CN103966282B

CN103966282B - 一种利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法

Info

Publication number: CN103966282B
Application number: CN201410211216.2A
Authority: CN
Inventors: 陈韶军; 黄玉才; 于洋; 隋志强; 张烨; 金艳方; 白丽莉; 王延兵
Original assignee: DAQING VERTEX CHEMICAL Co Ltd
Current assignee: BEIJING VICTEX ENVIRONMENTAL PROTECTION TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co.,Ltd.
Priority date: 2014-05-19
Filing date: 2014-05-19
Publication date: 2016-08-24
Anticipated expiration: 2034-05-19
Also published as: CN103966282A

Abstract

一种利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法。属于生物表面活性剂生产技术领域。该方法步骤为：（1）双相碳源优势菌株的选育：将铜绿假单胞菌CICC10204经活化及驯化培养后，筛选出双相碳源优势菌株；（2）菌种的扩大培养：将优势菌株经活化及扩大培养后得到二级种子液；（3）发酵培养：将二级种子液进行双碳源发酵培养；发；（4）分离提纯：将发酵液通过离心法或膜过滤去除菌体及杂质，再经6K道尔顿超滤膜去除生物大分子和多糖；将收集到的滤液通过蒸发浓缩去除水分，最终获得鼠李糖脂工业化提纯品。本发明实现了鼠李糖脂精制品的工业化生产，最终纯化的鼠李糖脂经浓缩可达90%以上。

Description

一种利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法

技术领域

本发明属于生物表面活性剂生产技术领域，具体涉及一种利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法。

背景技术

鼠李糖脂是由微生物在特定的生长条件下分泌的一种具有优良表面活性的代谢产物，是一种对环境无害的天然表面活性剂。近年来，随着鼠李糖脂在石油、农业、污染环境治理以及要求更高的日化、医药、食品等领域的成功实验应用，针对鼠李糖脂的研究也越来越广泛和深入。从生产菌种的选育、培养基配方的优化、发酵工艺及精制工艺的设计等，使鼠李糖脂在实验室水平的研究上日益成熟，提取的最高纯度可达95%以上，这些研究为鼠李糖脂的品质提高和应用领域的拓展提供了大量的科学依据。目前，鼠李糖脂发酵液的生产国内已实现工业化，但是纯度更高可应用于高端领域的鼠李糖脂精制品还处于实验室研究阶段，未能实现工业化，主要原因是由于工业化产脂较高的发酵液主要是以植物油作为碳源，而利用植物油为碳源生产的发酵液往往残油含量高，成品液体粘度大，乳化严重，常规方法难以破乳，要实现破乳就需要加入其他化学药剂，新加入成分又会给后续分离提纯带来极大困难，所以一直以来，以植物油为碳源的工业化生产的后续分离提纯问题仍没有解决，常用的可用于发酵液的分离提取方法也因为所得鼠李糖脂收率极低，精制成本过高而未能在工业上获得应用。

针对残油含量高的问题，亦有通过改变碳源的方式来优化最终发酵液状态的研究，相关文献也报道了其他碳源如葡萄糖、甘油、乙醇等进行生产的实例，虽然这些研究从发酵液状态的角度解决了残油高的问题，但是由于鼠李糖脂产生菌为铜绿假单胞菌，油性碳源更利于诱导表面活性物质的生成，而利用上述碳源生产的发酵液鼠李糖脂有效含量不高，产率低使得生产成本提高，这也是利用上述碳源其难以实现工业化的原因。鼠李糖脂尤其是精制品的工业化生产空白，严重制约了鼠李糖脂这一绿色环保的活性剂在更广泛领域的应用，所以亟需一种鼠李糖脂生产方法，一方面解决产脂含量低的问题，一方面解决后续分离提纯的问题。

