CN103232966A - 耐中高温产胞外水不溶性多糖原生质体融合工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐中高温产胞外水不溶性多糖原生质体融合工程菌及其应用，属于生物工程技术在微生物采油中的应用。所述菌种是保藏编号为CGMCC No.7346的耐中高温产胞外水不溶性多糖原生质体融合工程菌菌。该工程菌为不耐高温的产胞外水不溶性多糖的JD菌(Enterobacter sp.)与耐热菌AJ菌(Geobacillus sp.)通过原生质体融合法得到，其可在45℃条件下产生高质量的胞外水不溶性多糖。本发明的融合工程菌与油藏内源微生物共同培养时有明显的竞争优势，可用于中高温油藏的调剖，通过对高渗透层进行选择性封堵，达到提高原油采收率的目的；并为微生物采油所用菌株适用范围的扩大提供了有效的方法。

Description

耐中高温产胞外水不溶性多糖原生质体融合工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术在微生物采油育种中的应用，具体涉及一种利用原生质体融合法构建的耐中高温产胞外水不溶性多糖原生质体融合工程菌，以及该原生质体融合工程菌小罐发酵的方法及其在选择性封堵中高温油藏高渗透层、提高其原油采收率中的应用。

背景技术

生物技术已经被越来越多的应用于石油领域，微生物采油技术就是其中之一。微生物提高原油采收率(Microbial Enhanced Oil Recovery，MEOR)技术能够进一步提高原油采收率，延长油田开发寿命，具有广阔的应用前景。该技术与其它采油技术相比，具有成本低、适用范围广、生物活性稳定、有效作用时间长、环境友好等优点。

微生物采油技术正逐渐成为提高油田产量的主要方法之一。由于油田储层裂缝非常发育、非均质性比较严重，并随开采程度的提高而逐渐加剧，目前较多的油田常规水驱效果较差。为解决低渗油藏裂缝发育、非均质问题，可利用微生物代谢产生的生物聚合物对低渗透油藏进行深部调剖。

生物聚合物用于MEOR主要作用是对高渗透区域经选择性封堵从而改变渗透率。通过选择性封堵的方式，生物聚合物可以将水驱方向引至含油丰富通道。这是一种水驱辅助手段，可以使注水井中注入的水绕开油井中的寡油带从而将更多的原油带到地面。前期注入的微生物或者营养物质通过高渗通道到达油井内部，生物膜在岩层生长堵塞孔喉从而使高渗区域渗透率降低，该过程可以平衡整个储层的渗透率并恢复水驱波及效率。具有MEOR应用前景的生物聚合物包括，由黄单胞菌(Xanthomonas campestris)代谢产生的黄原胶、乳酸杆菌(Leuconostoc mesenteroides)的代谢产物右旋糖苷、嗜盐单胞菌属(Halomonas sp.)或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)代谢产生的果聚糖、短梗霉(Aureobasidium pullulans)代谢的生物大分子。

最初认为选择性封堵主要是由筛分作用决定的，即当孔喉半径小于菌体直径的两倍时效果为最好。死亡的菌株或是不能产生黏性物质的菌株较可代谢产生胞外多糖的菌株既不能封堵孔隙介质亦不能使介质的孔隙度降低。多糖的作用主要是保护菌株免受干燥和侵食，以及协助菌体粘附与介质表面。生物聚合物对填沙管及岩芯渗透率的影响已被实验室试验深入研究，作为封堵剂生物聚合物比菌体本身更有效。生物多糖作为水驱增稠剂已是众所周知，如黄单胞菌(Xanthomonas)利用碳水化合产生的热稳定杂多糖黄原胶，并已被用于水驱系统。虽然黄原胶是通过发酵碳水化合物得到的，但其应用的思路来源于化学法提高原油采收率。黄原胶的粘度、抗剪切力以及对温度和矿化度的耐受性使其成为EOR中理想的聚合物，这些正是其优于聚丙烯酰胺的理由。然而，黄原胶的成本较高且易被生物降解。另一种生物聚合物硬葡聚糖是由一类真菌的菌核代谢产生的，已有文献报道其可用于提高原油采收率。生物聚合物果聚糖可适用于油藏温度低于55℃、pH6-7、压力不高于500atm且盐浓度为4%的油井。虽然黄原胶为最有效的生物聚合物，但其他生物聚合物如热凝胶、葡聚糖及生物大分子在MEOR中的应用亦有文献报道。

