CN101177696B

CN101177696B - 一种鼠李糖脂生物发酵液的工业化制备方法

Info

Publication number: CN101177696B
Application number: CN2007101665125A
Authority: CN
Inventors: 陈韶军; 金艳芳; 张生; 赵力; 隋志强; 汪成章; 于洋; 王守忠; 沈超; 刘志梅
Original assignee: Daqing Vertex Chemical Co ltd
Current assignee: Beijing Victex Environmental Protection Technology Development Co ltd
Priority date: 2007-11-05
Filing date: 2007-11-05
Publication date: 2011-06-08
Anticipated expiration: 2027-11-05
Also published as: CN101177696A

Abstract

本发明涉及一种鼠李糖脂生物发酵液的制备方法。该方法包括下列步骤：在石油污染的土壤中提取并经过分离纯化得到的铜绿假单胞菌，该菌种经亚硝基胍诱变后得到铜绿假单胞菌VTS-1(Pseudomonas sp.VTS-1)保藏编号为：CGMCC2200，具体发酵培养步骤如下：A、菌种VTS-1接入摇瓶培养；B、一级发酵培养；C、二级发酵培养；D、发酵培养。该方法艺具有产量高、效率高、装料系数高、发酵周期短、工艺简单，使产品综合成本降低，完全适合工业化生产，对鼠李糖脂生物表面活性剂的推广及大规模应用起到了重要的作用。

Description

一种鼠李糖脂生物发酵液的工业化制备方法

技术领域：

本发明涉及一种生物表面活性剂的生产方法，尤其是一种鼠李糖脂生物发酵液的工业化制备方法。

背景技术：

鼠李糖脂属于一种糖脂类表面活性剂，是在发酵过程中微生物生长到一定阶段在适宜的条件下产生的一种胞外代谢产物，它是生物表面活性剂中效果较好的一种，同其它合成的表面活性剂一样，其分子结构具有亲水和疏水两种性能，并能降低表面张力，同时它有自己的特点：具有很高的生物降解性和更低的生物毒性、低的临界胶束浓度和更高的表面活性、吸收逐步、活性持续等特点。目前鼠李糖脂的研究一直都处在室内研究阶段，没有形成工业化生产规模并且发酵液鼠李糖脂含量低。目前，生产鼠李糖脂大多采用微生物发酵法，但仅限于实验室阶段，尚为进入工业化大生产阶段且没有与之相匹配的制备方法，并且现有的制备方法效率低、成本高及含量低，因此应用受到限制。

发明内容：

为了克服背景技术的不足，本发明提供一种新型的鼠李糖脂生物发酵液的工业化生产方法，这种生产工艺具有产量高、效率高、装料系数高、发酵周期短、工艺简单，使产品综合成本降低，完全适合工业化生产，对鼠李糖脂生物表面活性剂的推广及大规模应用起到了重要的作用。

本发明的技术方案是：该鼠李糖脂发酵液是由在石油污染的土壤中提取并经过分离纯化得到的铜绿假单胞菌经亚硝基胍诱变发酵培养产生，该生物材料分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、保藏编号为：CGMCC2200、保藏日期为2007年10月17日、保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、地址北为京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，具体发酵培养步

骤如下：A、菌种VTS-1接入摇瓶培养，温度为32±2℃、120转/分震荡培养12～16小时，得到摇瓶菌种；B、一级发酵培养：将A步骤中的摇瓶菌种按5％～10％的接种量转接入装有培养基的一级发酵罐中，在温度为32±2℃、pH 6.5～7.5、通风比1∶0.5～1及搅拌速度为100～150转/分的条件下发酵培养10～18小时，得到一级发酵菌种；C、二级发酵培养：将B步骤中的一级发酵菌种按5％～10％的接种量转接入装有培养基的二级发酵罐中，在温度为32±2℃、pH 6.5～7.5、通风比1∶0.5～1及搅拌速度为100～150转/分的条件下发酵培养10～18小时，得到二级发酵菌种；D、发酵培养：将C步骤中的二级发酵菌种按5％～10％的接种量转接入装有培养基的三级发酵罐中，在温度为32±2℃、pH 6.5～7.5、通风比1∶0.5～1、搅拌速度为100～150转/分及补料条件下发酵培养45～55小时，再进行80℃灭菌得到鼠李糖脂发酵液。