此外，对于发酵生产鼠李糖脂泡沫控制问题也是工业化难点，由于发酵过程产生大量的泡沫，泡沫的溢出直接影响发酵过程的完整性，往往由于泡沫量过大无法控制而导致发酵液溢出，一方面料液损失同时增加染菌机会，另一方面由于泡沫影响氧传递也使得发酵过程微生物处于异常代谢状态，导致产量下降或菌体自溶，所以鼠李糖脂工业化发酵泡沫控制问题也是实现稳定工业化发酵的关键，目前比较常用和有效的消泡方式是添加消泡剂或是利用机械搅拌桨消泡，消泡剂尤其是以发酵碳源作为消泡剂的消泡方式是比较有效的方式，如利用植物油作为消泡剂或是利用乙醇作为消泡剂，这里利用碳源作为消泡剂有一个风险就是用量的问题，如在大量泡沫产生的情况下，会导致消泡剂用量增加，对于植物油消泡就会导致发酵液残油量增加，影响发酵液状态增加分离纯化难度；而以乙醇为消泡剂的消泡方式如想在整个发酵过程完全控制泡沫，又容易出现乙醇加量过大的情况，导致菌体代谢异常或是菌体死亡，影响发酵正常进行，所以，对于工业发酵泡沫控制，如何实现减少泡沫的同时保证发酵过程稳定以及获取的初成品不会影响后续精制是亟待解决的问题。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题、实现鼠李糖脂精制品的工业化生产，本发明提供一种利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法。

该利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法的具体步骤如下：

（1）双相碳源优势菌株的选育：将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CICC10204活化培养，将活化的菌株转接至1#驯化培养基中培养24~60小时，培养温度32~37℃，转速150~200r/min，将培养后的菌液作为移接种子液以3%~5%的接种量接种至已灭菌的2#驯化培养基中培养24~60小时，培养温度32~37℃，转速150~200r/min，再将经2#驯化培养基培养的菌液作为种子液以3%~5%的接种量接种至新配制并灭菌的1#驯化培养基中驯化培养48小时，1#驯化培养基和2#驯化培养基在菌株整个驯化过程是每隔48小时进行交替使用（培养条件相同），并按照上述方法共转接6~10次，驯化培养结束；将驯化后得到的菌液稀释分离，挑出若干支单菌落，进行编号划线培养，并逐一进行发酵培养，筛选出2支产鼠李糖脂性能好、代谢油脂能力和乙醇耐受能力强、遗传性能稳定的菌株转接至保藏斜面（牛肉膏蛋白胨培养基），作为双相碳源优势菌株，4℃保存待用；

（2）菌种的扩大培养：将步骤（1）中得到的双相碳源优势菌株斜面活化培养24~48小时，培养温度32~37℃，然后接种至种子培养基中培养24~36小时，培养温度32~37℃，转速150~200r/min，得到一级种子液；按3~5%的接种量将一级种子液转接到新配制的种子培养基中培养24~36小时，培养温度32~37℃，转速150~200r/min，得到二级种子液；培养过程中的通风量（m³/ m³·min）为1：（0.6—1.0）；

（3）发酵培养：将步骤（2）中得到的二级种子液以3~5%接种量接入发酵罐内已灭菌的发酵培养基中，培养温度32~37℃，通风量（m³/ m³·min）为1：（0.6~1.0），搅拌转速150~220r/min，发酵过程pH值控制在 6.3~7.2，培养120~148小时；其中0~30小时植物油用量2%~5%，浓度为20%~50%乙醇用量0.3~0.8%；30小时后，开始流加浓度为20~50%的乙醇，每隔20~24小时流加一次，每次流加量为0.2~1%，直至发酵培养结束；发酵过程中产生的泡沫的控制方法采用喷淋和瞬时压差协同作用法：将发酵罐中的泡沫导入到消泡罐顶部，并通过孔径为1~2mm的泡沫喷淋头喷淋到消泡罐内，同时将高于消泡罐内气压0.1~0.25MPa的无菌空气瞬间释放到消泡罐内，待泡沫消除后停止释放，将泡沫液化后的发酵液用蠕动泵导回发酵罐；

（4）分离提纯：将步骤（3）得到的发酵液通过离心法或膜过滤去除菌体及杂质，再经6K道尔顿超滤膜去除生物大分子和多糖；将收集到的滤液通过蒸发浓缩去除水分，最终获得鼠李糖脂工业化提纯品。

所述步骤（1）中的1#驯化培养基的配方为（按质量百分比）：植物油3~6%，浓度为20~50%的乙醇0.1~1%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白胨0.3~0.6%，牛肉膏0.1~0.4%，MgSO₄ 0.02~0.08%，KH₂PO₄ 0.1~0.4%，NaCl 0.03~0.08%，FeSO₄·7H₂O 0.00001~0.00003%，微量元素混合液 0.3~0.8%，余量为水，培养基pH值7.0~7.2；2#驯化培养基的配方为（按质量百分比）：植物油1~3.5%，浓度为20~50%的乙醇1.5 ~5%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白胨0.3~0.6%，牛肉膏0.1~0.4%，MgSO₄ 0.02~0.08%，KH₂PO4 0.1~0.4%，NaCl 0.03~0.08%，FeSO₄·7H₂O 0.00001~0.00003 %，微量元素混合液0.3~0.8%，余量为水，培养基pH值7.0~7.2。

