CN103503924A - 一种尖孢镰刀菌菌剂的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种尖孢镰刀菌菌剂的制备方法与应用，该菌剂以尖孢镰刀菌为母菌剂，并在固体培养基中接入尖孢镰刀菌的发酵液进行固体发酵，发酵后的产物经粉碎后与硅藻土、噻唑膦颗粒充分混合均匀，制成菌剂。本发明的有益效果为：尖孢镰刀菌可以在植物体内定殖，但对植物不致病，为内生生防菌，在防治根结线虫上具有独特的优势，另外由于内寄生特性使得菌株受到外界其他微生物竞争作用较小，有利于稳定的发挥防效，可以直接利用尖孢镰刀菌对根结线虫的防治作用，并与噻唑膦进行配合使用，既能有效的控制蔬菜根结线虫危害，同时可以显著降低噻唑膦使用量，又可以促进作物生长，实现蔬菜的高产、安全、无公害生产。

Description

一种尖孢镰刀菌菌剂的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体而言，涉及一种尖孢镰刀菌菌剂的制备方法与应用。 

背景技术

目前我国黄瓜、番茄等作物普遍出现根结线虫病，尤其在设施栽培中发病更为严重，每年对各种农作物造成的损失达到几十亿美元。根结线虫侵染后，在作物根部形成根结，根部吸收功能被破坏，造成作为的地上部矮小、黄化甚至叶片脱落。 

由于抗根结线虫病的种质资源稀少，所以相关技术中防治根结线虫的重要措施是化学防治，如灭线磷、溴化钾和百亩威等。这些药剂虽然杀虫快，但是会严重降低蔬菜质量，污染环境，破坏生态平衡，因此生物防治措施日益受到人们的关注。国外已经利用少孢节丛孢菌开发成商品菌剂, 另外也出现了利用巴斯德杆菌防治南方根结线虫的研究，这些捕食真菌和寄生性细菌在土壤中可以有效的防治线虫，但是捕食性真菌对于线虫的捕食是非选择性，而巴斯德杆菌为专性寄生等特性都限制其高效发展，所以人们开始寻求内寄生于植物的真菌来防治线虫。 

镰刀菌和根结线虫都是作物的重要病原物，这两种病原物之间在寄主植物中存在着非常复杂的互作关系，植物寄生性线虫通常能够促进植物病原菌的侵染及扩展，从而引起严重的病害。然而，一些非致病性性的菌株被认为是内寄生性的共生菌，它们能在许多植物的根组织中定植，但是并不引起病害，而且能够增加植物对真菌病害及植物寄生线虫的抗性，镰刀菌即是其中之一。镰刀菌普遍存在于土壤中，广泛分布世界各地，是植物的致病菌，然而在土壤中，大量的菌株是非致病的，在土壤中起着未知作用。尖孢镰刀菌是根结线虫的拮抗菌，作为线虫生防菌具有巨大潜力，有关研究表明，镰刀菌可以产生某些代谢产物毒杀卵粒，再定植于卵，影响其发育，由于内寄生特性使得菌株受到外界其他微生物竞争作用较小，所以有利于稳定的发挥防效。但是目前这种防治黄瓜根结线虫病的尖孢镰刀菌菌剂的制备方法往往使用大量的噻唑膦来配合制成，使用大量的噻唑膦将带来很高的经济成本，不适合大规模的生产，防治根结线虫的效果差。 

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种尖孢镰刀菌菌剂的制备方法与应用。 

为达到上述目的，本发明实施例中提供了一种尖孢镰刀菌菌剂的制备方法，该制备方法包括以下步骤： 

（1）菌种培养：将黄瓜根系内部的非致病尖孢镰刀菌经过纯化后作为母菌剂，并在25-28℃的条件下，将此菌剂在121℃灭菌20-30分钟后的平板培养基中培养3-5天；

（2）发酵液制备：液体培养基经过高压湿热灭菌后，接入步骤（1）中培养的尖孢镰刀菌，然后在温度范围为25-28℃的条件下搅拌培养7-10天，培养后得到尖孢镰刀菌液作为发酵液；

