CN108641984A - 一株尿素芽胞杆菌sc-7及其在堆肥中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株尿素芽胞杆菌SC‑7及其在堆肥中的应用。本发明提供了一株尿素芽胞杆菌SC‑7,其保藏编号为CGMCC No.14961,该菌能够在高温条件下快速生长繁殖。将所述尿素芽胞杆菌发酵培养制备含有该菌的液体或固体菌剂,将其添加至堆肥中,能够显著缩短堆肥的升温时间,同时明显延长堆肥的高温期,进而加速堆肥的腐熟,同时促进残留抗生素的降解。本发明提供的尿素芽胞杆菌或含有该菌的菌剂对多种不同性质和种类的常用抗生素都具有较高的去除效率,从而能够实现残留抗生素的有效去除,减少抗生素残留对人类健康和环境的影响。
Description
技术领域
本发明涉及环境及农业生物技术领域,具体地说,涉及一株尿素芽胞杆菌SC-7及其在堆肥制备中的应用。
背景技术
为了满足消费者对畜禽产品的日益增长的需求,我国的养殖模式已从散户养殖转向规模化、集约化养殖。由于抗生素在促生长、预防和治疗动物疾病方面具有良好的效果,所以长期以来被广泛用于集约化畜禽养殖业。据统计,2013年我国抗生素总使用量约为16.2万吨,其中有52%为兽用抗生素。而这些用于畜禽养殖的抗生素大多数不能被动物完全吸收,约有60~90%的抗生素以原药或初级代谢产物的形式随动物粪尿排放到环境中,导致抗生素大量残留,如不经有效的无害化处理,则会进一步导致环境中抗生素耐药基因增殖,给公共健康带来更大的威胁。
高温好氧堆肥是畜禽养殖粪便有效的无害化、资源化处理手段之一,研究表明,堆肥也是促进养殖粪便中残留抗生素降解的有效方法,微生物好氧发酵过程中产热会使粪便中抗生素发生高温降解。但现有的堆肥工艺常常注重的是有机质、总养分、含水率等肥料指标,并不关注抗生素残留的降解,使得商品有机肥中仍然有一定程度的抗生素残留。
现有畜禽粪便堆肥过程中去除抗生素的技术,主要涉及添加调理剂(如竹炭、活性炭、木屑、凹凸棒土)、预处理剂(酸或碱),采用物理或者化学方法,通过调节含水量、堆体孔隙度来提高堆肥反应对抗生素的处理效果。这种外源添加特定调理剂的方法受到地域或市场影响,具有一定的局限性。目前只有少数研究涉及了通过添加微生物菌株(如黄孢原毛平革菌等),提高抗生素的降解效果。然而,目前堆肥中菌剂所使用菌株多数为中温菌株,如芽胞杆菌、乳酸菌、木霉菌等,虽然有些微生物能够耐受堆肥的高温,但并不能在高温状态下保持活性,并发挥作用。
针对以上抗生素残留且降解不完全的现象,需要能够快速提升堆肥温度,并尽可能的延长高温时间的堆肥技术,以保证粪便中残留的抗生素的有效降解,减少对环境和人类健康的危害。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题,本发明的目的在于提供一种尿素芽胞杆菌SC-7及其在堆肥中的应用。
首先,本发明提供一株尿素芽胞杆菌(Ureibacillus sp.)SC-7。所述尿素芽胞杆菌SC-7于2017年11月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),分类命名为Ureibacillus sp.,保藏编号为CGMCC No.14961。
所述尿素芽胞杆菌SC-7分离自沼渣高温堆肥,是一种嗜热菌,能够在高温下生长繁殖。其菌体形态及特性如下:杆菌(图1),革兰氏阴性,有鞭毛,具有运行性,形成白色形态不规则菌落。可在为35℃-60℃之间生长,过氧化氢酶与氧化酶阳性,厌氧条件下不生长。可利用碳源有葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇等单糖;能够水解淀粉、明胶、酪蛋白和尿素。
进一步地,本发明提供了包含所述尿素芽胞杆菌SC-7的菌剂,其中所述菌剂为液体菌剂或固体菌剂。
更进一步地,本发明提供了所述菌剂的制备方法。
其中,所述液体菌剂的制备方法为将所述尿素芽胞杆菌SC-7经发酵培养获得发酵菌液或经过处理的发酵菌液;