所述步骤（2）中的种子培养基的配方为（按质量百分比）：植物油2~5%，浓度为20%~50%的乙醇0.5~1%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白胨0.3~0.6%，牛肉膏0.1~0.4%，MgSO₄ 0.02~0.08%，KH₂PO4 0.1~0.4%，NaCl 0.03~0.08%，FeSO₄·7H₂O 0.00001~0.00003 %，微量元素混合液0.3~0.8%，余量为水，培养基pH值7.0~7.2。

所述步骤（3）中的发酵培养基的配方为（按质量百分比）：植物油2~5%，浓度为20%~50%的乙醇0.3~0.8%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白胨0.2~0.5%，牛肉膏0.05~0.2%，MgSO₄0.02~0.06%，KH₂PO₄ 0.06~0.2%，FeSO₄·7H₂O 0.00001~0.00003 %，微量元素混合液0.3~0.8%，余量为水，培养基pH7.0~7.2。

所述的微量元素混合液的配方为（按质量百分比）：MnSO₄·H₂O 0.01~0.02 %，CuSO₄·5H₂O 0.02~0.04%，CaCL₂·6H₂O 0.01~0.03 %，余量为水。

所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CICC10204保藏在中国工业微生物菌种保藏管理中心，可通过保藏机构购买获得。

本发明具有如下有益效果：

本发明使用的发酵菌种为经双相碳源驯化法驯化后的菌种，原出发菌株为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CICC10204，该菌种双相碳源驯化法的特点是驯化培养基中除添加植物油（大豆油、玉米油、米糠油或菜籽油等）作为碳源外，还加入了乙醇作为碳源，即以植物油和乙醇作为双相碳源。同时，在驯化培养过程中，采用乙醇两种浓度交替驯化培养，即乙醇含量低的第一驯化培养基中的植物油含量略高，乙醇含量高的第二驯化培养基中的植物油含量略低，进而保证碳源提供量平衡。经上述方法驯化后的菌种，能够适应并有效利用植物油和乙醇做为双碳源进行发酵。原出发菌株经驯化后，挑出若干支单菌落，然后逐一发酵培养，通过检测植物油代谢情况、乙醇代谢情况、鼠李糖脂含量、微生物增殖情况、溶液表面张力等相关参数，从中筛选出二支产鼠李糖脂性能好、代谢油脂能力和乙醇耐受能力强和遗传性能稳定的菌株，即可作为双相碳源优势菌株。

本发明的发酵培养过程采用双相碳源分段错时供应法，双相碳源是指以植物油和乙醇作为碳源。双相碳源分段错时供应法的特点是在发酵开始0~30小时的初期，提供少量植物油碳源，用于菌体前期生长；当植物油代谢减少至30~50%时，即发酵30小时后，每隔20~24小时流加一次乙醇，该方法能够使微生物对新碳源有一定的适应期，防止因突然改变碳源而增加微生物适应延滞期，影响发酵产率。双相碳源分段错时供应法结合了油脂发酵的高产脂优势和乙醇发酵的发酵液液体状态优化优势，通过调整碳源结构和双相碳源的分段错时提供，使生产菌更好、更有效的利用碳源，使微生物代谢鼠李糖脂的产率提高并促进其定向代谢产生满足于后续纯化要求的发酵液，减少后续加工处理难度，从而大幅度降低精制品的生产成本。双相碳源分段错时供应法解决了单一油脂发酵液乳化严重、后续纯化困难以及单一乙醇发酵产脂含量低的问题。使用该方法进行工业化发酵（装液量18t）粗制品的鼠李糖脂含量可达60g/L，发酵液状态为澄清透明，直接进行膜过滤收率可达70%以上，极大地提高了工业化产率及后续提纯收率，同时可节省鼠李糖脂生产成本20%以上。