（3）发酵培养：将固体培养基装入发酵瓶中，并在温度为121℃的条件下灭菌60-90分钟，然后接入步骤（2）中生成的发酵液，充分混匀，在温度范围为25-28℃的条件下发酵培养7-10天；

（4）菌剂的制备：将发酵培养后的产物干燥后，粉碎成粉状物，加入等质量的硅藻土进行混合，然后加入质量百分比为1%的噻唑膦颗粒作为增效剂，充分混合均匀后，形成尖孢镰刀菌制剂。

进一步的，步骤（1）中所述的平板培养基包括马铃薯200g、葡萄糖20g以及琼脂17g，并用蒸馏水配置，定容至1000 mL。 

进一步的，步骤（2）中所述的液体培养基包括马铃薯200g和葡萄糖20g，并用蒸馏水配置，定容至1000 mL。 

优选的，步骤（2）中，搅拌速度为170-220 r/min。 

进一步的，步骤（3）中，所述固体培养基包括草炭1000克、磷酸二氢钾20g、硫酸镁20克； 

先将磷酸二氢钾和硫酸镁溶于水中，再将其与草炭进行混合，制成固体培养基。

优选的，步骤（3）中，所述固体培养基与接入的发酵液的重量比为10:1。 

本发明还提供了尖孢镰刀菌菌剂的应用，该菌剂在制备毒杀蔬菜作物根结线虫药物中的应用。 

进一步的，将该菌剂在苗木移栽前均匀的沟施、穴施或撒施于土壤中，施量为10-20公斤/亩，用于防治根结线虫。 

本发明的有益效果为：（1）从健康的黄瓜根内分离到的尖孢镰刀菌，为内生菌，对作物安全无害，菌株经过发酵制成生防菌剂，制作方法简单、实用，适合于不同规模的生产；（2）尖孢镰刀菌的固体发酵原料主要为草炭粉，来源丰富、价格低廉，在使用过程中既可以保障菌株的活性，并可以促进作物的生长，改良土壤的结构；（3）本发明制备尖孢镰刀菌生防制剂可以与杀线虫剂噻唑膦复合使用，二者具有协同增效作用，混合使用，可以显著降低噻唑膦的用量，同时又可以达到理想的防治效果。噻唑膦的使用可以快速降低土壤中根结线虫的基数，而尖孢镰刀菌的应用又可以有效的持久抑制根结线虫的发生，实现了无污染、安全、高效的防治措施，黄瓜、番茄等根结线虫的防治效果可以达到75%以上。 

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。 

本发明提供了一种尖孢镰刀菌菌剂的制备方法，该制备方法包括以下步骤： 

（1）菌种培养：将黄瓜根系内部的非致病尖孢镰刀菌经过纯化后作为母菌剂，并在25-28℃的条件下，将此菌剂在121℃灭菌20-30分钟后的平板培养基中培养3-5天；

（2）发酵液制备：液体培养基经过高压湿热灭菌后，接入步骤（1）中培养的尖孢镰刀菌，然后在温度范围为25-28℃的条件下搅拌培养7-10天，培养后得到尖孢镰刀菌液作为发酵液；

（3）发酵培养：将固体培养基装入发酵瓶中，并在温度为121℃的条件下灭菌60-90分钟，然后接入步骤（2）中生成的发酵液，充分混匀，在温度范围为25-28℃的条件下发酵培养7-10天；

（4）菌剂的制备：将发酵培养后的产物干燥后，粉碎成粉状物，加入等质量的硅藻土进行混合，然后加入质量百分比为1%的噻唑膦颗粒作为增效剂，充分混合均匀后，形成尖孢镰刀菌制剂。

本发明利用尖孢镰刀菌对根结线虫的防治作用，并与噻唑膦进行配合使用，既能有效的控制蔬菜根结线虫危害，同时可以显著降低噻唑膦使用量，又可以促进作物生长，实现蔬菜的高产、安全、无公害生产。 

进一步的，步骤（1）中所述的平板培养基包括马铃薯200g、葡萄糖20g以及琼脂17g，并用蒸馏水配置，定容至1000 mL。 

进一步的，步骤（2）中所述的液体培养基包括马铃薯200g和葡萄糖20g，并用蒸馏水配置，定容至1000 mL。 

优选的，步骤（2）中，搅拌速度为170-220 r/min。搅拌速度增大了发酵速度，使菌体与培养将充分接触，缩短了发酵周期；搅拌过快将导致菌体与培养基的接触时间短，菌体不能充分发酵；搅拌过慢将延长发酵的时间。 

