CN103232957B - 高效抑菌鼠李糖脂高产菌株及其应用 - Google Patents
高效抑菌鼠李糖脂高产菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高效抑菌鼠李糖脂高产菌株及其应用。该菌株为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），其保藏编号为CGMCC NO.7266。本发明的菌株具有很强的产高效抑菌鼠李糖脂的功能。所产鼠李糖脂能够用于抑制细菌的增殖、抑制细菌在介质表面的吸附、降解细菌生物被膜。在医药与环境保护方面具有重要应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效抑菌鼠李糖脂高产菌株及其应用。
背景技术
鼠李糖脂是一种糖脂类的阴离子表面活性剂。因其良好的生物相容性和高效的乳化、增溶以及降低表面张力等能力而被广泛应用于石油工业，生物医药、环境保护以及食品等领域。
目前，对病原菌的杀灭主要还是使用各类抗生素。但是，由于长期抗生素的使用，许多细菌已经对抗生素产生了耐药性，生物被膜（biofilm）的形成也是病原菌耐药性升高的一个主要原因。因此，开发新的能够抑菌杀菌以及能够抑制和降解生物被膜的活性物质很有意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种高效抑菌鼠李糖脂高产菌株及其应用。
本发明所提供的菌株为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）IMP67，其保藏编号为CGMCC NO.7266。
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）IMP67CGMCC NO.7266的如下任一应用也属于本发明的保护范围：
（1）铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）IMP67CGMCC NO.7266在制备抑制细菌增殖的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或结核分支杆菌。
（2）铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）IMP67CGMCC NO.7266在制备抑制细菌在介质表面吸附的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
其中，所述介质进一步可为任何能供菌吸附的介质，如培养皿、96孔板等。
（3）铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）IMP67CGMCC NO.7266在制备降解细菌生物被膜的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
发酵铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）IMP67CGMCC NO.7266得到的发酵产物也属于本发明的保护范围。
其中，所述发酵中使用的培养基为低磷酸培养基，溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度如下：氯化铵0.02M，氯化钾0.02M，Tris-HCl0.12M，硫酸镁0.0016M，蛋白胨1%（质量百分含量），甘油1g/100ml，余量为水。
发酵条件：37℃、搅拌；发酵时间为2天。
上述任一所述发酵产物的如下任一应用也属于本发明的保护范围：
（1）所述发酵产物在制备抑制细菌增殖的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或结核分支杆菌。
（2）所述发酵产物和抗生素联用在制备抑制细菌增殖的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或结核分支杆菌。
其中，所述抗生素可为四环霉素、链霉素、氨苄青霉素、托普霉素或卡那霉素。
所述发酵产物和所述抗生素联用中，所述发酵产物和所述抗生素可为等质量比。
（3）所述发酵产物在制备抑制细菌在介质表面吸附的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
其中，所述介质可为任何能供菌吸附的介质，如培养皿、96孔板等。
（4）所述发酵产物在制备降解细菌生物被膜的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
本发明的另一个目的是提供一种提取物。
本发明所提供的一种提取物，按照如下方法制备：将上述任一所述发酵产物去除菌体，保留发酵液上清，调节发酵液上清的pH值至2，然后4℃放置过夜，离心，取沉淀，再用氯仿甲醇混合液抽提，取有机相，即得；氯仿和甲醇的体积比为2:1。
所述提取物的如下任一应用也属于本发明的保护范围：
（1）所述提取物在制备抑制细菌增殖的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或结核分支杆菌。
（2）所述提取物和抗生素联用在制备抑制细菌增殖的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或结核分支杆菌。
其中，所述抗生素可为四环霉素、链霉素、氨苄青霉素、托普霉素或卡那霉素。
所述提取物和所述抗生素联用中，所述提取物和所述抗生素可为等质量比。
（3）所述提取物在制备抑制细菌在介质表面吸附的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