所述固体菌剂的制备方法为将所述发酵菌液与干燥剂混合后,经过喷雾干燥制得。所述干燥剂包括但不限于无水钙盐,优选为无水碳酸钙或无水氯化钙。
本领域技术人员应当知晓,尽管本发明提供的菌剂为发酵菌液或发酵菌液经干燥制得,但根据实际需要,本领域技术人员也可以对发酵菌液进行其它预处理后制得菌剂。进一步地也可以在获得菌剂的基础上加入其它辅料成分制备其它微生物制剂(如微生物堆肥促进剂等)。
具体地,所述液体菌剂的制备方法如下:
(1)菌种活化:无菌条件下,挑取4℃低温保存于斜面培养基的尿素芽孢杆菌SC-7菌株,在固体培养基上划线,50℃±2℃培养12~24小时。
(2)种子培养:挑取一环步骤(1)获得的培养物接种至液体种子培养基中,在45~50℃条件下,摇床振荡培养12~24小时至菌数达到1×103个/ml~1×107个/ml数量级,得到种子液。
(3)发酵培养:将步骤(2)获得的种子液,按1~10%的体积比,接种至发酵培养基中,45~50℃发酵培养,至总菌数达到1×104个/ml~1×1012个/ml数量级,停止发酵,所得发酵菌液即为所述液体菌剂。
所述固体菌剂为将步骤(3)获得的发酵菌液与灭菌的无水碳酸钙混合后,经过喷雾干燥制得。
在本发明的具体实施方式中,作为示例,所述固体培养基为牛肉膏蛋白胨固体培养基:牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,NaCl 5.0g,琼脂15-20g,以蒸馏水补足至1L,1N盐酸调pH至7.4-7.6。所述种子培养基为牛肉膏蛋白胨液体培养基:牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,NaCl5.0g,以蒸馏水补足至1L,1N盐酸调pH至7.4-7.6。所述发酵培养基为:葡萄糖5g,淀粉15g,豆粕30g,玉米浆1g,磷酸氢二钠2g,硫酸镁1g,以蒸馏水补足至1L。
本领域技术人员应该理解,所述发酵的目的是提供尿素芽胞杆菌SC-7菌体。而培养基的组分和用量以及培养条件(温度,转速等)均可以根据不同的菌体生长速度和最终菌体量的需求进行调整,因此,培养尿素芽胞杆菌SC-7菌株的培养基和培养条件的选择不限于本发明具体实施方式中提供的培养基和培养条件。
本发明提供的尿素芽胞杆菌SC-7能在高温条件下快速增殖,从而缩短堆肥升温时间,延长堆肥高温期的时间,提高堆肥效率。同时,利用尿素芽胞杆菌SC-7高温生长的特性,能够促进有机废料中抗生素的降解,从而使得抗生素残留得到有效去除。
因此,另一方面,本发明还提供所述尿素芽胞杆菌SC-7或所述菌剂在净化有机废料中抗生素的应用。
以及,所述尿素芽胞杆菌SC-7或所述菌剂在堆肥中的应用。所述应用为在堆肥降解抗生素、加速堆肥腐熟、缩短堆肥升温时间和/或延长堆肥高温期中的应用。
其中,所述抗生素可以为四环素类、磺胺类、喹诺酮类或大环内酯类抗生素,具体可为土霉素、磺胺甲恶唑、环丙沙星或红霉素。
本领域技术人员应当理解,堆肥原料中可含有不同的有机质,在本发明具体实施方式中,堆肥原料主要为畜禽粪便,但堆肥原料的选择可以不限于此。
所述应用为将所述尿素芽胞杆菌SC-7或所述菌剂添加至所述有机废料或所述堆肥。具体地,所述应用为将所述菌剂以与所述有机废料或所述堆肥的质量比大于等于0.5‰的用量添加。
优选地,其中,所述液体菌剂的使用方法具体为将菌剂按堆肥原料的0.5~3.0‰(V/W)喷施至堆肥表面,使得菌液均匀覆盖堆体表面,可以在堆肥原料翻堆前进行喷施,也可随翻堆机一起喷施,促进堆体升温。
所述固体菌剂的使用方法为按堆肥原料的0.5~3.0‰(W/W)均匀撒布在堆肥原料表面。
本发明提供的菌剂或微生物分为液体和固体两种形态,在常温条件下,液体形态的菌剂有效期约为两个月,固体形态的菌剂的有效期为六个月以上。本领域技术人员可以根据实际情况的需要进行选择使用。
本发明的有益效果在于:
1、本发明提供的尿素芽胞杆菌及其菌剂能够利用有机废料中淀粉、蛋白等大分子物质快速生长繁殖,使堆肥堆体内达到最高温度的时间缩短了1天,且最高温度能够达到68.3℃,同时堆体内温度维持在50℃以上的时间延长了5天,从而实现迅速升温且高温期时间较长,能够促进堆肥腐熟,提高堆肥效率。
2、本发明提供的尿素芽胞杆菌及其菌剂能够在堆肥的高温期有效增殖,使得高温期时间延长,从而实现有机废料中残留抗生素的有效降解。
3、相比于现有技术中使用的菌剂对抗生素作用效果的选择性,本发明提供的尿素芽胞杆菌及其菌剂能够对于多种不同性质和种类的常用抗生素均具有99%以上的去除效率。
4、本发明提供的尿素芽胞杆菌可以在高温情况下快速繁殖,与中温菌相比具有更短的发酵周期,较高的发酵温度节约了发酵降温成本,从而节省了菌剂的生产成本。
5、本发明提供的菌剂的制备工艺及使用方法简单,易于操作,可以在实践上用于堆肥。
附图说明
图1为尿素芽胞杆菌SC-7在光学显微镜下的菌体形态图。
图2为尿素芽胞杆菌SC-7在鸡粪堆肥过程中堆体内温度变化。
图3为尿素芽胞杆菌SC-7在鸡粪堆肥中抗生素(分别为土霉素、磺胺甲恶唑、环丙沙星和红霉素)的浓度变化。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的,并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下,可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
实施例1液体菌剂的制备
包含尿素芽胞杆菌SC-7的液体菌剂的制备方法如下。
(1)菌种活化:无菌条件下,挑取4℃低温保存于斜面培养基的尿素芽孢杆菌SC-7菌株,在新鲜的牛肉膏蛋白胨固体培养基上划线,50℃±2℃培养24小时。
牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,NaCl 5.0g,琼脂15-20g,以蒸馏水补足至1L,1N盐酸调pH至7.4-7.6,121℃,灭菌20分钟。
(2)种子培养:配制牛肉膏蛋白胨液体培养基:牛肉膏0.6g,蛋白胨2g,NaCl 1g,加水补足至200ml,1N盐酸调pH至7.4-7.6,分装至2个250ml三角瓶,每瓶100ml,121℃,灭菌20分钟。在上述牛肉膏蛋白胨液体培养基中接种经过步骤(1)活化的尿素芽胞杆菌SC-7,45~50℃,150~200转/分钟,摇床培养12小时,获得的菌液作为种子液。
(3)发酵培养:在7L小型发酵罐中加入5L水,并加入葡萄糖25g,淀粉75g,豆粕150g,玉米浆5g,磷酸氢二钠10g,硫酸镁5g,115℃,灭菌20min。培养基温度降至50℃时,将2瓶种子液混合接种于发酵罐内,温度50℃、通气量5L/分钟、搅拌转速150-200rpm,加入2.5ml泡敌作为消泡剂,每两小时取样一次,稀释后测600nm下的吸光度,至总吸光度值达到20时,停止发酵,发酵液即为液体菌剂。
实施例2固体菌剂的制备
包含尿素芽胞杆菌SC-7的固体菌剂的制备方法如下。
(1)菌种活化:无菌条件下,挑取4℃低温保存于斜面培养基的尿素芽孢杆菌SC-7菌株,在新鲜的牛肉膏蛋白胨固体培养基上划线,50℃±2℃培养24小时。牛肉膏蛋白胨固体培养基的配制同实施例1的步骤(1)。
(2)种子培养:配制牛肉膏蛋白胨液体培养基,牛肉膏4.8g,蛋白胨16g,NaCl 8g,加水补至1.6L,1N盐酸调pH至7.4~7.6,分装至500ml三角瓶,每瓶装液160ml,共10瓶,121℃,灭菌20分钟。在上述牛肉膏蛋白胨液体培养基中接种经过步骤(1)活化的尿素芽孢杆菌SC-7十瓶,50℃,200转/分钟,摇床培养12小时,得到的菌液作为种子液。
(3)发酵培养:在100L发酵罐中加入75L水,并加入葡萄糖375g,淀粉1125g,豆粕30g,玉米浆2250g,磷酸氢二钠150g,硫酸镁75g,121℃,灭菌20分钟。培养基温度降至50℃时,将10瓶种子液混合成3瓶并接种于发酵罐内,发酵温度50℃,罐压0.05Mpa,通气量80L/分钟,搅拌转速150rpm,加入40ml泡敌作为消泡剂,每两小时取样一次,稀释后测波长600nm下的吸光度,至发酵菌液吸光度值达到2.0,停止发酵。