本发明在发酵培养过程中采用独特的的泡沫控制方法——喷淋和瞬时压差协同作用法，是一种综合性泡沫控制工艺。该方法通过泡沫喷淋和瞬时压差方式协同消泡，能够有效控制泡沫量，提高消泡速度。瞬时压差主要是利用泡沫在瞬间内外压力变化来使泡沫破灭的方式实现，当泡沫量非常多，泡沫喷淋头无法完全将泡沫转变成液体时，将储气罐中的压缩无菌空气，迅速释放到泡沫收集罐中，储气罐压力要比泡沫罐内压力大0.1~0.25MPa，操作的同时关闭发酵罐与泡沫收集罐的所有连通管路，压力消泡过程1分钟内可完成操作，消泡率可达到60~80%，整个操作过程可采取人工或自控系统实现。由于泡沫能够迅速被液化并返回发酵系统，因而整个发酵过程的环境条件和发酵装液量不会有较大改变，最大限度的保证了发酵过程的稳定进行。由于该方法不需添加植物油消泡剂或乙醇消泡剂，因而有效避免了因发酵液残油量高造成的分离纯化难度高以及因乙醇加量过大导致菌体代谢异常或是菌体死亡的问题。本发明的发酵后的发酵液经过滤和纯后，能够得到纯度为50~90%的鼠李糖脂工业化提纯品。

本发明的利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法实现了鼠李糖脂精制品的工业化生产，通过本方法发酵生产的鼠李糖脂发酵液，液体呈透明状态，培养底物残留低，彻底改变了原来鼠李糖脂发酵液乳化严重的状态，通过常规的膜过滤除菌及杂质和蒸发浓缩去除水分的方式即可实现分离及纯化，工艺更加简单，并且无需添加其他化学物质，最终纯化的鼠李糖脂经浓缩可达90%以上。此外本发明提供的泡沫控制方法，整个发酵过程无泡沫溢出情况，泡沫可被液化并迅速返回发酵系统，最大限度减少因环境条件改变造成的发酵异常情况，通过本发明技术的实施，为高纯品鼠李糖脂的制备提供了完整的工业化生产方法。

附图说明

图1为本发明的利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法所用装置示意图。

具体实施方式

下面结合图1对本发明进做进一步说明：

（1）双相碳源优势菌株的选育：

将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CICC10204活化培养，将活化的菌株转接至1#驯化培养基中培养48小时，培养温度35℃，转速200r/min，将培养后的菌液作为移接种子液以5%的接种量接种至已灭菌的2#驯化培养基中培养48小时，培养温度35℃，转速200r/min，再将经2#驯化培养基培养的菌液作为种子液以5%的接种量接种至新配制并灭菌的1#驯化培养基中驯化培养48小时，驯化培养过程温度和转速条件均相同，共进行8次，其中1、3、5、7次使用1#驯化培养基进行培养，2、4、6、8次使用2#驯化培养基进行培养；获得的最终培养菌液即为经双相碳源驯化后所得菌悬液。将获得的驯化培养菌悬液进行稀释分离，涂布平板后培养（平板用培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基），挑出若干单菌落，进行编号划线培养，并分别进行小试试验，平行试验三组，通过检测鼠李糖脂含量和发酵液表面张力来选择目标优势菌，鼠李糖脂含量采用3,5-二羟基甲苯硫酸比色法检测，含量高的作为优选；测定表面张力时溶液稀释同等倍数，取表面张力数值低的作为优选。筛选出的优良菌株用牛肉膏蛋白胨斜面培养基于4℃冰箱中保存。

其中，活化培养基配方（为按质量百分比）：牛肉膏 0.5%；蛋白胨 1%；NaCl 0.5%；琼脂 2%，余量为水；培养基pH值 7.0～7.2。

1#驯化培养基的配方为（按质量百分比）：植物油3~6%，浓度为20~50%的乙醇0.1~1%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白胨0.3~0.6%，牛肉膏0.1~0.4%，MgSO₄ 0.02~0.08%，KH₂PO₄ 0.1~0.4%，NaCl 0.03~0.08%，FeSO₄·7H₂O 0.00001~0.00003%，微量元素混合液 0.3~0.8%，余量为水；培养基pH值7.0~7.2。

2#驯化培养基的配方为（按质量百分比）：植物油1~3.5%，浓度为20~50%的乙醇1.5~5%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白胨0.3~0.6%，牛肉膏0.1~0.4%，MgSO₄ 0.02~0.08%，KH₂PO4 0.1~0.4%，NaCl 0.03~0.08%，FeSO₄·7H₂O 0.00001~0.00003 %，微量元素混合液0.3~0.8%，余量为水；培养基pH值7.0~7.2。

