CN102888356A - 一种枯草芽孢杆菌、利用此菌制备的微生物肥料及其制备方法以及此微生物肥料的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），于2012年7月16日在湖北武汉武昌路珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCM2012287。本发明同时公开了利用此菌制备的微生物肥料及其制备方法以及此微生物肥料在甜瓜种植方面的应用，所述微生物肥料通过促进甜瓜植株和根系的生长发育，增强甜瓜植株的抗病性，而达到降低甜瓜枯萎病的发病率的目的；并且提高了甜瓜的商品瓜产量，且品质有一定的改善。

Description

一种枯草芽孢杆菌、利用此菌制备的微生物肥料及其制备方法以及此微生物肥料的应用

技术领域

本发明属于农用微生物制剂领域，具体涉及一种新的枯草芽孢杆菌及利用此菌制备的微生物肥料及其制备方法，以及此微生物肥料的应用。 

背景技术

甜瓜枯萎病(Fusariumwilt)是危害甜瓜生产的重要土传病害，常午发病率为10％-40％，轻者造成植株生长衰弱、结瓜小而少，重者全株枯死。此病是一种世界性的甜瓜病害，遍布整个欧洲以及美洲、亚洲、非洲等地区，危害叶片、茎蔓和果实。发病初期仅有1或2个蔓失水萎蔫，之后根系变褐腐朽，纵剖根茎部可见维管束已褐，引起整株萎蔫枯死。甜瓜枯萎病由半知菌亚门，丝孢纲，瘤座孢科，镰孢霉属的尖镰孢菌甜瓜专化型(Fusariumaxysporum(Schi.)f.sp.melonisSnyder et Hansen)引起的一种土壤传播，根部侵入，维管束寄生的系统病害。我国新疆是甜瓜(Cucumis melonL.)种植面积最大且品种资源最丰富的地区，但枯萎病的发生严重影响着甜瓜的品质和产量。因枯萎病为土传病害，药剂防治相对困难，并且由于长期用药，病原菌逐渐产生抗药性，且防治效果日益降低，造成土壤的污染。鉴于化学防治对环境的污染和生态平衡，甜瓜枯萎病的生物防治越来越被重视。 

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtiles)是一类好氧内生芽孢的革兰氏阳性细菌，根据菌落形态生理生化特性以及形成芽孢等特点该菌命名为枯草芽孢杆菌。在自然界中广泛存在，不仅在土壤、植物根际、体表等外界环境中广泛存在，同时还是植物体内常见的内生细菌对人畜无毒无害，不污染环境，具有显著的抗菌活性和极强的抗逆能力。枯草芽孢杆菌生长快、营养、简单，能产生耐热抗逆的芽孢，其芽孢具有抗逆性强、利于保藏的特点，又能忍受极端的外部环境，而长 期存活，可以制成粉剂、可湿性粉剂等各种剂型或与化学农药混用而不失活，因此有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中的存活定殖与繁殖而且批量生产工艺简单成本也较低，施用方便，储存期长，是一种理想的生防微生物。国内外学者在枯草芽孢杆菌防治植物病害方面进行了大量研究，一些枯草芽孢杆菌优势菌株已经用于防治植物病害应用中。 

研究认为枯草芽孢杆菌主要通过以下三种方式提高植物对病原菌的抗性：(1)可以在植物根际体表或体内及土壤中快速大量繁衍和定殖，有效地排斥阻止和干扰植物病原微生物在植物上的定殖与侵染从而达到抑菌和防病的效果；(2)产生的抗菌物质，对病原菌有一定的杀灭功效；(3)可产生促植物生长的物质，增强植物和根系的生长发育，增强了植物自身的抗病性，从而间接地减少病害发生。 

如专利号为CN1934241B的中国专利报道了一种具有防治植物病害的拮抗活性的枯草芽孢杆菌菌株，发明人开发了一种可广泛抗植物病害的、具有强抗真菌活性的新微生物杀真菌剂，其枯草芽孢杆菌EB120显示出防治集中植物病害的拮抗活性，包括大麦和黄瓜白粉病、辣椒炭疽病、稻瘟病、番茄灰霉病和小麦叶锈病，显示出良好的应用前景，但对甜瓜枯萎病有无效果尚未报道。又如专利号CN100404664C的专利报道了一株作物青枯病生防枯草芽孢杆菌菌株，该菌株能够抑制青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的生长，并产生拮抗蛋白，可用于作物青枯病防治方面。以上两例主要为枯草芽孢杆菌产生拮抗病菌的物质，拮抗物质直接作用于病菌，达到抗病的功效。而对于枯草芽孢杆菌促生抗病的研究却较少报道。 

