CN103833427A - 一种水溶生物肥料 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水溶生物肥料，其活性成分为枯草芽孢杆菌BacillussubtilisLiu-3菌体，制备步骤为：1）用接菌环取生长在固体培养基上的BacillussubtilisLiu-3菌1环，接入5mL的液体培养基中，35-37℃，300-400r/min，摇床培养20-24h；2）将得到的一级种子培养液5mL，接入1000mL液体培养基中，35-37℃，300-400r/min，摇床培养20-24h；3）将得到的二级种子培养液1000mL，接入30L液体培养基中，35-37℃，200r/min，发酵培养70-72h，发酵液为每mL含有2亿个菌以上。本发明用于大田作物、果树与各种蔬菜瓜果的栽培等；本发明可以促进植物生长和提高作物的产量，具有可观的经济效益和社会效益。

Description

一种水溶生物肥料

技术领域

本发明涉及一种水溶生物肥料。 

背景技术

随着中国农业的集约化、规模化发展，以及水资源的日渐匮乏，滴灌、喷灌节水设施农业面积迅速扩大，水溶性肥料是水肥一体化肥料，也是中国肥料工业和产业未来发展的重点。 

当前，农业生产中使用的水溶性肥料大多数是化学肥料，广施化肥不仅造成了土壤污染，还加重了水体的富营养化污染，甚至影响到地下水和空气。超高量施用化肥也破坏耕地的土壤结构。降低农产品的品质，病虫害发生率提高。同时，化肥生产的超常发展，加速了矿质资源的耗竭。日渐成为威胁农业生产可持续发展的一大问题。我国是世界上使用化肥、农药数量最多的国家。在我国新农村建设和发展中正确引导农民合理调整施肥结构、研制推广肥效明显无污染的新型肥料，以实现农业生产增产增收、改善农产品品质、恢复和提高土壤可持续生产能力，是当前农业生产发展方向。 

一种发展绿色生态农业的方法是使用生物肥料。通过增加土壤有益微生物的数量来提升土壤肥力。本发明的细菌（Bacillus subtilis），特别是Bacillus subtilis Liu-3菌在生长代谢的过程中，产生生长素，植酸酶，磷酸酶等生物活性物质，促进植物根系大量地吸收土壤中的有效磷，促进植物的生长，提高植物干重，增加植物的叶绿素含量，提升绿叶蔬菜的品相。 

发明内容

本发明的目的在于提供了一种水溶生物肥料，用于大田作物，如玉米、小麦、大豆、甘蔗等；用于果树，如桃树、梨树、枣树、苹果树等；用于农业上各种蔬菜瓜果的栽培，如黄瓜、西红柿、小白菜、豆角、茄子、生菜、油麦菜、茼蒿、丝瓜、辣椒、油菜、甜瓜、草莓、葡萄等；本发明可以促进植物生长和提高作物的产量，具有可观的经济效益和社会效益。 

本发明提供的水溶生物肥料是以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Liu-3，菌种保藏编号：CGMCC No.8026。菌种保藏日：2013-08-15，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码是100101）为生物源制备的水溶生物肥料。 

Bacillus subtilis Liu-3的特征为： 

    枯草芽孢杆菌，生物学命名Bacillus subtilis，细胞杆状，大小为 0.3~0.7 X 2.0~3.0 μm, 革兰氏染色阳性，为生芽孢需氧菌，其芽孢的生物学特性为抗热耐干燥，芽孢为椭圆或长桶形，大小为 0.2~0.6 X 1.0~1.5 μm, 位于细胞的中央或近中央。菌落为白，谈黄至黄色。菌落不透明。生长温度为22~55℃，最适温度37℃，最适pH 7.2。在一定的条件下菌体细胞内产生芽孢，可以耐受高温、干燥的不良环境条件。正常情况下可以产生生长素和植酸酶等生物活性物质。

水溶生物肥料的制备步骤为： 

1）取Bacillus subtilis Liu-3菌的液体培养基：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠3g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。

用接菌环取生长在固体培养基 （固体培养基：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠3g/L，琼脂20 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。） 上的bacillus Liu-3菌1环，接入5mL上述液体培养基（酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠3g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。） 35-37℃，300-400r/min，摇床培养20-24h。将此培养液称为一级种子培养液。 

