CN103074315B - 一种脂肪酶lip及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种脂肪酶及其基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明是为了解决现有技术的不足，从黑曲霉中克隆得到一种脂肪酶基因。该脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达，可达到比现有技术更高的表达水平。因此，本发明的重组脂肪酶在工业生产中可大大降低生产成本，使其在洗涤、造纸、食品等工业中显示出更大应用潜力。

Description

一种脂肪酶LIP及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种脂肪酶及其基因和应用。

背景技术

脂肪酶（Lipase，E.C.3.1.1.3），全称为三酰基甘油酰水解酶（triacylglycerolacylhydrolase），它属于α/β折叠酶家族，是一种丝氨酸水解酶。脂肪酶催化三酰甘油的酯键水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。脂肪酶具有优良的立体选择性，反应条件温和并且不会造成环境污染，因此在洗涤、食品、造纸等许多工业领域中均有广泛的应用。

脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中，相对于动植物，微生物分泌的脂肪酶具有更广的底物专一性、作用温度以及作用PH范围。虽然微生物分泌的脂肪酶具有很好的应用特性，但是寻找到适于工业化大生产的脂肪酶生产菌株还是十分困难。通过传统诱变育种以及优化发酵条件，可以一定程度的提高微生物产脂肪酶的能力，然而脂肪酶产量和活力的突破性提高还需要依赖于基因工程。目前，在基因工程操作过程中一般选用大肠杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母作为脂肪酶基因的表达宿主。由于在大肠杆菌中表达产量较低，蛋白易形成包涵体，产业化生产困难。因此采用真核生物，如酿酒酵母和毕赤酵母等作为表达宿主成为当前的主要趋势。到目前为止已有多种微生物的脂肪酶基因在毕赤酵母中实现了异源表达，如溜曲霉（Shi B H etal..Cloning and Expression of Aspergillus tamarii FS132 Lipase Gene in Pichia pastoris.Int J MolSci,2010,11(6):2373-2382.）、米根霉（Minging S et al..Functional expression ofRhizopus oryzae lipase in Pichia pastoris:high-level production and some properties.JBiotechnol,1998,66(5):147-156.）、扩展青霉（袁彩,林琳,施巧琴.扩展青霉碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达.生物工程学报,2003,19(2):31-36.）等，表达的酶活分别为20U/ml、231U/ml和260U/ml。关于黑曲霉脂肪酶的研究报道主要是集中在酶的分离纯化、固定化以及应用，关于其基因的克隆与表达方面的报道很少，仅有的报道中也只是将黑曲霉脂肪酶基因转化到大肠杆菌（Shu Z Y et al..Aspergillus nigerlipase:gene cloning,over-expression in Escherichia coli and in vitro refolding.Biotechnol Lett,2007,29(12):1875-1879.）和毕赤酵母（舒正玉,杨江科,徐丽.黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达.武汉大学学报,2007,53(2):204-208.），并没有详细的研究重组工程菌株的酶活力以及酶学性质。总体上来说，目前所报道的脂肪酶重组酶的酶活力普遍较低，生产成本较高。因此筛选高比活酶基因，构建高效产酶微生物，进行基因改良，优化酶的性质，是当前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于黑曲霉的脂肪酶。

本发明的再一目的是提供上述脂肪酶的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述脂肪酶的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述脂肪酶的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种高效表达脂肪酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述脂肪酶的应用。

本发明从黑曲霉中分离纯化得到一种脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MFSGRFGVLL TALAALSAAA PTPLTVRSVS TSTLDELQLF SQWSAAWYCS 50