研究内容 

本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌以及利用此菌制备的微生物肥料及其制备方法，该微生物肥料可用于甜瓜种植，此肥料通过促进甜瓜植株和根系的生长发育，增强甜瓜植株的抗病性，而达到降低甜瓜枯萎病的发病率的目的。 

本发明通过以下技术方案实现。 

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis G-1），于2012年7月16日在湖北武汉武昌路珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2012287。 

本发明还涉及一种枯草芽孢杆菌微生物肥料，该微生物肥料由枯草芽孢杆菌CCTCC M 2012287经培养发酵后与硅藻土混合、干燥、粉碎而得。 

本发明还涉及所述枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法，其特征在于，由如下方法制备而成： 

1)菌种固体斜面培养：将枯草芽孢杆菌CCTCC M 2012287菌种接入固体斜面，在斜面培养基中培养，温度为30-35℃，培养时间16-24小时； 

2)一级种子液扩大培养：将步骤1)的枯草芽孢杆菌接种到盛有1000ml-级种子液培养基中摇瓶培养16-24小时，培养温度30-35℃，转速200-300转/分； 

3)二级种子液发酵培养：按1％接种量将步骤2)种子液接种到200升种子发酵罐中，培养基采用优化培养基，在30-35℃保温培养16-20个小时，同时辅以转速200-300转/分，通气量0.5-0.8立方米/分钟，进行发酵培养； 

4)三级种子液发酵培养：按10％的接种量将步骤3)的种子液接种到2000升的大发酵罐中，培养基同步骤3)，进行变温变通气量条件下培养，当菌体芽孢形成率达到75％并有20％形成独立芽孢后，发酵过程结束； 

5)微生物肥料的制备：发酵液与硅藻土按质量比5∶2-5∶3混合，将混合物置入隧道式干燥设备内，在70℃干热空气下进行3-4小时干燥，当混合物水分小于5％时烘干结束，粉碎后过100目筛并包装，微生物肥料制备完成。 

本制备方法的优选方案是，所述制备步骤1-4中的培养基均采用以下条件 灭菌，灭菌温度121-125℃，15-20分钟。 

本制备方法的优选方案是，制备步骤4中所述变温变通气量的培养条件为，先30-35℃、通气量0.5-0.8立方米/分钟、培养20小时，再升温到37℃、通气量加大到1.0立方米/分钟、再培养10-12小时，辅以转速200-300转/分进行培养。 

本制备方法的优选方案是，所述制备步骤1)中斜面培养基配方为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，自然pH值。 

本制备方法的优选方案是，所述制备步骤2)中一级种子液培养基配方为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，自然pH值。 

本制备方法的优选方案是，所述制备步骤3)或4)中，培养基采用优化培养基，培养基配方如下，玉米粉1.0-2.0％，麸皮0.1-0.5％，酵母粉0.1-0.5％，磷酸氢二铵0.01-0.05％，磷酸氢二钠0.02-0.08％，磷酸二氢钾0.05-0.08％，硫酸钠0.03-0.05％，硝酸钠0.01-0.05％，硫酸镁0.01-0.05％，硫酸亚铁0.0001-0.0003％，PH值调至7.0-7.2。 

本发明还涉及一种枯草芽孢杆菌微生物肥料的应用，其特征在于，在种植甜瓜过程中，使用上述枯草芽孢杆菌微生物肥料对降低甜瓜枯萎病发病率方面的应用。 

制备得到的微生物肥料含菌数检测方法为，按照常规的稀释平板法检测微生物肥料中的活芽孢菌数，称取干微生物肥料1.0克，加入99毫升无菌水中，进一步稀释，稀释到每毫升中仅有200-1000个，然后取0.1毫升稀释菌液到无菌的固体培养基平板上，进行涂布，在37℃恒温箱内培养24小时，计算培养皿平板上的菌落数，计数平板重复3次，取计数平板上生长的菌落数的平均值，按以下公式计算微生物肥料中的活菌数： 