进一步的，步骤（3）中，所述固体培养基包括草炭1000克、磷酸二氢钾20g、硫酸镁20克； 

先将磷酸二氢钾和硫酸镁溶于水中，再将其与草炭进行混合，制成固体培养基。采用草炭为培养基的主要成分，价格低廉，节省了制备成本，节约能源。

优选的，步骤（3）中，所述固体培养基与接入的发酵液的重量比为10:1。对固体发酵做进一步的限定，在固体培养基中接入质量为固体培养基10%的发酵液完全可以实现菌剂的发酵，过高则会使菌体的发酵液浪费，过低则会使菌剂中的母菌剂不足，从而达不到毒杀蔬菜作物中根结线虫的效果。 

上述实施例中所述的菌剂是由健康的黄瓜根内分离得到的尖孢镰刀菌为内生菌，对作物安全无害，菌株经过发酵制成生防菌剂，制作方法简单、实用，适合于不同规模的生产；尖孢镰刀菌的固体发酵原料主要为草炭，来源丰富、价格低廉，在使用过程中既可以保障菌株的活性，并可以促进作物的生长，改良土壤的结构；本发明制备尖孢镰刀菌生防制剂可以与杀线虫剂噻唑膦复合使用，二者具有协同增效作用，混合使用，可以显著降低噻唑膦的用量，同时又可以达到理想的防治效果。噻唑膦的使用可以快速降低土壤中根结线虫的基数，而尖孢镰刀菌的应用又可以有效的持久抑制根结线虫的发生，实现了无污染、安全、高效的防治措施，黄瓜、番茄等根结线虫的防治效果可以达到75%以上。 

本发明还提供了尖孢镰刀菌菌剂的应用，该菌剂在制备毒杀蔬菜作物根结线虫药物中的应用。 

进一步的，将该菌剂在苗木移栽前均匀的沟施、穴施或撒施于土壤中，施量为10-20公斤/亩，用于防治根结线虫。 

上述实施例中，尖孢镰刀菌可以在植物体内定殖，但对植物不致病，为内生生防菌，在防治根结线虫上具有独特的优势，另外由于内寄生特性使得菌株受到外界其他微生物竞争作用较小，有利于稳定的发挥防效，所以可以直接利用尖孢镰刀菌对根结线虫的防治作用，并与噻唑膦进行配合使用，既能有效的控制蔬菜根结线虫危害，同时可以显著降低噻唑膦使用量，又可以促进作物生长，实现蔬菜的高产、安全、无公害生产。 

实施例1：将尖孢镰刀菌菌株fus-1的菌丝体接种到平板培养基上，培养基配方为PDA培养基，该培养基包括马铃薯200g、葡萄糖20g以及琼脂17g，并用蒸馏水配置，定容至1000 mL。将此培养基在121℃灭菌20分钟后，接种镰刀菌Fus-1，并在温度为25℃的条件下培养3天，获得活化菌种。 

将活化的fus-1菌种接种到250 ml的三角瓶中，每瓶含有PDA液体培养基125ml，在25℃中以170 r/min的搅拌速度培养7天，得到大量的菌丝体和分生孢子。液体培养基配方为马铃薯200g、葡萄糖20g，并用蒸馏水配置，定容至1000 mL。 

将上述发酵液接入固体培养基中，充分混匀，在25℃下发酵培养7天，固体培养基上布满白色菌丝和孢子即可。所述固体培养基包括草炭1000克、磷酸二氢钾20g、硫酸镁20克；先将磷酸二氢钾和硫酸镁溶于水中，再将其与草炭进行充分的混合，制成固体培养基，固体发酵培养基装入发酵瓶中，在121℃下灭菌90分钟。 

