CN109370911A - 一种利用甜叶菊渣制备深绿木霉生防菌剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种利用甜叶菊残渣制备深绿木霉生防菌剂的方法，深绿木霉(Trichoderma atroviride)ZYTA09菌株，中国科学院微生物所菌种保藏中心保藏号CGMCC 14133。本发明利用甜叶菊渣发酵深绿木霉ZYTA09，制备生防菌剂。通过该方法发酵深绿木霉可减少生产工艺环节，使用本发明中的方法固体发酵深绿木霉，可产生大量的分生孢子，单位产量为2.5×109个孢子，发酵单位高，生产过程环保无污染。本发明技术方案不仅为甜叶菊的资源化利用提供了一条新途径，也为生产深绿木霉ZYTA09生防菌剂提供了可行发酵方法，发酵获得深绿木霉可用于田间施用，起到防治多种植物病原真菌、促进农作物生长和改良土壤的多重功效。

Description

一种利用甜叶菊渣制备深绿木霉生防菌剂的方法
技术领域
本发明涉及一种深绿木霉生防菌剂的制备方法，具体为一种利用甜叶菊渣制备深绿木霉生防菌剂的方法和深绿木霉生防菌剂的发酵。
背景技术
我国是目前世界上最大的甜叶菊糖产品生产供应国，约占全球总产量的90％，但大量甜叶菊渣未得到很好利用，不仅造成资源的极大浪费，还严重污染了环境。研究资料显示，甜叶菊渣作为饲料或添加剂极具利用价值，但甜叶菊渣渣中粗纤维较高，这是影响其作为饲料大比例添加的主要因素。将甜叶菊渣中含有较高的有机碳及微量元素，经过适当的预处理，并添加合适的营养元素，将其作为微生物发酵的培养基质底料，探讨其作为培养基质进行微生物固态发酵技术处理，
提高其营养价值，改善其适口性，得到较易被动物消化利用的具有高饲用价值的发酵饲料，可以实现甜叶菊渣渣低成本、无二次污染的综合利用，为拓展饲料资源，降低饲料成本探索一条新途径。
本试验研究利用甜叶菊渣渣为主要原料，通过对发酵菌种选择与配比等因素的实验研究，初步确定甜叶菊渣渣发酵菌剂的生产工艺，旨在探讨甜叶菊渣作为固体发酵菌剂的可行性及其在生防菌剂中的适宜比例，为甜叶菊渣渣的合理利用提供理论依据。
木霉(Trichoderma sp.)在自然界中分布广泛，是一种重要的生防菌，对多种植物病原菌均有较好的防治作用。深绿木霉能产生多种具有生物活性的酶系，所产纤维素酶活性最高的菌株之一，所产生的纤维素酶对作物有降解作用，效果非常好，又是一种资源丰富的拮抗微生物，在植物病理生物防治中具有重要的作用，具有保护和治疗双重功效，可有效防治土传性病害。山东农业大学微生物实验室保存的一株深绿木霉菌株，具有很好的生防作用。该菌株对多种植物病原真菌具有强烈的拮抗作用，。
如何降低深绿木霉生防菌剂的生产成本，同时为高效处理甜叶菊渣残渣找到有效的处理方法，减少环境污染，是本发明需要解决的问题。
文献报道的木霉的生产方法多采用的培养基以粮食及其副产品为主要营养物质来源，再添加其它物质进行固体发酵。如:公开号:CN102524305A和公开号:CN 102613252A的专利中公开了一种哈茨深绿木霉的生产方法，以蘑菇渣为支持物，按比例添加甘蔗渣，制成固体培养基，然后按照比例添加进甘薯/马铃薯淀粉废水制作的深绿木霉液体种子，获得的哈茨深绿木霉菌剂中的抱子数量最高为50亿/g。而仅以甜叶菊渣为固体培养基大批量固体发酵深绿木霉方法目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的就是针对上述存在的问题，提供一种仅利用甜叶菊渣制备深绿木霉生防菌剂的方法。本发明利用甜叶菊渣发酵深绿木霉，制备生防菌剂，通过该方法发酵深绿木霉可减少生产工艺环节，使用本发明中的方法固体发酵深绿木霉，可产生大量的分生抱子，发酵单位高，生产过程环保无污染。本发明技术方案不仅为甜叶菊渣的资源化利用提供了一条新途径，而且生产的深绿木霉生防菌剂可用于田间施用，起到防治多种植物病原真菌、促进农作物生长功效。
本发明的一种利用甜叶菊渣制备深绿木霉生防菌剂的方法技术方案为，包括以下步骤:
(1)甜叶菊渣处理；
(2)深绿木霉菌种的种子培养；
(3)深绿木霉发酵液制备；
(4)深绿木霉发酵液加到甜叶菊渣固体培养基中；
(5)后处理。
步骤(1)具体为:将甜叶菊渣粉碎，烘干，备用。
步骤(2)具体为:将深绿木霉种子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，培养温度为28℃，光照条件为光照8-16h、黑暗8-16h交替，培养时间为4d。作为一级种。
PDA培养基配方：
121度灭菌。