微生物肥料活芽孢数(个/克)＝平均每个平板菌落数(个)×10×样品稀释倍数 

微生物肥料成品质量要求： 

枯草芽孢杆菌芽孢总含量≥30×10⁸个 

微生物肥料含水量≤5.0％ 

微生物肥料细度：95％以上可过100目筛孔 

本发明与现有技术相比的有益效果是，提供了一种新的枯草芽孢杆菌，利用其制备的微生物肥料可促进甜瓜植株和根系的生长发育，其中甜瓜植株的株高、茎粗以及成品甜瓜的瓜宽、瓜长、单重均有明显增加；并且甜瓜的品质有明显提升、营养成分更高；从而增强了甜瓜植株的抗病性，甜瓜枯萎病的发病率降低50-70％，提高了甜瓜产量、种植效益。 

具体实施方式

本发明涉及的枯草芽孢杆菌（Bacillus  subtilis G-1），已于2012年7月16日在湖北武汉武昌路珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2012287。 

实施例1 

通过以下的方法制备本发明降低甜瓜枯萎病发病率的微生物肥料： 

1、菌种固体斜面培养：斜面培养基配方为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，自然pH值，灭菌条件为125℃、15分钟；将枯草芽孢杆菌CCTCC M 2012287菌种接入固体斜面，培养温度为35℃，培养时间16h； 

2、一级种子液扩大培养：将枯草芽孢杆菌接种到盛有1000ml一级种子液培养基中摇瓶培养16小时，培养温度35℃，转速250转/分；一级种子液培养基配方为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，自然pH值，灭菌条件为125℃、15分钟； 

3、二级种子液发酵培养：按1％接种量接种到200升种子发酵罐中，培养基采用优化培养基，培养基配方如下：玉米粉1.0％，麸皮0.1％，酵母粉0.1％，磷酸氢二铵0.01％，磷酸氢二钠0.02％，磷酸二氢钾0.08％，硫酸钠 0.03％，硝酸钠0.01％，硫酸镁0.01％，硫酸亚铁0.0001％，PH值调至7.0，灭菌条件为125℃、15分钟；在30℃保温培养20个小时，同时辅以转速250转/分，通气量0.5立方米/分钟，进行发酵培养； 

4、三级种子液发酵培养：按10％的接种量接种到2000升的大发酵罐中，三级培养基配方同二级培养基配方，培养条件同二级种子液发酵培养，培养时间为20个小时后，升温到37℃、通气量加大到1.0立方米/分钟，再培养12小时，当菌体芽孢形成率达到75％并有20％形成独立芽孢后，发酵过程结束； 

5、微生物肥料的制备：三级种子液与硅藻土按质量比5∶3混合，将混合物置入隧道式干燥设备内，在70℃干热空气下进行3-4小时干燥，当混合物水分小于5％时烘干结束，粉碎后过100目筛并包装，微生物肥料制备完成。 

实施例2 

通过以下的方法制备本发明降低甜瓜枯萎病发病率的微生物肥料： 

1.菌种固体斜面培养：斜面培养基配方为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，自然pH值，灭菌条件为123℃、18分钟；将枯草芽孢杆菌CCTCC M 2012287菌种接入固体斜面，培养温度为35℃，培养时间16h； 

2.一级种子液扩大培养：将枯草芽孢杆菌接种到盛有1000ml一级种子液培养基中摇瓶培养20小时，培养温度30℃，300转/分；一级种子液培养基配方为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，自然pH值，灭菌条件为123℃、18分钟； 

3.二级种子液发酵培养：按1％接种量接种到200升种子发酵罐中，培养基采用优化培养基，培养基配方如下：玉米粉1.5％，麸皮0.5％，酵母粉0.3％，磷酸氢二铵0.05％，磷酸氢二钠0.05％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸钠0.03％，硝酸钠0.01％，硫酸镁0.03％，硫酸亚铁0.0003％，PH值调至7.0，灭菌条件为123℃、18分钟；在30℃保温培养20个小时，同时辅以转速200 转/分，通气量0.6立方米/分钟，进行发酵培养； 

4.三级种子液发酵培养：按10％的接种量接种到2000升的大发酵罐中，三级培养基配方同二级培养基配方，培养条件同二级种子液发酵培养，培养时间为20个小时后，升温到37℃、通气量加大到1.0立方米/分钟，再培养10小时，当菌体芽孢形成率达到75％并有20％形成独立芽孢后，发酵过程结束； 