另一方面，生物膜是由菌体、胞外聚合物及水组成的异构系统。对生物膜的研究表明生物膜是由不足27%的菌体、胞外产物、胞外聚合物、孔隙空间组成的。生物聚合物可以在油井孔隙中形成不同形状的生物膜，生物聚合物的产生及其随后形成的生物膜对MEOR的有效开展都非常重要，二者受水中的化学物质、pH值、表面电荷、微生物生理、营养物质及流体流动等参数的影响。

微生物采油的关键技术是能否获得性状优异的菌种，菌种的好坏直接关系到矿场应用的效益和前景。从自然界筛选得到的采油菌株性能各异，很难同时既具有优良的驱油性能，又具有很好的环境适应性，因此其矿场应用范围也往往受到很大的限制。微生物育种的目的就是要人为地使某种特定的代谢产物过量积累，把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向引导，或者通过细胞工程与基因工程的手段构建优良的微生物菌种，提高目的代谢产物的代谢水平，增强其环境适应性。如中国专利ZL201010597680.1中记载的耐高温产胞外水不溶性多糖基因工程菌，便是利用基因工程的方法将嗜热菌的基因组DNA通过电击转化的方法转入产胞外水不溶性多糖的菌株中，使后者能够在56℃以下的温度条件下产胞外多糖，从而提高了产胞外多糖菌株在油田的应用范围。但该专利中的基因工程菌代谢产生的胞外水不溶性多糖在发酵液上方聚结成一薄层，在摇晃培养瓶时所产多糖易分裂成碎片，韧性较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐中高温产胞外水不溶性多糖的原生质体融合工程菌，该菌株能够在中高温下产生胞外水不溶性多糖，且所产胞外水不溶性多糖韧性好，且该工程菌与油藏内源微生物共同培养时有明显的竞争优势。

本发明的另一目的在于提供利用所述的耐中高温产胞外水不溶性多糖原生质体融合工程菌产水不溶性多糖的方法，以及所生产得到的水不溶性多糖。

本发明的另一目的在于提供所述的耐中高温产胞外水不溶性多糖原生质体融合工程菌在选择性封堵高温油藏的高渗透层、调剖和/或提高中高温油藏的高渗透层的原油采收率中的应用。

本发明提供了一种耐中高温产胞外水不溶性多糖原生质体融合工程菌，本发明中将其命名为ZR3，其具有在中高温下高产胞外水不溶性多糖的能力。根据本发明的具体实施方案，本发明的原生质体融合工程菌ZR3是利用原生质体融合的方法将亲本菌肠杆菌属Enterobacter sp.菌和嗜热菌Geobacillus sp.融合得到的。

本发明中所述的亲本菌Enterobacter sp.(根据本发明的具体实施方案，是从吉林油田采集的水样中筛选得到的一株Enterobacter sp.菌，命名为JD菌)，在37℃时够以单糖为碳源代谢产生胞外水不溶性多糖，这种水不溶性聚合物吸水性很强，湿重是干重的100多倍。矿场先导试验表明JD菌可以对高渗透油藏进行选择性封堵，但是其代谢产生胞外水不溶性多糖的性能受环境温度影响较大，当温度超过40℃时，难以形成多糖聚合物，不能应用于温度较高的油藏。