保藏斜面培养基配方为（按质量百分比）：牛肉膏 0.5%；蛋白胨 1%；NaCl 0.5%；琼脂 2%，余量为水；培养基pH值为 7.0～7.2。

微量元素混合液的配方为（按质量百分比）：MnSO₄·H₂O 0.01~0.02 %，CuSO₄·5H₂O 0.02~0.04%，CaCL₂·6H₂O 0.01~0.03 %，余量为水。

培养基及乙醇灭菌方法：培养基配制成溶液后采用高压蒸汽灭菌的方式，121℃灭菌20分钟。乙醇采用膜过滤除菌，膜采用0.1µm聚四氟乙烯薄膜。以下其它步骤中的培养基及乙醇灭菌方法均相同。

（2）菌种的扩大培养：

将步骤（1）中得到的双相碳源优势菌株斜面活化培养48小时，培养温度35℃，然后接种至种子培养基中培养36小时，培养温度35℃，转速200r/min，得到一级种子液；按5%的接种量将一级种子液转接到新配制的种子培养基中培养36小时，培养温度35℃，转速200r/min，得到二级种子液；培养过程中的通风量（m³/ m³·min）为1：0.8。

其中，该步骤采用的活化培养基配方与步骤（1）中的活化培养基配方相同。

种子培养基的配方为（按质量百分比）：植物油2~5%，浓度为20%~50%的乙醇0.5~1%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白胨0.3~0.6%，牛肉膏0.1~0.4%，MgSO₄ 0.02~0.08%，KH₂PO4 0.1~0.4%，NaCl 0.03~0.08%，FeSO₄·7H₂O 0.00001~0.00003 %，微量元素混合液0.3~0.8%，余量为水，培养基pH值7.0~7.2。

（3）发酵培养：

将步骤（2）中得到的二级种子液以5%接种量接入到18t发酵罐内已灭菌的发酵培养基中，培养温度35℃，通风量（m³/ m³·min）为1：0.8，搅拌转速220r/min，发酵过程pH值控制在 7.0，培养148小时；其中0~30小时植物油用量5%，浓度为40%乙醇用量0.6%；30小时后，开始流加浓度为45%的乙醇，每隔24小时流加一次，每次流加量为0.8%，直至发酵培养结束；发酵过程中产生的泡沫的控制方法采用喷淋和瞬时压差协同作用法：将发酵罐中的泡沫导入到消泡罐顶部，并通过孔径为1~2mm的泡沫喷淋头喷淋到消泡罐内，同时将高于消泡罐内气压0.1~0.25MPa的无菌空气瞬间释放到消泡罐内，待泡沫消除后停止释放，将泡沫液化后的发酵液用蠕动泵导回发酵罐。发酵后测得发酵液鼠李糖脂含量为6.5%.（采用3.5-二羟基甲苯硫酸法）。

其中，发酵培养基的配方为（按质量百分比）：植物油2~5%，浓度为20%~50%的乙醇0.3~0.8%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白胨0.2~0.5%，牛肉膏0.05~0.2%，MgSO₄0.02~0.06%，KH₂PO₄0.06~0.2%，FeSO₄·7H₂O 0.00001~0.00003 %，微量元素混合液0.3~0.8%，余量为水，培养基pH7.0~7.2。