5.微生物肥料的制备：发酵液与硅藻土按质量比2∶1混合，将混合物置入隧道式干燥设备内，在70℃干热空气下进行3-4小时干燥，当混合物水分小于5％时烘干结束，粉碎后过100目筛并包装，微生物肥料制备完成。 

实施例3 

通过以下的方法制备本发明降低甜瓜枯萎病发病率的微生物肥料： 

1、菌种固体斜面培养：斜面培养基配方为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，自然pH值，灭菌条件为121℃、20分钟；将枯草芽孢杆菌CCTCC M 2012287菌种接入固体斜面，培养温度为30℃，培养时间24h； 

2、一级种子液扩大培养：将枯草芽孢杆菌接种到盛有1000ml一级种子液培养基中摇瓶培养16小时，培养温度35℃，转速300转/分；一级种子液培养基配方为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，自然pH值，灭菌条件为121℃、20分钟； 

3、二级种子液发酵培养：按1％接种量接种到200升种子发酵罐中，培养基采用优化培养基，培养基配方如下：玉米粉2.0％，麸皮0.1％，酵母粉0.1％，磷酸氢二铵0.05％，磷酸氢二钠0.08％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸钠0.05％，硝酸钠0.05％，硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.0001％，PH值调至7.2，灭菌条件为121℃、20分钟；在35℃保温培养16个小时，同时辅以转速300转/分，通气量0.8立方米/分钟，进行发酵培养； 

4、三级种子液发酵培养：按8％的接种量接种到2000升的大发酵罐中，三级培 养基配方同二级培养基配方，培养条件同二级种子液发酵培养，培养时间为20个小时后，升温到37℃、通气量加大到1.0立方米/分钟，再培养10小时，当菌体芽孢形成率达到75％并有20％形成独立芽孢后，发酵过程结束； 

5、微生物肥料的制备：发酵液与硅藻土按质量比2∶1混合，将混合物置入隧道式干燥设备内，在70℃干热空气下进行3-4小时干燥，当混合物水分小于5％时烘干结束，粉碎后过100目筛并包装，微生物肥料制备完成。 

实施例4 

通过以下的方法制备本发明降低甜瓜枯萎病发病率的微生物肥料： 

1、菌种固体斜面培养：斜面培养基配方为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，自然pH值；将枯草芽孢杆菌CCTCC M 2012287菌种接入固体斜面，培养温度为35℃，培养时间20h； 

2、一级种子液扩大培养：将枯草芽孢杆菌接种到盛有1000ml一级种子液培养基中摇瓶培养24小时，培养温度30℃，转速200转/分；一级种子液培养基配方为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，自然pH值； 

3、二级种子液发酵培养：按1％接种量接种到200升种子发酵罐中，培养基采用优化培养基，培养基配方如下：玉米粉1.0％，麸皮0.3％，酵母粉0.5％，磷酸氢二铵0.05％，磷酸氢二钠0.05％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸钠0.03％，硝酸钠0.01％，硫酸镁0.03％，硫酸亚铁0.0003％，PH值调至7.0；在30℃保温培养20个小时，同时辅以转速300转/分，通气量0.8立方米/分钟，进行发酵培养； 

4、三级种子液发酵培养：按10％的接种量接种到2000升的大发酵罐中，三级培养基配方同二级培养基配方，培养条件同二级种子液发酵培养，培养时间为20个小时后，升温到37℃、通气量加大到1.0立方米/分钟，再培养12小时，当菌体芽孢形成率达到75％并有20％形成独立芽孢后，发酵过程结束； 

5、微生物肥料的制备：发酵液与硅藻土按质量比5∶2混合，将混合物置入隧道 式干燥设备内，在70℃干热空气下进行3-4小时干燥，当混合物水分小于5％时烘干结束，粉碎后过100目筛并包装，微生物肥料制备完成。 

实施例5盆栽试验与田间试验验证 

1、盆栽试验 

设置盆栽试验，种植甜瓜，设置2个处理，处理1为在甜瓜植株双叶期将本发明制备的枯草芽孢杆菌肥料稀释100倍，采用罐根方式，每株苗施入稀释液30ml；处理2为施入30ml清水对照，盆栽培养15天，测定甜瓜苗的株高、根长、茎粗、根干物质量、地上部分干物质量。 