将发酵培养后的产物在常温下干燥后，粉碎成粉状物，加入等比例的硅藻土进行混合，然后加入质量百分比为1%的噻唑膦颗粒作为增效剂，充分混合均匀后，形成尖孢镰刀菌制剂。 

实施例2： 将尖孢镰刀菌菌株fus-1的菌丝体接种到平板培养基上，培养基配方为PDA培养基，该培养基包括马铃薯200g、葡萄糖20g以及琼脂17g，并用蒸馏水配置，定容至1000 mL。将此培养基在121℃灭菌30分钟后，接种镰刀菌Fus-1，并在温度为28℃的条件下培养5天，获得活化菌种。 

将活化的fus-1菌种接种到250 ml的三角瓶中，每瓶含有PDA液体培养基125ml，在28℃中以220 r/min的搅拌速度培养10天，得到大量的菌丝体和分生孢子。液体培养基配方为马铃薯200g、葡萄糖20g，并用蒸馏水配置，定容至1000 mL。 

将液体扩繁的发酵液接入固体培养基中，充分混匀，在28℃下发酵培养10天，固体培养基上布满白色菌丝和孢子即可。所述固体培养基包括草炭1000克、磷酸二氢钾20g、硫酸镁20克；先将磷酸二氢钾和硫酸镁溶于水中，再将其与草炭进行充分的混合，制成固体培养基，固体培养基装入发酵瓶中，在121℃下灭菌90分钟。 

将发酵培养后的产物在常温下干燥后，粉碎成粉状物，加入等比例的硅藻土进行混合，然后加入质量比为1%的噻唑膦颗粒作为增效剂，充分混合均匀后，形成尖孢镰刀菌制剂。 

实施例3：尖孢镰刀菌的发酵液毒杀根结线虫病的实验 

将尖孢镰刀菌的发酵液及其稀释5倍、10倍、20倍以及100倍的尖孢镰刀菌的发酵液分别处理根结线虫，测定尖孢镰刀菌的发酵液对根结线虫的杀死效果。具体实验包括以下步骤：

（1）分别取部分上述三种发酵液，在转速为1000 r/min的条件下离心10分钟，取上清液进行杀线虫药效试验。

（2）制备试验用线虫，采自中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室，将辣椒根系取出，用水轻轻冲洗，小心取下乱开，放在1%的次氯酸钠中消毒3分钟，再用无菌水冲洗3次，放在含有少量无菌水的培养皿中，在25℃恒温箱中培养，每隔24小时收集一次孵化的根结线虫幼虫。 

（3）具体实验方法：在无菌的细胞培养板上，分别向孔内加入不同浓度的发酵液1mL ，并以无菌水作为空白对照，然后分别向发酵液和无菌水中加入100μl的根结线虫悬浮液（含有100条根结线虫），放在室温下24小时，观察根结线虫的死亡情况，计算死亡率，即为杀线虫效果。试验结果，测定不同浓度的发酵液对根结线虫的毒力效果，如表1所示： 

表1 不同浓度发酵液对根结线虫的杀死效果

结果表明不同发酵液倍数对线虫的作用效果不同，发酵液原液的作用根结线虫的校正死亡率为96.5%，发酵液稀释后防治效果明显降低在5倍稀释液中杀线虫为85.7%，发酵液稀释后防治效果明显降低在10倍稀释液中杀线虫为33.2%，发酵液稀释后防治效果明显降低在20倍稀释液中杀线虫为12.1%，而在100倍稀释液中线虫死亡率与对照没有差异均为1.1%，试验说明发酵液在高浓度下具有良好的防治根结线虫效果。

实施例4：尖孢镰刀菌菌剂防治根结线虫病的实验 

制备尖孢镰刀菌菌剂，菌剂在苗木移栽前均匀的沟施、穴施或撒施于土壤中，施量为10-20公斤/亩，并在6周后检测根结数量，计算防治效果，具体实验包括以下步骤：

（1）选择根结线虫发生较为严重的田块进行试验，首先将土地做垄起沟，然后将生防菌制剂均匀的撒施到要移栽苗木的位置，用量为每亩10-20公斤。并以未处理的土壤为阴性对照，以10%的噻唑膦颗粒剂为药剂处理对照。

（2）在处理7天后将黄瓜苗木移栽到处理好好的穴位中，并按照正常管理进行，在种植7周后对根结线虫发生情况进行检测，分析每个处理的根结线虫指数，计算防治效果。监测分为三个小区，每个小区30株苗木。实验结果如表2所示： 