其中，所述介质可为任何能供菌吸附的介质，如培养皿、96孔板等。
（4）所述提取物在制备降解细菌生物被膜的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
本发明的菌株具有很强的合成鼠李糖脂的功能。该菌株产生的鼠李糖脂能够用于抑制细菌的增殖、降低细菌在介质表面的吸附、降解细菌形成的生物被膜。在医药与环境保护方面具有重要应用价值。
附图说明
图1为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）IMP67所合成的鼠李糖脂的薄层层析图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、菌株的分离和鉴定
一、分离。
取新疆克拉玛依油田8区8805井附近的原油污染土壤样品，使用LB培养基进行分离，得到菌株，命名为IMP67。
二、鉴定。
检测菌株IMP67的16s RDNA的序列，测得序列为SEQ ID NO.1所示。将该序列在Genbank数据库进行BLAST比对，结果该序列与铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）菌株LCD12的相似性为99%，证明该菌株为铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）。
该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.7266，保藏日期为2013年3月1日，分类命名为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa。保藏中心的地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
实施例2、菌株的功能验证
一、菌发酵物的提取物的制备
发酵：将菌株接种于PPGAS培养基中，37℃培养，搅拌速度为200转/分钟，发酵周期为2天，离心去除菌体后得到发酵液上清。PPGAS培养基的溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度如下：氯化铵0.02M，氯化钾0.02M，Tris-HCl0.12M，硫酸镁0.0016M，蛋白胨1%（质量百分含量），甘油1g/100ml，余量为水。
提取物的制备：用盐酸调节发酵液上清pH值至2，然后4℃放置过夜，离心，取沉淀，然后再用氯仿甲醇（体积比为2:1）抽提，取有机相，即为抽提产物（即提取物），该提取物为较高纯度的鼠李糖脂。
提取物的含量检测：将抽提产物进行干燥，得到固体提取物，直接称量干重。结果IMP67菌株发酵液上清中提取物的含量为3.8±0.1克/升。同样条件下，对照菌株铜绿假单胞菌PAO1发酵液上清中提取物的含量为2.8±0.1克/升。
提取物的鉴定：用薄层层析法鉴定，结果如图1。迁移率为0.6的是双鼠李糖脂，迁移率为0.9的是单鼠李糖脂。
二、提取物的性能
IMP67菌株提取物具有高效的表面活性和乳化能力。IMP67和PAO1产生的提取物在水中的表面张力值分别为为29.85mN/m和31.23mN/m，临界胶束浓度分别为50毫克/升和60毫克/升，汽油乳化指标值分别为70和65，柴油的乳化指标值分别为80和70。在高温、高盐以及不同pH等环境下，IMP67菌株产生的提取物都能保持较高的表面活性和乳化能力。
三、菌发酵物的提取物的抑制细菌功能。
（一）最低半数抑菌浓度的检测
将生长12小时的枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的细菌数调整为105个/毫升，然后分别加入实验一制得的IMP67和PAO1的提取物溶液进行浓度梯度实验，过夜生长，细菌浓度与对照组相比，OD600减少一半的提取物的浓度即为该提取物的最低半数抑菌浓度。对照组：未添加提取物。
结果：IMP67来源的提取物对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的最低半数抑菌浓度值分别为4μg/ml，4μg/ml，16μg/ml，4μg/ml；PAO1来源的提取物对上述四种菌的最低半数抑菌浓度值分别为10μg/ml，30μg/ml，25μg/ml，20μg/ml，说明实验一制得的提取物能够较好的抑制枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生长。
（二）管碟法测抑菌能力
将实验一制得的来源于IMP67和PAO1的固体提取物重新溶解后进行实验。通过管碟法，分别加入浓度为1mg/ml实验一制得的来源于IMP67和PAO1的提取物，然后检测对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌以及结核分支杆菌的抑菌圈，结果IMP67来源的提取物对上述五种菌的抑菌圈分别为32.5±2.5mm，22.5±2.5mm，30±0mm，27.5±0.5mm和26±1mm；PAO1来源的提取物对上述五种菌的抑菌圈分别为22±3mm，14mm±1.5mm，24mm±1mm，20mm±1mm和20.5±1mm。说明IMP67来源的提取物具有很好的抑菌活性，而且可以抑制慢性感染病原菌结核分支杆菌的生长。
（三）提取物与抗生素联用明显降低抗生素的使用浓度。
将表1中的各种抗生素与实验一制得的IMP67来源的提取物等质量比混合，可以明显降低各种抗生素对所测试菌株的最低抑菌浓度值。
表1
四、提取物抑制细菌在介质表面的吸附。