NNIDSDDSNV TCTCDACPSV EEASTKMLLE FDLTNNFGGT AGFLAADNTN 100

KRLVVAFRGS STIKNWIADL DFILQDNDDL CTGCKVHTGF WKAWEAAADN 150

LTSKIKSAMS TYSGYTLYFT GHSLGGALAT LGATVLRNDG YSVELYTYGC 200

PRVGNYALAE HITSQGSGAN FRVTHLNDIV PRLPPMDFGF SQPSPEYWIT 250

SGTGASVTAS DIELIEGINS TAGNAGEATV LVLAHLWYFF AISECLL    297

该酶基因完整的开放阅读框（ORF）为894bp，推测其编码297个氨基酸，经分析发现其N端前19个氨基酸为信号肽序列。将克隆得到的黑曲霉脂肪酶LIP同已经报道的脂肪酶的氨基酸序列进行分析，发现该黑曲霉脂肪酶LIP也具有高度保守的脂肪酶活性中心催化三联体的三个氨基酸残基（Ser、Asp和His），并且Ser残基位于“-G-H-S-L-G-”的保守五肽中。构成脂肪酶LIP的第一个氧阴离子洞区的氨基酸残基序列也具有高度的保守性（VVAFRGS）。本发明获得的脂肪酶最适温度为50℃，最适反应pH值为7.0，与已报道的黑曲霉的脂肪酶相比具有更强的耐碱性。该酶在pH 4.0~9.0的条件下酶活稳定。此外，该重组酶的热稳定性较好，在65℃水浴中放置1h酶活力仍能保持60%以上。因此该酶可广泛应用洗涤、造纸等工业领域。

本发明还提供了编码上述脂肪酶的基因的序列如SEQ ID NO.2所示：

atgttctcag gacggtttgg agtgcttttg actgcgctcg ctgcgctgag 50

tgctgcggca ccgacaccac ttacagtgcg gagtgtctcg acttccacgt 100

tggatgagct gcaattgttc tcgcaatggt ctgccgcatg gtattgctcg 150

aacaatatcg actcggacga ctctaacgtg acatgcacgg ccgactgttg 200

tccatcagtc gaggaggcga gcaccaagat gctgctggag tttgacctga 250

caaataactt tggaggcaca gccggtttcc tggccgcgga caacaccaac 300

aagcggctcg tggtcgcctt ccgaggcagt agcaccatca agaactggat 350

tgctgatctc gacttcatcc tgcaagataa cgatgacctc tgtactggct 400

gcaaggttca cactggattc tggaaggcat gggaagccgc tgcagacaat 450

ctgacgagca agatcaagtc cgcgatgagc acgtattcgg gctataccct 500

ctacttcacc gggcacagct tgggcggcgc attggctaca ctgggagcaa 550

cggtcttgcg aaatgacggt tatagcgttg aactgtacac ctatggatgt 600

cctcgagtcg gaaactatgc gctggccgag cacatcacca gccagggatc 650

tggagcgaac ttccgcgtta cacacttgaa cgacatcgtc ccccggttgc 700

cacccatgga ctttggattc agccagccaa gtccagaata ctggatcacc 750

agtggcaccg gagccagtgt cacggcgtcg gatattgaac tcatcgaggg 800

aatcaattcg acggcgggga atgcaggcga agcaacggtg ctcgttttgg 850

ctcacttgtg gtactttttc gcaatttcag agtgtctact gtag       894

本发明通过生物信息学分析，采用同源克隆的方法分离得到上述脂肪酶基因，该基因全长894bp，其中1-57bp为信号肽序列。

本发明还提供了包含上述脂肪酶基因的重组表达载体，命名为pPICzαA-lip。将本发明的脂肪酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列与可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的脂肪酶基因插入到质粒pPICzalphaA上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPICzαA-lip。

本发明还提供了包含上述脂肪酶基因的重组菌株，优选重组菌株是毕赤酵母菌株X33。

本发明还提供了一种高效表达上述脂肪酶基因的方法，包括以下步骤：

1）用上述的重组载体转化毕赤酵母细胞，得重组菌株；

2）重组菌株在发酵罐中进行发酵，诱导重组脂肪酶的表达；

3）发酵结束后，回收并纯化所表达的脂肪酶。

其中，重组菌株在发酵罐中的发酵过程可分为3个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按5%~10%的比例接入种子，培养24-30小时，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80%以上即表明该阶段结束，为期约30~60min；第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20%以上，培养时间在180~200小时之间。发酵结束后，发酵液可通过陶瓷膜或超滤膜处理后获得粗酶液。利用本发明的方法高效表达上述的重组脂肪酶，可达到5000U/mL的发酵水平，同目前已报道的相比，本发明的脂肪酶通过高效表达后能够达到更高的表达水平。