该步骤在发酵培养过程中采用独特的的泡沫控制方法——喷淋和瞬时压差协同作用法，是一种综合性泡沫控制工艺。当发酵罐中泡沫到达罐顶后通过管道经过泡沫喷嘴以喷雾的形式喷淋至泡沫收集罐，实现初步的液化，此过程在发酵72小时内可对泡沫实现有效控制，随着发酵的继续泡沫量会持续增加，当泡沫高度到达收集罐三分之二高度时，由储气罐向泡沫罐内通入无菌压缩空气，进一步进行消泡，液化的泡沫通过蠕动泵重新回到发酵罐中。其中喷嘴根据罐压进行数量确定，以最终可喷成稳定雾状并可正常通风为标准，喷头孔径选1.5mm。该方法通过泡沫喷淋和瞬时压差方式协同消泡，能够有效控制泡沫量，提高消泡速度。瞬时压差主要是利用泡沫在瞬间内外压力变化来使泡沫破灭的方式实现，当泡沫量非常多，泡沫喷淋头无法完全将泡沫转变成液体时，将储气罐中的压缩无菌空气，迅速释放到泡沫收集罐中，储气罐压力要比泡沫罐内压力大0.1~0.25MPa，操作的同时关闭发酵罐与泡沫收集罐的所有连通管路，压力消泡过程1分钟内可完成操作，消泡率可达到60~80%，整个操作过程可采取人工或自控系统实现。由于泡沫能够迅速被液化并返回发酵系统，因而整个发酵过程的环境条件和发酵装液量不会有较大改变，最大限度的保证了发酵过程的稳定进行。由于该方法不需添加植物油消泡剂或乙醇消泡剂，因而有效避免了因发酵液残油量高造成的分离纯化难度高以及因乙醇加量过大导致菌体代谢异常或是菌体死亡的问题。

喷淋和瞬时压差协同作用法所采用的装置连接关系及工作流程如下：压缩空气通过预过滤器和精过滤器除菌后直接进入储气罐，储气罐气体在泡沫布满消泡罐释放到消泡罐中，同时储气罐中再补充气体。储气罐气体释放到发酵罐中，直接靠压力消泡，减少发酵罐中泡沫量，同时发酵罐中上部放气阀手动调节，防止因气体进入罐内压力过大，最终发酵罐内压力保持在0.05-0.1 MPa。发酵罐底部与消泡罐底部管线相连，通过阀门控制开合，主要用于泡沫在消泡罐液化后，液体输送回发酵罐中继续参与发酵。液体流向从消泡罐到发酵罐，为防止发酵罐内液体流向消泡罐，蠕动泵未启动时底部阀门应处于关闭状态。发酵罐顶部主管线分成两条支路分别与消泡罐顶部和储气罐顶部相连，消泡罐顶部另有一条管线与储气罐顶部相连。与消泡罐相连的管线在进入消泡罐前分成两条支线，主要用于发酵罐顶部泡沫产生量大，溢出时的泡沫输出，使其进入消泡罐，泡沫量少时直接进入消泡罐，再从底部通过蠕动泵输送回发酵罐，当泡沫量大，消泡罐内布满泡沫无法控制时，泡沫需要通过带有喷淋头的管路进入到消泡罐中，以加速泡沫液化，同时关闭直接进入消泡罐的管路，并将储气罐中的压缩。

（4）分离提纯：

将步骤（3）得到的发酵液通过离心法或膜过滤去除菌体及杂质，再经6K道尔顿超滤膜去除生物大分子和多糖，其中微滤膜0.2µm，过滤压力0.1-0.15mpa，超滤膜0.6万道尔顿，过滤压力0.12-0.15mpa。将收集到的滤液通过蒸发浓缩去除水分，最终获得纯度为90%的鼠李糖脂工业化提纯品。

Claims

1.一种利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法，其特征在于：该方法的具体步骤如下：

（1）双相碳源优势菌株的选育：将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CICC10204活化培养，将活化的菌株转接至1号驯化培养基中培养24~60小时，培养温度32~37℃，转速150~200r/min，将培养后的菌液作为移接种子液以3%~5%的接种量接种至已灭菌的2号驯化培养基中培养24~60小时，培养温度32~37℃，转速150~200r/min，再将经2号驯化培养基培养的菌液作为种子液以3%~5%的接种量接种至新配制并灭菌的1号驯化培养基中驯化培养48小时，1号驯化培养基和2号驯化培养基在菌株整个驯化过程是每隔48小时进行交替使用，培养条件相同，并按照上述方法共转接6~10次，驯化培养结束；将驯化后得到的菌液稀释分离，挑出若干支单菌落，进行编号划线培养，并逐一进行发酵培养，筛选出2支产鼠李糖脂性能好、代谢油脂能力和乙醇耐受能力强、遗传性能稳定的菌株转接至保藏斜面，所述保藏斜面为牛肉膏蛋白胨培养基，作为双相碳源优势菌株，4℃保存待用；

（2）菌种的扩大培养：将步骤（1）中得到的双相碳源优势菌株斜面活化培养24~48小时，培养温度32~37℃，然后接种至种子培养基中培养24~36小时，培养温度32~37℃，转速150~200r/min，得到一级种子液；按3~5%的接种量将一级种子液转接到新配制的种子培养基中培养24~36小时，培养温度32~37℃，转速150~200r/min，得到二级种子液；养过程中的通风量为1：（0.6—1.0）（m³/ m³·min）；