本发明中所述的亲本菌Geobacillus sp.，是从中原油田采出水中分离得到的一株嗜热菌（命名为AJ菌），可耐受80℃高温，但不具有产胞外水不溶多糖的性状。

本发明旨在提高JD菌代谢产生胞外水不溶性多糖的耐温性能且保持其所产多糖的良好物理性状（主要是韧性），通过原生质体融合的方法，将产胞外水不溶性多糖的JD菌与嗜热菌AJ进行原生质体融合，得到一株工程菌，本发明命名为ZR3，该原生质体融合工程菌ZR3可在温度45℃以下条件下稳定代谢产生胞外水不溶性多糖，且所产多糖性状良好，韧性强。本发明的原生质体融合工程菌ZR3产胞外水不溶性多糖温度为45℃以下，pH5～9.5，可耐受50000mg/L盐浓度。此外，实验表明，本发明的原生质体融合工程菌的与油藏内源微生物共同培养时有明显的竞争优势。

本发明的工程菌菌株ZR3己于2013年03月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏编号为CGMCC No.7346。

本发明还提供了一种耐中高温产胞外水不溶性多糖原生质体融合工程菌制剂，该原生质体融合工程菌制剂中含有本发明的保藏编号为CGMCC No.7346的耐中高温产胞外水不溶性多糖原生质体融合工程菌，可以是固态菌制剂，或是液态菌制剂或者含活菌的发酵培养液的形式。

本发明还提供了利用本发明的原生质体融合工程菌或原生质体融合工程菌制剂生产胞外水不溶性多糖的方法，该方法包括：将所述的原生质体融合工程菌或所述的原生质体融合工程菌制剂在发酵培养基中培养，产生胞外水不溶性多糖。

根据本发明的具体实施方案，所述发酵培养基的组分为：(NH₄)₂HPO₄0.05%～0.12%，NaNO₃0.05%～0.12%，NaCl2000～50000mg/L，蛋白胨0.25%～0.35%，酵母粉0.05%～0.15%。或者，所述发酵培养基的组分为：蛋白胨0.5%～1.5%，葡萄糖0.5%～1.5%，酵母粉0.3%～1.0%，牛肉膏0.3%～1.0%，NaCl2000～50000mg/L，pH值5～9.5。也可以采用常规的糖蜜培养基。本发明中，所述原生质体融合工程菌产胞外多糖条件优选为：NaCl2000～50000mg/L，pH5～9.5，温度45℃以下。

在本发明的一具体实施方案中，提供了一种利用本发明所述原生质体融合工程菌ZR3或原生质体融合工程菌制剂进行小罐发酵的方法，该方法包括：将本发明所述的原生质体融合工程菌或原生质体融合工程菌制剂在发酵培养基中小罐发酵培养。根据本发明的具体实施方案，所述原生质体融合工程菌产糖最优发酵培养基组分为：(NH₄)₂HPO₄0.1%，NaNO₃0.1%，NaCl0.1%，蛋白胨0.3%，酵母粉0.1%；发酵条件为：自然pH，发酵温度为35℃，搅拌速度200rpm，通气量为3.2L/min。

本发明还提供了一种胞外水不溶性多糖，其是利用本发明所述原生质体融合工程菌ZR3或原生质体融合工程菌制剂制备得到的。该水不溶性多糖物理性状良好，与亲本菌JD形似，产生于培养瓶中的胞外水不溶性多糖聚结成团，摇晃后不破碎，可用玻璃棒整体挑出，拉扯时成团的多糖很难分散，韧性及湿重均明显高于现有技术专利ZL201010597680.1中记载的基因工程菌所产的胞外水不溶性多糖。

本发明还提供了所述的耐中高温产胞外水不溶性多糖原生质体融合工程菌，或所述的原生质体融合工程菌制剂，或所述的水不溶性多糖，在微生物采油中的应用。

具体地，本发明提供了所述的耐中高温产胞外水不溶性多糖原生质体融合工程菌，或所述的原生质体融合工程菌制剂，或所述的水不溶性多糖，在选择性封堵中高温油藏的高渗透层中的应用。

