CN101182560B

CN101182560B - 一种提高铜绿假单胞菌产鼠李糖脂的方法

Info

Publication number: CN101182560B
Application number: CN2007101924524A
Authority: CN
Inventors: 刘小兰; 曾光明; 钟华; 傅海燕; 刘智峰; 陈耀宁; 黄海翼; 王静
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2007-11-29
Filing date: 2007-11-29
Publication date: 2011-04-27
Anticipated expiration: 2027-11-29
Also published as: CN101182560A

Abstract

本发明涉及一种提高铜绿假单胞菌产鼠李糖脂的方法，包括铜绿假单胞菌的活化、富集和进行好氧发酵培养，以及将发酵液高速离心除菌、萃取和风干等步骤。本发明通过加入载体使铜绿假单胞菌生长量增大，鼠李糖脂产量增加，有利于环境污染的治理。

Description

一种提高铜绿假单胞菌产鼠李糖脂的方法

技术领域

本发明涉及一种提高鼠李糖脂产量的方法。

背景技术

生物表面活性剂因其结构的多样性，无毒害或低毒害性以及可生物降解性而逐渐被人们重视，并正在某些方面逐步取代化学合成的表面活性剂。在城市生活垃圾堆肥领域，生物表面活性剂可以改善堆肥微环境，从而促进微生物对有机垃圾的分解，提高堆肥中垃圾的处理效率。然而，生物表面活性剂的生产成本昂贵，成为其在工业中被广泛采用的瓶颈。如能降低生物表面活性剂的生产成本，或者在同等生产成本下提高其产量，其在工业及环境污染治理中的应用将会更加广泛。

以往的文献资料中提到枯草芽孢杆菌产莎梵婷时利用固体状土豆培养基比溶解态的土豆培养基能有效提高其产量，粘质沙雷氏菌产一种脂肽类生物表面活性剂时加入硅胶能增加该脂肽类生物表面活性剂的产量，还有研究表明利用活性炭也能显著提高莎梵婷的产量。鼠李糖脂是铜绿假单胞菌产生的一类糖脂类生物表面活性剂，在工业领域以及环境堆肥中具有重要作用，如能在同等生产成本下提高其产量，无疑鼠李糖脂在工业及环境领域被更广泛地应用将成为一种可能。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种通过在发酵培养液中加入具有多孔疏松渗水结构的载体，从而提高铜绿假单胞菌产鼠李糖脂的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

1、将冷藏的铜绿假单胞菌于30～37℃下活化24h后，接种于富集培养液中，在温度30～37℃，转速200～250rpm条件下培养24h，将富集后的菌种按体积分数2.5～5％接种于装有高效悬浮大孔载体的好氧发酵培养液中进行好氧发酵培养，培养温度30～37℃，200～250rpm，培养时间最好为48～60h，通过测定发酵液表面张力值的变化确定鼠李糖脂的产生以及好氧发酵培养时间(表面张力值越低以及稀释倍数越大而表面张力值仍保持不变的时间点产生的鼠李糖脂越多)；所述富集培养液成分为：NaCl 4.5～5.0g，蛋白胨4.5～5.0g，牛肉粉2.5～3.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2；所述好氧发酵培养液组成为：葡萄糖20～25g，NaNO₃2.0～2.3g，KH₂PO₄1.5～1.8g，Na₂HPO₄·12H₂O1.5～1.8g，MgSO₄·7H₂O 0.8～1.0g，FeSO₄·7H₂O 0.01～0.015g，蒸馏水1000mL，pH6.5～6.8；取上述好氧发酵培养后的发酵液高速离心除菌，转速为8000～10000rpm，时间10～20min；取出适量上清液用作稀释测表面张力值以初步确定鼠李糖脂的产量为多少倍CMC；然后用HCl溶液调节剩余上清液pH1.5～2.0，再加入等体积的氯仿/甲醇(2∶1，体积比)的萃取剂，振荡、摇匀后、静置，上层液用同样的方法多次萃取，下层液合并后真空旋转蒸发，直到有机溶剂还剩下3～10mL；

2、取上述含鼠李糖脂的有机溶剂装于烧杯中(烧杯事先风干称重)，然后置于通风橱中风干，烧杯底上留下的棕黄色的粘稠油状物质即为鼠李糖脂。

本发明的优点：

本发明中载体的加入使铜绿假单胞菌生长量增大，鼠李糖脂产量增加，使得铜绿假单胞菌在工业中特别是环境污染的治理方面得到更为广泛的应用成为一种可能。在环境污染治理中的生活垃圾堆肥中，生物表面活性剂的加入将有利于改善堆肥微环境，促进微生物与有机物的接触密度和强度，提高易降解及难降解有机物的降解而提高堆肥效率。

