领域。 
背景技术
番茄根结线虫病是一种严重危害番茄品质和产量的土传性病害。根结线虫主要侵染番茄根部，尤其侧根受害多。根上形成很多近球状瘤状物，似念珠状相互连接，初表面白色，后变褐色或黑色，地上部表现萎缩或黄化。线虫以成虫或卵在病组织里或以幼虫在土壤中越冬。病土和病肥是发病主要来源。该线虫发育适温25-30℃，幼虫遇低温失去活动能力，48-60℃经5分钟致死，在土中存活一年，2年即全部死亡。番茄根部被破坏，影响正常的吸收机能，所以地上部生长发育受阻，轻者症状不明显，重者生长缓慢，植株比较矮小，生育不良，结果小而且少。在中午气温较高时，地上部植株呈萎蔫状态；早晚气温较低或浇水充足时，暂时萎蔫又可恢复正常。随着病情的发展，植株逐渐枯死。 
根结线虫防治以化学防治为主，不仅破坏土壤生态环境，还对人体健康造成影响。化学防治带来的环境污染和农药残留问题严重制约我国番茄产业的发展，生物防治具有环境相容性、绿色环保性特点，具有广阔的应用前景。近年来，番茄根结线虫生防菌的筛选受到关注。人们分离到多种根结线虫生防菌，如厚垣孢普可尼亚菌(Pochonia chlamydosporia)、尖孢枝孢(Cladosporium oxysporum)、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)和绿色木霉(Trichoderma viride)等。这些生防菌通过寄生线虫或卵块、分泌杀线虫活性物质来抑制根结线虫，但在田防效不佳，主要由于这些生防菌不能在土壤中定殖。植物内生真菌可产生杀线虫活性的次生代谢产物直接作用于线虫。内生真菌能定殖于植物体内，在与其他土壤微生物竞争中具有优势，能够以“守株待兔”的方式防治线虫，具有靶向性，极具开发潜力。 
发明内容
针对现有根结线虫生物防治技术未有良好生防菌的现状，本发明旨在提供一种番茄内生真菌交织枝顶孢及其作为番茄根结线虫生防菌的应用。通过试验验证，采用本发明提供的交织枝顶孢对防治番茄根结线虫具有良好效果。这对于进一步减少农药用量，提高番茄品质，促进我国的番茄产业向着绿色无公害方向发展具有重要意义。 
本发明的技术方案：通过从多年种植番茄大棚内感染根结线虫的番茄根结中分离内生真菌，获得较强抑制根结线虫活性的菌株，经过进一步筛选，获得一株编号为TEF。通过对菌株进行形态特征和18S rDNA序列测定及系统发育分析，初步确定了其分离地位；同时对该菌株的发酵液对根结线虫二龄幼虫致死率，菌株孢子悬浮液对番茄根结数量、土壤中根结 线虫虫口数量以及田间防效等进行了全面系统研究，为番茄根结线虫的生物防治提供了新选择，其拮抗作用对于番茄根结线虫的解决具有突出的技术效果。 
本发明提供的一种作为番茄根结线虫生防菌的交织枝顶孢(Acremonium implicatum)。通过在北京顺义地区种植番茄的大棚内番茄根结中分离、筛选和培养，获得一批作为番茄根结线虫拮抗菌的微生物菌株。从中筛选出一株编号为TEF的菌株，对于番茄根结线虫具有稳定而显著的拮抗效果，经微生物学分类与鉴定，属于交织枝顶孢菌。 
具体的，本发明提供的一种作为番茄根结线虫生防菌交织枝顶孢，命名为TEF。该菌株已于申请日前保藏于约布达佩斯条微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期2013.10.9，保藏号是CGMCC NO.8300。经微生物学鉴定为交织枝顶孢。该菌株最适生长条件为：温度25℃，培养基(PDA)为马铃薯粉0.6％(w/v)，葡萄糖1.5-2％(w/v)，琼脂1.5-2％(w/v)，pH7.0-7.2，121℃灭菌20分钟。在PDA培养基平板上，25℃，培养7天后，菌株TEF菌落直径为18-25mm，菌丝白色，菌落中央产生气生菌丝，瓶梗长度5-10μm，基部宽1.5～2.0μm，顶部宽0.5～1μm。分生孢子串生于瓶梗上，形成长链。分生孢子单胞，椭圆，平滑，大小4.4～5.2×1.4～2.0μm。未见厚垣孢子。依照《真菌鉴定手册》对菌株TEF形态进行测定，确定该菌株为枝顶孢属(Acremonium)成员。通过BLAST同源比对，TEF菌株的18S rDNA序列与Acremonium implicatum的18S rDNA序列相似性最高，因此将TEF菌株确定为交织枝顶孢(Acremonium implicatum)。 
进一步，本发明一种交织枝顶孢(Acremonium implicatum)作为番茄根结线虫生防菌的应用。 
本发明进一步提供了菌种的保存条件，采用培养基(PDA)成分：马铃薯粉0.6％(w/v)，葡萄糖1.5-2％(w/v)，琼脂1.5-2％(w/v)，pH7.0-7.2，121℃灭菌20分钟。在PDA培养基斜面上25℃条件下，培养3天，采用10％灭菌甘油作为保护剂，真空冷冻干燥后低温保存；平时使用保存在PDA培养基斜面上，4℃冰箱保存备用。 