上述的斜面培养基配方：牛肉膏0.3％、蛋白胨1％、NaCl 0.5％、琼脂2％，其余为蒸馏水，pH 6.2；摇瓶及发酵罐培养基配方：玉米油2～5％、尿素0.2～1.5％、糖蜜15～20％、KCl 0.05～1.0％、KH₂PO₄0.05～1.2％、K₂HPO₄0.05～1.5％、酵母膏0.005～0.1％及复合微量元素0.005～0.01％，余量为水，pH为6.5，所述的复合微量元素为Zn 1.5g/L、Cu 1.0g/L、Mn 1.0g/L、Se 1.5g/L、Co 1.0g/L及溶剂水复配而成；步骤D中所补的料是玉米油，每次补料量为1％～5％；各级发酵罐的装料系数是60～75％。

本发明具有如下有益效果：本发明是通过特定的微生物在适宜的培养基、培养环境、工艺控制等条件下和工艺下进行微生物发酵培养得到的一种生物发酵液。整个生产制备过程是逐级扩大发酵纯培养的过程。得到的鼠李糖脂生物表面活性剂发酵液经过杀菌和离心分离后，根据各种用途的需要纯化成不同等级的产品，广泛应用于三次采油、日化、农药、食品、土壤修复等行业。该生产工艺生产的鼠李糖脂生物表面活性剂，具有产量高、周期短、装料系数高、工艺简单等特点，实现了鼠李糖脂生物表面活性剂的工业化生产。本发明具有以下优点：(1)本发明首次将化学诱变方法应用与假单胞菌，并且成功得到了一株鼠李糖脂高产菌株Pseudomonas sp.VTS-1，为将来的基因工程改造假单胞菌奠定了实践基础；(2)本发明的鼠李糖脂含量达到35～45g/L，并取得了工业化生产实验的成功，发酵周期缩短到50小时，大大降低了生产成本；(3)本发明首次将工业化生产的鼠李糖脂发酵液应用现场，将其注入地下油层，使原来难以注水的区块水顺利注入，并且使原油采收率提高了3～7％；效率高。

附图说明：

图1为吸光度曲线。

图2生物表面活性剂在不同浓度时的界面张力值。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

实施例1、化学诱变法筛选高产菌株：

下述实验中用的培养基如下：富集培养基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、双蒸水1000mL及琼脂20g，pH 7.0～7.2。血琼脂平板培养基：此培养基购于北京益德益华科技有限公司；蓝琼脂平板培养基：硫酸铵0.1％，硝酸钠0.2％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾1％，磷酸氢二钠0.4％，酵母粉0.05％及余量水，pH 7.0～7.2，浸有原油的粗滤纸。

筛选步骤：

1、菌株的富集培养：

称取长期受原油污染的土壤1g溶到100ml无菌水后，吸取1mL接入于富集培养基中，置37℃恒温震荡培养箱中培养24小时。

2、分离纯化：

将富集培养后得到的菌悬液吸取0.2ml菌悬液进行血琼脂平板涂布，于37℃恒温培养箱中培养48小时，挑选菌落周围溶血圈大的菌株摇瓶培养后采用相同的方法涂布到蓝平板后分离纯化培养48小时。

3、诱变改良：

在上述方法筛选到的菌种制成菌悬液后涂布到平板后，在平板内边缘放上少许亚硝基胍晶体，倒置37℃恒温培养24小时，观察亚硝基胍周围的抑菌圈情况，诱变后挑取仅靠抑菌圈外侧少许菌苔到LB培养基中制成菌悬液，37℃震荡培养过夜，再取少量过夜培养的菌悬液涂布平板，培养24小时，转接到摇瓶发酵培养72小时，测定鼠李糖脂含量、发酵液表面张力及驱油效果，结果如下：

(1)、发酵液中鼠李糖脂表面活性剂的比色法检测含量：

显色液配制：A试剂：60％浓H₂SO₄，B试剂：1.6％3，5-二羟基甲苯，用之前7.5A：1B混合。

A.制备标准曲线：如图1所示。

B.发酵液中生物表面活性剂检测：

(a)、发酵液摇匀，取1ml，用去离子水稀释至6ml(稀释6倍)；取上述稀释溶液0.1ml，稀释至5ml(稀释50倍，可先加入5ml蒸馏水，从中吸出0.1ml蒸馏水，再加入稀释后的溶液0.1ml)；累计稀释300倍。

