CN102660486A - 一株嗜热地芽孢杆菌utm01及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)菌株UTM01，其保藏编号为CGMCC No.5641。本发明提供的菌株UTM01最高生长温度达75℃，能在高温堆肥环境迅速增殖，降解有机物质，促进堆肥进程。本发明还提供了利用菌株UTM01制备的固态堆肥接种剂及其制备方法和应用，该堆肥接种剂生产成本低，质量稳定，可应用于高温污泥堆肥，不会影响堆体的含水率，且绿色环保，无污染，性能优良，具有较好的经济效益和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，具体地，涉及一种嗜热地芽孢杆菌菌株UTM01及其应用。
背景技术
堆肥化是有机固体废弃物转化为简单的有机质和氮等营养物质的有效途径，以其经济性和易操作性被广泛关注，为堆肥的产业化发展提供了契机，但是堆肥工厂化的发展一直受到因堆肥时间和场地带来的成本问题的困扰。
堆肥接种是从堆肥过程是微生物主导的有机物降解转化的机理出发，从多样化的环境或物料中分离驯化具有不同功能作用的优势微生物菌株，并通过培养发酵形成菌剂生产，然后接种至堆肥中以强化这一过程的，从而达到促进堆肥化的进程、缩短堆肥时间的目的。但目前堆肥接种剂大多以中温菌为主，但随着堆肥温度的升高，微生物种群受到很大的抑制，表现为种类单一、数量减少，比中温阶段要少1～2个数量级，这无疑限制了有机物质的快速降解；再者，堆肥高温阶段还是绝大部分的寄生虫、虫卵、孢子和病原菌等被杀死的重要阶段，是保证堆肥无害化的最重要阶段，由于微生物活性下降、有机物质的降解受到限制，也在一定程度上影响了堆肥的无害化效果。
地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)是一组在表型上相近和系统发育上一致的嗜热菌群，大多数能够在55℃以上生长。由于其具有嗜热、兼性厌氧，降解和利用碳氢化合物、产生表面活性剂的特性，在环境治理等领域中有潜在应用价值。将地芽孢杆菌作为接种剂应用于堆肥，将有效解决以上问题，促进堆肥进程。但目前还未见到关于地芽孢杆菌作为接种剂应用于高温污泥堆肥的报告。
发明内容
本发明的目的在于提供一种嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)及其应用。
本发明提供的菌株为嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)菌株，是从腐熟的高温污泥堆肥样品中在70℃下分离得到的，采用形态观察法和16SrRNA序列测定相结合的方法，将该菌鉴定为地芽孢杆菌属(Geobacillussp.)，并将其命名为UTM01。该菌株已于2011年12月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为Geobacillus sp.，保藏号为CGMCC No.5641。
嗜热地芽孢杆菌菌株UTM01在LB固体培养基平板上的培养1天后特征是：单菌落为淡黄色，圆形，直径约2mm，表面湿润，中央扁平，边缘完整。其温度生长特性是：在LB固体培养基平板上，挑取单菌落划线在65-75℃下暗箱培养约12小时，便可形成明显菌落。其菌体细胞特征是：杆菌，长度约5μm。所述LB固体培养基的成分是：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，植物凝胶10g，蒸馏水1000ml，pH 7.2-7.4。
本发明提供了含有嗜热地芽孢杆菌UTM01的菌剂。
本发明提供了嗜热地芽孢杆菌UTM01或其发酵产物或上述菌剂在堆肥中的应用。
本发明提供了嗜热地芽孢杆菌UTM01或其发酵产物或上述菌剂在制备堆肥接种剂中的应用。
本发明还提供了一种制备堆肥接种剂的方法，包括以下步骤：
1)活化培养：取本发明嗜热地芽孢杆菌菌株UTM01的菌种，接种至新鲜LB固体试管斜面培养基上，在60-70℃下活化培养12-48h；
2)种子液制备：按一支试管斜面接种一个锥形瓶，将活化菌种接种于LB培养液中，密封瓶口，在65-70℃下振荡培养1-3天，振荡频率为160-200rpm；
3)发酵菌液制备：将步骤2)制得的种子液按3％-10％的体积比加入灭菌LB培养液中，控制温度65℃-70℃，每隔4-6h，通气10-30min，通气量按体积比0.8-1.5∶1，每隔12h搅拌10-20min，160-180rpm搅拌，培养2-4天；