本发明还提供了所述的耐中高温产胞外水不溶性多糖原生质体融合工程菌，或所述的原生质体融合工程菌制剂，或所述的水不溶性多糖，在提高原油采收率特别是中高温油藏的高渗透层的原油采收率中的应用。

本发明还提供了所述的耐中高温产胞外水不溶性多糖原生质体融合工程菌，或所述的原生质体融合工程菌制剂，在中高温调剖中的应用。本发明的原生质体融合工程菌具有良好的耐中高温特性，可以用作中高温油藏调剖菌。

根据本发明的具体实施方案，在具体应用时，以所述原生质体融合工程菌ZR3的发酵液（培养至对数生长期）的5%的稀释菌液计，是向高渗透层中注入0.5～2PV的稀释菌液，培养24小时以上，达到所述的选择性封堵中高温油藏的高渗透层、提高高温油藏的高渗透层的原油采收率的效果。实验表明，本发明的原生质体融合工程菌的与油藏内源微生物共同培养时有明显的竞争优势。

在本发明的一具体实施方案中，利用本发明的原生质体融合工程菌ZR3进行提高原油采收率的物理模拟试验，具体操作为：(1)用一定比例的石英砂装填模型，室温条件下用氮气测气测渗透率Kg；(2)抽真空、饱和新疆陆梁地层水，计算填沙岩芯的孔隙体积Vp；(3)40℃恒温箱中以1mL/min泵速饱和新疆陆梁原油至束缚水饱和，恒温箱中老化2d（模型基本参数见表1）；(4)以0.5mL/min泵速水驱至含水率（fw）98%，注入用糖蜜培养基（4%(v/v)糖蜜，0.1%(NH₄)₂HPO₄，以地层注入水配制）稀释20倍的菌液，40℃恒温培养7d后进行后续水驱，记录整个实验过程中的压力变化及采液量。

综上所述，本发明通过原生质体融合法将JD菌与AJ菌进行基因重组，得到可在40℃以上中高温条件下产生胞外水不溶性多糖的原生质体融合工程菌，该原生质体融合工程菌可用于中高温油藏的调剖，通过对高渗透层进行选择性封堵，达到提高原油采收率的目的，本发明还为微生物采油所用菌株适用范围的扩大提供了有效的方法。

附图说明

图1为温度对JD及ZR3产胞外水不溶性多糖的影响。

图2为盐浓度对ZR3产胞外水不溶性多糖的影响。

图3为pH对ZR3产胞外水不溶性多糖的影响。

图4为发酵过程中发酵液的pH及OD值变化。

图5为油藏内源微生物对ZR3及亲本菌JD产糖量的影响。

图6为低渗管原油采收率和含水率变化。

图7为高渗管原油采收率和含水率变化。

图8为ZR3与GJ产胞外水不溶性多糖的比较。

用于专利程序的微生物保存：

保藏日期：2013年03月21日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；

保藏编号：CGMCC No.7346；

分类命名：肠杆菌（Enterobacter sp.）。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的原生质体融合工程菌ZR3及特点和应用中所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。

实施例1、原生质体融合工程菌的构建

第一步：亲本菌株的筛选

亲本菌JD的筛选方法为：按照常规的菌株筛选方法，将从吉林油田采集的水样稀释10000倍后，涂布到含4%(v/v)糖蜜的琼脂平板上，30℃培养24h，将分离的各种微生物单菌落接到装有50mL4%糖蜜液体培养基中，30℃静置厌氧培养1天，判断不溶性聚合物的产生状况，经过多次分离、纯化，获得一株产水不溶性聚合物的JD菌。该菌株可以在温度低于37℃条件下利用单糖合成胞外水不溶性多糖。

亲本菌AJ的筛选方法为：按照常规的菌株筛选方法，将中原高温油田采出水稀释10000倍后涂布LB平板，80℃培养24h，平板上获得的单菌落经多次分离纯化后的到一株耐高温的菌株AJ，该菌株可在80℃高温条件下生长。