(b)、取稀释后的溶液0.5ml，加显色液4.5ml，混匀(做两个平行样)。

(c)、空白样：0.5ml蒸馏水，加显色液4.5ml，混匀。

(d)、水浴加热至80℃，30min，取出冷水浴迅速冷却至室温后421nm检测OD值，先用空白样校零，后用少许待测样润洗后，再测待测样OD值。根据标准曲线和稀释倍数计算出发酵液中生物表面活性剂的含量。(曲线对应的含量×300÷1000＝最后含量g/L)。

(2)、生物表面活性的界面张力检测：

A.实验仪器：JJ2000B型旋转滴界面张力测量仪、万分之一天平、电子秤、烧杯、吸管等。

B.实验材料：生物表面活性剂：VTS-1菌的发酵液浓度为0.05～1％、水：大庆油田地层水、原油：大庆原油，密度为0.8806g/m³。

C.检测方法参见中华人民共和国石油天然气行业标准SY/T5370-1999。

D.检测结果：

生物表面活性剂浓度为0.05～1.0％时与大庆原油之间的界面张力值见图2。

(3)、室内驱油实验：

A.实验材料：人造均质岩心：Y：Ф9.18×2.5cm；大庆原油：密度为0.84g/ml、粘度值为18mp·s；大庆油田地层水。

药剂：鼠李糖脂表面活性剂复合体系配方为鼠李糖脂发酵液(1％)+木质素磺酸盐(0.2％)+碳酸钠(1.2％)+余量水。

B.模拟地质条件：采用人造均质岩芯，其水相渗透率150～200md；油层温度50℃。

C.实验方法参见中华人民共和国石油天然气行业标准SY/T5336-1996。

D.驱油结果：见下表1

表1

岩心	长度 cm	孔隙度％	水相有效渗透率md	原始含油饱和度％	水驱采收率％	残油饱和度％	药剂注入量 pv	后续水驱采收率％
									Y	9.18	27	156	75	34.9	49	0.4	15.5

总结：经此种方法筛选到一株能以原油为碳源的铜绿假单胞菌(Pseudomonas sp VTS-1，菌种保藏号为CGMCC2200，其经发酵后鼠李糖脂含量可达到35～45g/L，45℃0.05～1％浓度的发酵液能使原油与地层水界面张力降低至0.4～0.7mN/m，在水相有效渗透率150-200md、残余油饱和度46～55％、注入量为0.4pv鼠李糖脂发酵液浓度为1％、50℃的条件下，原油采收率比水驱提高了15.5％左右。

4、小试摇瓶实验：

将诱变后菌种接种到新鲜的斜面培养基上37℃恒温培养箱中培养24h后，转接入到灭好菌的一级种子培养基中，置于摇床中震荡培养24h，摇床转速设置为130rpm、温度为30±2℃。将培养24h的一级种瓶转接至二级发酵种瓶中，置于摇床中震荡培养5d，摇床转速设置为130rpm、温度为37℃，在第四天利用上述的比色法检测含量为40.5g/L。

实施例2、工业化方法生产鼠李糖脂生物发酵液：

摇瓶及发酵罐培养基配方为：玉米油2％、尿素1％、糖蜜15％、KCl 0.1％、KH₂PO₄0.05％、K₂HPO₄0.3％、酵母膏0.005％、复合微量元素0.008％，其余为水，pH为6.5，所述的复合微量元素为Zn 1.5g/L、 Cu 1.0g/L、Mn 1.0g/L、Se 1.5g/L、Co 1.0g/L及溶剂水复配而成。

摇瓶及发酵罐培养：

利用实施例1所得的斜面菌种，培养30h，转接入5L摇瓶(装入2L培养基)，接种量5％(菌液浓度在OD₆₀₀＝0.8～1.0)、温度为32±2℃、120rpm培养14h，转接入500升的一级发酵罐，装料系数为70％，接种量5％、温度为32±2℃、通风比为1∶1、pH为6.5～7.5、搅拌转速为100rpm培养12h，转接入3.5吨二级发酵罐，装料系数为70％，接种量5％、温度为32±2℃、通风比为1∶1、pH为6.5～7.5、搅拌转速为100rpm培养12h，转接入30吨三级发酵罐，装料量为20吨，三级发酵罐的工艺参数为：温度32±2℃、灭菌前pH调到6左右，后期用0.245吨NaOH将pH控制在6以上，通风比为1∶1、搅拌转速为100rpm，期间累计补加2.0吨玉米油，发酵培养50小时后用比色法检测鼠李糖脂含量为39.5g/L。