如表1所示，试验结果表明稀释100倍的枯草芽孢杆菌肥料能明显提高根长，增加幅度16.03％，与对照比较达到极显著差异(P＜0.01)；茎粗增加幅度6.54％，与对照比较达到显著性差异(P＜0.05)；根干重增幅达36.4％，达到极显著性差异(P＜0.01)；枯草芽孢杆菌肥料处理的冠根比远小于对照，这说明枯草芽孢杆菌肥料处理能促进甜瓜根系的生长。 

表1枯草芽孢杆菌肥料对甜瓜植株苗期生长的影响 

2、田间试验(以2010.8月-2010午12月试验为例) 

(1)试验设置 

2010午8月15日进行定植。试验共设置3个处理，其中A处理施入4kg/亩枯草芽孢杆菌微生物肥料，B处理施入8kg/亩枯草芽孢杆菌微生物肥料，以不施微生物肥料为对照处理。以上3个处理按每小区面积0.3亩布置排，三次重复，施肥方式：基施(肥料上起垄)。统计与调查瓜苗株高、茎粗、瓜长、瓜宽、发病率、单果重、商品瓜产量、及品质分析(维生素C、可溶性糖、可滴定酸、可 溶性固形物)，并进行经济效益分析。 

(2)结果与分析 

①微生物肥料对甜瓜植株及果实生长的影响 

在定植45d时，株高分别为92.2、94.5、87.8cm，其中施用枯草芽孢杆菌微生物肥料均能够增加甜瓜植株的株高(见表2)，并且A、B处理与对照达到显著性差异(P＜0.05)。各处理茎粗分别为10.75、10.68、10.20mm，其中施用枯草芽孢杆菌微生物肥料均能够提高甜瓜植株的茎粗，增幅分别为5.39、4.71％，施肥处理植株茎粗与对照达到显著差别(P＜0.05)。各处理的甜瓜瓜长分别为18.52、17.69、17.00cm，各处理较对照瓜长提高1.52、0.69cm，增幅分别为8.94％、4.05；但A、B处理与对照比较没有达到显著性差异(P＞0.05)。各处理的瓜长分别为17.31、16.89、16.94cm，B处理较对照增加了0.37cm，但没有达到显著性差异(P＞0.05)。A处理表现为与对照之间比较差别不大。对照、A、B各处理的单果重分别为2.286、2.196、2.025kg，A、B处理较对照分别增加了0.171、0.261kg/个，增幅分别为7.48、12.9％，B施肥与对照达到显著性差异(P＜0.05)。 

表2菌肥对甜瓜植株及果实的影响 

处理	株高	茎粗	瓜宽	瓜长	单重(g)
						8kg	92.2±4.1ab	10.75±0.26b	17.31±1.07a	18.52±1.56a	2.286±0.125b
4kg	94.5±3.2b	10.68±0.31b	16.89±1.36a	17.69±1.21a	2.196±0.217ab
						对照	87.8±2.8a	10.2±0.25a	16.94±0.93a	17.00±0.83a	2.025±0.097a

②微生物肥料对甜瓜品质的影响 

一般，表征甜瓜品质的指标为总糖，维生素C和总糖、可溶性固形物。从表3的测定结果可看出，微生物肥料对于总糖有一定的提高作用，与对照对照相比较，A处理增加0.45、0.22％，但没有达到显著性差异(P＞0.05)。B处理的维生素C比对照增加了2.1mg/100g，增加幅度14.48％，达到显著性差异(P＜0.05)；A、B处理的可溶性固形物较对照均有增加，且与对照比较均达到显著性差异 (P＜0.05)。对照、A、B各处理对可滴定酸含量影响不大(P＞0.05)。 

整体来说，使用微生物肥料提高了甜瓜的可溶性固形物、维生素C含量，改善甜瓜的品质。 

表3甜瓜的品质分析 

③微生物肥料对甜瓜枯萎病发病率的影响 

微生物肥料能大幅度降低瓜类枯萎病的发病率(见表4)，由于该大棚种植甜瓜已经第三茬，虽然采用滴灌系统来控制水量及灌溉方式，但依然发病严重。其中对照收瓜前发病率为35.56％，而A、B施肥分别为15.63、11.19％，下降幅度分别为56.16％、68.53％，与对照达到极显著差异(P＜0.01)。 