第二步：JD菌与AJ菌的原生质体制备

(1)收集亲本细胞：将培养好的两亲本菌AJ与JD转移入10mL无菌离心管中，分别以4000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体。加入5mL pH6.0磷酸缓冲液，以旋涡混合器混合均匀，再以4000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，如此洗涤两次后，将收集的菌体混合于5mL SMM液（0.5M蔗糖，0.02M MgCl₂，0.02M顺丁烯二酸，pH6.5）中；

(2)总菌数的测定：取0.5mL含有菌体的SMM溶液以无菌水稀释到10^-8，涂布10^-8、10^-7、10^-6各0.2mL于营养琼脂平板上，30℃培养16～24h，计算破壁前总菌数；

(3)破壁：取3mL含有菌体的SMM溶液于10mL无菌离心管中，加入3mL浓度为2mg/mL的溶菌酶溶液，混合均匀，置于30℃摇床中保温60min，分别在30min、45min、60min时取样，用相差显微镜检测原生质体形成情况，当95%以上的菌体形成原生质体时，停止破壁，立即进行剩余菌数的测定；

(4)剩余菌数测定：将破壁后的菌体溶液以4000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，并以高渗缓冲液洗涤两次，再将菌体分散于3mL高渗缓冲液中。分别取0.5mL AJ菌与JD菌的高渗缓冲液溶液以无菌水稀释到10^-7，涂布0.2mL10^-7、10^-6、10^-5于营养琼脂平板上，30℃培养16～24h，计算破壁后的剩余菌数；

(5)原生质体再生：分别取0.5mL AJ菌与JD菌的高渗缓冲液溶液，以SMM溶液稀释到10^-7，涂布0.2mL10^-7、10^-6、10^-5于再生补充培养基平板上，30℃培养2天，计算原生质体再生率。

第三步：JD菌与AJ菌的原生质体融合

各取1mL AJ菌与JD菌的高渗缓冲液溶液，置于10mL离心管中，混合均匀，于30℃培养箱中保温5min，2500rpm离心10min，弃上清液，收集菌体。立即加入0.2mLSMM溶液，1.8mL促融合剂溶液，混合均匀置于30℃培养箱中保温5min。2500rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，加入2mL SMM溶液，混合均匀，以SMM溶液稀释到10^-5，涂布0.2mL10^-5、10^-4、10^-3于双抗再生补充培养基平板上，30℃培养2天，观察融合子生长情况。

第四步：原生质体融合工程菌的获得

从双抗性再生补充培养基平板上挑取形成的融合子，转接到50mL完全培养基中，40℃培养2天，观察生成不溶性聚合物的情况。从生成大量不溶性聚合物的菌液中，作为接种液，分别接种3mL菌液到50mL完全培养基中，置于40℃、45℃生化培养箱中培养2天，观察产生不溶性聚合物的情况。如此反复进行几代转接传代，最终得到遗传性能稳定的融合菌，本发明中命名为ZR3。该原生质体融合工程菌菌株ZR3己于2013年03月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101），保藏编号为CGMCCNo.7346。

实施例2、温度对原生质体融合工程菌ZR3产胞外水不溶性多糖的影响

将JD菌与原生质体融合工程菌ZR3接种于50mL液体完全培养基（蛋白胨1%，葡萄糖1%，酵母粉0.5%，牛肉膏0.5%，NaCl0.5%，pH值7.2）中，接种量为1%，，分别置于20℃、30℃、35℃、40℃、42℃、45℃的温度下静止培养2天。

培养结束后，滤纸过滤获得胞外水不溶性多糖，蒸馏水冲洗后称重。温度对原生质体融合工程菌ZR3产胞外水不溶性多糖的影响结果见图1，原生质体融合工程菌ZR3最大产胞外水不溶性多糖的温度为45℃，35℃时胞外水不溶性多糖的产量最高，且明显高于亲本菌JD的量。

