CN100497590C - 一种低温果胶酶菌株、低温果胶酶及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产生低温果胶酶的指甲隐球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)和利用此菌株生产低温果胶酶的生产方法，同时还提供了低温果胶酶。通过利用指甲隐球酵母菌(CGMCC.No.1472)，建立菌种保藏、复壮及选育的系统方法，经过培养基配方优化筛选及发酵工艺条件优化控制，确立了稳定的发酵方法，生产的低温果胶酶具有良好的低温活性、高酶活。可广泛用于果蔬加工及酿造行业、麻品加工及棉纤维精加工、洗涤、饲料用酶、植物体有机物的制取等行业，并具有重要意义。

Description

一种低温果胶酶菌株、低温果胶酶及其生产方法

发明领域

本发明涉及微生物及微生物发酵领域。具体的说，本发明涉及一种产生低温果胶酶的酵母菌株、低温果胶酶及其生产方法。

背景技术

果胶质是植物体细胞壁的主要成分，也是细胞间层的填充剂，约占植物体的20～30％。主要是以α-1，4-糖苷键聚合的D-半乳糖醛酸直链高分子化合物为主，其直链两侧有羟基和羧基，可与半纤维素、纤维素等结合或甲基化，形成复杂、稳定的高分子化合物，对细胞起到粘联的作用，其一旦分解，植物组织将分散。因此，果胶质对植物体形态与结构的稳定性起关键作用。

果胶酶(Pactinase，E.C.3.2.1.15)是一类能够分解果胶质的复合酶的总称。最早在植物病原菌中发现，后在植物和多种微生物中均发现果胶酶的存在，随着物种的不同，所产生的酶的种类和特性存在较大差异，每一菌种均能产生多种不同组分的果胶酶，如原果胶酶、果胶裂解酶(PL)、内聚半乳糖醛酸酶(Endo-PG)、外聚半乳糖醛酸酶(EX-PG)、果胶酯酶(PE)等，每一种果胶酶组分在酶学特性上也存在较大的差异性。

果胶酶是一种重要的酶制剂，是世界四大酶种之一。在国外，果胶酶制剂很早就被用于生产和生活，我国于1986年才在桔子脱皮工艺上首次使用。目前，果胶酶已在以下果蔬加工及酿造行业、麻品加工及棉纤维精加工、洗涤、饲料用酶、植物体有机物的制取等行业得到广泛的运用。同时，我国也是果胶酶生产的主要国家之一。

果胶酶依据其最适酶解温度的差异可分为高温果胶酶和常温果胶酶。常温果胶酶的最适酶解温度在40～45℃，而高温果胶酶的最适酶解温度大于60℃。目前，国内外从事果胶酶生产及研究以常温果胶酶和高温果酶酶为主。其涉及的主要菌种及其产生的果胶酶主要特性如下：

黑曲霉(Aspergillus niger)6034，该酶酶解最佳作用条件为pH4.2、温度50℃(钱玉英李孝辉沙恩泳果胶酶高产菌株Aspe-rgillusniger6034的生理生化特性浙江农业学报9(4)：181-184，1997)；黑曲霉563，该酶酶解最佳作用条件为pH4.0～5.0、温度50℃(谷海先王建酿造工业用果胶酶、纤维素酶生产菌的选育研究中国酿造2004，1：12-15)；黑曲霉(陈荣谢必峰陈哲超谢树森吴松刚激光诱变选育果胶酶高产菌株光子学报1997/02：97-100)；黑曲霉(Aspergillusniger)(李廷生，王平诸果胶酶高产菌株Aspergillus niger 3502的选育郑州工程学院学报2001，04：14-16+25)；由拉加兹工业菌种保藏室提供的黑曲霉经诱变处理后得到的MING1.1、MIUG1.16、MIUG1.58和MIUG1.109产生的果胶酶酶解最适条件为：pH 4.5左右、温度40℃(钦传光，丹·娃伦亭娜果胶酶高产菌株Aspergillus niger 3502的选育中国酿造2000，04：16-17+20)；黑曲霉(Aspergillus niger)SM40-6，该酶酶解最佳条件为pH 4.5，温度50℃(周仕春，邵继荣果胶酶SM40-6菌株的选育及其液体发酵条件西南农业学报1996/04：63-68)。