表2 尖孢镰刀菌菌剂防治根结线虫效果 

由上述实验所得，通过试验可以看出在尖孢镰刀菌处理后黄瓜植株上的根结线虫数量显著降低，达到27.2%， 化学药剂噻唑膦的根结线虫指数为17.5%，而对照为85.6%。当使用尖孢镰刀菌菌剂后，防治效果显著提高防治效果，由原来的68.2% 提高到了79.1%，防治效果增加了10.9%，与化学杀菌剂噻唑膦79.5%的防治效果相近，说明生防菌剂可以有效的防治黄瓜根结线虫，同时与化学杀根结线虫剂混用，既可以提高防治效果，同时可以显著降低农药用量。在农业生产，特别是设施黄瓜栽培中防治根结线虫病具有重要价值。

尖孢镰刀菌及其发酵产物在室内及田间对根结线虫均具有良好的防治效果，且尖孢镰刀菌可以在植物体内定殖，但对植物不致病，为内生生防菌，在防治根结线虫上具有独特的优势，首先由于内寄生特性使得菌株受到外界其他微生物竞争作用较小，有利于稳定的发挥防效；噻唑膦颗粒剂是防治植物寄生性线虫的化学药剂，具有触杀和内吸作用，毒性较低，符合农产品出口标准，对根结线虫，根腐线虫有特效，在中国已取得了在黄瓜，番茄，西瓜上的登记，可广泛应用于蔬菜，香蕉，果树，药材等作物；将尖孢镰刀菌与噻唑膦进行协同作用制成尖孢镰刀菌菌剂，该菌剂应用具有双重增效作用，降低农药使用量，使作物生产实现安全、无污染。 

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (8)

1.一种尖孢镰刀菌菌剂的制备方法，其特征在于：该制备方法包括以下步骤：

（1）菌种培养：将黄瓜根系内部的非致病尖孢镰刀菌经过纯化后作为母菌剂，并在25-28℃的条件下，将此菌剂在121℃灭菌20-30分钟后的平板培养基中培养3-5天；

（2）发酵液制备：液体培养基经过高压湿热灭菌后，接入步骤（1）中培养的尖孢镰刀菌，然后在温度范围为25-28℃的条件下搅拌培养7-10天，培养后得到尖孢镰刀菌液作为发酵液；

（3）发酵培养：将固体培养基装入发酵瓶中，并在温度为121℃的条件下灭菌60-90分钟，然后接入步骤（2）中生成的发酵液，充分混匀，在温度范围为25-28℃的条件下发酵培养7-10天；

（4）菌剂的制备：将发酵培养后的产物干燥后，粉碎成粉状物，加入等质量的硅藻土进行混合，然后加入质量百分比为1%的噻唑膦颗粒作为增效剂，充分混合均匀后，形成尖孢镰刀菌制剂。

2.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌菌剂，其特征在于：步骤（1）中所述的平板培养基包括马铃薯200g、葡萄糖20g以及琼脂17g，并用蒸馏水配置，定容至1000 mL。

3.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌菌剂，其特征在于：步骤（2）中所述的液体培养基包括马铃薯200g和葡萄糖20g，并用蒸馏水配置，定容至1000 mL。

4.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌菌剂，其特征在于：步骤（2）中，搅拌速度为170-220r/min。

5.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌菌剂，其特征在于：步骤（3）中，所述固体培养基包括草炭1000克、磷酸二氢钾20g、硫酸镁20克；

先将磷酸二氢钾和硫酸镁溶于水中，再将其与草炭进行混合，制成固体培养基。

6.根据权利要求5所述的尖孢镰刀菌菌剂，其特征在于：步骤（3）中，所述固体培养基与接入的发酵液的重量比为10:1。

7.权利要求1所述的尖孢镰刀菌菌剂的应用，其特征在于：该菌剂在制备毒杀蔬菜作物根结线虫药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的尖孢镰刀菌菌剂的应用，其特征在于：将该菌剂在苗木移栽前均匀的沟施、穴施或撒施于土壤中，施量为10-20公斤/亩，用于防治根结线虫。