由于生物表面活性剂生产成本昂贵，极大的限制了其在工业及环境方面的应用。先前的工作主要通过使用便宜的培养基来降低生产过程中的原材料成本，以及发展有效的生物处理过程、包括培养条件的优化及生物表面活性剂大量生产和回收的经济有效的分离过程来降低生产成本。这两种方法已经极大地得到了开发。目前，随着分子生物学及基因工程技术的发展，也有工作者通过开发并使用高产诱变菌种或重组菌种来提高生物表面活性剂产量，但由于其中使用的药剂昂贵，且大多具有致癌、致突变和致畸性，对人体和环境都会造成极大的毒害。

本发明中所使用的载体价格易于被人们接受，且对环境和人体均无毒害，同等培养条件下，与未加载体时相比，能增加铜绿假单胞菌的生物量，提高鼠李糖脂产量，使得其广泛应用于工业及环境领域成为一种可能。

附图说明

图1：实施例1中发酵液表面张力值随时间的变化情况；

图2：实施例1中菌体吸光度随时间的变化情况；

图3：实施例1中48h时发酵液表面张力值随稀释倍数变化情况；

图4：实施例2中发酵液表面张力值随时间的变化情况。

具体实施方式

实施例1：

本发明中用到的菌种为铜绿假单胞菌(编号Pseudomonas aeruginosa CCTCCAB93066)，该菌种购自中国典型培养物保藏中心，每1～2月在斜面培养基上接种一次，菌种在4℃条件下保藏。

1.取冷藏的菌种于37℃下活化24h，然后在无菌操作台中用接种环从斜面培养基中挑取一环菌种接种于富集培养液中，富集培养液事先于高压蒸汽锅中在115℃下灭菌30min。将接种后的富集培养液放在恒温振荡培养箱中于37℃，200rpm条件下培养。富集培养液的组成为：NaCl，5.0g；蛋白胨，5.0g；牛肉粉，3.0g；蒸馏水，1000mL；并用1M NaOH调节pH7.0。

2.将上述培养24h的富集培养液按体积分数2.5％的接种量接种于发酵培养液中。发酵培养液组成为：葡萄糖，20g；NaNO₃，2.0g；KH₂PO₄，1.5g；Na₂HPO₄·12H₂O，1.5g；MgSO₄·7H₂O，1.0g；FeSO₄·7H₂O，0.01g；蒸馏水，1000mL；并用1M NaOH调节pH6.5，加入8块高效悬浮大孔载体(聚氨酯材质，海绵状，具有多孔、疏松、渗水的结构特性，体积大约为6～8cm³)，另设立不加入载体的对照组。发酵培养液事先也于高压蒸汽锅中在115℃下灭菌30min。每个1000mL的锥形瓶装250mL接种后的发酵培养液，放置在恒温振荡培养箱中，于温度37℃，转速200rpm的条件下进行培养。

3.每6h(晚上12h)取发酵液15mL，于10000rpm下离心10min，用自动界面张力仪测定上清液的表面张力值(如图1)，发酵液培养48～60h时表面张力由最初的69.0mN/m下降到32.4mN/m左右，发酵液的表面张力值达到最低，意味着此时发酵液中鼠李糖脂的产量最大。离心后残留于离心管中的菌体用无菌水溶解，用紫外分光光度计在420nm波长下测定菌体吸光度(如图2)，根据菌体浓度与菌体吸光度成线性关系，可以发现发酵液培养48h时铜绿假单胞菌达到对数生长期后期，此时菌体浓度最大，表明该细菌是生长相关型的。

4.取上述培养48h的发酵液于8000rpm下离心20min，除去发酵液中的菌体，取出15mL上清液再加入15ml超纯水稀释，测表面张力值以初步确定产生的鼠李糖脂量(若表面张力值不升高，则从该稀释后的上清液中取出10mL，加入10mL超纯水，相当于稀释到原上清液的4倍测表面张力值，如不升高则重复上述操作稀释到8倍、16倍、32倍，直至上清液表面张力值突然增大，如稀释到16倍时表面张力值仍保持原来未进行稀释时的上清液表面张力值或者升高很少，而稀释到32倍时表面张力值突然增大，则表示发酵液中产生的鼠李糖脂为16倍CMC)(如图3)。然后用6N HCl调节剩余上清液pH2.0后，再加入等体积的氯仿/甲醇(2∶1，体积比)的萃取剂，振荡、摇匀后、静置，上层液用同样的方法多次萃取，下层液合并后于40℃真空旋转蒸发，直到有机溶剂还剩下5mL。将该5ml含鼠李糖脂的有机溶剂装于10mL烧杯中(烧杯事先风干称重)，然后置于通风橱中风干，烧杯底上留下的物质即为鼠李糖脂，称重，加载体的得到1104mg/L的鼠李糖脂，不加载体的为730mg/L。

实施例2：

1.如实施例1，取4℃条件下冷藏的菌种于30℃下活化24h，然后在无菌操作台中用接种环从斜面培养基中挑取一环菌种接种于富集培养液中，富集培养液事先于高压蒸汽锅中在115℃下灭菌30min，将接种后的富集培养液放在恒温振荡培养箱中于30℃，250rpm条件下培养。富集培养液的组成为：NaCl，4.5g；蛋白胨，4.5g；牛肉粉，2.5g；蒸馏水，1000mL；并用1M NaOH调节pH7.2。