A.niger来源的果胶酶为材料(周立，李建吾商品果胶酶中endo-PG的分离纯化及其部分性质研究中国生物化学与分子生物学报1995，04：446-451)。

炭黑曲霉(Aspergilluscarbonarius)AS3.396，(佘秋生郭蔼果胶酶G5512菌株深层液体发酵中试及提取工艺研究光西北农林科技大学学报(自然科学版)2004，5：88-91)；炭黑曲霉突变株K-58(专利公开号：CN1273273A)。

禾黑芽枝霉突变菌株GBIBU7，经测试其产生的果胶酶含有三种组分，分别命名为PI，PII和PIII.测定了果胶酶的三种组分的动力学参数.其最适反应温度分别为45℃，35℃和45℃，最适pH值分别为4.4，5.0和5.0(巫华美，秦淮禾黑芽枝霉诱变体果胶酶的分离纯化和理化特性贵州科学1997，03：163-170；项明巫华美禾黑芽枝霉及其诱变体的果胶酶生产特性贵州科学1996/04：13-19)。

米曲霉(Aspergillus oryzae)野生菌株N328，该菌产生菌的果胶酶酶解最佳作用条件为：pH3.6，温度45℃，(张宁欣，赵学慧果胶酶高产菌株选育微生物学杂志1996/03：1-8)；米曲霉S-48(王成华Asp·oryzaeS-48果胶酶的性质和组分山东化工1996/01：23-26)；优于AS.3.396菌株(张玉墀果胶酶产生菌的选育食品科学1987，02：16-20)。

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Xg-01，该菌产生菌的果胶酶酶解最佳条件为：pH8.0～10，温度65℃[郭爱莲一株产果胶酶菌株Xg-01的鉴定陕西师范大学学报(自然科学版)1996/02：74-76；郭爱莲王少辉产果胶酶芽孢杆菌X_g-01的分离、筛选及发酵条件的研究西北大学学报(自然科学版)1997，01：53-56；郭爱莲，张渭细菌果胶酶菌株Xg-02的选育中国酿造1997/04：21-23]]；

吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii S-2)，该酶酶解最佳作用条件为pH10.5、温度60℃(张保国白志辉李祖明张国政张洪勋吉氏芽孢杆菌S-2菌株固态发酵制备碱性果胶酶食品科技，2004，12：8-11)；

Bacillus EP-5，该酶酶解最佳作用条件为pH8.0、温度60℃，(茆军孙建张志东唐琦勇耐热果胶酶产生菌的分离及酶学特性研究新疆农业科学，2004，S1：30-31)；

枯草杆菌(Bacillus subtilis)18，酶最适pH9.0，最适反应温度60℃[章银梅李心治枯草杆菌(Bacillus subtilis)产果胶酶的研究I.菌种选育、鉴定及其酶学特征分析工业微生物2000，01：27-29]；

Bacillus MHZP 01和MHZP 02(葛菁萍凌宏志果胶酶产生菌的分离及培养条件研究中国生物工程杂志2004，08：93-95)；另外，细菌果胶酶产生菌菌种还有枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis CGMCC NO：0213，专利公开号：CN1055118C)、枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis CCTCCNO：200038，专利公开号：CN1366043A)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilusCCTCC NO：M203042，专利公开号：CN1480529A)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis，专利号：US6429000)、Bacillus subtilis(Nasser et al.(1993)FEBS 335：319-326)、Bacillus sp.YA-14(Kim et al.(1994)Biosci.Biotech.Biochem.58：947-949)、Bacillus pumilus(Dave andVaughn(1971)J.Bacteriol.108：166-174)，B.polym-yxa(Nagel andVaughn(1961)Arch.Biochem.Biophys.93：344-352)、B.s-tearothermophilus(Karbassi and Vaughn(1980)Can.J.Microbiol.26：377-384)、Baci1lus sp.(Hasegawa and Nagel(1966)J.Food Sci.31：838-845)and Bac-illus sp.RK9(Kelly and Fogarty(1978)Can.J.Microbiol.24：1164-1172)等，这些菌株产生菌均为碱性、高温型果胶酶。

