CN107058190A - 一种高效杀线虫的组合菌剂的制备方法 - Google Patents

一种高效杀线虫的组合菌剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种高效杀线虫的组合菌剂的制备方法，包括：制备金龟子绿僵菌悬液；制备光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB‑1悬液；制备克鲁丝假丝酵母菌TY9悬液；制备菌种混合液；准备浒苔以及固体发酵步骤。所得长效生物杀线虫组合剂中，金龟子绿僵菌种含量为菌种含量为3×106cfu·g‑1以上、光合细菌嗜酸柏拉红菌菌种含量为2×107cfu·g‑1以上、克鲁丝假丝酵母菌菌种含量为1×107cfu·g‑1以上。本发明使用了不同类型的三种菌种并以浒苔作为发酵原料进行发酵，发酵产物具备良好的杀线虫效果，且能够提供含有丰富氮磷钾和微量元素的肥料，防治率达85‑100％，作物增产5‑15％。

Description

一种高效杀线虫的组合菌剂的制备方法
技术领域
本发明涉及农业杀线虫药剂制备领域，具体涉及一种高效杀线虫的组合菌剂的制备方法。
背景技术
根结线虫作为分布广泛、为害严重的一种植物寄生线虫，对农林业生产造成极大的经济损失。根结线虫可直接破坏寄主表皮细胞使作物造成机械损伤，也可通过口针刺伤寄主，分泌有毒物质，形成瘤状根结，影响作物生长。几乎所有的树种容易被这些害虫感染，具体表现为影响宿主植物的根，但也可损害地上部分，包括茎、叶和花。
防治线虫的方法，之前绝大多数在线虫控制方面的尝试包括施用化学驱线虫剂和/或微生物例如某些真菌和细菌，人们发现这些方法类似地通过杀伤线虫而具有控制。但是由于它们的毒性，很多有效的化学驱线虫剂反而污染了环境。因此，很多传统化学驱线虫剂(例如甲基-溴化物和有机磷酸酯类)的使用已经被淘汰，从而产生了对开发替代处理线虫的需求。
微生物菌株是防止线虫危害的一种良好手段，在实际应用中，许多产品因含孢量有限而防效不及化学杀线虫剂，而且单一菌种的发酵液在只能对特定的线虫种类起到作用，并不具备广谱杀线虫的能力。因此，研发一种高效杀线虫的组合菌剂仍然是一项重要的研究内容。
另一方面，由于排放近海海水的污染(污染源中含有大量的氮磷元素)，自2008年以来我国近海海域，尤其是黄海海域，经常发生浒苔爆发事件。浒苔的大规模爆发会带来危害。打捞上来的浒苔并不容易治理，目前并没有合适的处理方式，任由浒苔堆抵，会带来另外的环境污染问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种高效杀线虫的组合菌剂的制备方法。本发明的一种高效杀线虫的组合菌剂杀线虫效率高，灭杀线虫的种类所，且灭杀效果长久有效，减轻了线虫的危害，显著提高作为的增产增收，防治率达85-100％。
本发明的技术方案如下。
一种高效杀线虫的组合菌剂的制备方法，包括：
步骤(1)，制备金龟子绿僵菌悬液；将金龟子绿僵菌(Metarhizum anisoplia，保藏编号为CGMCC No.8385，通过商业途径购得)菌种于24℃接种在PDA斜面培养基上培养5-10天，该PDA斜面培养基的配方包括，以重量份数计，土豆粉5-10份、蔗糖1-5份、玉米粉5-20份、MgSO4·7H2O 0.1-5份以及K2HPO4 0.2-3份，培养结束后使用去离子水洗涤，洗下液体即金龟子绿僵菌悬液；
制备光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1悬液(Rhodoblastus acidophilus，保藏编号CCTCC NO.M 206124，通过商业途径购得)，将光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1菌种置于液体培养基中培养发酵，在1000-4000LX灯光照射培养5-7天，或者在自然光下光照培养15-30天；其中，该液体培养基包括，以重量份数计，蔗糖5-10份、乙酸钾0.1-2份、MgSO4·7H2O 0.01-0.2份、KH2PO4 0.02-0.2份、CaCl2·2H2O 0.01-0.3份、CaCO3 0.02-0.3份，该液体培养基的pH为6.4-6.8；液体培养所得溶液即光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1悬液；