（3）发酵培养：将步骤（2）中得到的二级种子液以3~5%接种量接入发酵罐内已灭菌的发酵培养基中，培养温度32~37℃，通风量为1：（0.6~1.0）（m³/ m³·min），搅拌转速150~220r/min，发酵过程pH值控制在 6.3~7.2，培养120~148小时；其中0~30小时植物油用量2%~5%，浓度为20%~50%乙醇用量0.3~0.8%；30小时后，开始流加浓度为20~50%的乙醇，每隔20~24小时流加一次，每次流加量为0.2~1%，直至发酵培养结束；发酵过程中产生的泡沫的控制方法采用喷淋和瞬时压差协同作用法：将发酵罐中的泡沫导入到消泡罐顶部，并通过孔径为1~2mm的泡沫喷淋头喷淋到消泡罐内，同时将高于消泡罐内气压0.1~0.25MPa的无菌空气瞬间释放到消泡罐内，待泡沫消除后停止释放，将泡沫液化后的发酵液用蠕动泵导回发酵罐；

（4）分离提纯：将步骤（3）得到的发酵液通过离心法或膜过滤去除菌体及杂质，再经6K道尔顿超滤膜去除生物大分子和多糖；将收集到的滤液通过蒸发浓缩去除水分，最终获得鼠李糖脂工业化提纯品；

所述步骤（1）中的1号驯化培养基的配方为，按质量百分比：植物油3~6%，浓度为20~50%的乙醇0.1~1%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白胨0.3~0.6%，牛肉膏0.1~0.4%，MgSO₄ 0.02~0.08%，KH₂PO₄ 0.1~0.4%，NaCl 0.03~0.08%，FeSO₄·7H₂O 0.00001~0.00003%，微量元素混合液0.3~0.8%，余量为水，培养基pH值7.0~7.2；2号驯化培养基的配方为，按质量百分比：植物油1~3.5%，浓度为20~50%的乙醇1.5 ~5%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白胨0.3~0.6%，牛肉膏0.1~0.4%，MgSO₄ 0.02~0.08%，KH₂PO4 0.1~0.4%，NaCl 0.03~0.08%，FeSO₄·7H₂O 0.00001~0.00003 %，微量元素混合液0.3~0.8%，余量为水，培养基pH值7.0~7.2，所述的微量元素混合液的配方为，按质量百分比：MnSO₄·H₂O 0.01~0.02 %，CuSO₄·5H₂O 0.02~0.04%，CaCL₂·6H₂O 0.01~0.03 %，余量为水。

2.根据权利要求1所述的利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法，其特征在于：所述步骤（2）中的种子培养基的配方为，按质量百分比：植物油2~5%，浓度为20%~50%的乙醇0.5~1%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白胨0.3~0.6%，牛肉膏0.1~0.4%，MgSO₄ 0.02~0.08%，KH₂PO4 0.1~0.4%，NaCl 0.03~0.08%，FeSO₄·7H₂O 0.00001~0.00003 %，微量元素混合液0.3~0.8%，余量为水，培养基pH值7.0~7.2，所述的微量元素混合液的配方为，按质量百分比：MnSO₄·H₂O 0.01~0.02 %，CuSO₄·5H₂O 0.02~0.04%，CaCL₂·6H₂O 0.01~0.03 %，余量为水。

3.根据权利要求1所述的利用双相碳源发酵制备鼠李糖脂的工业化生产方法，其特征在于：所述步骤（3）中的发酵培养基的配方为，按质量百分比：植物油2~5%，浓度为20%~50%的乙醇0.3~0.8%，葡萄糖0.2~0.5%，蛋白胨0.2~0.5%，牛肉膏0.05~0.2%，MgSO₄0.02~0.06%，KH₂PO₄ 0.06~0.2%，FeSO₄·7H₂O 0.00001~0.00003 %，微量元素混合液0.3~0.8%，余量为水，培养基pH7.0~7.2，所述的微量元素混合液的配方为，按质量百分比：MnSO₄·H₂O 0.01~0.02 %，CuSO₄·5H₂O 0.02~0.04%，CaCL₂·6H₂O 0.01~0.03 %，余量为水。