2）将上述一级种子培养液5mL，接入1000 mL上述液体培养基 （酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠3g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。） 中，35-37℃，300-400r/min，摇床培养20-24h。将此培养液称为二级种子培养液。 

3）将上述二级种子培养液1000 mL，接入30L液体培养基 （酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠3g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。） 中，35-37℃，200r/min，在发酵罐内发酵培养70-72h。发酵液为每mL含有2亿个菌以上，取出发酵液，灌装，备用。 

本发明提供的一种水溶生物肥料，用于大田作物，如玉米、小麦、大豆、甘蔗等；用于果树，如桃树、梨树、枣树、苹果树等；用于农业上各种蔬菜瓜果的栽培，如黄瓜、西红柿、小白菜、豆角、茄子、生菜、油麦菜、茼蒿、丝瓜、辣椒、油菜、甜瓜、草莓、葡萄等；本发明可以促进植物生长和提高作物的产量，具有可观的经济效益和社会效益。 

附图说明

图1 生长素标准曲线。 

图2 Bacillus subtilis Liu-3 菌的菌液生长素的测定结果。 

图3 植酸酶的测定结果。 

图4盆栽玉米的株高测定结果。 

图5盆栽玉米的干重测定结果。 

图6盆栽玉米土壤中生长素的测定结果。 

图7盆栽玉米土壤中有效磷的测定结果。 

图8盆栽玉米土壤中磷酸酶活性的测定结果。 

图9水溶生物肥料促进黄瓜（新夏1号）苗生长的效果（n=50, P<0.05)。 

图10 水溶生物肥料促进茼蒿叶绿素含量增加的效果。 

  

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，实施例仅为解释性的，决不意味着它以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1 

Bacillus subtilis Liu-3的筛选

取天津市西青区精武镇种植玉米的耕层土壤，取土壤的方法为五点取样法。将5个取样点的5份土壤混合，称取10ｇ混合土壤，放入250mL无菌三角瓶内，加入90mL无菌水，置于恒温震荡培养箱，37℃，180r/min，震荡30min，取出，得到土壤微生物混悬液。取土壤混悬液1mL加入无菌水9mL，制成10mL10^-2倍的土壤微生物悬液，继续将土壤微生物悬液稀释成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6倍稀释的土壤微生物悬液，取各种浓度的土壤微生物悬液200μL涂布于培养皿内固体培养基（固体培养基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，琼脂20 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。）上，每个浓度3次重复，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱。分别在培养1d、2d、3d时，挑取单菌落细菌。共挑取100个单菌落，用接菌环分别接种在新鲜的固体培养基（固体培养基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3g /L，琼脂20 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。）上，37℃培养24h。得上述单菌落固体培养物共100个，将这100个固体培养物依次编号，分别记为Bacillus Liu-1；Bacillus Liu-2； Bacillus Liu-3；...... ；Bacillus Liu-100。

在每一个固体培养物中，用接菌环取菌一环，转接液体培养基（酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。）10mL，37℃，400r/min，摇床培养24h。培养结束以后，分别测定培养液中生长素和植酸酶的含量，从中确定出生长素和植酸酶同时高含量的培养液，按照编号找出其来源的单菌落固体培养物。实验结果显示Bacillus Liu-3的培养液中同时具有高含量的生长激素和植酸酶，所以筛选出编号为Bacillus Liu-3的单菌落固体培养物。用接菌环将编号为Bacillus Liu-3的单菌落固体培养物转接在新鲜的固体培养基（固体培养基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，琼脂20 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。）上， 37℃培养24h，培养结束将其命名为Bacillus Liu-3菌株。保存备用。 

Bacillus Liu-3菌株的特征 

（1）革兰氏染色检验

采用细菌革兰氏染色法进行染色观察，Bacillus Liu-3菌体着色，呈现紫色。为革兰氏染色阳性。

（2）菌体形态特征 

将Bacillus Liu-3菌接种在固体培养基（固体培养基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，琼脂20 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。）上， 37℃培养，菌体为杆状。37℃培养12h，菌体能运动，鞭毛周生。37℃培养24h后产生芽孢，芽孢中生，椭圆形，孢囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴孢晶体。