实施例3、盐浓度对原生质体融合工程菌ZR3产胞外水不溶性多糖的影响

分别取已活化的融合工程菌ZR30.5mL，接种于含1000mg/L、2000mg/L、3000mg/L、5000mg/L、10000mg/L、20000mg/L和50000mg/L NaCl的50mL液体完全培养基（蛋白胨1%，葡萄糖1%，酵母粉0.5%，牛肉膏0.5%，pH值7.2）中，40℃温度下培养2天

培养结束后，滤纸过滤获得胞外水不溶性多糖，蒸馏水冲洗后称重。盐浓度对原生质体融合工程菌ZR3产胞外水不溶性多糖的影响结果见图2，原生质体融合工程菌ZR3在50000mg/L高盐浓度下仍可以产多糖，且产糖量较高，盐浓度为20000mg/L时胞外水不溶性多糖产量最高。

实施例4、pH对原生质体融合工程菌ZR3产胞外水不溶性多糖的影响

分别取已经活化的融合工程菌ZR30.5mL，接种于pH值为3.5、4.5、5.0、5.5、6.2、6.8、7.2、7.6、8.0、8.5、9.0、9.5的液体完全培养基（蛋白胨1%，葡萄糖1%，酵母粉0.5%，牛肉膏0.5%，NaCl0.5%，pH值7.2）中，40℃温度下培养2天。

培养结束后，滤纸过滤获得胞外水不溶性多糖，蒸馏水冲洗后称重。pH对原生质体融合工程菌ZR3产胞外水不溶性多糖的影响结果见图3，ZR3对酸碱的耐受范围较大，pH4.5和9.5时胞外水不溶性多糖量均可达到最适条件的一半以上，其最适产胞外水不溶性多糖的酸碱条件为pH7.0～9.0。

实施例5、ZR3小罐发酵试验

发酵培养基配方：(NH₄)₂HPO₄0.1%，NaNO₃0.1%，NaCl0.1%，蛋白胨0.3%，酵母粉0.1%，以自来水配制培养基5L，自然pH，115℃灭菌30min。灭菌后发酵液的pH为7.33，整个发酵过程中的无需调节发酵液的pH。发酵温度为35℃，搅拌速度200rpm，通气量为3.2L/min。发酵所需种子液以-70℃保存的R3甘油管接种LB液体培养基，培养12h后以2.5%接种量接种发酵液。

实验过程中发酵液的pH及OD值变化见图4，在发酵进行至1h时开始出现泡沫，当发酵至6.5h后泡沫开始减少。初始发酵液中的菌浓为7.9×10⁷cells/mL，发酵至12h后菌浓达到2.7×10¹⁰cells/mL。

实施例6、原生质体融合工程菌ZR3与内源微生物配伍性

将培养至对数期的ZR3、JD按5%(v/v)接种量接种新疆六中区地层水（已过滤除去地层水中的原油）培养基（内含糖蜜4%(V/V)，(NH₄)₂HPO₄0.1%(W/V)），20℃静置培养，考察融合工程菌及亲本菌与六中区内源微生物的配伍情况。

如图5所示，ZR3与新疆六中区内源菌群共同培养使可以产生大量的多糖，表明ZR3可与油藏内源菌群较好配伍，而亲本菌株JD在与内源菌共存时的竞争优势较弱，几乎没有胞外水不溶性多糖产生。

实施例7、原生质体融合工程菌ZR3提高原油采收率的物理模拟试验

评价融合工程菌提高原油采收率的效果采用并联填沙管，具体方法步骤如下：

(1)用一定比例的石英砂装填模型，室温条件下用氮气测气测渗透率Kg；

(2)抽真空、饱和新疆陆梁地层水，计算填沙岩芯的孔隙体积Vp；

(3)40℃恒温箱中以1mL/min泵速饱和新疆陆梁原油至束缚水饱和，恒温箱中老化2d（模型基本参数见表1）；

(4)以0.5mL/min泵速水驱至含水率（fw）98%，注入用糖蜜培养基（4%(v/v)糖蜜，0.1%(NH₄)₂HPO₄，以地层注入水配制）稀释20倍的菌液，40℃恒温培养7d后进行后续水驱，记录整个实验过程中的压力变化及采液量。