4)堆肥接种剂制备：将麦麸与玉米面按重量比1-2∶1混合后，然后分别添加硫酸铵、尿素和发酵菌液，再添加总重量0.1％-0.5％的糖类，混合均匀，使其含水率在45％-55％之间，用1％-2％石灰水调节pH为7.0-7.4。
其中所述步骤4)是分别按麦麸和玉米面的总重量0.1％-1％添加硫酸铵，0.1％-3％添加尿素，0.5％-3％添加发酵菌液。
本发明提供的制备堆肥接种剂的方法还包括以下步骤：堆置15-25天后，期间翻堆1-2次，将堆体摊开陈化使其含水率下降至30％以下，即得固态堆肥接种剂。
本发明提供了上述方法制备得到的堆肥接种剂。
本发明还提供了上述堆肥接种剂在污泥堆肥中的应用。
堆肥接种剂的应用方法是：在堆肥物料添加辅料，使堆肥物料碳氮比为20-30∶1，含水率50％-60％进行混合完毕后，按物料总干重的0.1％-1.0％将堆肥接种剂添加到物料中，混合均匀。
本发明提供的嗜热地芽孢杆菌菌株UTM01是一种新发现的嗜热地芽孢杆菌资源，最高生长温度可达75℃，能在堆肥环境中尤其是堆肥高温期迅速增殖，形成优势种群，降解有机物质，促进堆肥进程；利用本发明菌株制备的堆肥接种剂为含水率在30％以下的小颗粒固体，可长期保存，且添加到堆肥时不会对堆体的含水率造成较大影响，是一种优良的堆肥调理剂。因此，本发明的嗜热地芽孢杆菌菌株UTM01具有重要的经济价值和应用前景，适合大规模应用于堆肥中，可在有机固体废物处理中推广使用。
附图说明
图1为显微镜下嗜热地芽孢杆菌菌株UTM01(1000×)。
图2为堆肥过程中温度变化曲线。
图3为堆肥过程中挥发分的变化。
图4为堆肥过程中碳氮比的变化。
图5为堆肥过程中发芽指数的变化。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 嗜热地芽孢杆菌UTM01的分离与鉴定
在无菌的环境中，称取10g污泥腐熟堆肥样品于装有10粒玻璃珠的100ml无菌水三角瓶中，用锡箔纸封口，置于摇床上160r/min振荡30分钟，使样品充分散开，然后放置70℃下，静置富集培养6-12天。
取出以上富集培养三角瓶，用无菌吸管吸取1ml上清液加到装有9ml无菌水中即得(10-1)稀释液。依次类推，制得10-1至10-3稀释液。取9个无菌平皿，用1ml无菌吸管分别吸取以上稀释液0.1ml，接入平板，每一稀释度设3个重复；将已融化并冷却至约50℃的LB培养基倒入无菌培养皿中，每皿约20ml，与菌液充分混匀，凝固后，在培养皿上作好稀释度及日期标记。
然后将各平板倒置于密闭箱中，将其置于干燥箱中70℃下暗箱培养2天，观察各平板的生长情况，选择菌落分散较好的平板上挑取菌落形态不同的单菌落进行划线培养，如此至2代以后，将形态一致的菌落制片，进行简单染色，在油镜下观察菌体形态，多视野下观察菌体细胞形态，确认菌体形态一致后，用LB培养基斜面培养至丰厚，于4℃冰箱中保存菌种，备用。
上述LB培养基的成分为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，植物凝胶10g，蒸馏水1000ml，pH 7.2-7.4。
将本发明菌株菌落制片，用结晶紫染料进行简单染色，油镜下观察菌体细胞形态，结果显示均为杆状菌，见图1；以本发明菌株的DNA为模板，PCR扩增其16S rRNA序列，引物为(27f)：5′-AGA GTT TGA TCCTGG CTC AG-3′和(1492r)：5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环，72℃延伸10min。扩增产物经电泳检测其纯度后测序，测序结果见序列表SEQ ID No.1所示。将16S rRNA基因序列在GenBank中进行Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，发现与Geobacillus sp.O83(DQ642093.1)相似度最高，把该菌株鉴定为地芽孢杆菌属(Geobacillus sp.)，命名为UTM01，并于2011年12月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为Geobacillus sp.，保藏号为CGMCC No.5641。
实施例2 堆肥接种剂的制备