（3）群体生长特征 

在固体平板培养基（固体培养基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，琼脂20 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。）上，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘不整齐，表面干燥有褶皱；在固体斜面培养基（固体培养基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，琼脂20 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。）上划线培养，呈直线形；在液体培养基（液体培养基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。）中静止培养，表面成白色菌膜。

（4）生理生化特征 

将Bacillus Liu-3菌株与枯草芽孢杆菌标准菌株1504（中国菌种保藏管理委员会）在相同的实验条件下进行生理生化性状检测。结果（见表1）Bacillus Liu-3菌株的生理生化特征与枯草芽孢杆菌标准菌株1504相同，说明BAB-1菌株属于一种枯草芽孢杆菌。

表1 Bacillus Liu-3菌株的生理生化鉴定结果 

注：“+”阳性结果，“-”阴性结果。

细菌常规鉴定手册『《一般细菌常用鉴定方法》（中国科学院微生物细菌研究细菌分类组编.科学出版社，1978年），《芽孢杆菌属》（蔡妙英等译.农业出版社，1988年）和《微生物分类学》（张继忠.上海复旦大学出版社，1995）等）』显示枯草芽孢杆菌可运动，革兰氏阳性，芽孢椭圆形或柱状、中生或偏中，接触酶试验阳性，V-P试验阳性，7%-10%氯化钠中生长，从葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇产酸，水解淀粉，利用柠檬酸盐作为碳源，还原硝酸盐，解酪素，卵黄反应阴性，在葡萄糖和酪氨酸琼脂上不形成黑色素，不利用丙酸盐，不分解酪氨酸等特点。将以上Bacillus Liu-3菌株的部分生理生化性状检测结果与枯草芽孢杆菌标准菌株相比较，根据《一般细菌常用鉴定方法》，《芽孢杆菌属》和《微生物分类学》的检索表进行检索，确定菌株Bacillus Liu-3生理生化性状与枯草芽孢杆菌相应性状吻合。鉴定Bacillus Liu-3菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。 

故将Bacillus Liu-3菌株重新命名为Bacillus subtilis Liu-3。 

Bacillus subtilis Liu-3菌的测定结果 

1）取Bacillus subtilis Liu-3菌的液体培养基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。

2) 用接菌环取生长在固体培养基（固体培养基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，琼脂20 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。）上的Bacillus subtilis Liu-3菌1环，接入5mL上述液体培养基（酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。）， 37℃，400r/min，摇床培养。 

3) 采用Salkowski（Michael Lcbuhn, Anton Wartmm.Method for the determination of indole-3-acetic acid and related compounds of t-tryptophan catabolism in soils[J].Journal of Chromatography, 1993, 62(9): 255-266.）方法，每隔24h测定一次菌悬液中生长素（indole-3-acetic acid, 简称为IAA）的含量。生长素标准曲线的绘制：准确称取生长素1mg，溶于100mL去离子水中，依次稀释为2.5, 5.0, 7.5和10μg/mL的生长素溶液，同待测物质同时进行反应，于535nm波长测定吸光值，以吸光值为纵坐标，以生长素浓度为横坐标，绘制标准曲线，见图1。依据标准曲线，测定结果为图2。 

4）植酸酶检测培养基：蔗糖6.0g，KCl 0.1g，MnSO4 0.6g，NH4NO3 0.1g，植酸钙0.8g，MgSO4 0.6g，Fe2(SO4)30.6g，琼脂粉2.0g，加水定容至130mL，pH 7.0。将Bacillus subtilis Liu-3菌接种在植酸酶检测培养基上，静置20min后倒置培养在37℃温箱中，分别恒温培养24，36，48，60，72，84ｈ。测定水解圈直径/菌落直径，菌株分泌植酸酶活力的测定结果见图3。 

实施例2 

本发明提供的水溶生物肥料是以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Liu-3）为生物源制备的水溶生物肥料，步骤为： 

1）具体水溶生物肥料的制备：

取Bacillus subtilis Liu-3菌的液体培养基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。