制备克鲁丝假丝酵母菌TY9悬液(Candida krusei，保藏编号为CCTCC M 2014435，通过商业途径购得)，将克鲁丝假丝酵母菌TY9接种至液体培养基中培养5-10天，培养温度是25-33℃，该液体培养基包括，以重量份数计，蔗糖10-20份、蛋白胨5-10份、氯化钠1-3份，液体培养所得溶液即克鲁丝假丝酵母菌TY9悬液；
步骤(2)，将步骤(1)获得的金龟子绿僵菌悬液、光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1悬液、克鲁丝假丝酵母菌TY9悬液按照质量比1∶2∶2.5的比例混合，在混合液中加入占混合夜总重量的5-8％的蔗糖和1-10％土豆粉，获得混合菌液，在1-5℃下保存备用；
步骤(3)，将浒苔粉碎，直径在1-10cm，自然晾晒后备用，得到干燥浒苔；
步骤(4)，将步骤(2)的混合菌液、步骤(3)的干燥浒苔混合，同时加入干燥浒苔重量0.1-0.6％的蔗糖、0.01-0.5％的尿素以及0.001-0.01％的Na2B4O7·10H2O，进行自然发酵，发酵10-20天，自然凉干即得所述的一种长效生物杀线虫组合剂。
优选的，步骤(4)中，混合菌液与的干燥浒苔的质量用量比例为1-3∶100-2000。
优选的，所得长效生物杀线虫组合剂中，金龟子绿僵菌种含量为菌种含量为3×106cfu·g-1以上、光合细菌嗜酸柏拉红菌菌种含量为2×107cfu·g-1以上、克鲁丝假丝酵母菌菌种含量为1×107cfu·g-1以上。
本发明进一步请求保护一种由上述方法制备得到的长效生物杀线虫组合剂。
本发明取得了显著地技术进步。
本发明创造性的甄选使用了三种不同性质的菌种进行发酵，发酵得到的代谢产物能够灭杀几乎全部的线虫种类，上述的三种不同类型的菌种起到了相互促进的协同作用，在固体发酵时，光合细菌嗜酸柏拉红菌能够产生更多的营养物质，以供应金龟子绿僵菌和克鲁丝假丝酵母菌的代谢，克鲁丝假丝酵母菌能够在固体发酵基质的的内部进行发酵代谢，而在固体发酵基质的外部受到阳光照射的部分，光合细菌嗜酸柏拉红菌的代谢更加活跃，都促进了不同菌种的代谢作用，提高了组合剂中菌种的含量。
本发明将影响环境的浒苔作为发酵原料，浒苔来源于海洋，浒苔中含有大量的氮磷钾以及丰富的微量元素，本发明在固体发酵时仅仅加入了少量的的尿素和Na2B4O7·10H2O以便于固体发酵初始阶段的快速发酵，随着发酵的深入，浒苔中的营养元素和微量元素转移到菌种的发酵液中，提高了产品的肥力，不仅能够杀线虫，还能够提高含有丰富氮磷钾和微量元素的肥料，促进了作物的生长，且解决了浒苔带来的环境问题，本发明取得了显著地技术进步和实质性先进的技术效果。
本发明使用了不同类型的三种菌种并以浒苔作为发酵原料进行发酵，发酵产物具备良好的杀线虫效果，且能够提供含有丰富氮磷钾和微量元素的肥料，使用本发明的产品杀线虫效率高，灭杀线虫的种类全，且灭杀效果长久有效，减轻了线虫的危害，显著提高作为的增产增收，防治率达85-100％，作物增产5-15％。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进一步详述本发明的技术方案。
实施例1
一种高效杀线虫的组合菌剂的制备方法，包括：
步骤(1)，制备金龟子绿僵菌悬液；将金龟子绿僵菌(Metarhizum anisoplia，保藏编号为CGMCC No.8385，通过商业途径购得)菌种于24℃接种在PDA斜面培养基上培养5天，该PDA斜面培养基的配方包括，以重量份数计，土豆粉5份、蔗糖1份、玉米粉5份、MgSO4·7H2O0.1份、及K2HPO4 0.2份，培养结束后使用去离子水洗涤，洗下液体即金龟子绿僵菌悬液；
制备光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1悬液(Rhodoblastus acidophilus，保藏编号CCTCC NO.M 206124，通过商业途径购得)，将光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1菌种置于液体培养基中培养发酵，在1000LX灯光照射培养5天，其中，该液体培养基包括，以重量份数计，蔗糖5份，乙酸钾0.1份，MgSO4·7H2O 0.01份，KH2PO40.02份，CaCl2·2H2O 0.01份，CaCO3 0.02份，该液体培养基的pH为6.4；液体培养所得溶液即光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1悬液；
制备克鲁丝假丝酵母菌TY9悬液(Candida krusei，保藏编号为CCTCC M 2014435，通过商业途径购得)，将克鲁丝假丝酵母菌TY9接种至液体培养基中培养5天，培养温度是25℃，该液体培养基包括，以重量份数计，蔗糖10份，蛋白胨5份，氯化钠1份，液体培养所得溶液即克鲁丝假丝酵母菌TY9悬液；