(1)活化培养：取本发明嗜热地芽孢杆菌菌株UTM01的4℃保藏菌种，接种至新鲜LB固体培养基上，在60℃下活化培养48小时；
(2)种子液制备：按一支试管斜面接种一个锥形瓶，将活化培养得到菌种菌落全部接种至装有LB培养液的锥形瓶中，密封瓶口，置于水浴恒温振荡器上，在65℃下振荡培养2天，振荡频率为160rpm；
(3)发酵液制备：摇瓶种子液按5％(v/v)接入装有60L已灭菌LB培养液的100L容积的发酵罐中，控制温度65℃，每隔6小时通气20分钟，通气量按1∶1(v/v)，每隔12小时搅拌15分钟，160rpm搅拌，培养3天；
(4)堆肥接种剂制备：取麦麸与玉米面各40kg混合后，然后分别按总重量0.3％和0.2％添加硫酸铵和尿素，按总重量2.5％接种发酵菌液，适当加水，混合均匀，使其含水率约45％，视情况，用1％石灰水调节pH为7.0，进行堆置，第7天翻堆，发酵至第11天后，再次进行翻堆，在第15天将堆体摊开陈化一段时间使其含水率下降至30％以下，即得固态堆肥接种剂。
实施例3 堆肥接种剂的制备
(1)活化培养：取本发明嗜热地芽孢杆菌菌株UTM01的4℃保藏菌种，接种至新鲜LB固体培养基上，在70℃下活化培养24小时；
(2)种子液制备：按一支斜面试管接种一个锥形瓶，将活化的菌种斜面接种至装有已灭菌LB培养液的锥形瓶中，然后密封瓶口，置于水浴恒温振荡器上，在70℃下振荡培养36小时，振荡频率为200rpm；
(3)发酵液制备：摇瓶种子液按10％(v/v)接入装有60L已灭菌LB培养液的100L容积的发酵罐中，控制温度70℃，每隔4小时通气30分钟，通气量按1.5∶1(v/v)，每隔12小时搅拌10分钟，180rpm搅拌，培养2天；
(4)堆肥接种剂制备：取麦麸与玉米面分别为60kg和30kg混合后，然后分别按总重量1％和3％添加硫酸铵和尿素，按总重量1.5％接种发酵液，适当加水，混合均匀，使其含水率在55％，视情况，用2％石灰水调节pH为7.4，进行堆置，第8和16天翻堆，于第24天将堆体摊开放置一段时间使其含水率下降至30％以下，即得固态堆肥接种剂。
实施例4 堆肥接种剂的制备
(1)活化培养：取本发明嗜热地芽孢杆菌菌株UTM01的4℃保藏菌种，接种至新鲜LB固体培养基上，在65℃下活化培养28小时；
(2)种子液制备：按一支斜面试管接种一个锥形瓶，将活化的菌种斜面接种至装有已灭菌LB培养液的锥形瓶中，然后密封瓶口，置于水浴恒温振荡器上，在68℃下振荡培养2天，振荡频率为180rpm；
(3)发酵液制备：摇瓶种子液按3％(v/v)接入装有60L已灭菌LB培养液的100L容积的发酵罐中，控制温度68℃，每隔5小时通气10分钟，通气量按0.8∶1(v/v)，每隔12小时搅拌10分钟，170rpm搅拌，培养3天；
(4)堆肥接种剂制备：取麦麸与玉米面分别为60kg和40kg混合后，然后分别按总重量0.5％和2％添加硫酸铵和尿素，按总重量3％接种发酵菌液，适当加水，混合均匀，使其含水率在50％，视情况，用1.5％石灰水调节pH为7.2，进行堆置，第7、14天翻堆，再继续发酵6天后，将堆体摊开陈化一段时间使其含水率下降至30％以下，即得固态堆肥接种剂。
实施例5 堆肥接种剂的应用
本例以污泥为堆肥主料，说明本发明堆肥接种剂的应用。
采集某污水厂污泥样品，检测其基本性质为：含水率79.87％，含碳量22.56％，含氮量2.07％，重金属含量为Cr 128mg/kg，Cu 62.8mg/kg，Ni 43.6mg/kg，Pb 68.0mg/kg，Zn 422mg/kg，Cd 1.22mg/kg，Hg 1.46mg/kg，As 38.8mg/kg，在城镇污水厂污泥处置农用泥质标准(CJ/T309-2009)A级污泥限值以下。取中药渣与花生壳粉作为辅料，调节物料的含水率与碳氮比，具体的，取污泥4吨、中药渣和花生壳粉各1吨，进行混合，然后添加40kg实施例2制备的固态堆肥接种剂，充分混合均匀，进行堆置发酵10-15天后，再进行二次陈化，使含水率降至30％以下，陈化后的堆肥可作为土壤改良剂或进行深加工制备功能性商品有机肥料进行出售。
按照上述同样的方法，采用实施例3和4制备的固体堆肥接种剂进行堆肥应用，也能得到上述相同的有机肥产品。
实施例6 堆肥接种剂的应用效果
下面以实施例5中的堆肥原料进行效果验证试验。具体的堆肥原料用量为：污泥400kg、辅料选用中药渣和花生壳粉各100kg，本固态堆肥接种剂400g，充分混合均匀，进行堆置发酵。