实施例3、工业化方法生产鼠李糖脂生物发酵液：

摇瓶及发酵罐培养基配方为：玉米油3％、尿素1.5％、糖蜜17％、KCl 1.0％、KH₂PO₄0.2％、K₂HPO₄1.5％、酵母膏0.02％、复合微量元素0.01％，其余为水，pH为6.5，所述的复合微量元素为Zn 1.5g/L、Cu 1.0g/L、Mn 1.0g/L、Se 1.5g/L、Co 1.0g/L及溶剂水复配而成。

摇瓶及发酵罐培养：

利用实施例1所得的斜面菌种，培养30h，转接入5L摇瓶(装入2L培养基)，接种量5％、32±2℃、120rpm培养16h，转接入500升的一级发酵罐，装料系数为67％，接种量5％、32±2℃、通风比为1∶1、pH为6.5～7.5、搅拌转速为120rpm培养12h，转接入3.5吨二级发酵罐，装料系数为67％，接种量5％、32±2℃、通风比为1∶1、pH为6.5～7.5、搅拌转速为120rpm培养12h，转接入30吨三级发酵罐，装料量为20吨，三级发酵罐的工艺参数为：温度32±2℃、灭菌前pH调到6左右，后期用0.210吨NaOH将pH控制在6以上，通风比为1∶1、搅拌转速为120rpm，期间累计补加玉米油1.9吨，发酵培养54小时后用比色法检测鼠李糖脂含量为37.8g/L。

实施例4、工业化方法生产鼠李糖脂生物发酵液：

摇瓶及发酵罐培养基配方为：玉米油5％、尿素0.2％、糖蜜20％、KCl 0.05％、KH₂PO₄1.2％、K₂HPO₄0.05％、酵母膏0.1％、复合微量元素0.005％，其余为水，pH为6.5，所述的复合微量元素为Zn 1.5g/L、Cu 1.0g/L、Mn 1.0g/L、Se 1.5g/L、Co 1.0g/L及溶剂水复配而成。

摇瓶及发酵罐培养：

利用实施例1所得的斜面菌种，培养30h，转接入5L摇瓶(装入2L培养基)，接种量5％、32±2℃、120rpm培养12h，转接入500升的一级发酵罐，装料系数为60％，接种量5％、32±2℃、通风比为1∶1、pH为6.5～7.5、搅拌转速为120rpm培养12h，转接入3.5吨二级发酵罐，装料系数为60％，接种量5％、32±2℃、通风比为1∶1、pH为6.5～7.5、搅拌转速为100rpm培养12h，转接入30吨三级发酵罐，装料量为18吨，三级发酵罐的工艺参数为：温度32±2℃、灭菌前pH调到6左右，后期用0.185吨NaOH将pH控制在6以上，通风比为1∶1、搅拌转速为120rpm，期间累计补加玉米油1.8吨，发酵培养52小时后用比色法检测鼠李糖脂含量为40.4g/L。

实施例5、工业化方法生产鼠李糖脂生物发酵液：

摇瓶及发酵罐培养基配方为：玉米油3％、尿素1％、糖蜜20％、KCl 0.5％、KH₂PO₄0.5％、K₂HPO₄0.5％、酵母膏0.05％及复合微量元素0.005％，其余为水，pH为6.5，所述的复合微量元素为Zn 1.5g/L、Cu 1.0g/L、Mn 1.0g/L、Se 1.5g/L、Co 1.0g/L及溶剂水复配而成。

摇瓶及发酵罐培养：

利用实施例1所得的斜面菌种，培养30h，转接入5L摇瓶(装入2L培养基)，接种量5％、32±2℃、120rpm培养12h，转接入500升的一级发酵罐，装料系数为75％，接种量5％、32±2℃、通风比为1∶1、pH为6.5～7.5、搅拌转速为120rpm培养12h，转接入3.5吨二级发酵罐，装料系数为75％，接种量5％、32±2℃、通风比为1∶1、pH为6.5～7.5、搅拌转速为120rpm培养12h，转接入30吨三级发酵罐，装料量为22.5吨，三级发酵罐的工艺参数为：温度32±2℃、灭菌前pH调到6左右，后期用0.255吨NaOH将pH控制在6以上，通风比为1∶1、搅拌转速为120rpm，期间累计补加玉米油1.8吨，发酵培养55小时后用比色法检测鼠李糖脂含量为42.7g/L。