放线菌果胶酶产生菌，酶促反应最适条件是：pH9.6，温度45℃，其组分E1酶解最佳条件为：pH10、温度40℃(吴琼，刘自镕放线菌果胶酶的分离纯化及酶学性质的研究山东轻工业学院学报1996/04：53-58；吴琼，刘自镕放线菌果胶酶产酶条件及酶促反应条件的研究工业微生物1996/04：31-35)。

中温或高温果胶酶具有酶解反应温度等劣势，在工业化应用过程中需要的供较高的热能以达到其最适的应用条件。随着国际生物行业研究的深入，科学发现许多冷适应性微生物(适冷菌与嗜冷菌)可产生冷活性酶类，这类酶通常的特性是最适酶解反应温度较低，在低温条件下酶解活化能较低。因此，冷活性菌在工业化生产中具的较好的应用前景。

近几年国外开始从事低温果胶酶产生菌的筛选及酶学特性的研究工作，其主要的生产菌种及酶学特性如下：酵母菌Cryptococcus aquaticus，Cryptococcus macerans，Cystofilobasidium capitatum，Cystofilobasidium lari-marin，其产生的酶最适酶解温度40℃，最适pH5.0，主要用于食品加工行业，(Cold-adapted yeasts as producers ofcold-active polygalacturonases，Springer-Verlag Tokyo，June 2003Volume 7，Number 3：1431-0651)、酵母菌Cryptococcus cylindricus和Mrakiafrigida，其菌种可在4℃生长，产生的果胶酶在4℃下具有酶活性，可用于食品加工行业(Isolation and characterization of psychrophilicyeasts producing cold-adapted pectinolytic enzymes，PMID：9165700[PubMed-indexed for MEDLINE])。低温酶类的研究因其在节能、环保上的特殊性受到世界科学家的重视。目前，低温果胶酶的研究主要仍集中于产生菌种的选育研究。现有的低温果胶酶菌种产生菌的低温果胶酶其最适作用温仍较高，不能达到的室温下有较高酶学特性的要求，或是嗜低温菌种，发酵生产低温果胶酶条件较高苛刻，所产生的低温果胶酶最适作用过低，热稳定性差，应用中需进行降温控制。我国有关低温酶的研究工作刚刚开展，尚未见有关低温果胶酶的研究报导。

发明内容

针对国内外低温果胶酶菌种产生菌的低温果胶酶其最适作用温仍较高，不能达到的室温下有较高酶学特性的要求，或是嗜低温菌种，发酵生产低温果胶酶条件较高苛刻，所产生的低温果胶酶最适作用过低，热稳定性差，应用中需进行降温控制。本发明提供一种产生该果胶酶的微生物菌种、低温果胶酶及生产该低温果胶酶的方法。所述的低温果胶酶较常温果胶酶、高温果胶酶比较，在较低温的作用温度下可发挥较高的酶解特性。

本发明提供的一株产低温果胶酶的菌株，通过在新疆阿勒泰地区典型的自然低温环境的土壤样本分离、筛选和培养，获得一批耐低温的微生物菌株，从中筛选出一株编号为LPLB42的菌株，从而提供了一种低温果胶酶菌株，其具有生产低温果胶酶的优良特性，经微生物学鉴定，属于隐球酵母菌属的指甲隐球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)。

本发明在获得的指甲隐球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)的基础上，提供了一种低温果胶酶的生产方法。

同时，本发明还提供了一种低温果胶酶，通过利用本发明的菌株经过本发明确定的具体发酵方法而获得。

本发明提供了一种低温果胶酶菌株，命名为LPLB42，其能够以高产率产生低温果胶酶。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮编：100080。保藏日期是2005年9月30日，保藏号是CGMCC.No1472。经微生物学鉴定为指甲隐球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)。该菌株生长于MYPG-agar培养基表面，菌落呈乳白色，表面光滑，蜡样，不透明，有光泽，无丝状菌丝体，菌落老化后略带浅红色。该菌种可在5-35℃及pH3.5-9范围内均可生长；依照伯杰氏系统细菌学手册第八版，LPLB42菌为隐球酵母菌属中的成员，定为指甲隐球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)。该菌种产生的低温果胶酶，在pH3.5～7.4，温度在5～40℃范围内均有酶解特性，其最适酶解条件为20℃、pH5.8。本发明进一步建立菌种保藏、复壮及选育的系统工艺流程技术。