2.将培养24h的富集培养液按体积分数5％的接种量接种于发酵培养液中。发酵培养液组成为：葡萄糖，25g；NaNO₃，2.3g；KH₂PO₄，1.8g；Na₂HPO₄·12H₂O，1.8g；MgSO₄·7H₂O，0.8g；FeSO₄·7H₂O，0.015g；蒸馏水，1000mL；并用1M NaOH调节pH6.8，加入5块实施例1所述高效悬浮大孔载体，另设立不加入载体的对照组。发酵培养液事先也于高压蒸汽锅中在115℃下灭菌30min。每个500mL的锥形瓶装125mL接种后的发酵培养液，放置在恒温振荡培养箱中，于温度30℃，转速250rpm的条件下进行培养。

3.每6h(晚上12h)取发酵液15mL，于8000rpm下离心15min，用自动界面张力仪测定上清液的表面张力值(如图4)，与实施例1类似，发酵液培养48～60h时表面张力值同样达到最低，由最初的69.0mN/m下降到32.4mN/m左右，发酵液的表面张力值达到最低，意味着此时发酵液中鼠李糖脂的产量最大。离心后残留于离心管中的菌体用无菌水稀释，用紫外分光光度计在420nm波长下测定菌体吸光度，同样地发现发酵液培养48h时铜绿假单胞菌达到对数生长期后期，此时菌体浓度最大。再次证明该种生物表面活性剂的产生是生长相关型的。

1.取培养48h的发酵液于8000rpm下离心30min，除去发酵液中的菌体。取出15mL稀释法测表面张力值以初步确定产生的鼠李糖脂量(加有载体的为8倍CMC，未加载体的为4倍CMC)，然后用6N HCl调节剩余上清液pH1.5后，再加入等体积的氯仿/甲醇(2∶1)的萃取剂，振荡、摇匀后、静置，上层液用同样的方法多次萃取，下层液合并后于40℃真空旋转蒸发，直到有机溶剂还剩下7mL。将该含鼠李糖脂的有机溶剂装于10mL烧杯中(烧杯事先风干称重)，然后置于通风橱中风干，烧杯底上留下的物质即为鼠李糖脂，称重，加载体的为564mg/L的鼠李糖脂产量，不加载体的为300mg/L。

Claims

1.一种提高铜绿假单胞菌产鼠李糖脂的方法，其特征在于包括以下步骤：

a.将铜绿假单胞菌CCTCC AB93066(Pseudomonas aeruginosa)活化后，接种于富集培养液中培养，再将富集后的菌种接种于装有海绵状聚氨酯材质的高效悬浮大孔载体的好氧发酵培养液中进行好氧发酵培养，并通过测定发酵液表面张力值的变化确定鼠李糖脂的产生以及好氧发酵培养时间，即表面张力值越低以及稀释倍数越大而表面张力值仍保持不变的时间点产生的鼠李糖脂越多；

所述的富集培养液的成分为：NaCl 4.5～5.0g，蛋白胨4.5～5.0g，牛肉粉2.5～3.0g和蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2；

所述的好氧发酵培养液的组成为：葡萄糖20～25g，NaNO₃ 2.0～2.3g，KH₂PO₄1.5～1.8g，Na₂HPO₄·12H₂O 1.5～1.8g，MgSO₄·7H₂O 0.8～1.0g，FeSO₄·7H₂O 0.01～0.015g和蒸馏水1000mL，pH6.5～6.8；

b.取上述好氧发酵培养后的发酵液高速离心除菌，取出适量上清液稀释后测表面张力值以初步确定鼠李糖脂的产量为多少倍CMC，用HCl溶液调节剩余上清液的pH值至1.5～2.0，然后加入等体积的氯仿/甲醇的萃取剂，该萃取剂中氯仿与甲醇的体积比为2∶1；振荡、摇匀后、静置，上层液用同样的方法多次萃取，下层液合并后于真空旋转蒸发，直到有机溶剂还剩下3～10mL；

c.取上述含鼠李糖脂的有机溶剂装于烧杯中，然后置于通风橱中风干，烧杯底上留下的棕黄色的粘稠油状物质即为鼠李糖脂。

2.根据权利要求1所述的提高铜绿假单胞菌产鼠李糖脂的方法，其特征在于，所述步骤a中铜绿假单胞菌CCTCC AB93066于30～37℃下活化24h；接种于富集培养液中后在温度30～37℃，转速200～250rpm条件下培养24h；富集后的菌种按体积分数2.5～5％接种；好氧发酵培养温度为30～37℃，200～250rpm，培养时间最好为48～60h。

3.根据权利要求1或2所述的提高铜绿假单胞菌产鼠李糖脂的方法，其特征在于所述步骤b中高速离心除菌转速为8000～10000rpm，时间10～20min。