步骤(3)具体为:将经过步骤(2)培养的深绿木霉用挑针挑取少量菌丝体，加入PDB培养基中，置于25-30℃摇床培养150r/min，连续培养3-5d,得到深绿木霉液体发酵液。
PDB培养基配方为：
步骤(4)具体为:将经过步骤(1)处理的甜叶菊渣进行湿热灭菌，处理的甜叶菊渣中，加入甜叶菊渣重量的0.5％磷酸二氢钠、0.5％黄豆粉，料水比为1：2，充分混匀，制成深绿木霉生防菌剂，密封包装。
步骤(5)具体为:经过步骤(4)处理的甜叶菊渣中，加入磷酸二氢钠、黄豆粉和适量水，充分混匀，制成深绿木霉生防菌剂，密封包装。
步骤(5)中，冷却后加入深绿木霉液体发酵液。在经过步骤(4)
所述的一种利用甜叶菊渣制备深绿木霉生防菌剂的方法，具体包括以下步骤:
(1)甜叶菊渣处理:将新鲜的甜叶菊渣121℃烘干12h，粉碎至粒度为0.2-0.6cm，备用；
(2)深绿木霉菌种的种子培养
将深绿木霉种子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，培养温度为28℃，光照条件为光照8-16h、黑暗8-16h交替，培养时间为4d；
(3)深绿木霉发酵液制备
将经过步骤(2)培养的深绿木霉用挑针挑取少量菌丝体，加入PDB培养基中，置于25-30℃摇床培养150r/min，连续培养3-5d,得到深绿木霉液体发酵液；
(4)深绿木霉发酵液加到甜叶菊渣固体培养基中
将经过步骤(1)处理的甜叶菊渣进行121℃湿热灭菌25min，冷却后加入深绿木霉液体发酵液，接菌量为甜叶菊渣重量的5％；
(5)后处理：在经过步骤(4)处理的甜叶菊渣中，加入甜叶菊渣重量的0.5％磷酸二氢钠、0.5％黄豆粉，料水比为1：2，充分混匀，制成深绿木霉生防菌剂，密封包装。
本发明的有益效果为:本发明利用甜叶菊渣发酵深绿木霉，制备生防菌剂，通过该方法发酵深绿木霉可减少生产工艺环节，使用本发明中的方法固体发酵深绿木霉，可产生大量的分生孢子，发酵单位高，生产过程环保无污染。本发明技术方案不仅为甜叶菊渣的资源化利用提供了一条新途径，而且生产的深绿木霉生防菌剂可用于田间施用，起到防治多种植物病原真菌、促进农作物生长和改良土壤的多重功效。
本发明的深绿木霉生防菌剂中深绿木霉分生抱子为有效杀菌成分，甜叶菊渣为深绿木霉提供碳源，黄豆粉为深绿木霉提供氮源，磷酸二氢钠可作为缓冲剂和软水剂。该菌剂可以直接用于农田土壤，既能增加土壤肥力，又能改良土壤，有效防治多种植物病原真菌，促进农作物生长。
具体实施方式:
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明
并不局限于此。
实施例1
采用的菌种为山东农业大学微生物实验室保存的一株深绿木霉(Trichodermaatroviride)ZYTA09菌株，中国科学院微生物所菌种保藏中心保藏号CGMCC 14133，分离自植物腐殖质，具有很好的生防作用。该菌株对多种植物病原真菌具有强烈的拮抗作用，，对植物根结线虫也具有一定的防治效果。深绿深绿木霉能产生多种具有生物活性的酶系，所产纤维素酶活性最高的菌株之一，所产生的纤维素酶对作物有降解作用，效果非常好，又是一种资源丰富的拮抗微生物，在植物病理生物防治中具有重要的作用，具有保护和治疗双重功效，可有效防治土传性病害。
(1)甜叶菊渣处理:将新鲜的甜叶菊渣121℃烘干12h，粉碎至粒度为0.2-0.6cm，备用；
(2)深绿木霉菌种的种子培养
将深绿木霉种子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，培养温度为28℃，光照条件为光照8h、黑暗16h交替，培养时间为4d；
(3)深绿木霉发酵液制备
将经过步骤(2)培养的深绿木霉用挑针挑取少量菌丝体，加入PDB培养基中，置于25-30℃摇床培养150r/min，连续培养3-5d,得到深绿木霉液体发酵液；
(4)深绿木霉发酵液加到甜叶菊渣固体培养基中
将经过步骤(1)处理的甜叶菊渣进行121℃湿热灭菌25min，冷却后加入深绿木霉液体发酵液，接菌量为甜叶菊渣重量的5％；
(5)后处理：在经过步骤(4)处理的甜叶菊渣中，加入甜叶菊渣重量的0.5％磷酸二氢钠、0.5％黄豆粉，料水比为1:2，充分混匀，制成深绿木霉生防菌剂，密封包装。制成的深绿深绿木霉生防菌剂，产品中分生孢子最高浓度可达到7.5×108/g，可以直接用于农田土壤，既能增加土壤肥力，又能改良土壤，有效防治多种植物病原真菌，促进农作物生长。
实施例2
利用甜叶菊渣生深绿深绿木霉生防菌剂
(1)甜叶菊渣处理:将新鲜的甜叶菊渣121℃烘干12h，粉碎至粒度为0.2-0.6cm，备用；
(2)深绿木霉菌种的种子培养