首先，取200ul的含浓度梯度的实验一制得的提取物溶液加入96孔板中，4℃过夜，然后用PBS洗两次，调整在LB液体培养基中37℃生长过夜的菌的浓度为105个/毫升，然后加入200ul菌液进96孔板中，4℃过夜后，弃去未吸附的菌体，然后用1%结晶紫染色观测，用酶标板读取OD560值，记录OD560值与未加提取物的对照组相比减少一半时的提取物的最低浓度。结果如表2。提取物可以较好的抑制枯草芽孢杆菌和表皮葡萄球菌在介质表面的吸附。对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在介质表面的吸附也有很好的效果。
五、提取物降解细菌生物被膜。
利用实验一制得的提取物来降解微生物在介质表面形成的生物被膜。首先，调整在LB液体培养基中37℃生长过夜的菌的浓度为105个/毫升，然后加入200ul菌液进96孔板中，37℃培养一个星期，然后弃去未吸附的菌体，此时菌在介质表面形成生物被膜。用PBS缓冲液洗两遍，然后加入不同浓度的提取物，37℃培养过夜，弃去未吸附的菌体，然后用1%结晶紫染色用酶标板读取OD560值，记录OD560值与未加提取物的对照组相比减少一半时的提取物的最低浓度。
结果如表2。说明实验一制得的提取物对表皮葡萄球菌形成的生物被膜的去除效果最好，对枯草芽孢杆菌，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌形成的生物被膜的降解也有较好的效果。
表2
Claims (6)
1.铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)IMP67，其保藏编号为CGMCC NO.7266。
2.铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)IMP67CGMCC NO.7266的如下任一应用：
(1)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)IMP67CGMCC NO.7266在制备抑制细菌增殖的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或结核分支杆菌；
(2)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)IMP67CGMCC NO.7266在制备抑制细菌在介质表面吸附的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌；
(3)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)IMP67CGMCC NO.7266在制备降解细菌生物被膜的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
3.发酵铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)IMP67CGMCC NO.7266得到的发酵产物，其特征在于：所述发酵产物的制备方法为：将所述铜绿假单胞菌IMP67CGMCC NO.7266接种于PPGAS培养基中，37℃培养，搅拌速度为200转/分钟，发酵周期为2天，离心去除菌体后得到发酵液上清；所述PPGAS培养基的溶剂为水，溶质及其在培养基中的浓度如下：0.02M氯化铵，0.02M的氯化钾，0.12M的Tris-HCl，0.0016M的硫酸镁，质量百分含量为1％的蛋白胨，1g/100ml的甘油，余量为水。
4.权利要求3所述发酵产物的如下任一应用：
(1)权利要求3所述发酵产物在制备抑制细菌增殖的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或结核分支杆菌；
(2)权利要求3所述发酵产物和抗生素联用在制备抑制细菌增殖的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或结核分支杆菌；
(3)权利要求3所述发酵产物在制备抑制细菌在介质表面吸附的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌；
(4)权利要求3所述发酵产物在制备降解细菌生物被膜的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
5.一种提取物，按照如下方法制备：将权利要求3所述的发酵产物去除菌体，保留发酵液上清，调节发酵液上清的pH值至2，然后4℃放置过夜，离心，取沉淀，再用氯仿甲醇混合液抽提，取有机相，即得；氯仿和甲醇的体积比为2:1。
6.权利要求5所述提取物的如下任一应用：
(1)权利要求5所述提取物在制备抑制细菌增殖的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或结核分支杆菌；
(2)权利要求5所述提取物和抗生素联用在制备抑制细菌增殖的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或结核分支杆菌；
(3)权利要求5所述提取物在制备抑制细菌在介质表面吸附的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌；
(4)权利要求5所述提取物在制备降解细菌生物被膜的产品中的应用；其中，所述细菌为枯草芽孢杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
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