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果：本发明提供的交织枝顶孢(Acremonium implicatum)是一种根结线虫生防菌，在番茄根结线虫防治方面有较高的应用价值，尤其是该菌是番茄内生菌，能够持续对根结线虫起作用，克服了一般生防菌不能在土壤中定殖而造成防效低的缺陷，所以防治效果较好。 
附图说明
图1所示为交织枝顶孢(Acremonium implicatum)Tef的菌落形态图。图中，A：菌落形态，B：瓶梗C：分生孢子，D：分生孢子串生。 
图2所示为交织枝顶孢(Acremonium implicatum)Tef的18S rDNA片段PCR扩增结果图，图中，M指标准DNA序列片段大小。 
图3所示为交织枝顶孢(Acremonium implicatum)Tef的18S rDNA系统发育树图。图中，Tef指交织枝顶孢(Acremonium implicatum)Tef菌株。 
图4所示为交织枝顶孢(Acremonium implicatum)Tef对根结线虫抑制的盆栽效果图。图中，A为对照，B为交织枝顶孢菌液处理。 
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不局限于下述的实施例。 
本发明中涉及到的主要原辅材料、试剂盒仪器设备：供试南方根结线虫(Meloidogyne incongnita)由中国农业科学院蔬菜花卉研究所病害组提供；番茄样品采自北京市顺义区杨镇蔬菜基地，取番茄根结后，在实验室进行表面消毒，然后分离根结内生真菌。分离采用马铃薯葡糖培养基(PDA)；MSSPx-250生化培养箱，MLS-3020高压蒸汽灭菌锅，单人双面净化工作台，PCR仪Eppendorf，Allegra X-15R台式冷冻离心机，电泳仪Bio-Rad Mode，凝胶成像仪United-Bio GK-330C，真菌基因组DNA提取试剂盒(杭州博日科技有限公司)，Sigma-Aldrich公司的ReadyMixTM Taq PCR Reaction Mix(含有MgCl2)，其余试剂为分析纯。 
本发明中选用的所有原辅材料、试剂盒仪器都为本领域熟知的，其他本领域熟知的一些试剂盒设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。 
实施例一：交织枝顶孢(Acremonium implicatum)的分离、筛选及鉴定 
(1)拮抗菌的分离和筛选 
根结内生真菌分离：取番茄根结组织，用自来水冲洗掉根结表面泥土，然后用无菌水冲洗3次，75％酒精浸泡1分钟，无菌水冲洗3次。用无菌剪刀将根结剪成0.5×0.5cm小块，置于PDA培养基上培养。PDA培养基中含有75μg/mL氨苄青霉素，抑制细菌生长。将培养基置于25℃培养，待根结小块长出菌落后，分别挑取菌落边缘菌丝到另一PDA平板上，纯化。最后将纯化的菌株保存备用。 
菌株发酵液对根结线虫致死活性测定：将菌株接种于含有马铃薯葡糖培养液的三角瓶中，25℃，震荡培养7天。将发酵液800rmp/min离心2分钟，去除菌丝和孢子，再经细菌过滤器过滤，得到无菌的发酵液。取根结线虫2龄幼虫虫悬液1ml(约含有500头线虫)加入到4ml发酵液中，25℃静置48小时后，将线虫转移至无菌水中复苏2小时，身体僵直不活动的线虫为死亡线虫。统计线虫总数量和死亡线虫数量。马铃薯葡萄糖液体培养基作为对照。计算测试菌株对根结线虫的致死率，筛选致死率高的菌株进行后续试验。 
根结线虫致死率公式： 
在所有测试的真菌中，菌株TEF对根结线虫致死率最高为97％，因此该菌株进行后续试验。 
参见附图1，获得菌株TEF在PDA培养基平板上，25℃，培养7天后，菌株1号菌落直径为18-25mm，菌丝白色，菌落中央产生气生菌丝，瓶梗长度5-10μm，基部宽1.5～2.0μm，顶部宽0.5～1μm。分生孢子串生于瓶梗上，形成长链。分生孢子单胞，椭圆，平滑，大小4.4～5.2×1.4～2.0μm。未见厚垣孢子。根据《真菌鉴定手册》对菌株TEF进行形态学测定。 
PCR扩增菌株TEF的18S rDNA序列及其测序 
挑取菌落上菌丝，放入盛有300μL真菌裂解液的EP管中，65℃裂解2小时，然后用真菌基因组DNA提取试剂盒(杭州博日科技有限公司)提取真菌DNA，菌株DNA用于扩增18S rDNA序列。 
引物1：5’TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA3’ 
引物2：5’ATTGCAATGCYCTATCCCCA3’ 
PCR扩增反应体系为20μL，含有10μL PCR Master Mix，1μL引物1，1μL引物2，2μL DNA模板，Taq酶0.5μL，无菌水5.5μL。扩增条件：94℃4min，94℃55s，55℃30s，72℃50s，30个循环；72℃7min。扩增产物(约800bp)经1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，PCR产物直接进行双向测序。 
18S rDNA序列比对及系统发育分析 