本发明的低温果胶酶微生物菌种，其菌学特性如表1所示。其菌学特性通过法国梅里埃公司生产的VITEK32自动鉴定仪测定。其结果与指甲隐球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)相似性达99％。

表1：LPLB42菌株生理生化特性

 

测定项目	结果
		Galactose(GAL)	阴性
Lactose(LAC)	阴性
		Sucrose(sUC)	阳性
Maltose(MLT)	阳性
		Cellobiose(CEL)	阴性
Methyl-D-glrcosede(AMG)	阳性
		Xylose(XYL)	阳性
Arabinose(ARA)	阳性
		Trehalose(TRE)	阳性
Melezitose(MLZ)	阳性
		Raffinose(RAF)	阴性
N-acethl-D-glucosamine(NAG)	阴性
		Xylitol(XLT)	阴性
Dulcitol(DUL)	阴性
		Adonitol(ADO)	阴性
Palatinose(PAL)	阳性
		Glycerol(GLy)	阴性
Sorbitol(sOR)	阴性

 

Erthritol(ERY)	阴性
		Melibiose(MEL)	阴性
Cyclohexamide(CYC)	阴性
		Glucose(GLU)	阳性
Incsitol(IN0)	阴性
		Nitrate(NIT)	阴性
2-Keto-D-glucose(2KD)	阳性
		Urea(URE)	阳性

作本发明低温果胶酶的产生菌种，既可为本发明所保护的菌株，也可为自然筛选的原始菌株，或通过自然变异或人工诱导变异的变异菌株，通过本发明所述的方法，均可实现本发明所阐述的技术效果。

作为上述变异菌株的研制方法，包括物理诱变，如紫外线辐射处理、钴60辐照处理、离子注入处理、激光辐照等各种射线处理；化学诱变，如亚硝基胍(NTG)、硫酸二乙酯等化学诱变剂处理，用常规果胶酶产生菌分离筛选培养基及方法优选出生产性能优异的菌株。

另外，也可通过分子生物学技术，从原始菌株或诱导变异菌种中获取低温果胶酶基因，以原菌核微生物，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等、真核微生物，如酵母等，作为基因受体菌，构建基因工程生产菌株，也可作为本发明的低温果胶酶产生菌种。

作为本发明的低温果胶酶产生菌种LPLB42，可采用如下方法对其进行保存、活化与筛选，及其摇瓶发酵获得本发明的低温果胶酶。

本发明的低温果胶酶产生菌LPLB42采用常规的斜面传代保存法，此方法是将本发明菌种接种于只要适合于酵母菌生长的斜面培养基表面，15～25℃培养3～4天，再于4℃下低温保藏，可存放3个月。或是利用真空冷冻干燥法将本发明菌种制成干粉菌种，低温或常温保藏可达1年以上。

长期保藏的菌种在使用时按如下方法进行活化、筛选。将长期保藏的本发明菌种接种于MYPG-agar培养基或其它适合于酵母菌生长的培养基表面，15～25℃培养3～4天；其MYPG-agar培养基成分如下：麦芽膏3g、酵母膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂30g、蒸馏水1000mL。再将其接种于含有0.1％的果胶的MYPG agar培养基表面，15～25℃培养2～3天；加入多糖沉淀剂10％的三甲基溴化铵溶液，静置。在菌落周围可形成明显的透明圈，挑取透明圈与菌落直径比最大的菌株作为本发明的实验菌株。

利用经活化筛选出的本发明的实验菌株进行发酵培养实验，获得本发明的低温果胶酶。在发酵培养过程中，可将斜面菌种直接接种于发酵培养基中，或是将菌种先进行液体增殖培养，再以5％-15％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养。

作为培养基的营养源，可广泛使用通常用于培养的营养源。只要是可作为碳源同化的碳化合物或者是含有该碳化合物的，微生物菌种可利用的、适合于发酵培养产生果胶酶的碳源即可，例如，可使用葡萄糖、麦芽汁、蔗糖、水解糖、可用的多糖等。本发明中优选葡萄糖和桔皮粉为最优碳源。葡萄糖用量为0.2-1.5％、桔皮粉用量为0.5-1.0％。