表4甜瓜植株发病率统计 

④微生物肥料对甜瓜商品产量的影响及经济效益分析 

甜瓜的商品产量，是指瓜的外观(网纹均匀、色泽均一、无裂口)、品质(糖度)符合商品要求(20元/kg)。从表5可以看出对照、A、B各处理亩商品瓜产量分别为994.8、1043.6kg、810.4/亩，A、B处理较对照增产184.4、233.2kg/亩，增产幅度分别为22.75、28.76％。A、B处理与对照相比达到显著性差异(P＜0.05)。主要原因是对照植株在采前20天发病，并出现植株死亡、早衰，后期甜瓜品象较差，且糖度积累不够，造成甜瓜商品率较低。对照、A、B处理亩 产产值分别为19897.89、20873.0kg/亩，分别扣除肥料成本40、80元，微生物肥料的A、B处理较对照处理平均增加效益3648、4584元/亩。 

表5产量与效益分析 

(3)结论 

枯草芽孢杆菌微生物肥料施肥处理均能够明显降低甜瓜枯萎病的发病率，并且已经进行了三茬连作甜瓜(一午两茬)，提高了甜瓜的商品瓜产量，且品质有一定的改善。 

Claims (9)

1.一种枯草芽孢杆菌（Bacillus  subtilis G-1），其特征在于，所述枯草芽孢杆菌于2012年7月16日在湖北武汉武昌路珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2012287。

2.一种枯草芽孢杆菌微生物肥料，其特征在于，该微生物肥料由枯草芽孢杆菌CCTCC M 2012287经培养发酵后与硅藻上混合、干燥、粉碎而得。

3.权利要求2所述枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法，其特征在于，由如下方法制备而成：

1)菌种固体斜面培养：将枯草芽孢杆菌CCTCC M 2012287菌种接入固体斜面，在斜面培养基中培养，温度为30-35℃，培养时间16-24小时；

2)一级种子液扩大培养：将步骤1)的枯草芽孢杆菌接种到盛有1000ml-级种子液培养基中摇瓶培养16-24小时，培养温度30-35℃，转速200-300转/分；

3)二级种子液发酵培养：按1％接种量将步骤2)种子液接种到200升种子发酵罐中，培养基采用优化培养基，在30-35℃保温培养16-20个小时，同时辅以转速200-300转/分，通气量0.5-0.8立方米/分钟，进行发酵培养；

4)三级种子液发酵培养：按10％的接种量将步骤3)的种子液接种到2000升的大发酵罐中，培养基同步骤3)，进行变温变通气量条件下培养，当菌体芽孢形成率达到75％并有20％形成独立芽孢后，发酵过程结束；

5)微生物肥料的制备：发酵液与硅藻土按质量比5∶2-5∶3混合，将混合物置入隧道式干燥设备内，在70℃干热空气下进行3-4小时干燥，当混合物水分小于5％时烘干结束，粉碎后过100目筛并包装，微生物肥料制备完成。

4.根据权利要求3枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法，其特征在于，所述制备步骤1-4中的培养基均采用以下条件灭菌，灭菌温度121-125℃，15-20 分钟。

5.根据权利要求3枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法，其特征在于，制备步骤4中所述变温变通气量的培养条件为，先30-35℃、通气量0.5-0.8立方米/分钟、培养20小时，再升温到37℃、通气量加大到1.0立方米/分钟、再培养10-12小时，辅以转速200-300转/分进行培养。

6.根据权利要求3枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法，其特征在于，制备步骤1)中斜面培养基配方为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，自然pH值。

7.根据权利要求3枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法，其特征在于，制备步骤2)中一级种子液培养基配方为蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，自然pH值。

8.根据权利要求3枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法，其特征在于，制备步骤3)或4)中，所述优化培养基配方如下，玉米粉1.0-2.0％，麸皮0.1-0.5％，酵母粉0.1-0.5％，磷酸氢二铵0.01-0.05％，磷酸氢二钠0.02-0.08％，磷酸二氢钾0.05-0.08％，硫酸钠0.03-0.05％，硝酸钠0.01-0.05％，硫酸镁0.01-0.05％，硫酸亚铁0.0001-0.0003％，PH值调至7.0-7.2。

9.一种枯草芽孢杆菌微生物肥料的应用，其特征在于，在种植甜瓜过程中，使用权利要求2所述的微生物肥料对降低甜瓜枯萎病发病率方面的应用。