将测序得到的18S rDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，从中获取相近的其他物种18S rDNA序列，用MEGA5.0中Neighbor-joining法构建系统进化树。 
用真菌18s rDNA序列通用引物，PCR扩增菌株的18S rDNA序列，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像参见附图2所示。经测序分析菌株扩增的18S rDNA序列长约为760bp。将菌株的18S rDNA序列进行BLAST分析后，结果显示，菌株TEF与Acremonium implicatum相似度最高，达到了98％。 
将菌株TEF的18S rDNA序列在NCBI数据库中进行BLAST后，下载相似度最高的5个物种18SrDNA序列，用MEGA5.0构建进化树。参见附图3所示，菌株TEF与Acremonium implicatum之间的进化距离最短，是Acremonium implicatum近似种。结合菌株TEF的形态结构，确定其为交织枝顶孢(Acremonium implicatum)。 
实施例2交织枝顶孢(Acremonium implicatum)对根结线虫盆栽防效测定 
将交织枝顶孢接种于含有马铃薯葡糖培养液的三角瓶中，25℃，震荡培养7天。用无菌纱布过滤掉菌丝，留下孢子，用无菌水将孢子配置成孢子悬浮液，浓度为1×106CFU/ml。从预先播种好番茄的苗盘中轻柔取出三叶期番茄(品种为立春)，尽量不要伤根。将番茄根系 浸入孢子悬浮液，浸泡1min，取出，种植于营养钵基质中。营养基质为草炭：蛭石按照2：1比例混合。待番茄生长7天后，每个营养钵中接入200条新孵化的根结线虫二龄幼虫。番茄生长1个月后，检测番茄根结数量、根数量、营养钵土壤中二龄幼虫数量等。以无菌水为对照。每个处理50株番茄。 
试验结果：交织枝顶孢对根结线虫具有良好的防效，参见附图4。对照番茄根结数量多，平均每株番茄121.6个根结，而且根结大，根系少，每株番茄根数量平均为38.0条。处理番茄根结数量少，平均每株番茄40.6个根结，且根结小，根系发达，侧根和毛根数量多，每株番茄根数量平均为122.1条。对照营养钵土壤中根结线虫二龄幼虫数量为每100g土壤375.1条，而处理营养钵土壤中线虫数量为每100g土壤151.1条。由此可见，交织枝顶孢抑制了根结线虫对番茄根系的侵染，降低了根结线虫的繁殖率，从而降低了土壤中根结线虫二龄幼虫的虫口数量。 
实施例3交织枝顶孢(Acremonium implicatum)对根结线虫田间防效测定 
试验温室位于北京市顺义区。选择多年种植番茄温室，且根结线虫发病重的田块作为试验田。田间试验共设三个处理：A、交织枝顶孢；B、10％福气多颗粒剂；C、空白对照。每个小区30m2，小区设三行隔离区，各处理按照完全随机区组排列，重复5次，全试验共设15个小区。试验前将温室试验地翻耕耙平，开好隔离沟和种植穴。交织枝顶孢孢子悬浮液培养方法同实施例2。将孢子悬浮液用灭菌的草炭进行吸附，制备成菌剂，比例为1000g草炭混合500ml孢子悬浮液。田间施用菌剂采用沟施或穴施，使用量为每垄1000g，垄长10m，垄宽0.6m，种植20棵番茄植株。施用10％福气多颗粒剂按每亩2kg用量，沟施或穴施。对照处理，番茄幼苗按照常规栽培，不施用任何农药。其他按常规农事操作管理。于收获拔秧时调查根结线虫的危害程度，计算病情指数和田间防效。 
试验结果：对照区番茄病情指数为92，福气多处理区番茄的病情指数为32，而交织枝顶孢处理区病情指数为25，与对照相比，病情指数下降67。与福气多相比，病情指数下降7。交织枝顶孢对根结线虫防效达到72.8％。由此可见，交织枝顶孢对根结线虫防效良好。 

Claims (3)

1.一种从番茄根结中分离的，可作为番茄根结线虫生防菌菌株TEF，为交织枝顶孢(Acremonium implicatum)，2013年10月9日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为CGMCC NO.8300。
2.如权利要求1所述的交织枝顶孢(Acremonium implicatum)CGMCC NO.8300在作为番茄根结线虫生防菌的应用。
3.如权利要求2所述的交织枝顶孢在防治番茄根结线虫的使用方法，其特征在于：
1)将交织枝顶孢接种于含有马铃薯葡糖培养液的三角瓶中，25℃，震荡培养7天。
2)用无菌纱布过滤掉菌丝，留下孢子，用无菌水将孢子配置成孢子悬浮液，浓度为1×106CFU/ml。
3)将孢子悬浮液用灭菌草炭进行吸附，制备成菌剂，比例为1000g草炭吸附500ml孢子悬浮液。
4)田间施用菌剂采用沟施或穴施，使用量为每垄1000g，垄长10m，垄宽0.6m，种植20棵番茄植株。
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