作为氮源，只要是可作为氮源同化的氮化合物或者是含有该氮化合物的即可，例如，可用铵盐、硝酸盐、大豆粉、肉类提取物、玉米浸渍液、玉米浆、酵母膏等。其氮源的选择和用量，可依据其它营养源的成分和用量的不同而不同，只要选合于本发明的低温果胶酶产生菌的培养及酶的产生即可。在本发明中，优选蛋白胨、酵母膏作为最佳的氮源，用量均在0.1-0.5％。

作为无机盐类，可适当添加磷酸氢氨、磷酸二氢钾等的磷酸盐、镁盐、钙盐、锰盐等的盐类。培养条件依培养基的组份而多少不同，但只要是适合于菌体培养产的、产生本发明中的果胶酶的条件即可。

作为产酶促进剂，可适量添加Tween系的表面活性剂、SDS等，添加量适培养基的不同而定，只要适宜促进培养过程产生本发明的果胶酶即可。

通常，可选择以下的条件进行培养。即，培养温度为5～35℃，最好为15～25℃的范围；培养时间为48～80小时，只要在本发明的低温果胶酶的生产量达到最高时结束发酵培养即可；培养基的pH可在3.5～9的生产范围，特别是在pH 5～7范围更适于本发明的果胶酶的生产。经如上所述的发酵培养方法，产生本发明的低温果胶酶。

从如上所得的培养液中采集低温果胶酶，可按照通常用于采集细胞外酶的方法，如硫酸铵盐析、超滤浓缩、冷冻干燥、色谱分离等，由分离、精制而进行，即，本发明可由下述方法获得的低温果胶酶：由过滤法或离心分离法从培养液中分离菌体及培养基固形物，得到上清液或滤液，对该些分离液进行或不进行浓缩，添加可溶性盐类，使酶沉淀的盐析法；添加亲水性的有机溶剂，使酶或夹杂物沉淀的有机溶剂沉淀法；使用离子交换树脂等的吸附脱离法；凝胶过滤法；添加稳定辅助剂或不添加稳定辅助剂的喷雾干燥法；单独或多个组合使用冷冻干燥法等的分离或精制方法。

通过本发明如上的阐述，得到后面实施例进一步的验证，得知本发明低温果胶酶的酶学特性。本发发明菌株产生的低温果胶酶最适酶解pH为5.8左右，在pH3.5～7.4范围内均有酶学活性；在5～40℃范围内均有酶特性，其最适酶解温度在20℃，在5℃下仍可保持60％左右的相对酶活力；该低温果胶酶具有较高的热稳定性，在20℃和30℃以下保温12小时，其酶活性不发生衰褪，在30℃以下处理36小时仍可保存80％以上的相对酶学活性。金属离子对低温果胶酶的活性具有一定的影响作用，其中Ca²⁺对具有激活作用，Zn²⁺、Mg²+、Mn²⁺对其活性无显著影响、Cu²⁺、Hg²⁺、Fe³⁺、Ba²⁺、Fe²⁺、Pb²⁺对酶活性具有抑制作用。作用温度与低温果胶酶酶活力的关系；低温果胶酶热稳定性；低温果胶酶pH稳定性；金属离子对低温果胶酶酶活力的影响作用。

通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果。

本发明的指甲隐球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)菌株及在菌学上来说与其同等的菌株及其变异菌株，可有效地用于产生本发明的低温果胶酶。再有，本发明的优点在于，使用所述菌株的制造具有上述性质的低温果胶酶的方法可有效地产生所述的低温果胶酶。所得的果胶酶酶液的酶活性可达40U/ml。

附图说明

图1：所示为以本发明的指甲隐球酵母菌(Cryptococcusnuiguttulatus)LPLB42产生的低温果胶酶反应pH和相对酶活性关系的图表。

图2：所示为以本发明的指甲隐球酵母菌(Cryptococcusnuiguttulatus)LPLB42产生的低温果胶酶反应温度和相对酶活性关系的图表。

图3：所示为以本发明的指甲隐球酵母菌(Cryptococcusnuiguttulatus)LPLB42产生的低温果胶酶在各温度下处理残余酶活性的图表。

图4：所示为各种金属离子对本发明的指甲隐球酵母菌(Cryptococcusnuiguttulatus)LPLB42产生的低温果胶酶酶活性的影响效果图。

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，则％皆指重量写。

具体实施方式

实施例1：低温果胶酶产生菌(LPLB42)的培养

将低温果胶酶产生菌接种于含有0.1％的果胶的麦芽膏酵母膏蛋白胨葡萄糖琼脂(MYPG agar)培养基上，其成分为：麦芽膏3g、酵母膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂30g、蒸馏水1000mL，将各成分在水中溶化后分装，10磅灭菌15分钟。15～25℃培养1～3天，加入多糖沉淀剂，10％的三甲基溴化铵溶液，静置。在菌落周围可形成明显的透明圈。