本发明是为了解决现有技术的不足，从黑曲霉中克隆得到一种脂肪酶基因。该脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达，可达到比现有技术更高的表达水平。因此，本发明的重组脂肪酶在工业生产中可大大降低生产成本，使其在洗涤、造纸、食品等工业中显示出更大应用潜力。

附图说明

图1脂肪酶活性检测功能平板图，紫外光下的YEPD-罗丹明B平板转化子1，2：转化子；CK：pPICzαA空载体对照转化子；

图2重组脂肪酶在50L罐中的发酵过程曲线；

图3重组菌株分泌表达脂肪酶的SDS-PAGE图谱，1：纯化后的重组脂肪酶；M：蛋白标准；

图4重组脂肪酶的最适反应温度；

图5重组脂肪酶的温度耐受性；

图6重组脂肪酶的最适反应pH值；

图7重组脂肪酶的pH耐受性；

图8金属离子和EDTA对重组脂肪糖酶酶活力的影响。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实验材料和试剂：

1、菌株与载体

大肠杆菌菌株Topl0、毕赤酵母X33、载体pPICzalphaA购自Invitrogen公司，载体pMD18-T购自TaKaRa公司。

2、酶与试剂盒

逆转录酶SuperScript^TM III、RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司。质粒DNA提取试剂盒，胶回收试剂盒，PCR纯化试剂盒购自上海生工公司。限制性内切酶购自Fermentas公司。

3、培养基

基本盐培养基：磷酸氢二铵5%、磷酸二氢钾0.5%、七水硫酸镁1.5%、硫酸钾1.95%、硫酸钙0.1%、氢氧化钾0.1%、消泡剂0.03%。高压后每升加4.35毫升PTM1

PTM1（微量盐溶液）：硫酸铜0.6%、碘化钾0.018%、一水硫酸锰0.3%、二水钼酸钠0.02%、硼酸0.002%、六水氯化钴0.05%、氯化锌2%、七水硫酸铁6.5%、浓硫酸0.5%、生物素0.02%

实施例1、黑曲霉Aspergillus niger脂肪酶基因lip的克隆及其序列分析

运用RNA提取试剂盒，提取黑曲霉Aspergillus niger总RNA，按照逆转录酶SuperScript^TM III Reverse Transcriptase操作说明合成第一链cDNA。以cDNA为模板，设计扩增脂肪酶基因的引物进行PCR扩增，将PCR产物由限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切，然后与经过同样酶切的毕赤酵母表达载体pPICzalphaA相连接，连接产物转化大肠杆菌Topl0感受态细胞，经抗生素Zeocin筛选后,获得阳性克隆。提取阳性克隆的质粒。送样到上海英骏生物公司测序，测序结果表明，获得克隆DNA插入片段含有脂肪酶基因完整的开放阅读框。该脂肪酶基因lip，全长894bp（SEQ IDNo.2），编码297个氨基酸（SEQ ID No.1），得到的重组表达载体命名为pPICzαA-lip，所用引物序列如下：

正向引物（含EcoRI酶切位点）：

5'-ATCGGAATTCATGTTCTCTGGACGGTTTGGAGT-3'

反向引物（含NotI酶切位点）：

5'-ATATGCGGCCGCCTATAGCAGACACTCTGAAATTG-3'

实施例2、包含脂肪酶基因lip的毕赤酵母工程菌的构建

将上述重组表达载体pPICzαA-lip用SacI进行线性化，线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母X33，得到毕赤酵母重组菌株转化子，用牙签将转化子转接到YPDZ培养基平板上，28℃培养2天，用牙签再将YPDZ培养基平板上的菌落转接至脂肪酶活性检测功能平板上，滴加甲醇进行诱导培养，定时观察脂肪酶活性检测功能平板的变化。实验结果如图1所示，转化子1和2周围有明显的显色圈，说明导入到毕赤酵母X33内的脂肪酶基因实现了功能性表达并分泌到细胞外。