步骤(2)，将步骤(1)获得的金龟子绿僵菌悬液、光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1悬液、克鲁丝假丝酵母菌TY9悬液按照质量比1∶2∶2.5的比例混合，在混合液中加入占混合夜总重量的5％的蔗糖和1％土豆粉，获得混合菌液，在1℃下保存备用；
步骤(3)，将浒苔粉碎，直径在2cm，自然晾晒后备用，得到干燥浒苔；
步骤(4)，将步骤(2)的混合菌液、步骤(3)的干燥浒苔混合，混合菌液与的干燥浒苔的质量用量比例为1∶100同时加入干燥浒苔重量0.1％的蔗糖、0.01％的尿素，以及0.001％的Na2B4O7·10H2O，进行自然发酵，发酵10天，自然凉干即得所述的一种长效生物杀线虫组合剂。
经测试，所得长效生物杀线虫组合剂中，金龟子绿僵菌种含量为菌种含量为3.2×106cfu·g-1、光合细菌嗜酸柏拉红菌菌种含量为2×107cfu·g-1、克鲁丝假丝酵母菌菌种含量为1×107cfu·g-1。
实施例2
一种高效杀线虫的组合菌剂的制备方法，包括：
步骤(1)，制备金龟子绿僵菌悬液；将金龟子绿僵菌菌种于24℃接种在PDA斜面培养基上培养10天，该PDA斜面培养基的配方包括，以重量份数计，土豆粉10份、蔗糖5份、玉米粉20份、MgSO4·7H2O 5份、及K2HPO4 3份，培养结束后使用去离子水洗涤，洗下液体即金龟子绿僵菌悬液；
制备光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1悬液，将光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1菌种置于液体培养基中培养发酵，在4000LX灯光照射培养7天；其中，该液体培养基包括，以重量份数计，蔗糖10份，乙酸钾2份，MgSO4·7H2O 0.2份，KH2PO4 0.2份，CaCl2·2H2O 0.3份，CaCO30.3份，该液体培养基的pH为6.8；液体培养所得溶液即光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1悬液；
制备克鲁丝假丝酵母菌TY9悬液，将克鲁丝假丝酵母菌TY9接种至液体培养基中培养10天，培养温度是33℃，该液体培养基包括，以重量份数计，蔗糖20份，蛋白胨10份，氯化钠3份，液体培养所得溶液即克鲁丝假丝酵母菌TY9悬液；
步骤(2)，将步骤(1)获得的金龟子绿僵菌悬液、光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1悬液、克鲁丝假丝酵母菌TY9悬液按照质量比1∶2∶2.5的比例混合，在混合液中加入占混合夜总重量的8％的蔗糖和10％土豆粉，获得混合菌液，在5℃下保存备用；
步骤(3)，将浒苔粉碎，直径在10cm，自然晾晒后备用，得到干燥浒苔；
步骤(4)，将步骤(2)的混合菌液、步骤(3)的干燥浒苔混合，混合菌液与的干燥浒苔的质量用量比例为3∶2000同时加入干燥浒苔重量0.6％的蔗糖、0.5％的尿素，以及0.01％的Na2B4O7·10H2O，进行自然发酵，发酵10-20天，自然凉干即得所述的一种长效生物杀线虫组合剂。
经测试，所得长效生物杀线虫组合剂中，金龟子绿僵菌种含量为菌种含量为3.5×106cfu·g-1、光合细菌嗜酸柏拉红菌菌种含量为1×108cfu·g-1、克鲁丝假丝酵母菌菌种含量为1.6×107cfu·g-1。
实施例3
一种高效杀线虫的组合菌剂的制备方法，包括：
步骤(1)，制备金龟子绿僵菌悬液；将金龟子绿僵菌菌种于24℃接种在PDA斜面培养基上培养6天，该PDA斜面培养基的配方包括，以重量份数计，土豆粉6份、蔗糖5份、玉米粉10份、MgSO4·7H2O 0.3份、及K2HPO4 0.3份，培养结束后使用去离子水洗涤，洗下液体即金龟子绿僵菌悬液；
制备光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1悬液，将光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1菌种置于液体培养基中培养发酵，在自然光下光照培养30天；其中，该液体培养基包括，以重量份数计，蔗糖10份，乙酸钾2份，MgSO4·7H2O 0.2份，KH2PO4 0.2份，CaCl2·2H2O 0.3份，CaCO30.3份，该液体培养基的pH为6.8；液体培养所得溶液即光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1悬液；