由上述几个实例可以看出采用此生产工艺发酵鼠李糖脂含量可达到35-45g/L。

实施例6、鼠李糖脂表面活性剂驱油现场试验：

2007年4月将鼠李糖脂表面活性剂复合体系配方鼠李糖脂发酵液(1％)+木质素磺酸盐(0.2％)+碳酸钠(1.2％)+余量水对大庆油田采油五厂杏13-33-26井区的4口注水井(杏13-33-25、杏13-丁3-28、杏13-丁4-26、杏13-33-28)进行了现场驱油试验。

杏十三区过渡带位于大庆长垣杏树岗油田最南端，原始地层压力11.27MPa，饱和压力6.28MPa，该井区共有油水井14口，其中油井10口，水井4口，布井面积0.3445km²，控制地质储量6.3116×10⁴t，截止到2007年4月份，该区日注水152m³，日产液134t，日产油16.9t，综合含水87.4％，流压3.47MPa，累计注水26.8029×10⁴m³，累计产油1.8353×10⁴t，累计产水12.4661×10⁴m³，采出程度29.07％。这4口注水井均为杏十三区西部过渡带扩边分层井，平均单井射开砂岩厚度为24.4m，有效厚度为6.4m，平均注水压力12.8MPa，实际注入生物表面活性剂量见表2。

生物表面活性剂复配体系注入量表表2

井号	杏13-33-25	杏13-丁3-28	杏13-丁4-26	杏13-33-28	合计
						注入生物表面活性剂复配体系(t)	20.3	19.5	18.4	19.3	77.5

2.试验效果检测：

现场注入生物表面活性剂3个月后，试验井组陆续见到驱油效果，井组日产油由16.9t上升到20.5t。杏13-丁3-26井日产液由驱油前的2.2t上升到2007年10月的3.0t，与试验前对比，单井日增油0.9t，含水保持稳定。10口油井全部获得增产，截止2007年10月底井组增油1893.4吨。

生物表面活性剂驱油试验区4口水井周围油井增油量表表3

现场实验数据显示：本发明中假单胞菌VTS-1在发明中所提的配方和工艺条件下得到的鼠李糖脂发酵液复合体系在7个月时间内效果明显，日增产原油约0.9吨/口井。

Claims

1.一种鼠李糖脂生物发酵液的制备方法，其特征在于：该鼠李糖脂发酵液是由在石油污染的土壤中提取并经过分离纯化得到的铜绿假单胞菌再经亚硝基胍诱变后得到铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)VTS-1，保藏编号为：CGMCC2200，具体发酵培养步骤如下：

A、菌种VTS-1接入摇瓶培养，温度为32±2℃、120转/分震荡培养12～16小时，得到摇瓶菌种；

B、一级发酵培养：将A步骤中的摇瓶菌种按5％～10％的接种量转接入装有培养基的一级发酵罐中，在温度为32±2℃、pH 6.5～7.5、通风比1∶0.5～1及搅拌速度为100～150转/分的条件下发酵培养10～18小时，得到一级发酵菌种；

C、二级发酵培养：将B步骤中的一级发酵菌种按5％～10％的接种量转接入装有培养基的二级发酵罐中，在温度为32±2℃、pH 6.5～7.5、通风比1∶0.5～1及搅拌速度为100～150转/分的条件下发酵培养10～18小时，得到二级发酵菌种；

D、发酵培养：将C步骤中的二级发酵菌种按5％～10％的接种量转接入装有培养基的三级发酵罐中，在温度为32±2℃、pH 6.5～7.5、通风比1∶0.5～1、搅拌速度为100～150转/分及补料条件下发酵培养45～55小时，再进行80℃灭菌得到鼠李糖脂发酵液。

2.根据权利要求1所述的鼠李糖脂生物发酵液的制备方法，其特征在于：步骤D中所补的料是玉米油，每次补料量为1％～5％。

3.根据权利要求1所述的鼠李糖脂生物发酵液的制备方法，其特征在于：各级发酵罐的装料系数是60～75％。