实施例2：低温果胶酶产生菌(LPLB42菌株)的发酵培养-I

将桔皮粉1％、磷酸氢二钾0.2％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钙0.1％、蛋白胨0.5％、酵母膏0.5％及葡萄糖1.5％的液体培养基100ml装入500mL锥形瓶中，在121℃作高压蒸汽灭菌20分钟后。将经活化培养的本发明的实验菌株接种于上述培养基中，在20℃，于150rpm下振荡培养72小时。培养后，经离心分离，获得低温果胶酶粗酶液。所得的果胶酶酶液的低温果胶酶活性为14U/ml。

实施例3：低温果胶酶产生菌(LPLB42菌株)的发酵培养-II

指甲隐球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)LPLB42菌株的发酵培养。

将低温果胶酶产生菌LPLB42接种于MYPG培养基中。MYPG培养基如下：麦芽膏3g、酵母膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、蒸馏水1000mL，将各成分在水中溶化后分装，10磅灭菌15分钟。20℃、150rpm，培养36小时后，将培养物以15％的比例加入到如下发酵培养基中。

桔皮粉1％、磷酸氢二钾0.2％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钙0.1％、葡萄糖1.5％、蛋白胨0.5％、酵母膏0.5％及SDS0.4％的液体培养基100ml装入500mL锥形瓶中，在121℃作高压蒸汽灭菌20分钟后。在20℃，于200rpm下振荡培养80小时。培养后，离心分离去除菌体，得到低温果胶酶粗酶液。所得的果胶酶酶液的低温果胶酶活性可达为40U/ml。

从如此所得的果胶酶液中，由硫酸按沉淀法得到65％饱和部分的沉淀。再以通常的方法脱盐后，冷冻干燥得低温果胶酶的原粉。

实施例4：酶活性的测量方法

低温果胶酶活力测定方法参照《中华人民共和国轻工行业标准》食品添加剂果胶酶制剂(QB1502-1992)标准测定方法。具体测定方法如下：

于甲乙两支比色管中，分别加入10g/L果胶溶液(用Sigma公司出品的桔子果胶标准品制剂制备)5mL，在25±0.2℃水浴中预热5min。向甲管(空白)中加入0.02M磷酸盐缓冲液(pH＝5.5)5mL；向乙管(样品)中加入稀释酶液1mL、0.02M磷酸盐缓冲液(pH＝5.5)4mL，立即摇匀，计时；在此温度下准确反应0.5h，立即取出并加热煮沸5min终止反应，冷却。取上述甲、乙管反应液各5mL放入碘量瓶中，准确加入1M碳酸钠溶液1mL、0.1M碘液5mL，摇匀，于暗放置20min；取出，加入2M硫酸溶液2mL，用0.05M硫代硫酸钠标准液滴定至浅黄色，加入淀粉指示液3滴，继续加滴定至蓝色刚好消失为终点，记录甲管(空白)、乙管(样品)反应液消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积。同时作平行样品的测定。

测定结果计算如下：

$X=\frac{(A-B)\×C\×0.51\×194.14\×N\×10}{5\×1\×0.5}$

式中：X—样品酶活力，u/mL；

      A—空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL；

      B—样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL；

      C—代表硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol.L；

      0.51—1毫摩尔硫代硫酸钠相当于0.51毫摩尔的游离半乳糖醛酸；

194.14—半乳糖醛酸毫摩尔质量，mg；

N—酶液稀释倍数；

10—反应总体积；

5—滴定时取反应混合物的体积，mL；

1—反应时国入稀释酶液的体积，mL；

0.5—反应时间，h。

实施例5：作用pH对低温果胶酶酶活力的影响

作用pH和最佳pH以10％的果胶酶溶液(Sigma公司出品的桔子果胶标准品配制)为基质，按前述的活性测试方法进行测定。测定的pH分别为3.5～8.0范围内的不同的pH值。以测定的最高酶活力为对照，设定其相对酶活力为100％。作用pH与酶活性的关系如图1所示。本发发明菌株产生的低温果胶酶最适酶解pH为5.8，在pH3.7～6.4范围内可保持较高的酶学活性。