制备克鲁丝假丝酵母菌TY9悬液，将克鲁丝假丝酵母菌TY9接种至液体培养基中培养10天，培养温度是33℃，该液体培养基包括，以重量份数计，蔗糖20份，蛋白胨5份，氯化钠1份，液体培养所得溶液即克鲁丝假丝酵母菌TY9悬液；
步骤(2)，将步骤(1)获得的金龟子绿僵菌悬液、光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1悬液、克鲁丝假丝酵母菌TY9悬液按照质量比1∶2∶2.5的比例混合，在混合液中加入占混合夜总重量的6％的蔗糖和8％土豆粉，获得混合菌液，在4℃下保存备用；
步骤(3)，将浒苔粉碎，直径在10cm，自然晾晒后备用，得到干燥浒苔；
步骤(4)，将步骤(2)的混合菌液、步骤(3)的干燥浒苔混合，同时加入干燥浒苔重量0.6％的蔗糖、0.5％的尿素，以及0.01％的Na2B4O7·10H2O，进行自然发酵，发酵20天，自然凉干即得所述的一种长效生物杀线虫组合剂。
经检测，所得长效生物杀线虫组合剂中，金龟子绿僵菌种含量为菌种含量为3.1×106cfu·g-1、光合细菌嗜酸柏拉红菌菌种含量为2.9×107cfu·g-1、克鲁丝假丝酵母菌菌种含量为1.2×107cfu·g-1以上。
需要特别指出的是，上述具体实施方式仅仅是本发明的技术方案的优选的实施例，不能对本发明的技术方案造成限制，任何构思落入本发明权利要求范围内的产品，均侵犯本发明的专利权。

Claims (4)

1.一种高效杀线虫的组合菌剂的制备方法，其特征在于，包括：
步骤(1)，制备金龟子绿僵菌悬液；将金龟子绿僵菌菌种于24℃接种在PDA斜面培养基上培养5-10天，该PDA斜面培养基的配方包括，以重量份数计，土豆粉5-10份、蔗糖1-5份、玉米粉5-20份、MgSO4·7H2O 0.1-5份、以及K2HPO4 0.2-3份，培养结束后使用去离子水洗涤，洗下液体即金龟子绿僵菌悬液；
制备光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1悬液；将光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1菌种置于液体培养基中培养发酵，在1000-4000LX灯光照射培养5-7天，或者在自然光下光照培养15-30天；其中，该液体培养基包括，以重量份数计，蔗糖5-10份、乙酸钾0.1-2份、MgSO4·7H2O0.01-0.2份、KH2PO4 0.02-0.2份、CaCl2·2H2O 0.01-0.3份、以及CaCO3 0.02-0.3份，该液体培养基的pH为6.4-6.8；液体培养所得溶液即光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1悬液；
制备克鲁丝假丝酵母菌TY9悬液；将克鲁丝假丝酵母菌TY9接种至液体培养基中培养5-10天，培养温度是25-33℃，该液体培养基包括，以重量份数计，蔗糖10-20份、蛋白胨5-10份、以及氯化钠1-3份，液体培养所得溶液即克鲁丝假丝酵母菌TY9悬液；
步骤(2)，将步骤(1)获得的金龟子绿僵菌悬液、光合细菌嗜酸柏拉红菌PSB-1悬液、克鲁丝假丝酵母菌TY9悬液按照质量比1∶2∶2.5的比例混合，在混合液中加入占混合夜总重量的5-8％的蔗糖和1-10％土豆粉，获得混合菌液，在1-5℃下保存备用；
步骤(3)，将浒苔粉碎，直径在1-10cm，自然晾晒后备用，得到干燥浒苔；
步骤(4)，将步骤(2)的混合菌液、步骤(3)的干燥浒苔混合，同时加入干燥浒苔重量0.1-0.6％的蔗糖、0.01-0.5％的尿素以及0.001-0.01％的Na2B4O7·10H2O，进行自然发酵，发酵10-20天，自然凉干即得所述的一种长效生物杀线虫组合剂。
2.根据权利要求1所述的一种高效杀线虫的组合菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，混合菌液与的干燥浒苔的质量用量比例为1-3∶100-2000。
3.根据权利要求1所述的一种高效杀线虫的组合菌剂的制备方法，其特征在于，所得长效生物杀线虫组合剂中，金龟子绿僵菌种含量为菌种含量为3×106cfu·g-1以上、光合细菌嗜酸柏拉红菌菌种含量为2×107cfu·g-1以上、克鲁丝假丝酵母菌菌种含量为1×107cfu·g-1以上。
4.一种由权利要求1-3任意一项所述制备方法制备得到的高效杀线虫的组合菌剂。
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