将深绿木霉种子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，培养温度为28℃，光照条件为光照16h、黑暗8h交替，培养时间为4d；
(3)深绿木霉发酵液制备
将经过步骤(2)培养的深绿木霉用挑针挑取少量菌丝体，加入PDB培养基中，置于25-30℃摇床培养180r/min，连续培养3-5d,得到深绿木霉液体发酵液；
(4)深绿木霉发酵液加到甜叶菊渣固体培养基中
将经过步骤(1)处理的甜叶菊渣进行121℃湿热灭菌25min，冷却后加入深绿木霉液体发酵液，接菌量为甜叶菊渣重量的5％；
(5)后处理：在经过步骤(4)处理的甜叶菊渣中，加入甜叶菊渣重量的0.5％磷酸二氢钠、0.25％黄豆粉、0.25％硫酸铵，料水比为1:1.7，充分混匀，制成深绿木霉生防菌剂，密封包装。制成的深绿深绿木霉生防菌剂，产品中分生孢子最高浓度可达到2.96×108/g，可以直接用于农田土壤，既能增加土壤肥力，又能改良土壤，有效防治多种植物病原真菌，促进农作物生长。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不限制本发明，尽管参照实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、修改等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种利用甜叶菊渣制备深绿木霉生防菌剂的方法，其特征在于，利用甜叶菊发酵木霉制备生防菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种利用甜叶菊制备木霉生防菌剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)甜叶菊处理；
(2)木霉菌种的种子培养；
(3)木霉发酵液制备；
(4)木霉发酵液加到甜叶菊固体培养基中；
(5)后处理。
3.根据权利要求2所述的一种利用甜叶菊制备木霉生防菌剂的方法，其特征在于，步骤(1)具体为:将新鲜的甜叶菊粉碎，烘干，备用。
4.根据权利要求2所述的一种利用甜叶菊制备木霉生防菌剂的方法，其特征在于，步骤(2)具体为:所述木霉菌种为深绿木霉；将木霉种子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，培养温度为28℃，光照条件为光照8-16h、黑暗8-16h交替，培养时间为4d。
5.根据权利要求2所述的一种利用甜叶菊制备木霉生防菌剂的方法，其特征在于，步骤(3)具体为:将经过步骤(2)培养的木霉用挑针挑取少量菌丝体，加入PDB培养基中，置于25-30℃摇床培养150r/min，连续培养3-5d,得到木霉液体发酵液。
6.根据权利要求2所述的一种利用甜叶菊制备木霉生防菌剂的方法，其特征在于，步骤(4)具体为:将经过步骤(1)处理的甜叶菊进行湿热灭菌，冷却后加入木霉液体发酵液。
7.根据权利要求2所述的一种利用甜叶菊制备木霉生防菌剂的方法，其特征在于，步骤(5)具体为:在经过步骤(4)处理的甜叶菊中，加入磷酸二氢钠、黄豆粉和适量水，充分混匀，制成木霉生防菌剂，密封包装。
8.根据权利要求7所述的一种利用甜叶菊制备木霉生防菌剂的方法，其特征在于，步骤(5)中，在经过步骤(4)处理的甜叶菊中，加入甜叶菊重量的0.5％磷酸二氢钠、0.5％黄豆粉，料水比为1：2。
9.根据权利要求2所述的一种利用甜叶菊制备木霉生防菌剂的方法，其特征在于，包括以下步骤:
(1)甜叶菊处理:将新鲜的甜叶菊121℃烘干12h，粉碎至粒度为0.2-0.6cm，备用；
(2)木霉菌种的种子培养
将木霉种子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，培养温度为28℃，光照条件为光照8-16h、黑暗8-16h交替，培养时间为4d；
(3)木霉发酵液制备
将经过步骤(2)培养的木霉用挑针挑取少量菌丝体，加入PDB培养基中，置于25-30℃摇床培养150r/min，连续培养3-5d,得到木霉液体发酵液；
(4)木霉发酵液加到甜叶菊固体培养基中
将经过步骤(1)处理的甜叶菊进行121℃湿热灭菌25min，冷却后加入木霉液体发酵液，接菌量为甜叶菊重量的5％；
(5)后处理：在经过步骤(4)处理的甜叶菊中，加入甜叶菊重量的0.5％磷酸二氢钠、0.5％黄豆粉，料水比为1：2，充分混匀，制成木霉生防菌剂，密封包装。
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