用接菌环取生长在固体培养基（固体培养基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，琼脂20 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。）上的Bacillus subtilis Liu-3菌1环，接入5mL上述液体培养基（酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。）， 37℃，400r/min，摇床培养24h。将此培养液称为一级种子培养液。 

3）将上述一级种子培养液5mL，接入1000 mL上述液体培养基（酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。）中，37℃，400r/min，摇床培养24h。将此培养液称为二级种子培养液。 

4）将上述二级种子培养液1000 mL，接入30L液体培养基（酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4。121℃，灭菌30min。）中，37℃，200r/min，在发酵罐内发酵培养72h。发酵液为每mL含有2亿个菌以上，取出发酵液，灌装，每桶5L，放入库房，备用。 

实施例3 

水溶生物肥料的使用实验：

玉米的盆栽，每盆加入耕层土壤5kg。玉米种子：天塔九号，购于天津市西青种子公司。每盆栽种5棵玉米，浇水。玉米苗长至2叶期时，分别浇灌水溶的水溶生物肥料，方法是取0，1，10，20，30mL水溶生物肥料溶于水，终体积50mL。重复处理3盆。玉米苗长至4叶期，收获玉米苗。测定结果见图4和图5。图4  盆栽玉米的株高测定结果。图5  盆栽玉米的干重测定结果。

使用水溶的水溶生物肥料促进了玉米的生长。玉米苗的株高增加了，最高增加了15.08cm。玉米苗的干重增加了，最高增加了0.237g。 

盆栽玉米土壤中生长素（indole-3-acetic acid, IAA）的测定： 

1.）生长素标准曲线的绘制：见图1。

2.）生长素的测定：生长素的测定采用Salkowski 方法。 

3.）土壤样品的制取：定量取根际土壤，制备土壤悬液10mL，10000rpm离心15min，取上清液1mL与2mL Salkowski 试剂于暗处反应30min，于535nm波长下测定反应液吸光值，以空白对照调节零点。根据标准曲线计算生长素含量。测定结果见图6。图6  盆栽玉米土壤中生长素的测定结果。 

测定结果表明栽培玉米时，施加本发明的水溶生物肥料可以增加植物根际土壤内的生长素，因而促进了植物的生长。 

盆栽玉米土壤中有效磷的测定： 

1.）分别吸取5mg/L磷标准溶液0、1.50、2.50、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00mL于50mL容量瓶中，每一容量瓶即为磷0、0.15、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50mg/L，采用碳酸氢钠-钼锑抗比色法（邢晓丽等.土壤有效磷测定方法及注意事项.河南农业,2011,2:48-49.）进行比色，绘制磷标准曲线。

2.）定量取根际土壤，制备土壤悬液，10000rpm离心15min，取上清液以碳酸氢钠-钼锑抗比色法测定有效磷。根据标准曲线计算有效磷含量。测定结果见图7。随着使用水溶生物肥料的量的增加，玉米根际土壤有效磷含量而降低。说明水溶生物肥料促进了植物的生长，表现出植物根系大量地吸收土壤中的有效磷而降低了玉米根际土壤的有效磷含量。图7  盆栽玉米土壤中有效磷的测定结果。 

盆栽玉米土壤中磷酸酶的测定： 

植酸酶是磷酸酶家族的成员，鉴于土壤农业化学的常用方法，选取磷酸酶的测定方法，可以了解到Bacillus subtilis Liu-3菌在土壤中产生磷酸酶，也可以间接地证明Bacillus subtilis Liu-3菌在土壤中产生植酸酶。

1.）采用磷酸苯二钠比色法（关松萌.土壤酶及其研究法，北京：农业出版社，1986：310-313）测定土壤磷酸酶活性。取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，分别加入20mL蒸馏水。再加入0.25mL缓冲液，0.5mL 4-氨基氨替比林液，0.5mL铁氰化钾液。每次加入试剂要充分摇动，最后定容至50mL。以磷酸苯二钠比色法，在15min内，在分光光度计上于510nm处比色测定溶液的光密度。最后绘成标准曲线。 