表1各填沙管基本参数

ZR3提高采收率试验过程中采收率和含水率变化见图6、图7，在并联管实验中，高渗透管提高的采收率仅为3.54%，低渗管的采收率增加了11.25%，二者总共增加了14.79%的采收率，低渗管采收率的增加量应归功于ZR3的代谢产物对高渗管的调堵作用。

实施例8、原生质体融合工程菌ZR3与基因工程菌GJ的比较

将原生质体融合工程菌ZR3与保藏编号为CGMCC No.3909的基因工程菌GJ的胞外水不溶性多糖产量进行比较。

将已活化的ZR3和GJ分别接种于糖蜜培养基（糖蜜4%(V/V)，(NH₄)₂HPO₄0.1%(W/V)，NaCl15000mg/L），静止培养4天，培养温度分别为40℃和50℃。培养结束后，滤纸过滤获得胞外水不溶性多糖，分别称量干燥前后胞外水不溶性多糖的重量。

二者胞外水不溶性多糖产量比较见图8，虽然ZR3的干多糖重量较GJ略少，但由于ZR3的胞外水不溶性多糖含水率高，因此其胞外水不溶性多糖的湿重远高于基因工程菌GJ。且ZR3代谢产生的胞外水不溶性多糖物理性状与亲本菌JD形似，产生于培养瓶中的胞外水不溶性多糖聚结成团，摇晃后不破碎，可用玻璃棒整体挑出，拉扯时成团的多糖很难分散，而基因工程菌GJ代谢产生的胞外水不溶性多糖虽亦聚结成一薄层，但在摇晃培养瓶时所产多糖易分裂成碎片，韧性明显较ZR3菌差。

Claims (9)

1.保藏编号为CGMCC No.7346的耐中高温产胞外水不溶性多糖原生质体融合工程菌。

2.一种耐中高温产胞外水不溶性多糖原生质体融合工程菌制剂，该原生质体融合工程菌菌制剂中含有保藏编号为CGMCC No.7346的耐中高温产胞外水不溶性多糖原生质体融合工程菌，为固态或液态菌制剂。

3.利用权利要求1所述的原生质体融合工程菌或权利要求2所述的原生质体融合工程菌制剂生产胞外水不溶性多糖的方法，该方法包括：将权利要求1所述的原生质体融合工程菌或权利要求2所述的原生质体融合工程菌制剂在发酵培养基中培养，产生胞外水不溶性多糖。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述发酵培养基的组分为：(NH₄)₂HPO₄0.05%～0.12%，NaNO₃0.05%～0.12%，NaCl2000～50000mg/L，蛋白胨0.25%～0.35%，酵母粉0.05%～0.15%；或者所述发酵培养基的组分为：蛋白胨0.5%～1.5%，葡萄糖0.5%～1.5%，酵母粉0.3%～1.0%，牛肉膏0.3%～1.0%，NaCl2000～50000mg/L，pH值5～9.5。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述原生质体融合工程菌产胞外多糖条件为：NaCl2000～50000mg/L，pH5～9.5，温度45℃以下。

6.一种胞外水不溶性多糖，其是按照权利要求3～5任一项方法制备得到的。

7.权利要求1所述的原生质体融合工程菌，或权利要求2所述的原生质体融合工程菌制剂，或权利要求6所述的胞外水不溶性多糖，在选择性封堵中高温油藏的高渗透层中的应用。

8.权利要求1所述的原生质体融合工程菌，或权利要求2所述的原生质体融合工程菌制剂，或权利要求6所述的胞外水不溶性多糖，在提高中高温油藏的高渗透层的原油采收率中的应用。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其中，以所述原生质体融合工程菌的发酵液的5%的稀释菌液计，是向高渗透层中注入0.5～2PV的稀释菌液，培养24小时以上。

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