实施例3、脂肪酶重组菌株的高效表达

将上述重组菌单菌落进行高密度发酵培养。配制20L基本盐培养基，在50L自动控制发酵罐中灭菌后，冷却至常温备用。用氨水和磷酸调节发酵液的pH值至4.8，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于30%，发酵温度为30℃。整个发酵过程分3个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，将重组菌按照10%的接种量接种至发酵罐中，流加已灭菌的4L 50%的葡萄糖，培养24~30小时，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80%以上即表明该阶段结束，为期约30~60min；第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20%以上，培养时间在160~190小时之间。发酵液可通过陶瓷膜或超滤膜处理后获得酶液。在发酵过程中的不同时间点取样测定酶活，发酵过程中脂肪酶的表达情况如图2所示，诱导培养180h的发酵液酶活为5000U/mL。

实施例4、重组脂肪酶的LIP活性分析

脂肪酶活力测定采用橄榄油乳化液水解滴定法，酶活定义：脂肪酶在40℃、pH8.0的条件下水解橄榄油乳化液产生1μmol/min脂肪酸所消耗的酶量，即为1个脂肪酶活力单位。实验设三次重复，每个样品测定均设三个平行实验，相对误差控制在8％以内。

实施例5、重组脂肪酶LIP的性质测定

1、重组脂肪酶LIP的分离纯化及其分子量大小

将上述发酵液中的脂肪酶通过硫酸铵分级沉淀、充分透析、再通过离子交换柱（Q Sepharose^TMFast Flow Ion Exchanger）层析纯化，将纯化后的蛋白液进行12％SDS－PAGE检测（见图3）。

2、重组脂肪酶LIP的最适反应温度及温度稳定性测定

在20℃~80℃下，以10℃为间隔，分别测定脂肪酶的活力，以在50℃的酶活力为基础，其它温度下测得的酶活与之相比，即得到该温度下的相对酶活。结果如图4，脂肪酶作用的最适合温度为50℃。将脂肪酶酶液在不同温度（30℃~80℃）下保温1h，测定残留脂肪酶活力，以未处理的酶活力为对照，其它温度下测得的酶活与之相比，即得到该温度下剩余的相对酶活。结果如图5：此脂肪酶在65℃以下较稳定，保温1h后剩余酶活可达到60%以上，超过此温度脂肪酶的活性急剧下降，在70℃处理1h后，剩余酶活仅为38%。

3、重组脂肪酶LIP的最适pH和pH稳定性

在不同pH值（4.0~11.0）的缓冲液体系中分别测定脂肪酶的酶活力，以pH值7.0的酶活力为基础，其它pH值下测得的酶活与之相比，即得到该pH值下的相对酶活。结果如图6所示：该脂肪酶作用的最适pH值为7.0。向上述不同pH值缓冲液体系中分别加入稀释好的酶液，室温处理2h，测定残留脂肪酶活力，以未处理的酶活力为对照。测定结果表明：该酶的pH稳定范围较广，在pH4.0~9.0范围内性质稳定，当pH值大于9.0后其酶活急剧下降。

4、金属离子和EDTA对酶活力的影响

将含有1mM Fe²⁺、Fe³⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Co²⁺、Al³⁺、Cu²⁺和EDTA的溶液与稀释适当倍数的酶液混合，室温放置30min，以未处理的酶液为对照，测定脂肪酶的相对酶活。结果如图8所示，在供试的9种金属离子中，1mM的Fe³⁺、Fe²⁺和Al³⁺对该酶的活性有显著抑制作用，而1mM Ca²⁺、Mg²⁺、Co²⁺对该酶有激活作用，Cu²⁺和EDTA对该酶酶活影响不显著。

Claims (7)

1.一种脂肪酶LIP，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种脂肪酶基因lip，其特征在于，编码权利要求1所述的脂肪酶LIP。

3.如权利要求2所述的脂肪酶基因lip，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2所述的脂肪酶基因lip的重组载体。

5.根据权利要求4所述重组载体为pPICzαA-lip。

6.一种高效表达脂肪酶LIP的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）用权利要求4所述的重组载体转化毕赤酵母细胞，得重组菌株；

2）重组菌株在发酵罐中进行发酵，诱导重组脂肪酶的表达；以及

3）发酵结束后，回收并纯化所表达的重组脂肪酶LIP。

7.权利要求1所述的脂肪酶LIP在洗涤、造纸、食品工业中的应用。

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