2.）取盆栽玉米的根区土壤，采用磷酸苯二钠比色法测定土壤磷酸酶活性。称取5g风干土样，置于50mL三角瓶中，加5滴甲苯后再加20mL 0.5％磷酸苯二钠，充分振荡后置于37℃恒温箱中，培养2h。不加土样的相同处理作为空白对照。取培养后的滤液5mL，显色，比色测定。磷酸酶活性，以2h后100g土壤中P₂O₅的毫克数表示。测定结果见图8。结果表明使用水溶生物肥料增加了玉米根区土壤的磷酸酶活性。图8  盆栽玉米土壤中磷酸酶活性的测定结果。 

总之，使用水溶生物肥料增加了土壤中的有益微生物，其生长代谢增加了土壤中生长素，磷酸酶，植酸酶的含量，促进了植物的生长，提高了植物的干重。 

水溶生物肥料在蔬菜大棚中的使用： 

栽培品种：黄瓜（Cucumis sativus Linn.）新夏1号，播种方式为穴播，每穴2粒种子，种子萌发后浇水，幼苗长至10~15cm时，间苗，每穴留1棵苗。黄瓜苗生长至40~60cm时，挑选长势均匀的黄瓜苗，取4组处理分别为施用水溶生物肥料0，1，10，30ml/穴，分别记为CK, 1-APB (Active Phytase Bacteria), 10-APB，30-APB。测量黄瓜苗的高度后分别施用水溶生物肥料，设为处理0天。处理6天后再次测量黄瓜苗高度，测定结果见图9。图9 水溶生物肥料促进黄瓜（新夏1号）苗生长的效果（n=50, P<0.05)。    

实验结果显示，在6天中，CK组黄瓜苗增长了54.1cm, 1-APB的黄瓜苗增长了54.87cm，10-APB的黄瓜苗增长了62.375cm，30-APB的增长了64.36cm。经SPSS分析比较，处理组与对照组差异显著。

栽培品种：茼蒿（Chrysanthemum carinatum Schousb.）津1号，散播种植，每畦播种60克种子。茼蒿苗长至20~30cm高时，划分小区，每个实验小区1m²，分别命名为CK, 67-APB (Active Phytase Bacteria), 670-APB，2000-APB。小区随机分布。每个小区分别施用0，67，670，2000mL水溶生物肥料。设为0天，生长7天后，采收茼蒿，测定叶绿素含量，测定结果见（图10）。水溶生物肥料增加了植物的叶绿素含量，提升了绿叶蔬菜的品相。 

Claims (3)

1.一种水溶生物肥料，其特征在于其活性成分为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Liu-3菌体，制备步骤为：

1）取Bacillus subtilis Liu-3菌的液体培养基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4，121℃，灭菌30min；

用接菌环取生长在固体培养基上的Bacillus subtilis Liu-3菌1环，接入5mL上述液体培养基中，35-37℃，300-400r/min，摇床培养20-24h，将此培养液称为一级种子培养液；

所述的固体培养基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，琼脂20 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4，121℃，灭菌30min。

2.一种权利要求1所述的水溶生物肥料的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）取Bacillus subtilis Liu-3菌的液体培养基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4，121℃，灭菌30min；

用接菌环取生长在固体培养基上的Bacillus subtilis Liu-3菌1环，接入5mL的液体培养基中，35-37℃，300-400r/min，摇床培养20-24h，将此培养液称为一级种子培养液；

2）将上述一级种子培养液5mL，接入1000 mL液体培养基中，35-37℃，300-400r/min，摇床培养20-24h，将此培养液称为二级种子培养液；

3）将上述二级种子培养液1000 mL，接入30L液体培养基中，35-37℃，200r/min，在发酵罐内发酵培养70-72h,发酵液为每mL含有2亿个菌以上,取出发酵液，灌装，备用；

所述的固体培养基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，琼脂20 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4，121℃，灭菌30min；所述的液体培养基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠3 g/L，加水至1L，pH为7.2-7.4，121℃，灭菌30min。

3.权利要求1所述的水溶生物肥料用于大田作物：玉米、小麦、大豆、甘蔗；用于果树：桃树、梨树、枣树、苹果树；用于农业上各种蔬菜瓜果的栽培：黄瓜、西红柿、小白菜、豆角、茄子、生菜、油麦菜、茼蒿、丝瓜、辣椒、油菜、甜瓜、草莓、葡萄。

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