实施例6：作用温度与低温果胶酶酶活力的关系

作用温度及最佳温度以10％的果胶酶溶液(Sigma公司出品的桔子果胶标准品配制)为基质，其它与前述的活性测定方法相同，在5～40℃的范围内的不同的反应温度下进行测试，以酶活力最高的温度为基准，设定相对酶活力为100％。反应温度和相对酶活性的关系如图2所示。在5～40℃的温度范围内测定时，本发明的低温果胶酶均呈现酶学活性，其最佳温度为20℃。在10～40℃的测定温度范围内具有良好的酶学特性。在5℃时仍可保持60％的相对酶学活性。

实施例7：低温果胶酶热稳定性

将低温果胶酶酶液分别在20℃、30℃、40℃下保温72小时处理，在不同的时间取样，按上述酶活性测定方法对其残余酶活力进行测定，以未经保温处理的酶液为对照，其相对酶活力为100％。测定条件为pH 5.7、20℃。此时的处理温度和残余活性的关系如图3所示。本发明的LPLB42菌株产生的低温果胶酶具有较高的热稳性。在20℃和30℃保温处理12小时，其酶学活性基本不发生改变；在30℃以下处理36小时仍可保存80％以上的相对酶学活性。

实施例8：金属离子对低温果胶酶酶活力的影响作用

金属离子对低温果胶酶的影响作用按上述酶活性测定法，在pH＝5.7的磷酸缓冲液中添加Ca²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺、Fe²⁺，使其终浓度达到0.02M。按上述测定方法对酶活性进行测定。以未加金属离子的处理为对照，设定其相对酶活力为100％。金属离子对酶活力的影响作用如图4所示。Ca²⁺对本发明的低温果胶酶具有激活作用，Cu²⁺、Hg²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺对酶活性具有不同程度的抑制作用，其余金属离子对低温果胶酶无明显的激活或抑制作用。

Claims (8)

1、一种具有产生低温果胶酶能力的指甲隐球酵母菌(Cryptococcusnuiguttulatus)CGMCC.No.1472。

2、一种低温果胶酶的生产方法，其包括，

A：对指甲隐球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)CGMCC.No.1472进行菌种活化培养步骤；

B：利用步骤A获得的活化菌种进行发酵步骤。

3、如权利要求2所述的生产方法，其特征在于，所述的活化菌种进行发酵步骤中的发酵培养基中，最优碳源为葡萄糖、桔皮粉；最优氮源为蛋白胨、酵母膏；其中，葡萄糖使用量为0.2-1.5％，桔皮粉使用量为0.5-1.0％，酵母膏与蛋白胨使用量均在0.1-0.5％；

以上％为W/V。

4、如权利要求2所述的生产方法，其特征在于发酵步骤中，接种量按体积比为1％-15％，发酵温度15℃-25℃，生长pH范围为5-7，转速为150-200rpm，发酵周期48-80小时。

5、一种低温果胶酶，其利用权利要求1所述的指甲隐球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)CGMCC.No.1472，由权利要求2所述的生产方法制备而成。

6、如权利要求5所述的低温果胶酶，其特征在于，该低温果胶酶具有高的热稳定性，在5℃-40℃范围内均有酶学活性，并在5℃仍可保持60％的相对酶活性；在20℃和30℃保温12小时，其酶活性不发生衰褪，在pH3.5—7.4范围内均有酶学活性。

7、如权利要求6所述的低温果胶酶，其特征在于，最适酶解温度为20℃，最适酶解pH5.8。

8、如权利要求6所述的低温果胶酶，其特征在于，金属离子对低温果胶酶的活性有影响作用，其中Ca²⁺对该低温果胶酶具有激活作用，Cu²⁺、Hg²⁺、Fe³⁺、Ba²⁺、Fe²⁺、Pb²⁺对其酶学活性具有抑制作用。

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