另以等量已灭活的本固态堆肥接种剂按相同方法进行堆肥，作为对照。堆肥周期为15天，每天10∶00和16∶00多点检测堆肥温度的大小，取两者的平均值作为当天的堆肥温度，分别于第0、3、6、9、12、15天在堆肥表层10-20cm处采样，按5点采样法的原则，充分混匀。取干样和鲜样各3份，干样风干备用，鲜样储存于4℃冰箱中待用。堆肥温度变化见图2。
表1 菌剂接种对堆肥温度的影响分析
| 实验处理 | 达到50℃天数 | ＞50℃持续的天数 | 最高温度 | 累积温度 |
| 接菌堆肥 | 第3天 | 8天 | 66.5℃ | 720.5℃ |
| 空白对照 | 第4天 | 6天 | 57.0℃ | 689.5℃ |
从上表可见，接种本发明固态接种剂后，缩短了堆肥从中温进入高温期(＞50℃)的时间，使堆肥高温期(＞50℃)提前1天，高温期(＞50℃)维持的天数延长2天，堆肥最高温度提高，微生物活性明显提高，保证有机物料的快速降解及提高堆料的无害化程度，从而缩短了堆肥周期。
从图3可见，整个堆肥过程中，接种处理挥发分的含量均比相同时期的空白对照的低，堆肥结束时，接种处理与空白对照的挥发分降解率分别是28.4％与24.8％，接种处理明显要高于空白对照，说明接种本发明菌剂加快了有机物的分解速率。
从图4可见，接菌堆肥与空白对照相比，碳氮比下降的速度快，在第12天后趋于稳定，而空白对照则一直呈下降趋势，说明接种本菌剂能加快堆肥有机物料的降解，达到稳定化的程度，最终的碳氮比及T值(终点C/N：初始C/N)分别为：17.1与19.9及0.59与0.69。
从图5可见，堆肥过程中，发芽指数基本呈上升趋势；在第6天后，接种堆肥的发芽指数比空白对照上升的速率更快些，到堆肥结束时分别增加为90.1％和84.5％。说明接种本发明提供的固态接种剂有利于减少堆肥的生物毒性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一株嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)菌株UTM01，其保藏编号为CGMCC No.5641。
2.含有权利要求1所述嗜热地芽孢杆菌UTM01的菌剂。
3.权利要求1所述的嗜热地芽孢杆菌UTM01或其发酵产物或权利要求2所述的菌剂在堆肥中的应用。
4.权利要求1所述的嗜热地芽孢杆菌UTM01或其发酵产物或权利要求2所述的菌剂在制备堆肥接种剂中的应用。
5.一种制备堆肥接种剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)活化培养：将权利要求1所述嗜热地芽孢杆菌菌株UTM01的菌种在60-70℃下活化培养12-48h；
2)种子液制备：将活化菌种接种于LB培养液中，密封瓶口，在65-70℃下振荡培养1-3天，振荡频率为160-200rpm；
3)发酵菌液制备：将步骤2)制得的种子液按3％-10％的体积比加入灭菌LB培养液中，控制温度65℃-70℃，每隔4-6h，通气10-30min，通气量按体积比0.8-1.5∶1，每隔12h搅拌10-20min，160-180rpm搅拌，培养2-4天；
4)堆肥接种剂制备：将麦麸与玉米面按重量比1-2∶1混合后，然后分别添加硫酸铵、尿素和发酵菌液，再添加总重量0.1％-0.5％的糖类，混合均匀，使其含水率在45％-55％之间，用1％-2％石灰水调节pH为7.0-7.4。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤4)是分别按麦麸和玉米面的总重量的0.1％-1％添加硫酸铵，0.1％-3％添加尿素，0.5％-3％添加发酵菌液。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：堆置15-25天后，期间翻堆1-2次，将堆体摊开陈化使其含水率下降至30％以下。
8.权利要求5-7任一所述方法制备得到的堆肥接种剂。
9.权利要求8所述的堆肥接种剂在污泥堆肥中的应用。
10.权利要求9所述的应用，其特征在于，在污泥中添加辅料，使碳氮比为20-30∶1，含水率50％-60％；混合完毕后，按堆肥物料总干重的0.1％-1.0％将堆肥接种剂添加到污泥中，混合均匀；所述辅料为中药渣和/或花生壳粉。
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