(4)将步骤(3)获得的菌液与灭菌的无水碳酸钙混合后,并经过喷雾干燥,获得固体菌剂。
实施例3尿素芽胞杆菌SC-7菌剂在堆肥中的应用
实验材料:实验用鸡粪取自北京市密云某养鸡场,粪便采集前5天,家禽施用不含抗生素的饲料,采集第6天的新鲜粪便自然晒干供堆肥使用。
实验方案:设置实验组(加菌)和对照组(不加菌),每组设两个重复,主要堆肥成分如下蘑菇渣9.2kg,鸡粪18.3kg,含水率为60%,并在堆肥中人为添加土霉素、磺胺甲恶唑、环丙沙星、红霉素,使每种抗生素的终浓度达到60mg/kg。实验组:取高温尿素芽胞杆菌SC-7菌液30g,并使用300g清水稀释后,与堆肥物料混合均匀。定期检测堆体内部温度,取样并检测堆肥中抗生素浓度。
采用固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱方法检测抗生素的浓度。
实验结果:经过畜禽粪便堆肥实验,结果表明,添加含有尿素芽胞杆菌菌剂的实验组的堆体内升温迅速(图2),只需2天即可达到最高温度68.3℃,与对照组相比,其达到最高温度的时间提前了1天,基本没有发酵延迟期,且加入尿素芽胞杆菌菌剂的实验组达到的最高堆体内温度比对照组提高了2.9℃;同时,实验组的堆体内温度在50℃以上维持了20天,与对照组相比延长了5天左右;在高温期结束后,土霉素、磺胺甲恶唑、环丙沙星、红霉素四种抗生素的去除率均达到了99%以上(图3),与对照组80~90%间的去除率相比,添加含有尿素芽胞杆菌的菌剂的实验组的抗生素去除率显著的提高,说明添加该菌剂能够促进畜禽粪便中抗生素的快速降解。
综上所述,利用本发明提供的尿素芽胞杆菌SC-7或含有尿素芽胞杆菌SC-7的菌剂,能够显著缩短畜禽养殖粪便堆肥的升温时间,并延长高温期时间,同时使畜禽粪便中残留的多种抗生素的得到有效去除。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一株尿素芽胞杆菌SC-7,其特征在于,其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.14961。
2.包含权利要求1所述的尿素芽胞杆菌SC-7的菌剂,其特征在于,所述菌剂为液体菌剂或固体菌剂。
3.权利要求2所述菌剂的制备方法,其特征在于,其中,所述液体菌剂为将所述尿素芽胞杆菌SC-7经发酵培养获得发酵菌液或经过处理的发酵菌液;所述固体菌剂为将所述发酵菌液或经过处理的发酵菌液与干燥剂混合后,经过喷雾干燥制得,所述干燥剂优选为无水钙盐,更优选为无水碳酸钙或无水氯化钙。
4.权利要求1所述尿素芽胞杆菌或权利要求2所述菌剂在净化有机废料中抗生素的应用。
5.权利要求1所述尿素芽胞杆菌或权利要求2所述菌剂在堆肥中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述应用为在堆肥降解抗生素中的应用。
7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述应用为在加速堆肥腐熟中的应用。
8.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述应用为在缩短堆肥升温时间和/或延长堆肥高温期。
9.根据权利要求4-8任意一项所述应用,其特征在于,所述应用为将所述尿素芽胞杆菌SC-7或含有其的菌剂添加至有机废料或堆肥。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述应用为将所述菌剂以与所述有机废料或所述堆肥的质量比大于等于0.5‰的用量添加。
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